JP5639730B2 - Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter - Google Patents

Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter Download PDF

Info

Publication number
JP5639730B2
JP5639730B2 JP2014149854A JP2014149854A JP5639730B2 JP 5639730 B2 JP5639730 B2 JP 5639730B2 JP 2014149854 A JP2014149854 A JP 2014149854A JP 2014149854 A JP2014149854 A JP 2014149854A JP 5639730 B2 JP5639730 B2 JP 5639730B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
filter
sample
filtration
membrane
specimen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014149854A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2014206544A (en
Inventor
清水 英晴
英晴 清水
浩一 稲野
浩一 稲野
文夫 権平
文夫 権平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denka Seiken Co Ltd
Original Assignee
Denka Seiken Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denka Seiken Co Ltd filed Critical Denka Seiken Co Ltd
Priority to JP2014149854A priority Critical patent/JP5639730B2/en
Publication of JP2014206544A publication Critical patent/JP2014206544A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP5639730B2 publication Critical patent/JP5639730B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Filtering Materials (AREA)
  • Filtration Of Liquid (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

本発明は、検体試料中の被分析物質を特異的に定性又は定量測定する検出法、検出装置並びに検出キットに関する。   The present invention relates to a detection method, a detection apparatus, and a detection kit for specifically qualitatively or quantitatively measuring an analyte in a specimen sample.

最近、抗原抗体反応や酵素反応等を利用した、ウイルスや細菌等の病原体への感染、妊娠の有無、血糖値など様々な測定項目を数分から数十分の短時間で検出あるいは定量する簡易検査試薬又はキットが開発されている。病原体構成蛋白質、ヒト繊毛性ゴナドトロピン(hCG)、血糖等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬はOTCとして一般薬局で販売されている。また病原体への感染を測定する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、症状が早期のうちに治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。   Recently, a simple test that uses antigen-antibody reaction or enzyme reaction to detect or quantify various measurement items such as infection with pathogens such as viruses and bacteria, presence of pregnancy, blood glucose level in a few minutes to tens of minutes. Reagents or kits have been developed. Pathogen component proteins, human ciliary gonadotropin (hCG), blood glucose, and the like are targets for detection or quantification. Many of the simple test reagents do not require special equipment and are easy to operate and inexpensive. For example, simple test reagents for pregnancy diagnosis are sold as OTC at general pharmacies. Unlike other test reagents, simple test reagents for measuring infection with pathogens are widely used in general hospitals and clinics in addition to large hospitals and medical test centers. These facilities are often the first medical institutions visited by patients, and if specimens collected from patients are found to be infected on the spot, symptoms can be treated as soon as possible. The importance of test reagents in medicine is increasing.

現在、簡易検査方法として、免疫測定法、すなわち免疫凝集法やイムノメンブレンアッセイ法、特にニトロセルロース等の膜やフィルター等のメンブレンを用いたアッセイ方法が一般に知られており、フロースルー式とラテラルフロー式メンブレンアッセイ法に大別される。前者は被検出物を含む溶液を被検出物に対する検出用物質が塗布された膜を垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。いずれの場合も被検出物に特異的に結合する膜固相物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで被検出物の検出あるいは定量を行うという点で共通しているが、最近ではより簡便で、より短時間での検出が可能であることから、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法(イムノクロマト法ともいう)が主流になっている。   Currently, immunoassay methods, that is, immunoaggregation methods and immunomembrane assay methods, particularly assay methods using membranes such as nitrocellulose and membranes, such as filters, are generally known as simple test methods. It is roughly classified into the formula membrane assay method. The former allows the solution containing the detection object to pass through the film coated with the detection substance for the detection object in the vertical direction, and the latter allows the solution to be developed in the horizontal direction. In either case, a membrane solid phase substance that specifically binds to the detected substance, a detected substance, and a complex of a labeled substance that specifically binds to the detected substance is formed on the film to detect or quantify the label. This is common in that detection or quantification of the detected substance is possible, but recently it is simpler and can be detected in a shorter period of time. Therefore, the lateral flow membrane assay method (also referred to as immunochromatography) is used. ) Has become mainstream.

しかし、このような膜やフィルターを用いるメンブレンアッセイ法による簡易検査方法では、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が生じることがある。病原体の感染を測定する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。したがって偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。   However, in a simple test method based on a membrane assay using such a membrane or filter, in the analysis of a sample actually collected from a patient, it is determined that the detected object is positive even though it is not present in the sample. So-called false positives may occur. If a false positive reaction occurs when measuring the infection of a pathogen, it will give incorrect information about the disease, so it will not only delay the cause identification but also take inappropriate measures, making the medical condition more serious, etc. It can have serious consequences. Therefore, suppressing false positives is an extremely important issue in view of the main purpose of the simple test method.

偽陽性の発生する原因は完全には判明していない。しかし検体中に含まれる混入物が原因の一つと考えられている。被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる簡易メンブレンアッセイ法では、被検出物が存在すると予測される部位、例えば患者の咽頭や鼻腔等から綿棒等の検体採取器具を用いて拭い液を採取して緩衝液に浮遊したり、被検出物を含む鼻汁や便等の分泌物や排泄物から一部を採取し、緩衝液で浮遊して、メンブレンアッセイ用の検体試料を調製するが、この場合、前記試料中に被検出物の他、検体採取部位から剥落した細胞や分泌物、排泄物の成分等が混入することがある。このような混入物にはプロテオグルカン、糖脂質等の粘性物質をはじめ、様々な生体成分が含まれているため、前記検体試料をそのまま膜等のメンブレン上に添加すると、上記成分の一部がメンブレン上あるいはメンブレン中に付着すると考えられる。特にメンブレンとして孔径又は保留粒子径が0.5〜15μm程度のものが使用されることが多いが、この孔径又は保留粒子径に匹敵する大きさの成分が添加されると、メンブレン中の細孔を塞ぎ溶液中の成分の移動を阻害することが考えられる。このような現象により非特異的な反応が起こり、被検出物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が起こると考えられる。   The cause of false positives is not completely known. However, it is thought that the contamination contained in the specimen is one of the causes. In a simple membrane assay method using an assay device equipped with a membrane to which a capture substance is bound to capture the detection target, a sample such as a cotton swab from the pharynx or nasal cavity of the patient where the detection target is expected to exist is detected. Use a sampling device to collect the wiping solution and float it in a buffer solution, or collect a part from secretions and excreta such as nasal discharge and stool containing the object to be detected, and float in the buffer solution for membrane assay. In this case, in addition to the detection target, cells, secretions, excrement components, and the like that have fallen from the sample collection site may be mixed in the sample. Since such contaminants include various biological components including viscous substances such as proteoglucan and glycolipid, when the specimen sample is added as it is onto a membrane such as a membrane, a part of the above components is present. It is thought that it adheres on or in the membrane. In particular, a membrane having a pore size or retained particle size of about 0.5 to 15 μm is often used, but if a component having a size comparable to this pore size or retained particle size is added, the pores in the membrane are blocked. It is conceivable to inhibit the movement of components in the solution. It is considered that a non-specific reaction occurs due to such a phenomenon, and so-called false positive occurs in which it is determined that the object to be detected is positive even though the detection target does not exist in the sample.

また、上記の混入物の含量、性状によってはメンブレン中の細孔が相当程度又は完全に塞がれてしまい、検体がメンブレン中を通過することが著しく困難になるか不可能になってしまうことにより、反応速度が極端に遅くなったり、測定不可能になったりしてしまう場合もあり、これを防ぐことも大きな課題である。   In addition, depending on the content and properties of the above contaminants, the pores in the membrane may be clogged to a considerable extent or completely, making it extremely difficult or impossible for the specimen to pass through the membrane. As a result, the reaction rate may become extremely slow or measurement may become impossible, and preventing this is a major problem.

上記の問題点を解決するためには、検体試料をあらかじめろ過して、メンブレン上に添加するという方法が有効である(特許文献1及び2を参照)。ろ過により検体試料中の偽陽性原因物質が除去されるので、これらの物質がアッセイ装置のメンブレン上あるいはメンブレン中に付着して、偽陽性を引き起こすのを阻止することができる。ところがフィルターでろ過する場合、検体試料中の物質がフィルターに目詰まりしてしまい、アッセイ装置のメンブレン上への添加が不可能になってしまうことがある。この問題を解決するための一つの手段は、試料ろ過フィルターの構成を工夫することである。孔径又は保留粒子径の大きなフィルターから小さなフィルターを何枚か重ねた試料ろ過フィルターを用いることで、ろ過時における検体試料の目詰まりをある程度回避することが可能である。しかし、ここで新たに問題が生じる。まず何枚ものフィルターを重ねることによりフィルターが厚くなり、一般によく用いられるセルロースろ紙等を用いた場合、検体試料を吸収してしまうため、検体試料の量が減少することである。特に感度を高めるためには緩衝液をなるべく少なくし、検体試料中の被検出物濃度を高めておく必要があるが、フィルターによる吸収分が多いとその分緩衝液を増やしておかなければならないので、感度が低下してしまう。また、フィルターの枚数を重ねれば、それだけ被検出物のフィルターへの吸着が多くなる可能性が高くなる。これらの問題点から逃れる手段としては、ろ過面積を大きくすることが考えられるが、緩衝液量が限られていることから無制限に大きくすることはできず大きな効果は期待できない。以上のことから感度を犠牲にせずに検体試料のろ過を達成することはキットの測定系構築にとって重要な課題となっていた。   In order to solve the above problems, it is effective to filter the specimen sample in advance and add it onto the membrane (see Patent Documents 1 and 2). Since the false positive causative substances in the specimen sample are removed by filtration, it is possible to prevent these substances from adhering to the membrane of the assay device or causing them to cause false positives. However, when filtering with a filter, the substance in the sample may be clogged in the filter, making it impossible to add the assay device onto the membrane. One means for solving this problem is to devise the configuration of the sample filtration filter. By using a sample filtration filter obtained by stacking several small filters from a filter having a large pore diameter or retained particle diameter, it is possible to avoid clogging of the specimen sample to some extent during filtration. However, a new problem arises here. First, by stacking a number of filters, the thickness of the filter increases, and when a commonly used cellulose filter paper or the like is used, the sample sample is absorbed, so the amount of the sample sample is reduced. In particular, to increase sensitivity, it is necessary to reduce the buffer solution as much as possible and increase the concentration of the analyte in the sample. However, if the amount of absorption by the filter is large, the buffer solution must be increased accordingly. Sensitivity will decrease. In addition, if the number of filters is increased, the possibility that the object to be detected is more adsorbed on the filter increases. As means for avoiding these problems, it is conceivable to increase the filtration area. However, since the amount of the buffer solution is limited, it cannot be increased without limitation, and a great effect cannot be expected. From the above, achieving the filtration of the specimen sample without sacrificing the sensitivity has been an important issue for the construction of the measurement system of the kit.

特開2000-88851号公報JP 2000-88851 A 特開2004-28875号公報JP 2004-28875 A

本発明の目的は、メンブレンアッセイ法を用いた検体の簡易な検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止できる検体試料のろ過法を提供し、被検出物の精度の高い検出又は定量を可能にする方法及びそのような方法において使用されるキットを提供することである。   An object of the present invention is to provide a specimen sample filtration method capable of preventing false positives and clogging while maintaining sensitivity in a simple specimen inspection method using a membrane assay method, and highly accurate detection or quantification of an object to be detected. And a kit for use in such a method.

すなわち本発明の課題は、被検出物を捕捉するための捕捉試薬が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易メンブレンアッセイ法において、強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを用いて検体試料をろ過した後にメンブレン上に滴下し、前記検体試料中の被検出物の存在を検出することを特徴とする方法、により解決される。   That is, an object of the present invention is to use a filter including a rigid filter in a simple membrane assay method of a detection object in a specimen sample using an assay device including a membrane to which a capture reagent for capturing the detection object is bound. This is solved by a method characterized in that a sample sample is filtered using a configured filter and then dropped on a membrane to detect the presence of an object to be detected in the sample sample.

また、本発明の課題は、以下を含む、検体試料中の被検出物の存在を検査するための簡易メンブレンアッセイキット;
(1)強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ、及び
(2)検体試料中の被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置、
により解決される。
Moreover, the subject of this invention is the simple membrane assay kit for test | inspecting presence of the to-be-detected object in a sample sample containing the following;
(1) An assay sample including a filter tube for a specimen sample including a filtration filter constituted by a filter including a strong rigidity filter, and (2) a membrane bound with a capture substance for capturing an object to be detected in the specimen sample. apparatus,
It is solved by.

本発明の好ましい実施態様は、強剛性フィルターが焼結フィルターである、上記方法又はキットである。   A preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the rigid filter is a sintered filter.

本発明の特に好ましい実施態様は、焼結フィルターの材質が、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、アルミナ、ジルコニア及びケイ素からなる群より選ばれることを特徴とする、上記方法又はキットである。   A particularly preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, characterized in that the material of the sintered filter is selected from the group consisting of polypropylene, polyethylene, polystyrene, polymethyl methacrylate, alumina, zirconia and silicon.

本発明の他の好ましい実施態様は、ろ過フィルターが2枚以上のフィルターを重ねて構成されており、粗ろ過用の1枚は孔径又は保留粒子径がメンブレンの孔径以上〜200μm以下であり、精密ろ過用の1枚は孔径又は保留粒子径がメンブレンの孔径以下である上記方法又はキットである。強剛性フィルターは精密ろ過用としても、粗ろ過用としても用いることができるが、少なくとも1枚の強剛性フィルターの孔径又は保留粒子径はメンブレンの孔径以上であり、200μm以下が好ましい。   In another preferred embodiment of the present invention, the filtration filter is formed by stacking two or more filters, and one of the coarse filters has a pore diameter or a retained particle diameter of not less than the pore diameter of the membrane and not more than 200 μm. One sheet for filtration is the above-mentioned method or kit in which the pore diameter or the retained particle diameter is not more than the pore diameter of the membrane. The rigid filter can be used for both fine filtration and coarse filtration, but the pore size or retained particle size of at least one of the rigid filters is not less than the pore size of the membrane, and preferably not more than 200 μm.

また、本発明の他の好ましい実施態様は、検体採取器具として、綿棒を用いる、上記方法であり、又は綿棒を含む上記キットである。   Moreover, the other preferable embodiment of this invention is the said method using a cotton swab as a specimen collection instrument, or the said kit containing a cotton swab.

また、本発明の特に好ましい実施態様は、上記の綿棒がブラシ状綿棒である、上記方法であり、又はブラシ状綿棒を含む上記キットである。   Also, a particularly preferred embodiment of the present invention is the above method, wherein the swab is a brush swab, or the kit comprising a brush swab.

また、本発明の好ましい実施態様は、検体試料が生体試料である、上記方法又はキットである。   Moreover, the preferable embodiment of this invention is the said method or kit whose specimen sample is a biological sample.

また、本発明の特に好ましい実施態様は、検体がヒト又は他の動物の咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液又は直腸拭い液である、上記方法又はキットである。   Further, in a particularly preferred embodiment of the present invention, the specimen is a pharyngeal wipe, nasal wipe, nasal aspirate, nasal wash, alveolar wash, stool suspension or rectal wipe of a human or other animal. Method or kit.

また、本発明の特に好ましい実施態様は検体中の被検出物が呼吸器感染症の原因微生物又は下痢症の原因微生物である、上記方法又はキットである。   In addition, a particularly preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the detected substance in the specimen is a microorganism causing respiratory infection or a microorganism causing diarrhea.

また、本発明の特に好ましい実施態様は検体中の被検出物がインフルエンザウイルス、RSウイルス、アデノウイルス、A群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質又はそれらに対する抗体である上記方法又はキットである。   Further, in a particularly preferred embodiment of the present invention, the detected substance in the sample is selected from the group consisting of influenza virus, RS virus, adenovirus, group A streptococcus, pneumonia mycoplasma, norovirus, rotavirus, sapovirus and diarrhea adenovirus. The above-described method or kit, which is a pathogenic microorganism or a substance derived from the microorganism or an antibody against them.

また、本発明の特に好ましい実施態様は、フロースルー式又はラテラルフロー式簡易メンブレンアッセイ法に関する上記方法又はキットである。   Further, a particularly preferred embodiment of the present invention is the above method or kit relating to a flow-through type or lateral flow type simple membrane assay method.

本発明の方法又は装置を用いて検体試料中の被検出物質を検出・定量する場合、検体が咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液等の不純物を多く含む検体であっても、検体採取器具及び/又はろ過フィルターにより検体量を減らすことなく、不純物を除去することができる。その結果、不純物に影響されることなく、正確な結果を得ることができる。   When detecting or quantifying a substance to be detected in a sample using the method or apparatus of the present invention, the sample is a sample containing a large amount of impurities such as a pharyngeal wiping solution, a nasal wiping solution, a nasal aspirate, and an alveolar lavage solution. In addition, impurities can be removed without reducing the amount of the sample by using the sample collection device and / or the filtration filter. As a result, accurate results can be obtained without being affected by impurities.

以下、本発明を詳細に説明する。
(簡易メンブレンアッセイ方法及びアッセイ装置)
本発明の方法は、被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易メンブレンアッセイ法であって、強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを用いて被検出物を含む検体から調製した検体試料をろ過した後に前記メンブレン上に滴下し、前記検体試料中の被検出物の存在を検出あるいは定量することを特徴とする方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(Simple membrane assay method and assay device)
The method of the present invention is a simple membrane assay method for an object to be detected in a specimen sample using an assay device including a membrane to which a capture substance for capturing the object to be detected is bound, and includes a filter including a rigid filter A specimen sample prepared from a specimen containing a detection object using a filtration filter constituted by the above is filtered and dropped on the membrane, and the presence or absence of the detection object in the specimen sample is detected or quantified. It is a method to do.

本明細書において“簡易メンブレンアッセイ法”とは、被検出物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含むアッセイ装置を用いて検体試料中の被検出物の存在の有無を短時間に簡便に検査する方法である。典型的には、被検出物と、前記捕捉物質及び標識物質を反応させて補足物質-被検出物-標識物質という構造を有するサンドイッチ状の複合体をメンブレン上に形成させ、前記標識物を検出することにより、この複合体の存在を検出する方法である。被検出物と前記捕捉物質及び標識物質との反応としては、抗原抗体反応、その他の受容体とレセプターの反応、ビオチンとアビジンの特異的結合反応、相補的配列を持つDNA同士の反応等が挙げられる。また、本発明の簡易検査方法は、このような方法に用いるものであれば、被検出物、メンブレン、標識物質の種類について限定されるものではない。   In this specification, the “simple membrane assay method” refers to the presence or absence of an analyte in a specimen sample using an assay device including a membrane on which a capture substance that specifically binds to the analyte is immobilized. This is a simple inspection method in a short time. Typically, a detection target is reacted with the capture substance and the labeling substance to form a sandwich-like complex having a structure of supplementary substance-detection target-labeling substance on the membrane, and the labeling substance is detected. This is a method for detecting the presence of this complex. Examples of the reaction between the detected substance and the capture substance and the labeling substance include antigen-antibody reaction, reaction between other receptor and receptor, specific binding reaction between biotin and avidin, reaction between DNAs having complementary sequences, and the like. It is done. In addition, the simple inspection method of the present invention is not limited to the types of the detection target, the membrane, and the labeling substance as long as they are used in such a method.

本明細書にいうメンブレンを備えたアッセイ装置(メンブレンアッセイ装置ともいう)とは、被検出物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含む装置である。このようなアッセイ装置としては、フロースルー式メンブレンアッセイ法又はラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用するものであることが、簡便かつ迅速であるため好ましい。フロースルー式メンブレンアッセイ法は被検出物を含む溶液を、被検出物と特異的に結合する捕捉試薬や検出用物質が塗布されたメンブレンに対して垂直方向に通過させるものであり、被検出物に特異的に結合する捕捉物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出又は定量を行う。ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法は、同様なメンブレンを用いてメンブレンに対して被検出物を含む溶液を水平方向に展開させる点でフロースルー式メンブレンアッセイ法と異なるが、被検出物の検出原理は同様である。2種類の方法のうち、簡便さと測定時間の短さの面からラテラルフロー式メンブレンアッセイ法がより好ましい。   An assay device including a membrane (also referred to as a membrane assay device) as used in the present specification is a device including a membrane on which a capture substance that specifically binds to an object to be detected is immobilized. As such an assay apparatus, it is preferable to use a flow-through membrane assay method or a lateral flow membrane assay method because it is simple and rapid. In the flow-through membrane assay method, a solution containing an object to be detected is passed in a direction perpendicular to a membrane coated with a capture reagent or a detection substance that specifically binds to the object to be detected. By forming a complex of a capture substance that specifically binds to the target substance, an object to be detected, and a label substance that specifically binds to the object to be detected, and detecting or quantifying the label, Perform quantification. The lateral flow membrane assay method differs from the flow-through membrane assay method in that the same membrane is used to spread the solution containing the analyte on the membrane in the horizontal direction, but the detection principle of the analyte is the same. It is. Of the two methods, the lateral flow membrane assay is more preferable from the viewpoint of simplicity and short measurement time.

ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用するアッセイ装置の具体例は、例えば図1及び2に示されるような装置である。   A specific example of an assay device using a lateral flow membrane assay is a device as shown in FIGS. 1 and 2, for example.

図1は装置の平面図であり、図2は、図1のI−I’切断端面である。図1及び2において、aは調製した検体試料を滴下するために設置されたサンプル滴下パッドである。bは標識物質が乾燥化されて保持される標識物質乾燥パッドである。cは滴下された溶液を吸収するためのサンプル吸収パッドである。dは被検出物に特異的に結合する捕捉物質が結合したメンブレンであり、e、f及びgは被検出物に特異的に結合する捕捉物質がd上でライン状に結合している位置を示す。さらに捕捉物質が結合している位置の下流の位置hに標識物質を結合することができる物質、例えば被検出物と同等の反応性を有する物質又は標識物質に結合する抗体を固相してもよい。これにより標識物質が標識物質乾燥パッドから捕捉物質が結合したメンブレン上を流れたことを試験ごとに確認することができる。ろ過の際にフィルターが目詰まりしたり、フィルターに検体試料が吸収されてしまい充分量の検体試料のろ過ができなかったり、アッセイ装置のメンブレンの目詰まりが発生した場合にはhの位置には発色は認められない。iは部材を固定し、強度を増すためのプラスチック製バッキングシートである。jはサンプル滴下パッドの一部、標識物質乾燥パッド、サンプル吸収パッド及びメンブレンを被覆する透明プラスチックラミネートである。   1 is a plan view of the apparatus, and FIG. 2 is a cut end surface taken along the line I-I ′ of FIG. 1. In FIGS. 1 and 2, a is a sample dropping pad installed to drop the prepared specimen sample. b is a labeling substance drying pad on which the labeling substance is dried and held. c is a sample absorption pad for absorbing the dropped solution. d is a membrane to which a capture substance that specifically binds to the detection target is bound, and e, f, and g are positions on the d where the capture substance that specifically binds to the detection target is bound in a line. Show. Further, a substance capable of binding the labeling substance to a position h downstream of the position where the capture substance is bound, for example, a substance having reactivity equivalent to the detection target or an antibody binding to the labeling substance may be solid-phased. Good. Thus, it can be confirmed for each test that the labeling substance flows from the labeling substance drying pad on the membrane to which the trapping substance is bound. If the filter is clogged during filtration, the sample sample is absorbed by the filter and a sufficient amount of sample sample cannot be filtered, or the membrane of the assay device is clogged, the h position is Color development is not recognized. i is a plastic backing sheet for fixing members and increasing strength. j is a transparent plastic laminate covering a part of the sample dropping pad, the labeling substance drying pad, the sample absorbing pad, and the membrane.

メンブレンアッセイ装置中のメンブレンとしては、紙やニトロセルロースなどの多孔質物質、又は繊維状マトリクス、薄層クロマトグラフに用いられるシリカ、微細顆粒セルロース、ナイロン6,6などの担体からできたメンブレンを挙げることができる。感度・特異性が高いラテラルフロー式メンブレンアッセイを行うために好ましい多孔質物質としては、微多孔質セルロースエステル、たとえばアルカンカルボン酸などの脂肪族カルボン酸とのセルロースエステルが挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質が挙げられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブレンの平均孔径は0.5〜15μmが用いられることが多い。   Examples of the membrane in the membrane assay apparatus include porous materials such as paper and nitrocellulose, or membranes made of a carrier such as a fibrous matrix, silica used for thin layer chromatography, fine granular cellulose, nylon 6,6, and the like. be able to. Preferred porous materials for conducting a lateral flow membrane assay with high sensitivity and specificity include microporous cellulose esters, for example, cellulose esters with aliphatic carboxylic acids such as alkane carboxylic acids, particularly preferably nitro Examples include microporous materials made from cellulose. Moreover, the mixture of the said cellulose ester and nitrocellulose can also be used suitably. The average pore diameter of the membrane is often 0.5 to 15 μm.

以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
(1)ウイルスや細菌等に感染した疑いがある患者の咽頭、鼻腔あるいは直腸等から綿棒等の検体採取器具を用いて直接採取した検体試料を、後述するような検体浮遊液に浮遊させる。あるいは患者から採取した鼻腔吸引液、尿、便等の被分析対象物から綿棒等の検体採取器具を用いて採取した検体試料を、後述するような検体浮遊液に浮遊させる。
Below, an example of a more specific procedure is shown about the method of this invention, and this invention is demonstrated.
(1) A sample sample collected directly from a pharynx, nasal cavity, rectum or the like of a patient suspected of being infected with a virus or bacteria using a sample collection device such as a cotton swab is suspended in a sample suspension as described later. Alternatively, a specimen sample collected from a subject to be analyzed such as a nasal aspirate, urine, or feces collected from a patient by using a specimen collection device such as a cotton swab is suspended in a specimen suspension as described later.

(2)この浮遊液を、ろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ中に入れてろ過する。 (2) The suspended liquid is filtered in a specimen sample filtration tube equipped with a filtration filter.

(3)このろ過液を、メンブレンを備えたアッセイ装置中の被検出物に特異的に結合して被検出物を捕捉する捕捉試薬が結合したメンブレンに滴下等により添加して、被検出物をメンブレン上に捕捉させる。この際、ろ過液をサンプル滴下パッドに滴下することにより、毛細管現象により被検出物がメンブレンに流れていく。 (3) Add this filtrate by dropping or the like to a membrane bound with a capture reagent that specifically binds to the analyte in the assay device equipped with the membrane and captures the analyte. Capture on membrane. At this time, by dropping the filtrate onto the sample dropping pad, the detection object flows through the membrane by capillary action.

(4)前記メンブレン上に、被検出物に特異的に結合する検出試薬である標識物質を滴下等により添加し、捕捉試薬/被検出物/標識物質の複合体を形成させる。この際、標識物質はあらかじめアッセイ装置に組み込んでおいてもよい。この場合、検体試料を含む浮遊液をアッセイ装置に添加することにより、該浮遊液がアッセイ装置上を流れ、検出試薬を含むパッド部分に到達すると、検出試薬が前記浮遊液に溶解し、被検体とともにメンブレンに到達し、メンブレンの捕捉試薬との間で複合体を形成する。 (4) A labeling substance, which is a detection reagent that specifically binds to the object to be detected, is added onto the membrane by dropping or the like to form a capture reagent / object to be detected / labeled substance complex. At this time, the labeling substance may be incorporated in the assay device in advance. In this case, by adding the suspension liquid containing the specimen sample to the assay apparatus, when the suspension liquid flows on the assay apparatus and reaches the pad portion containing the detection reagent, the detection reagent dissolves in the suspension liquid, and the analyte At the same time, it reaches the membrane and forms a complex with the capture reagent of the membrane.

(5)前記複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被検出物の有無を測定する。複合体の存在の検出の前に、必要に応じて反応停止液を用いて反応を停止させてもよい。 (5) The presence or absence of an object to be detected in the specimen sample is measured by detecting the presence of the complex with the labeling substance in the complex. Prior to detecting the presence of the complex, the reaction may be stopped using a reaction stop solution, if necessary.

(検体採取器具)
検体採取するための器具としては、綿棒、白金耳、スポイト又はさじ形状の用具等を用いることができる。特に人体を被験体とし、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、肺胞洗浄液、便懸濁液又は直腸拭い液を検体とする場合は、検体採取器具として主として綿棒を用いることが多い。
(Sample collection device)
As an instrument for collecting the specimen, a cotton swab, platinum ear, dropper, spoon tool or the like can be used. In particular, when a human body is a subject and a nasal swab, nasal aspirate, throat swab, alveolar lavage, stool suspension or rectal wiping fluid is used as a specimen, a cotton swab is mainly used as a specimen collection device.

従来使用されている綿棒は図3に示すように、検体採取部分k1は軸部lの片方の先端にある頭部mに綿を巻き付けた綿球から形成される。この従来の綿棒は検体を採集した後に綿棒から放出し試験に供するという本来の検体採取器具の目的を考慮すると、必要以上に綿を要し、綿の深部まで検体が入り込みそこに保持され、次の検体を放出する工程において検体中の被検出物が十分に放出されないという問題がある。   As shown in FIG. 3, a conventionally used cotton swab is formed by a cotton ball in which a sample collection portion k1 is wound around a head m at one end of a shaft portion l. Considering the purpose of the original sample collection device, which collects the sample and then releases it from the swab for use in the test, this conventional swab requires more cotton than necessary, and the sample enters the deep part of the cotton and is held there. In the step of releasing the specimen, there is a problem that the object to be detected in the specimen is not sufficiently released.

最近、天然物又は人工物でできた繊維がブラシ状に配置され、毛細管現象を利用し液体を採取する新しい方式の綿棒が市販されており、ブラシ状綿棒と呼ばれる。該ブラシ状綿棒は、以下の理由により本発明に特に好適に使用することができる。ブラシ状綿棒は、例えばフロック加工と呼ばれる、短く切った繊維(フロック)を、静電気により接着剤を塗布した綿棒の柄に付着させる方法により作製することができる。また、この方式の綿棒では、液体中の溶解物や混合物である固体や粘性物質も採取可能であり、この場合毛細管現象だけではなく、固体や粘性物質が本発明に器具の被分析試料採取部位に吸着等により結合することを利用して採取する。従来の綿棒と比較して表面積が大幅に増えるので、それだけ検体の採取量が大きく、検体中の被検出物をより多く吸着することが可能である。また浮遊液に浮遊させる際にも従来の綿棒とは異なり、浮遊液は容易に繊維間に入り込むことができるため、被検出物が放出されやすく、効率的に被検出物を浮遊液中に回収することができる。   Recently, a new type of cotton swab in which fibers made of natural products or artificial products are arranged in a brush shape and liquid is collected using capillary action is commercially available and is called a brush-like swab. The brush-like swab can be particularly preferably used in the present invention for the following reasons. The brush-like swab can be produced by, for example, a method called flocking, in which short cut fibers (floc) are attached to the handle of a swab to which an adhesive is applied by static electricity. Also, with this type of swab, it is possible to collect a solid or viscous substance that is a dissolved or mixed material in a liquid. In this case, not only the capillary phenomenon but also a solid or viscous substance is collected in the sample collection site of the instrument in the present invention. It is collected by using the binding by adsorption. Since the surface area is greatly increased as compared with a conventional cotton swab, the amount of sample collected is large, and more objects to be detected in the sample can be adsorbed. In addition, when suspended in suspended liquid, unlike conventional cotton swabs, suspended liquid can easily enter between fibers, so that the detected object is easily released and the detected object is efficiently collected in the suspended liquid. can do.

図4にブラシ状綿棒の1例を示す。軸部lの片方の先端の頭部mの表面に繊維をブラシ状に配置した検体採取部分k2を備える。軸部l及び頭部mの材質に特に限定はないが、検体採取部位k2よりは液体吸収性に劣り、適度な硬度かつ適度な柔軟性を備えた物質がふさわしい。木、プラスチック、ウレタン樹脂、紙、金属等の成型物が好ましく、それら材料の混合物の成型品でもかまわない。硬度、柔軟性や液体吸収性等の調整を目的として、必要に応じて薬品等で処理してもかまわない。軸部lと頭部mは別々の材料から作られていてもかまわないし、同じ材料から作られていてもかまわない。また、別成型としてもよいし、一体成型としてもかまわない。検体採取部位k2を構成する繊維の材質に特に限定はないが、例えば細い繊維がより合わされ、織られ、編まれ、あるいは集合体として形成された物が利用でき、例えば布、織物、不織物、綿花状の物、海綿状の物が利用できる。材料は天然物、人工物いずれも利用でき、綿花や絹等の天然物や脱脂綿等の天然物の加工物、天然物の薬品処理物、ナイロン繊維等の人工物が利用できる。いずれの材料も組合せ又は層状に重ねて使用することもできる。細い繊維はブラシ状に配置され、軸部の軸中心に向かって実質的に垂直方向に配置されるのが好ましい。ブラシ状に配置された繊維部分は、毛細管現象により液体を吸収・保持し得る。ブラシ状の繊維部分の厚さは、適宜選択することができるが、0.5〜5mm、好ましくは1〜2mm程度である。毛細管現象を利用し液体を採取するブラシ状繊維部分、軸部及び頭部は軸部の中心軸に対して通常は対象な形状であり、軸方向に対する垂直断面は軸を中心に円形であるが、必要に応じて形状を変えてもかまないし、毛細管現象を利用し液体を採取するブラシ状繊維部分を選択的に配置してもかまわない。ブラシ状に配置された繊維は、軸部の軸中心に向かって実質的に垂直方向に配置されるのが好ましい。繊維の太さ及び配置密度はその目的、材質に応じて適宜選択することができるが、繊度は1.0〜4.0dtexが好ましい。   FIG. 4 shows an example of a brush-like swab. A specimen collection portion k2 in which fibers are arranged in a brush shape on the surface of the head m at one end of the shaft portion l is provided. There are no particular limitations on the material of the shaft portion l and the head portion m, but a substance that is inferior in liquid absorptivity than the specimen collection portion k2 and has appropriate hardness and appropriate flexibility is suitable. A molded product of wood, plastic, urethane resin, paper, metal, or the like is preferable, and a molded product of a mixture of these materials may be used. For the purpose of adjusting the hardness, flexibility, liquid absorbency, etc., it may be treated with chemicals as necessary. The shaft portion l and the head portion m may be made of different materials or may be made of the same material. Moreover, it is good also as separate molding and it does not matter even as integral molding. There is no particular limitation on the material of the fibers constituting the specimen collection site k2, but for example, a material in which fine fibers are combined, woven, knitted, or formed as an aggregate can be used, for example, cloth, woven fabric, non-woven fabric, Cotton-like and sponge-like items can be used. Natural materials and artificial materials can be used, and natural products such as cotton and silk, processed products of natural products such as absorbent cotton, chemical processed products of natural products, and artificial products such as nylon fibers can be used. Any material can be used in combination or in layers. It is preferable that the fine fibers are arranged in a brush shape and are arranged in a substantially vertical direction toward the axial center of the shaft portion. The fiber portion arranged in a brush shape can absorb and hold the liquid by capillary action. The thickness of the brush-like fiber portion can be appropriately selected, but is about 0.5 to 5 mm, preferably about 1 to 2 mm. The brush-like fiber part that collects liquid by utilizing capillary action, the shaft part and the head part are usually the target shape with respect to the central axis of the shaft part, and the vertical cross section with respect to the axial direction is circular around the axis. The shape may be changed as necessary, or a brush-like fiber portion that collects liquid using capillary action may be selectively disposed. The fibers arranged in a brush shape are preferably arranged in a substantially vertical direction toward the axis center of the shaft portion. The thickness and arrangement density of the fibers can be appropriately selected according to the purpose and material, but the fineness is preferably 1.0 to 4.0 dtex.

(ろ過フィルター)
本発明の方法において、患者から採取した検体は検体浮遊液に浮遊させて検体試料とした後、アッセイ装置中のメンブレンの目詰まりや偽陽性を防止するために、ろ過フィルターを用いてろ過される。特に検体採取器具としてブラシ状綿棒を用いた場合、通常の綿棒を用いた場合よりも多くの被検出物を採取することが可能であるが、同時に検体採取部位から剥落した細胞や分泌物、排泄物の成分等もより多く採取するため、メンブレンの目詰まりや偽陽性もより発生しやすい。したがってろ過工程の重要性もより高くなる。ろ過フィルターはメンブレンの目詰まりや偽陽性及びろ過フィルター自身の目詰まりを防ぐため、1種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良いが、本発明においては、少なくとも1種の強剛性フィルターを含むことが必要である。
(Filtration filter)
In the method of the present invention, a specimen collected from a patient is suspended in a specimen suspension and used as a specimen sample, and then filtered using a filtration filter to prevent clogging or false positives of the membrane in the assay device. . In particular, when a brush-like swab is used as a specimen collection device, it is possible to collect more detection objects than when using a normal swab, but at the same time cells, secretions and excretion that have fallen from the specimen collection site. Since more components are collected, membrane clogging and false positives are more likely to occur. Therefore, the importance of the filtration process becomes higher. In order to prevent clogging and false positives of the membrane and clogging of the filtration filter itself, the filtration filter may be combined not only with one type but also with several different materials, those with different pore diameters or retained particle diameters. In the invention, it is necessary to include at least one type of rigid filter.

ここに言う強剛性フィルターとは外部からの力に対して変形しにくいフィルターをいう。
ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液をメンブレンアッセイ装置中のメンブレンに滴下する際に、フィルターはろ過チューブ内の検体試料等の液体や空気の圧力を受ける。このとき、フィルターの厚さ方向の潰れや湾曲等の変形が発生する可能性があるが、これらの現象はフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ、フィルター自身が目詰まりする原因となる。本発明に用いる強剛性フィルターは、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けた強剛性フィルターを含むろ過フィルターを通してろ過し、ろ液をメンブレンアッセイ装置中のメンブレンに滴下する際に、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているフィルターをいう。別の表現をすれば、ろ液の圧力によってもフィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えたフィルターのことをいう。
The rigid filter mentioned here refers to a filter that is not easily deformed by an external force.
Place the specimen sample suspended in the specimen suspension in the filtration tube, filter through a filtration filter including a rigid filter attached to the tip, and filter the filtrate when dropping the filtrate onto the membrane in the membrane assay device. Receives the pressure of liquid or air such as the specimen sample in the tube. At this time, the filter may be crushed or deformed in the thickness direction, but these phenomena block the flow path of the filtrate inside the filter and cause the filter itself to be clogged. The rigid filter used in the present invention is a method in which a specimen sample suspended in a specimen suspension is placed in a filtration tube and filtered through a filtration filter including a rigid filter attached to the tip, and the filtrate is passed through a membrane in a membrane assay device. It refers to a filter having rigidity that is difficult to be crushed in the thickness direction of the filter when it is dropped onto the filter or to be deformed such as curved. In other words, it refers to a filter having rigidity that makes it difficult to block the flow path of the filtrate inside the filter even by the pressure of the filtrate.

強剛性フィルターは変形しにくいため、目詰まりが起こりにくい。さらに積層したり、あるいは厚さを数mm〜数cm程度に厚く加工することができるため、それにより有効ろ過面積が大きくできることも目詰まりが起こりにくい要因である。本発明においては、そのような変形が生じないような強剛性フィルターを含むことが必要である。   The rigid filter is not easily deformed, so clogging is unlikely to occur. Further, since it can be laminated or processed to a thickness of about several millimeters to several centimeters, the fact that the effective filtration area can be increased is also a factor that prevents clogging. In the present invention, it is necessary to include a strong filter that does not cause such deformation.

フィルターの厚さ方向に潰れにくい剛性を備えているとは、例えば、検体試料をろ過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が0.2[MPa]を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が5%以上とならず、好ましくは2%以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかってもろ過時のフィルターの曲率半径が2cm以下とならないことをいう。   For example, even if the pressure applied to the filter by liquid or air when the specimen sample is filtered exceeds 0.2 [MPa], the thickness at the time of pre-filtration vs. filtration The amount of change in thickness does not exceed 5%, preferably 2% or more, and is rigid enough to prevent deformation such as bending. This means that the radius of curvature is not less than 2cm.

強剛性フィルターとしては各種の金属繊維をワインドしたもの、金属繊維の不織布を用いたもの、プラスチックスを発泡させたもの、金属メッシュを層状に重ね合わせたもの、金属、プラスチックス、セラミック等の粉末や金属繊維を熱や圧力で接着した焼結フィルターが挙げられ、いずれも本発明において使用可能である。   As the strong filter, various metal fibers are wound, metal fiber nonwoven fabrics are used, plastics are foamed, metal mesh is laminated in layers, metal, plastics, ceramic powder, etc. And sintered filters in which metal fibers are bonded with heat or pressure, and any of them can be used in the present invention.

焼結フィルターは、金属、セラミック、プラスチック等の粉末粒子や金属繊維を熱及び圧力により直接接着し(焼結)製造されるフィルターである。強剛性フィルターの中でも焼結フィルターは、1)安価である、2)粒子の大きさにより孔径を制御することが可能である、3)大量製造に向く、4)生体物質との親和性が低いため被検出物を特異的に結合しない、5)液体中の水分の吸収がほとんどない、6)粒子の大きさにより様々な孔径のものを作製できる、という特徴を有するので、生体物質を含む検体試料のろ過に好ましい。   The sintered filter is a filter that is manufactured by directly bonding (sintering) powder particles such as metal, ceramic, plastic, and metal fibers by heat and pressure. Among strong filters, sintered filters are 1) inexpensive, 2) pore size can be controlled by particle size, 3) suitable for mass production, and 4) low affinity with biological materials. Therefore, it does not specifically bind an object to be detected, 5) hardly absorbs moisture in the liquid, and 6) it can be produced with various pore sizes depending on the size of the particle, so that it contains a biological substance. Preferred for sample filtration.

焼結フィルターの素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン(低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン)、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂、アルミナ、ジルコニア、ケイ素、ケイ素四フッ化エチレン重合体、ステンレス鋼等を挙げることができるが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の樹脂を用いたものが加工性の面から好ましい。   Materials for the sintered filter include polypropylene, polyethylene (low density polyethylene, high density polyethylene, ultra high molecular weight polyethylene), polystyrene, polymethyl methacrylate resin, alumina, zirconia, silicon, silicon tetrafluoroethylene polymer, stainless steel Although steel etc. can be mentioned, the thing using resin, such as a polypropylene, polyethylene, a polystyrene, a polymethylmethacrylate, is preferable from the surface of workability.

試料ろ過フィルターは、2種類以上の強剛性フィルターを組み合わせて作製してもよい。また、強剛性フィルターと強剛性フィルター以外のフィルターと組み合わせてもよい。   The sample filtration filter may be produced by combining two or more types of strong rigidity filters. Moreover, you may combine with filters other than a rigid filter and a rigid filter.

強剛性フィルターは精密ろ過用としても、粗ろ過用としても用いることができるが、少なくとも1種類の強剛性フィルターの孔径又は保留粒子径はメンブレンの孔径以上であり、200μm以下が好ましい。   Although the rigid filter can be used for both fine filtration and coarse filtration, the pore diameter or retained particle diameter of at least one kind of rigid filter is not less than the pore diameter of the membrane, and preferably not more than 200 μm.

例えば、ポリプロピレン製強剛性フィルターの孔径は50〜200μm、低密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は30〜70μm、高密度ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は10〜50μm、超高分子量ポリエチレン製強剛性フィルターの孔径は10〜20μm、ポリスチレン製強剛性フィルターの孔径は100〜200μm、四フッ化エチレン重合体製強剛性フィルターの孔径は30〜100μmである。素材及び/孔径の異なる複数の強剛性フィルターを組合せて用いてもよい。   For example, a polypropylene rigid filter has a pore size of 50 to 200 μm, a low density polyethylene rigid filter has a pore size of 30 to 70 μm, a high density polyethylene rigid filter has a pore size of 10 to 50 μm, and an ultrahigh molecular weight polyethylene rigid filter The pore size of the polystyrene rigid filter is 100 to 200 μm, and the pore size of the tetrafluoroethylene polymer strong filter is 30 to 100 μm. A plurality of strong rigidity filters having different materials and / or hole diameters may be used in combination.

精密ろ過用フィルターとして例えば膜状のフィルターを用いることができ、その材質はセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、ニトロセルロース、セルロースエステル、ニトロセルロースとセルロースエステルの混合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン6,6、ポリエステル、コットン、ステンレススチール繊維等の中から好適なものを適宜選択することができるが、被検出物を結合させず、検体浮遊液の吸収量が多くないものにすることが必要である。   For example, a membrane filter can be used as a filter for microfiltration. The material is cellulose, glass fiber, silica fiber, nitrocellulose, cellulose ester, a mixture of nitrocellulose and cellulose ester, polyethersulfone, polysulfone, tetrafluoride. A suitable one can be appropriately selected from among ethylene resin, vinylidene fluoride resin, polycarbonate, polypropylene, polyamide, nylon 6,6, polyester, cotton, stainless steel fiber, etc. It is necessary to make the amount of the sample suspension absorbed less.

ろ過フィルターを構成するフィルターの中で最小の孔径又は保留粒子径を有するフィルターの最小の孔径又は保留粒子径がメンブレンの孔径以下であることが好ましい。すなわち、例えば用いるメンブレンの孔径が10μm以上の場合、ろ過フィルターの少なくとも1つは、孔径10μm以下であることが好ましい。   It is preferable that the minimum pore diameter or the retained particle diameter of the filter having the smallest pore diameter or the retained particle diameter among the filters constituting the filtration filter is not more than the pore diameter of the membrane. That is, for example, when the pore diameter of the membrane to be used is 10 μm or more, it is preferable that at least one of the filtration filters has a pore diameter of 10 μm or less.

強剛性フィルター及び強剛性フィルター以外の別の種類のフィルター(以下、非強剛性フィルターということがある)の組合せ方は、例えば、フィルターを2つ用いる場合、フィルターを後記のろ過チューブのろ過用ノズルの底面から1段目フィルター、2段目フィルターとすると(この場合、最初に検体試料と接触するのは、1段目フィルターであり、検体試料は1段目フィルターを通過して、アッセイ装置に添加される)、1段目フィルターと2段目フィルターの組合せとして、強剛性フィルターと強剛性フィルター、強剛性フィルターと非強剛性フィルターの組合せがある。なお、ノズル先端部に近いフィルターを下流側フィルターと呼び、より早く検体試料に接触するフィルターを上流側フィルターと呼ぶことがある。フィルターを組合せる場合、孔径が異なるフィルターを組合せることが好ましく、2種類のフィルターのうち、少なくとも1つは孔径がメンブレンフィルターの孔径より小さいことが好ましい。強剛性フィルターはいずれもフィルターの表面だけでなく、その内部でも混入物をトラップするため、ある程度の厚さが必要である。必要な厚みは混入物の量やフィルターの孔径や大きさにより当然異なるが、一般に簡易メンブレンアッセイに必要な検体試料100〜2000μlを直径が5〜20mm程度の試料ろ過フィルターでろ過する場合、強剛性フィルター又は非強剛性フィルターの厚さは、限定されないが、好ましくは、0.5mm〜7mm、さらに好ましくは1mm〜5mmである。また、試料ろ過フィルターの厚さの合計は2mm〜10mm程度が好ましい。   For example, when two filters are used in combination with another type of filter other than the strong rigidity filter and the strong rigidity filter (hereinafter sometimes referred to as a non-rigid rigidity filter), the filter is a filtration nozzle for a filtration tube described later. (In this case, the first-stage filter is the first-stage filter that contacts the specimen sample first, and the specimen sample passes through the first-stage filter and enters the assay device.) As a combination of the first stage filter and the second stage filter, there are a combination of a strong filter and a strong filter, and a combination of a strong filter and a non-rigid filter. A filter close to the nozzle tip is sometimes referred to as a downstream filter, and a filter that comes into contact with a specimen sample earlier is sometimes referred to as an upstream filter. When combining the filters, it is preferable to combine filters having different pore diameters, and at least one of the two types of filters preferably has a pore diameter smaller than that of the membrane filter. Since all of the strong filters trap contaminants not only on the filter surface but also inside, a certain thickness is required. The required thickness naturally depends on the amount of contaminants and the pore size and size of the filter, but it is generally rigid when 100 to 2000 μl of a sample sample required for a simple membrane assay is filtered with a sample filtration filter with a diameter of about 5 to 20 mm. The thickness of the filter or the non-rigid filter is not limited, but is preferably 0.5 mm to 7 mm, more preferably 1 mm to 5 mm. The total thickness of the sample filtration filter is preferably about 2 mm to 10 mm.

ろ過フィルターに孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせる場合は、孔径又は保留粒子径の大きなフィルターを上流側に、小さなフィルターを下流側に、両フィルターが重なるように配置することが、ろ過時における検体試料の目詰まりを回避する上で好ましい。例えば、2つのフィルターを組合わせる場合、1段目のフィルターに孔径又は保留粒子径が大きいフィルターを用い、2段目のフィルターに孔径が小さいフィルターを用いることが好ましい。   When combining several filters with different pore diameters or retained particle diameters, it is necessary to place a filter with a large pore diameter or retained particle diameter upstream and a small filter downstream so that both filters overlap. This is preferable in order to avoid clogging of the specimen sample at the time. For example, when two filters are combined, it is preferable to use a filter having a large pore diameter or retained particle diameter as the first-stage filter and a filter having a small pore diameter as the second-stage filter.

用いるフィルターのサイズは、アッセイに用いる検体浮遊液チューブのサイズによるが、例えば、円形で直径0.5〜1.5cmである。   The size of the filter used depends on the size of the specimen suspension tube used in the assay, but is, for example, circular and has a diameter of 0.5 to 1.5 cm.

(検体試料用ろ過チューブ)
上記ろ過フィルターは、本発明の簡易メンブレンアッセイ法又はキットにおいて、検体試料用ろ過チューブの先端に取り付けて使用されることが好ましい。すなわち、ろ過チューブ中に検体浮遊液に浮遊させた検体試料を入れて、先端に取り付けたろ過フィルターを通してろ過し、ろ液をメンブレンアッセイ装置中のメンブレンに滴下する方法が簡便であり、好ましい。このろ過チューブの一実施態様の模式図を図5及び図6に示す。ろ過チューブは例えば図5及び図6に記載されるように先端部(ろ過ノズル)nと本体部pからなる形状であり、先端部の内部に図5に示されるようにろ過フィルターo1〜o3が備えつけられている。図5のろ過ノズルにおいて、図下部がノズル底面であり、ろ過フィルターo1、o2及びo3は、それぞれ3段目フィルター、2段目フィルター及び1段目フィルターである。図6に示すような本体部に検体を浮遊液に浮遊させた調製した検体試料を入れ、ろ過フィルターを備えた先端部を取り付ける。ろ過フィルターを通して検体試料をろ過し、ろ液をメンブレンアッセイ装置に滴下する。本体部がポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)等のフレキシブルな材質からなる場合、ろ過フィルターを取り付け、内部に検体試料を入れた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料をろ過することができるため、好ましい。
(Filtration tube for specimen sample)
In the simple membrane assay method or kit of the present invention, the filtration filter is preferably used by being attached to the tip of a specimen sample filtration tube. That is, a method in which a specimen sample suspended in a specimen suspension is put in a filtration tube, filtered through a filtration filter attached to the tip, and the filtrate is dropped onto a membrane in a membrane assay apparatus is simple and preferable. The schematic diagram of one embodiment of this filtration tube is shown in FIG.5 and FIG.6. For example, as shown in FIG. 5 and FIG. 6, the filtration tube has a shape including a tip portion (filtration nozzle) n and a main body portion p, and the filtration filters o1 to o3 are provided inside the tip portion as shown in FIG. It is provided. In the filtration nozzle of FIG. 5, the lower part of the drawing is the bottom surface of the nozzle, and the filtration filters o1, o2, and o3 are a third-stage filter, a second-stage filter, and a first-stage filter, respectively. A prepared specimen sample in which a specimen is suspended in a suspended liquid is placed in a main body as shown in FIG. 6, and a tip portion equipped with a filtration filter is attached. The specimen sample is filtered through a filtration filter, and the filtrate is dropped onto the membrane assay device. When the main body is made of a flexible material such as polyethylene or polyethylene terephthalate (PET), the sample can be easily removed by attaching a filtration filter and applying pressure by hand with the sample in the sample. Since it can filter, it is preferable.

(被検出物)
本発明でいう被検出物にはインフルエンザウイルス、RSウイルス、アデノウイルス、A群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、下痢症の原因微生物、例えばノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス等の病原微生物若しくは該病原微生物由来のタンパク質等の物質又はそれらに対する抗体、ペプチドホルモン、ステロイド、生理活性アミン類、ビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬、及び病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができる。上記の病原微生物若しくは該病原微生物由来のタンパク質等の物質又はそれらに対する抗体等を非検出物として用いる場合、特にインフルエンザウイルス、RS(Respiratory Syncytial)ウイルス、アデノウイルス、A群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、ロタウイルス及びノロウイルス等のように、大流行し、ごく短時間に特定する必要がある病原体の診断に、極めて有用である。
(Detected object)
Examples of detected substances in the present invention include influenza virus, RS virus, adenovirus, group A streptococcus, pneumonia mycoplasma, pathogenic microorganisms such as norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus, and the like Substances such as proteins derived from pathogenic microorganisms or antibodies to them, peptide hormones, steroids, bioactive amines, vitamins, prostaglandins, tetracycline and other antibiotics, toxins produced by bacteria, various tumor markers, pesticides And nucleotides complementary to a nucleic acid component derived from a pathogenic microorganism. When the above pathogenic microorganisms or substances such as proteins derived from the pathogenic microorganisms or antibodies against them are used as non-detected substances, in particular, influenza virus, RS (Respiratory Syncytial) virus, adenovirus, group A streptococcus, pneumonia mycoplasma, rotavirus In addition, it is extremely useful for diagnosis of pathogens such as Norovirus that are very popular and need to be identified in a very short time.

本発明の検査方法により分析するための検体は、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液、便懸濁液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、髄液、膿、臓器抽出液、各種組織抽出液等の生体試料、食品抽出液、培養上清、上水、下水、湖水、河川水、海水、土壌抽出液、汚泥抽出液を用いることができるがこれらに限定されない。この中でも、特に生体試料を検体とした場合に有用であり、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液又は便懸濁液を検体とした場合に極めて有用である。生体試料はヒト由来であっても、非ヒト動物由来であってもよい。   Samples to be analyzed by the test method of the present invention are pharyngeal wiping fluid, nasal wiping fluid, nasal aspirate, alveolar lavage fluid, stool suspension, plasma, serum, urine, saliva, amniotic fluid, spinal fluid, pus, organ Extracts, biological samples such as various tissue extracts, food extracts, culture supernatants, clean water, sewage, lake water, river water, seawater, soil extracts, and sludge extracts can be used, but are not limited thereto. Among them, it is particularly useful when a biological sample is used as a specimen, and is extremely useful when a pharyngeal wiping liquid, nasal wiping liquid, nasal aspirate, nasal washing liquid, alveolar washing liquid, rectal wiping liquid or stool suspension is used as a specimen. Useful. The biological sample may be derived from a human or a non-human animal.

(捕捉物質)
被検出物を捕捉するための捕捉物質は、被検出物と、抗原抗体反応のような特異的反応により結合して、複合体を形成する物質である。従って、被検出物により使用する捕捉物質が異なることは当然であるが、一般には被検出物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。そのほか、ウイルス抗原、ウイルス中空粒子、遺伝子組換え大腸菌発現タンパク質、遺伝子組換え酵母発現タンパク質等が挙げられる。このような捕捉物質を上述したメンブレン表面に結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、又は化学的な結合によるものであってもよい。固相化は、タンパク質をニトロセルロースメンブレン等の固相に固相化するための公知の方法で行うことができる。捕捉物質が結合したメンブレンの調製は、例えば、捕捉物質を緩衝液等に希釈した溶液をメンブレンに吸着してその後乾燥することにより行われる。補足物質は、例えばライン状に固相化すればよい。
(Capture substance)
The capture substance for capturing the detection target is a substance that binds to the detection target through a specific reaction such as an antigen-antibody reaction to form a complex. Therefore, it is natural that the capture substance to be used differs depending on the object to be detected. However, in general, when the object to be detected is bacteria, viruses, hormones, other clinical markers, etc., they specifically react to bind to them. Polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and the like. In addition, virus antigens, virus hollow particles, recombinant E. coli expressed protein, recombinant yeast expressed protein and the like can be mentioned. As a method for binding such a capturing substance to the above-described membrane surface, physical adsorption may be used, or chemical binding may be used. The immobilization can be performed by a known method for immobilizing a protein on a solid phase such as a nitrocellulose membrane. The membrane to which the capture substance is bound is prepared, for example, by adsorbing a solution obtained by diluting the capture substance in a buffer solution or the like and then drying the membrane. What is necessary is just to solidify a supplementary substance in the shape of a line, for example.

(検体浮遊液)
本発明において、検体浮遊液とは、患者や環境等から採取した被検出物を含む可能性がある検体を浮遊又は懸濁するための溶液であり、該検体を浮遊又は懸濁した浮遊液は検体試料としてアッセイ装置に滴下等により添加されて、アッセイに供される。
(Sample suspension)
In the present invention, the specimen suspension is a solution for suspending or suspending a specimen that may contain an object to be detected collected from a patient or the environment. A sample sample is added to the assay device by dropping or the like and used for the assay.

採取検体には被検出物以外にも様々な物質が含まれている。例えば、病原体感染測定のため、人から検体を採取する際には鼻腔、咽頭又は直腸より綿棒等で採取することが多いが、この検体中には患者由来の組織片や分泌物の他、被検出物である病原体の組織が含まれている場合がある。これらの一部は検体浮遊液中に凝集物として存在し、一部は検体試料中に溶解した状態で存在する。これらを含んだ状態で検体試料をアッセイ装置に添加すると、非特異反応により偽陽性が発生する場合がある。凝集物を除去するためにはアッセイ装置に添加する前にろ過用のメンブレンを通過させてろ過する方法が有効であるが、溶解物の場合、ろ過により除去することはできないので、検体浮遊液の組成を工夫する必要がある。   The collected specimen contains various substances in addition to the object to be detected. For example, when collecting specimens from humans for pathogen infection measurements, they are often collected from the nasal cavity, pharynx, or rectum with a cotton swab, etc., but in this specimen, in addition to patient-derived tissue fragments and secretions, It may contain the pathogen tissue that is detected. Some of these exist as aggregates in the sample suspension, and some exist in a dissolved state in the sample. If the specimen sample is added to the assay device in a state containing these, a false positive may occur due to a non-specific reaction. In order to remove aggregates, a method of filtering through a membrane for filtration before adding to the assay device is effective. However, in the case of lysate, it cannot be removed by filtration. It is necessary to devise the composition.

検体浮遊液には、通常、塩及びpHを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられる。さらに検体浮遊液には特異的な凝集反応を阻害しない範囲で非特異反応を減じる目的で界面活性剤を含有させることが可能である。界面活性剤としては、Triton X-100(商品名):ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Tween 20:ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Tween 80:ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Nonidet P-40:ノニデット P-40、ZWITTERGENT 3-14:n−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネ−ト、CHAPS:3−〔(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等あるいはこれらを2種類以上混合したものを用いることができる。   The specimen suspension usually contains a salt and a buffer for maintaining a constant pH. As the buffer solution, a buffer solution usually used in immunological tests can be used, and examples include Tris buffer solution, phosphate buffer solution, Good's buffer solution and the like. Furthermore, a surfactant can be contained in the specimen suspension for the purpose of reducing nonspecific reactions within a range that does not inhibit specific agglutination reactions. As surfactants, Triton X-100 (trade name): polyethylene glycol mono-р-isooctyl phenyl ether, Tween 20: polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween 80: polyoxyethylene sorbitan monooleate, Nonidet P -40: nonidet P-40, ZWITTERGENT 3-14: n-tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, CHAPS: 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio ] Propanesulfonic acid, sodium dodecyl sulfate (SDS) or the like, or a mixture of two or more of these can be used.

検体浮遊液にはその他、非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等を含有させることも可能である。   In addition, the sample suspension may contain proteins such as bovine serum albumin, immunoglobulin and casein, serum from rabbits and mice, and the like for the purpose of reducing non-specific reactions.

また、例えば、被検出物が細菌のように細胞壁を有し、かつ標識物質や捕捉物質の被検出物への結合部位が細菌の内部にある場合には、検体浮遊液中に検体を浮遊させただけでは結合部位が容易に外部に露出せず、検出・定量ができないことがある。その際にはNaOH等のアルカリ等の添加、中和、又は熱処理等の前処理が必要な場合もある。   In addition, for example, when the detection target has a cell wall like bacteria and the binding site of the labeling substance or capture substance to the detection target is inside the bacteria, the specimen is suspended in the specimen suspension. Only the binding sites are not easily exposed to the outside, and detection / quantification may not be possible. In this case, pretreatment such as addition of alkali such as NaOH, neutralization, or heat treatment may be necessary.

上記のような工夫によっても偽陽性の発生を減じることができるが、完全に防ぐことはできない。   Although the above-mentioned device can reduce the occurrence of false positives, it cannot be completely prevented.

(検出試薬)
本明細書において、検出試薬とは、被検出物に特異的に結合し、被検出物と複合体を形成しうるものである。また、標識物質とは、被検出物と複合体を形成した後に何らかの手段で検出可能なように標識された検出試薬を意味する。例えば、被検出物がウイルス等の抗原物質である場合には、そのウイルスに対する抗体であって、酵素等で標識化された抗体が挙げられる。このように酵素で標識された場合には、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。標識化される前の検出試薬としては、捕捉試薬について述べたものと同じものが挙げられる。また、標識は、酵素、蛍光発光性標識、磁性体標識、放射性同位元素、金コロイド、着色ラテックス等が挙げられる。検出試薬は、検体試料をアッセイ装置に添加した後に、アッセイ装置に添加してもよく、またあらかじめアッセイ装置に組み込んでおいてもよい。検出試薬をアッセイ装置に組み込む場合、例えば、検出試薬を含浸させて乾燥させたパッドをサンプル滴下パッドと捕捉物質を含むメンブレンの間に組み込んでおけばよい。この場合、検体試料を含む浮遊液をアッセイ装置に添加することにより、該浮遊液がアッセイ装置上を流れ、検出試薬を含むパッド部分に到達すると、検出試薬が前記浮遊液に溶解し、被検体とともにメンブレンに到達し、メンブレンの捕捉試薬との間で複合体を形成する。検出試薬を含むパッド部は、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。
(Detection reagent)
In the present specification, the detection reagent is capable of specifically binding to an object to be detected and forming a complex with the object to be detected. The labeling substance means a detection reagent labeled so that it can be detected by some means after forming a complex with an object to be detected. For example, when the object to be detected is an antigenic substance such as a virus, an antibody against the virus and labeled with an enzyme or the like can be used. When labeled with an enzyme in this way, the complex can be detected by adding a substrate of the enzyme that produces a substance detectable by a colorimetric method or a fluorescence method by a reaction catalyzed by the enzyme. It can be carried out. Examples of the detection reagent before labeling are the same as those described for the capture reagent. Examples of the label include an enzyme, a fluorescent label, a magnetic label, a radioisotope, a gold colloid, and a colored latex. The detection reagent may be added to the assay device after the sample sample is added to the assay device, or may be incorporated in the assay device in advance. When the detection reagent is incorporated into the assay device, for example, a pad impregnated with the detection reagent and dried may be incorporated between the sample dropping pad and the membrane containing the capture substance. In this case, by adding the suspension liquid containing the specimen sample to the assay apparatus, when the suspension liquid flows on the assay apparatus and reaches the pad portion containing the detection reagent, the detection reagent dissolves in the suspension liquid, and the analyte At the same time, it reaches the membrane and forms a complex with the capture reagent of the membrane. For the pad portion containing the detection reagent, for example, a nonwoven fabric made of cellulose, glass fiber, or the like is used.

酵素標識を用いる場合には、使用される酵素としては例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース‐6‐リン酸脱水素酵素が挙げられる。   When an enzyme label is used, examples of the enzyme used include alkaline phosphatase, peroxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase.

標識物質の標識として酵素標識を用いた場合には、通常その酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものを添加する。具体例としては、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸(BCIP)/ニトロテトラゾリウムブルー(NBT)、テトラメチルベンチジン(TMB)、グルコース‐6‐リン酸NAD+が挙げられる。   When an enzyme label is used as a label for a labeling substance, a substrate that is usually a substrate for the enzyme and generates a substance detectable by a colorimetric method or a fluorescence method by a reaction catalyzed by the enzyme is added. . Specific examples include 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) / nitrotetrazolium blue (NBT), tetramethylbenzidine (TMB), and glucose-6-phosphate NAD +.

(反応停止液)
本発明のキットにはさらに必要により、例えば酵素と基質との反応を停止させるための反応停止液が含まれていてもよい。このような反応停止液としては、例えば、クエン酸、硫酸等が挙げられる。
(Reaction stop solution)
The kit of the present invention may further contain a reaction stop solution for stopping the reaction between the enzyme and the substrate, for example, if necessary. Examples of such a reaction stop solution include citric acid and sulfuric acid.

本発明の装置は、吸収パッド部を備えていてもよい。吸収パッド部は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの一端に設けられデバイスを展開する液体を吸収することによりメンブレン上の液体の流れを促進する。吸収パッド部は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜15mm×10mm〜40mm、厚さ0.5mm〜3mm程度である。   The device of the present invention may include an absorbent pad portion. The absorption pad portion is provided at one end of the enzyme immunoassay device of the present invention, and promotes the flow of the liquid on the membrane by absorbing the liquid developing the device. The absorbent pad portion is made of a water-absorbing material so that a large amount of liquid can be absorbed. For example, a nonwoven fabric made of cellulose, glass fiber, or the like is used. The size is not particularly limited, but is usually about 3 mm to 15 mm × 10 mm to 40 mm and a thickness of about 0.5 mm to 3 mm.

(簡易メンブレンアッセイキット)
本発明の簡易メンブレンアッセイキットは、上述した本発明の簡易メンブレンアッセイ法に用いるキットである。本発明の簡易メンブレンアッセイキットは少なくとも以下の(i)及び(ii)を含む。
(i) 強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されるろ過フィルター、及び
(ii) 被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置。
(Simple membrane assay kit)
The simple membrane assay kit of the present invention is a kit used in the above-described simple membrane assay method of the present invention. The simple membrane assay kit of the present invention comprises at least the following (i) and (ii).
(I) An assay device comprising a filtration filter composed of a filter including a rigid filter, and (ii) a membrane bound with a capture substance for capturing an object to be detected.

上記ろ過フィルターは、さらに上述した検体試料用ろ過チューブに取り付けられていることが好ましい。   The filtration filter is preferably attached to the specimen sample filtration tube described above.

キットは必要により綿棒等の検体採取器具を含んでいてもよい。検体採取器具としては、ブラシ状綿棒が好ましい。   The kit may contain a sample collection device such as a cotton swab, if necessary. As the sample collection device, a brush-like swab is preferable.

キットはさらに必要により、検体浮遊液、洗浄液組成物、及び/又は標識物質を含んでいてもよい。洗浄液組成物は、生理食塩水、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等を用いることができ、さらに、塩化ナトリウム、界面活性剤、ウシ血清アルブミン、アジ化ナトリウム等を適宜加えてもよい。また、標識物質の標識が酵素標識である場合には、後述する酵素の基質、反応停止液等を含むことができる。   The kit may further contain a sample suspension, a cleaning solution composition, and / or a labeling substance, if necessary. As the cleaning composition, physiological saline, Tris buffer, phosphate buffer, Good's buffer, etc. can be used, and sodium chloride, surfactant, bovine serum albumin, sodium azide, etc. are added as appropriate. Also good. In addition, when the label of the labeling substance is an enzyme label, it can contain an enzyme substrate, a reaction stop solution, and the like described later.

また、必要に応じて、キットの活性を検査するためのバッファーのみからなる陰性コントロール液、抗原性物質などの被検出物を含むバッファーからなる陽性コントロールを含んでいてもよい。   Further, if necessary, a negative control solution consisting only of a buffer for examining the activity of the kit, and a positive control consisting of a buffer containing an object to be detected such as an antigenic substance may be included.

以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。   The present invention will be specifically described below based on examples of the present invention. The present invention is not limited to the following examples.

[実施例1]ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔吸引液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出1
1.モノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNP(Nucleoprotein;核蛋白)モノクローナル抗体(マウス)の作製
精製A型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。
[Example 1] Detection of influenza virus and RS virus in nasal aspirate by lateral flow immunochromatographic assay 1
1. Production of monoclonal antibody (1) Production of anti-influenza A virus NP (Nucleoprotein; nucleoprotein) monoclonal antibody (mouse) Immunized with purified influenza A virus antigen, and spleen was removed from BALB / c mice maintained for a certain period of time. The cells were fused with mouse myeloma cells (P3 × 63) by the method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975)).

得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。   The obtained fused cells (hybridomas) are maintained in a 37 ° C. incubator, and purification of the cells (monocloning) is performed while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an influenza A virus NP antigen solid phase plate. went.

取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、2種類の精製抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体を得た。   The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by affinity purification using Protein A column chromatography (Amersham) to obtain two types of purified anti-influenza A virus NP monoclonal antibodies.

(2)抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体(マウス)
精製B型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)は、37℃下にてインキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスNP抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)によってIgGを精製し、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体を得た。
(2) Anti-influenza B virus NP monoclonal antibody (mouse)
The spleen was excised from BALB / c mice that had been immunized with purified influenza B virus antigen and maintained for a certain period of time, and the mouse myeloma was prepared by the method of Keller et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975). Fused with cells (P3x63). The obtained fused cells (hybridomas) are maintained in an incubator at 37 ° C., and cell purification is performed while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an influenza B virus NP antigen solid phase plate (monoclonal clone). ). The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by Protein A column chromatography (Amersham) to obtain two types of purified anti-influenza B virus NP monoclonal antibodies.

(3)RSウイルスFPモノクローナル抗体(マウス)
ヒトRSウイルスのFP(Fusion Protein)のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチドを免役し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。
(3) RS virus FP monoclonal antibody (mouse)
A spleen was excised from a BALB / c mouse that had been immunized with a polypeptide obtained by synthesizing a part of the amino acid sequence of FP (Fusion Protein) of human RS virus, and the method of Keller et al., Nature, vol, 256, p495-497 (1975)) and fused with mouse myeloma cells (P3 × 63).

得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、RSウイルスFP抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。   The obtained fused cells (hybridoma) were maintained in a 37 ° C. incubator, and the cells were purified (monocloned) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an RS virus FP antigen solid phase plate. .

取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、2種類の精製抗RSウイルスFPモノクローナル抗体を得た。   The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by affinity purification using Protein A column chromatography (Amersham) to obtain two types of purified anti-RS virus FP monoclonal antibodies.

2.標識抗インフルエンザウイルス抗体(標識物質)の作製
(1)ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウイルス抗体の調製
抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち1種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate;同仁化学社)緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)%赤色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基;Magsphere社)と液量比40:1になるように混合し、反応させた。次に、1(W/V)%のEDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mMTris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン), 0.4Mトレハロース, 0.2(V/V)% TritonX-100)20mL中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
2. Preparation of labeled anti-influenza virus antibody (labeling substance) (1) Preparation of latex particle-labeled anti-influenza A virus antibody One type of anti-influenza A virus NP monoclonal antibody is 50 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate) After dialysis with a buffer solution (pH 6.0), 10 mL of a solution diluted with the same buffer solution was prepared so that OD 280 nm = 0.5. Next, mixed with 10 (W / V)% red polystyrene latex particles (particle size 0.45μm, surface functional group is carboxyl group, functional group density 65Å 2 / COOH group; Magsphere) so that the liquid volume ratio is 40: 1. And reacted. Next, 1 (W / V)% EDAC (N- (3-Dimethlaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma) was added to a final concentration of 0.1%, followed by reaction for 2 hours. After washing, it floats in 20mL of the final suspension (5mM Tris, 0.04 (W / V)% BSA (bovine serum albumin), 0.4M trehalose, 0.2 (V / V)% TritonX-100). The latex particles were dispersed.

(2)ラテックス粒子標識抗B型インフルエンザウイルス抗体の調製
抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち1種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate;同仁化学社)緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)%青色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.45μm, 表面官能基はカルボキシル基, 官能基密度65Å2/COOH基;Magsphere社)と液量比40:1になるように混合し、反応させた。次に、1(W/V)%のEDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mMTris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン), 0.4Mトレハロース,0.2(V/V)% TritonX-100)20mL中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
(2) Preparation of latex particle-labeled anti-influenza B virus antibody One type of anti-influenza B virus NP monoclonal antibody was prepared in a 50 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate) buffer solution (pH 6.0). After dialysis, 10 mL of a solution diluted with the same buffer was prepared so that OD 280nm = 0.5. Then 10 (W / V)% blue polystyrene latex particles (particle size 0.45 [mu] m, the surface functional group is a carboxyl group, a functional group density 65 Å 2 / COOH group; Magsphere Co.) and liquid volume ratio of 40: mixed at a 1 And reacted. Next, 1 (W / V)% EDAC (N- (3-Dimethlaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma) was added to a final concentration of 0.1%, followed by reaction for 2 hours. After washing, the sample was suspended in 20 mL of the final suspension (5 mM Tris, 0.04 (W / V)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (V / V)% TritonX-100), and an ultrasonic dispersion device (Olympus) The latex particles were dispersed.

(3)ラテックス粒子標識抗RSウイルス抗体の調製
抗RSウイルスFPモノクローナル抗体のうち1種類を50mM MES緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)%緑色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.49μm, 表面官能基はカルボキシル基, 官能基密度69Å2/COOH基;メルク社)と液量比40:1になるように混合し、反応させた。次に、1(W/V)%のEDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mMTris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン), 0.4Mトレハロース,0.2(V/V)% TritonX-100)20mL中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
(3) Preparation of latex particle-labeled anti-RS virus antibody One type of anti-RS virus FP monoclonal antibody was dialyzed with 50 mM MES buffer solution (pH 6.0) and diluted with the same buffer solution so that OD280nm = 0.5. 10 mL of the solution was prepared. Then 10 (W / V)% green polystyrene latex particles (particle size 0.49 .mu.m, the surface functional group is a carboxyl group, a functional group density 69 Å 2 / COOH group; Merck) and liquid volume ratio of 40: mixed at a 1 And reacted. Next, 1 (W / V)% EDAC (N- (3-Dimethlaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma) was added to a final concentration of 0.1%, followed by reaction for 2 hours. After washing, the sample was suspended in 20 mL of the final suspension (5 mM Tris, 0.04 (W / V)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (V / V)% TritonX-100), and an ultrasonic dispersion device (Olympus) The latex particles were dispersed.

3.ラテックス粒子標識抗体の乾燥化
(1)ラテックス粒子標識抗体の混合
上記2.(1)、(2)及び(3)で作製したラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウイルス抗体、ラテックス粒子標識抗B型インフルエンザウイルス抗体及びラテックス粒子標識抗RSウイルス抗体をラテックス濃度がそれぞれ0.3(W/V)%になるように、上記2.(1)記載の最終浮遊液で希釈後、室温下にて150rpmで5分間撹拌して等量混合した。
3. 2. Drying of latex particle labeled antibody (1) Mixing of latex particle labeled antibody The latex concentration of the latex particle-labeled anti-type A influenza virus antibody, latex particle-labeled anti-type B influenza virus antibody and latex particle-labeled anti-RS virus antibody prepared in (1), (2) and (3) is 0.3 (W / V)%, so that 2. (1) After dilution with the final suspension described above, the mixture was stirred at 150 rpm for 5 minutes at room temperature and mixed in equal amounts.

(2)ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
3.(1)で作製したラテックス粒子標識抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて8μL/cmの塗布量でリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を1分間吹きつけて乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製した。
(2) Production of latex particle-labeled antibody dry pad The latex particle-labeled antibody prepared in (1) was sprayed on the entire surface of a cellulose nonwoven fabric having a width of 15 mm wound in a reel shape at a coating amount of 8 μL / cm using a positive pressure spray device (BioJet; BioDot). After spraying, warm air of 50 ° C. was blown for 1 minute to dry, thereby preparing a latex particle-labeled antibody drying pad.

4.メンブレン固相用抗体の調製
(1)固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体の調製
上記1.(1)で作製した精製抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液(10mM Tris-HCl(pH7.5))に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=4.0になるように固相液で希釈して固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体を調製した。
4). Preparation of antibody for membrane solid phase (1) Preparation of anti-influenza A virus antibody for solid phase The purified anti-influenza A virus NP monoclonal antibody prepared in (1), which was not used for labeling, was dialyzed against a solid phase solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5)), and 0.22 μm filtered after dialysis. The solution was diluted with a solid phase solution so that OD 280 nm = 4.0, and an anti-influenza A virus antibody for solid phase was prepared.

(2)固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体の調製
上記1.(2)で作製した精製抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液(10mM Tris-HCl(pH7.5))に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=3.0になるように固相液で希釈して固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体を調製した。
(2) Preparation of anti-influenza B virus antibody for solid phase The purified anti-influenza B virus NP monoclonal antibody prepared in (2), which was not used for labeling, was dialyzed against a solid phase solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5)), and 0.22 μm filtered after dialysis. The solution was diluted with a solid phase solution so that OD 280nm = 3.0, and an anti-type B influenza virus antibody for solid phase was prepared.

(3)固相用抗RSウイルス抗体の調製
上記1.(3)で作製した精製抗RSウイルスFPモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液(10mM Tris-HCl(pH7.5),1(W/V)%トレハロース)に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=3.0になるように固相液で希釈して固相用抗RSウイルス抗体を調製した。
(3) Preparation of anti-RS virus antibody for solid phase The purified anti-RS virus FP monoclonal antibody prepared in (3), which was not used for labeling, was dialyzed against a solid phase solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 (W / V)% trehalose). After dialysis, 0.22 μm filtration was performed, and dilution with a solid phase solution was performed so that OD 280 nm = 3.0 to prepare an anti-RS virus antibody for solid phase.

5.インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図1及び図2に示すものと同様の構成のものを用いた。
5. Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Influenza and RS Virus A lateral flow membrane assay device for detection of influenza and RS virus was used having the same configuration as that shown in FIGS.

メンブレンは、幅3cm×長さ10cmのニトロセルロースメンブレン(孔径12μm;ワットマン社製)シート(白色)を用いた(図1及び図2のd)。その長軸側の一端(この端を上流端、反対側を下流端とする)から6mm離れたeの位置に固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体を1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、10mm離れたfの位置に固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体を1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、14mm離れたgの位置に固相用抗RSウイルス抗体を1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布した。22mm離れたhの位置に抗マウスIgG抗体をO.D.280nm=1.0に希釈し、1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布した。塗布後、45℃の温風を10分間吹き付けて乾燥した。 The membrane used was a nitrocellulose membrane (pore diameter 12 μm; manufactured by Whatman) sheet (white) having a width of 3 cm and a length of 10 cm (d in FIGS. 1 and 2). A positive pressure spraying device with a coating amount of 1 μL / cm of anti-influenza A virus antibody for solid phase at a position e of 6 mm away from one end of the long axis side (this end is the upstream end and the opposite side is the downstream end) (BioJet; BioDot) was applied in a line, and a positive pressure spraying device (BioJet; BioDot) was applied at a coating amount of 1 μL / cm for anti-influenza B virus antibody for solid phase at a position f 10 mm away. The solid-phase anti-RS virus antibody was applied linearly at a coating amount of 1 μL / cm at a position of 14 mm away using a positive pressure spray device (BioJet; BioDot). The anti-mouse IgG antibody was diluted to OD 280nm = 1.0 at a position h of 22 mm away, and applied in a linear manner using a positive pressure spray device (BioJet; BioDot) at a coating amount of 1 μL / cm. After the application, it was dried by blowing warm air of 45 ° C. for 10 minutes.

次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面(この面を上面とする)の反対側(この面を下面とする)にプラスチック製バッキングシート(BioDot社製)を接着した(図2のi)。   Next, in order to fix the member and increase the strength, a plastic backing sheet (BioDot) is bonded to the opposite side (this surface is the lower surface) of the membrane antibody application surface (this surface is the upper surface). (I in FIG. 2).

次に、上記3(2)で作製したラテックス粒子標識抗体乾燥パッド(図1及び図2のb)を幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が2mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッド(図1及び図2のa)とした。   Next, the latex particle labeled antibody drying pad (b in FIGS. 1 and 2) prepared in 3 (2) above is cut into a width of 15 mm and a length of 10 cm so that the upstream end of the membrane overlaps with the upper surface of the membrane by 2 mm. Place and paste a cellulose filter paper (Wattman) 23 mm wide x 10 cm long on the top of the latex particle-labeled antibody drying pad so as to overlap 13 mm. A).

次に、幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と5mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッド(図1及び図2のc)とした。   Next, cellulose filter paper (Wattman Co., Ltd.) having a width of 30 mm and a length of 10 cm is attached to the upper surface of the membrane so as to overlap the downstream end of the membrane by 5 mm, and a sample absorption pad (FIG. 1 and FIG. 2 c) and did.

次にサンプル滴下パッドの上流端の幅5mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート(Adhesive Research社)で被覆した(図2のj)。   Next, the entire upper surface was covered with a transparent plastic laminate (Adhesive Research) except for a width of 5 mm at the upstream end of the sample dropping pad (j in FIG. 2).

最後に長軸方向に沿って、5mmずつ切断し、図1及び図2に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。   Finally, the membrane assay apparatus shown in FIGS. 1 and 2 was produced by cutting along the long axis direction by 5 mm.

6.試料ろ過フィルターの作製
図5のnに示した様なろ過用ノズルを用意し、表1に示す部材を円形(直径0.7cm)に打ち抜き、ノズルの底面に装填し、表2に示すような構成の試料ろ過フィルターを作製した。ろ過フィルターとして2枚以上の部材を重ねた場合には底面の側から1段目、2段目、3段目と数えた。
6). Preparation of sample filtration filter Prepare a nozzle for filtration as shown in Fig. 5n, punch the member shown in Table 1 into a circle (diameter 0.7cm), and load it on the bottom of the nozzle, as shown in Table 2 A sample filtration filter was prepared. When two or more members were stacked as a filtration filter, they were counted as the first, second, and third steps from the bottom side.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

Figure 0005639730
Figure 0005639730

7.インフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にインフルエンザウイルスあるいはRSウイルス感染が疑われる患者から鼻腔吸引液を採取した。まず、そのうち一部を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてRT-PCR法により検体中にインフルエンザウイルス遺伝子又はRSウイルス遺伝子が存在するかを確認した。インフルエンザウイルス遺伝子検出のためのRT-PCR法は、清水の方法(感染症学雑誌、第71巻、第6号、p522-526)で実施した。またRSウイルス遺伝子検出のためのRT-PCR方はStockton等の方法(Journal of Clinical Microbiology 、第36巻、p2990-2995、1998年)で実施した。その結果より、A型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を10検体、B型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を10検体、RSウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を10検体及びいずれの遺伝子も検出されなかった鼻腔吸引液を10検体それぞれ選び出し、以後の試験に用いた。
7). Detection of influenza virus and RS virus (1) Sample collection and sample preparation Nasal aspirate was collected from patients clinically suspected of influenza virus or RS virus infection. First, a part thereof was suspended in 2 mL of virus isolation medium, and using this suspension, it was confirmed by RT-PCR method whether influenza virus gene or RS virus gene was present in the specimen. The RT-PCR method for detecting influenza virus genes was performed by the method of Shimizu (Journal of Infectious Diseases, Vol. 71, No. 6, p522-526). The RT-PCR method for detecting RS virus gene was performed by the method of Stockton et al. (Journal of Clinical Microbiology, Vol. 36, p2990-2995, 1998). As a result, 10 samples of nasal aspirate fluid from which influenza A virus gene was detected, 10 samples of nasal aspirate fluid from which influenza B virus gene was detected, 10 samples of nasal aspirate fluid from which RS virus gene was detected, and Ten specimens of nasal aspirate from which no gene was detected were selected and used in subsequent tests.

選択した鼻腔吸引液に頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)及び軸部に綿を巻き付けて綿球を形成した頭部を有する従来型綿棒(検体採取部分の水分吸収量100μL;日本綿棒社)をそれぞれ10秒間浸した後に引き上げ、図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。鼻腔吸引液1検体につきブラシ状綿棒3本、従来型綿棒3本を用いて検体試料を計6本調製した。   A conventional cotton swab (with a water absorption of 90 μL of sample collection part; microRheologics, Inc.) and a cotton swab wound around the shaft to form a cotton ball on the selected nasal aspirate fluid. A sample suspension (100mL; Nippon Cotton Swab Co., Ltd.) was soaked for 10 seconds and then pulled up and dispensed into a tube as shown in Fig. 6 (20 mM MES buffer (pH 6.0), 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% bovine serum albumin) were floated in 0.3 mL, and specimen samples were prepared. A total of six specimen samples were prepared using three brush-like swabs and three conventional cotton swabs per specimen of nasal aspirate.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
鼻腔吸引液1検体より調製した検体試料の入った6本のチューブの先端に6.で作製した各種の試料ろ過フィルターをそれぞれ2個ずつ装着した。検体採取に用いた綿棒の種類と試料ろ過フィルターの種類の組み合わせを表3に示した。
(2) Detection by membrane assay method 6. At the tip of six tubes containing specimen samples prepared from one specimen of nasal aspirate. Two each of the various types of sample filtration filters prepared in the above were attached. Table 3 shows combinations of the types of cotton swabs used for specimen collection and the types of sample filtration filters.

検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、上記5.で作製したインフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸した。10分後、アッセイ装置を観察し、図1又は図2のhの位置(コントロールライン)に発色が認められた場合を有効とし、eの位置に標識に用いた着色ラテックスの色調の発色(この場合、赤色)が認められた場合にはA型インフルエンザウイルス陽性、fの位置に着色ラテックスの色調の発色(この場合、青色)が認められた場合にはB型インフルエンザウイルス陽性、gの位置に着色ラテックスの色調の発色(この場合、緑色)が認められた場合はRSウイルス陽性、いずれの位置にも発色が認められない場合は陰性と判定した。またhの位置に発色が認められない場合を無効とした。
試験の結果を表3に示す。
The collected filtrate is passed through the nozzle for filtration and collected in a tube, and then the above 5. The sample dripping pad side of the lateral flow membrane assay device for detecting influenza and RS virus prepared in 1 was immersed in the solution. 10 minutes later, the assay device is observed, and the case where color development is observed at the position h (control line) in FIG. 1 or FIG. 2 is effective, and the color development of the colored latex used for the labeling (position e) In case of red), positive for influenza A virus, positive coloration of colored latex at position f (in this case, blue), positive for influenza B virus, position at g When color development of colored latex (green in this case) was observed, it was judged as positive for RS virus, and negative when no color development was observed at any position. Also, the case where no color development was observed at the position h was regarded as invalid.
The results of the test are shown in Table 3.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

結果の説明
A型インフルエンザ陽性:RT-PCRにてA型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にA型インフルエンザウイルスのみ陽性と判定された場合
B型インフルエンザ陽性:RT-PCRにてB型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にB型インフルエンザウイルスのみ陽性と判定された場合
RS陽性:RT-PCRにてRSウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にRSウイルスのみ陽性と判定された場合
陰性:RT-PCRにていずれの遺伝子も検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際に陰性と判定された場合
非特異:試験した際にRT-PCRにて検体から遺伝子が検出されなかったウイルスがメンブレンアッセイ法にて陽性であると判定された場合(RT-PCRにて遺伝子が検出されたウイルスに加えて、遺伝子が検出されなかったウイルスもメンブレンアッセイ法にて陽性と判定された場合を含む)
無効:メンブレンアッセイ法にてhの位置に発色が認められなかった場合
簡易メンブレンアッセイにおいて焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターで鼻腔吸引液から調製した検体試料をろ過することにより目詰まりによる無効や偽陽性を防ぎ、さらにブラシ状綿棒との組み合わせにより感度・特異性が共に高い測定が可能となることが判明した。
Explanation of results Positive type A influenza: When tested by a membrane assay using a sample prepared from a sample from which the type A influenza virus gene was detected by RT-PCR, only the type A influenza virus was determined to be positive. In case of influenza B positive: when tested by membrane assay using a sample prepared from a sample from which the influenza B virus gene was detected by RT-PCR, only influenza B virus was determined to be positive Case
RS positive: When a sample sample prepared from a sample in which the RS virus gene was detected by RT-PCR was tested by the membrane assay method, only RS virus was determined to be negative. When a sample prepared from a sample in which no gene was detected was tested as negative when tested by a membrane assay method Non-specific: A gene was detected from the sample by RT-PCR when tested If the virus that was not detected was determined to be positive by the membrane assay (in addition to the virus for which the gene was detected by RT-PCR, the virus for which the gene was not detected was also determined to be positive by the membrane assay. Including the case where
Invalid: When color development is not recognized at the position h in the membrane assay method, invalid or false due to clogging by filtering the specimen sample prepared from the nasal aspirate with a sample filtration filter containing a sintered filter in a simple membrane assay It was found that measurement with high sensitivity and specificity is possible by preventing positiveness and combining with a brush-like swab.

[実施例2]ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔吸引液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出2
1.インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
実施例1で用いたものを使用した。
[Example 2] Detection of influenza virus and RS virus in nasal aspirate by lateral flow immunochromatographic assay 2
1. Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Influenza and RS Virus The same one used in Example 1 was used.

2.試料ろ過フィルターの作製
図5のnに示した様なろ過用ノズルを用意し、表4に示す部材を円形(直径0.7cm)に打ち抜き、ノズルの底面に装填し、表5に示すような構成の試料ろ過フィルターを作製した。ろ過フィルターとして2枚以上の部材を重ねた場合には底面の側から1段目、2段目、3段目と数えた。また、試料ろ過フィルターに含まれる2種類のフィルターのうち、孔径の小さいフィルターを精密ろ過用フィルターと、孔径の大きいフィルターを粗ろ過用フィルターと呼ぶ。
2. Preparation of sample filtration filter Prepare a nozzle for filtration as shown in Fig. 5n, punch out the members shown in Table 4 in a circular shape (0.7cm in diameter), load them on the bottom of the nozzle, and configure as shown in Table 5 A sample filtration filter was prepared. When two or more members were stacked as a filtration filter, they were counted as the first, second, and third steps from the bottom side. Of the two types of filters included in the sample filtration filter, a filter with a small pore size is called a fine filtration filter, and a filter with a large pore size is called a coarse filtration filter.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

Figure 0005639730
Figure 0005639730

3.インフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
実施例1で用いた鼻腔吸引液の中から、実施例1に記載の方法によりA型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を10検体、B型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を7検体、RSウイルス遺伝子が検出された鼻腔吸引液を10検体及びいずれの遺伝子も検出されなかった鼻腔吸引液を10検体それぞれ選び出し、以後の試験に用いた。
3. Detection of influenza virus and RS virus (1) Collection of specimen and preparation of specimen sample From the nasal aspirate used in Example 1, nasal aspiration in which influenza A virus gene was detected by the method described in Example 1 10 samples of liquid, 7 samples of nasal aspirate fluid in which influenza B virus gene was detected, 10 samples of nasal aspirate fluid in which RS virus gene was detected, and 10 samples of nasal aspirate fluid in which no gene was detected Selected and used for subsequent tests.

鼻腔吸引液に頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒を10秒間浸した後に引き上げ、図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中に浮遊し、検体試料を調製した。鼻腔吸引液1検体につき6本の検体試料を調製した。   A sample-like suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0), 1) which was pulled up after immersing a brush-like swab whose head is made of nylon fiber in nasal aspirate for 10 seconds and then dispensed into a tube as shown in FIG. (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% bovine serum albumin) were suspended in 0.3 mL, and a specimen sample was prepared. Six specimen samples were prepared for one specimen of nasal aspirate.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
鼻腔吸引液1検体より調製した検体試料の入った6本のチューブの先端に上記2.で作製したA、D、E、F、G及びHの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
試験の結果を表6に示す。尚、結果の説明は実施例1の表3に記載したものと同じである。
(2) Detection by membrane assay method The above-mentioned 2. is attached to the tip of six tubes containing specimen samples prepared from one specimen of nasal aspirate. Each of the various sample filtration filters A, D, E, F, G, and H prepared in Step 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.
The results of the test are shown in Table 6. The explanation of the results is the same as that described in Table 3 of Example 1.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

D〜Hのどの試料ろ過フィルターを用いた場合でも、試料ろ過フィルターを用いない場合と比較して効果が見られたが、精密ろ過用のフィルターの孔径がメンブレンの孔径より大きかったり、粗ろ過用フィルターの孔径が200μm以上のろ過フィルターを使用した場合には、非特異や無効と判定される検体が発生した。   Even if any sample filtration filter of DH was used, the effect was seen compared with the case where the sample filtration filter was not used, but the pore size of the filter for microfiltration was larger than the pore size of the membrane, or for coarse filtration. When a filter with a filter pore size of 200 μm or more was used, a sample determined to be non-specific or invalid was generated.

[実施例3] ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔拭い液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
1.インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
実施例1で用いたものを使用した。
2.試料ろ過フィルターの作製
実施例1及び2で作製した試料ろ過フィルターのうちA、C及びDを用いた。
[Example 3] Detection of influenza virus and RS virus in nasal wipes by lateral flow immunochromatographic assay Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Influenza and RS Virus The same one used in Example 1 was used.
2. Production of Sample Filtration Filter A, C and D among the sample filtration filters produced in Examples 1 and 2 were used.

3.インフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にインフルエンザウイルスあるいはRSウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)を用いて鼻腔拭い液を3本、咽頭拭い液を1本採取した。まず、そのうち咽頭拭い液を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いて実施例1の7.(1)記載のRT-PCR法により検体中にインフルエンザウイルス遺伝子又はRSウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した咽頭拭い液中からA型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された患者を5人、B型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された患者を5人、RSウイルス遺伝子が検出された患者を5人及びいずれの遺伝子も検出されなかった患者を5人選び出し、その患者から採取した鼻腔拭い液を図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
3. Detection of influenza virus and RS virus (1) Sample collection and sample preparation Brushed swabs made of nylon fibers from patients clinically suspected of influenza virus or RS virus infection (water absorption in sample collection part) 90 μL; microRheologics) was used to collect 3 nasal wipes and 1 pharyngeal wipe. First of all, the pharyngeal wiping solution was suspended in 2 mL of virus isolation medium, and this suspension was used to perform 7. of Example 1. (1) The presence of influenza virus gene or RS virus gene in the specimen was confirmed by the RT-PCR method described. As a result, 5 patients with influenza A virus gene were detected from the collected throat swabs, 5 patients with influenza B virus gene were detected, and 5 patients with RS virus gene detected. And 5 patients who did not detect any gene, and the sample suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0)) in which the nasal wipes collected from the patients were dispensed into a tube as shown in FIG. 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% bovine serum albumin) were suspended in 0.3 mL, and specimen samples were prepared.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
1人の患者より採取した鼻腔拭い液から調製した検体試料の入った3本のチューブの先端に2.で作製したA、C及びDの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
試験の結果を表7に示す。尚、結果の説明は実施例1の表3に記載したものと同じである。
(2) Detection by membrane assay 2. At the tip of three tubes containing specimen samples prepared from nasal wipes collected from one patient. Each of the sample filtration filters A, C, and D prepared in 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.
The test results are shown in Table 7. The explanation of the results is the same as that described in Table 3 of Example 1.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

簡易メンブレンアッセイにおいて鼻腔拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。   It was found that the sample sample prepared from the nasal wiping solution in the simple membrane assay was filtered with a sample filtration filter including a sintered filter to prevent invalidity and false positives due to clogging.

[実施例4] ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
1.インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
実施例1で用いたものを使用した。
2.試料ろ過フィルターの作製
実施例1及び2で作製した試料ろ過フィルターのうちA、C及びDを用いた。
[Example 4] Detection of influenza virus and RS virus in throat swabs by lateral flow immunochromatographic assay Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Influenza and RS Virus The same one used in Example 1 was used.
2. Production of Sample Filtration Filter A, C and D among the sample filtration filters produced in Examples 1 and 2 were used.

3.インフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にインフルエンザウイルスあるいはRSウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)を用いて咽頭拭い液を3本、鼻腔拭い液を1本採取した。まず、そのうち鼻腔拭い液を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いて実施例1の7.(1)記載のRT-PCR法により検体中にインフルエンザウイルス遺伝子又はRSウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した咽頭拭い液中からA型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された患者を5人、B型インフルエンザウイルス遺伝子が検出された患者を5人、RSウイルス遺伝子が検出された患者を5人及びいずれの遺伝子も検出されなかった患者を5人選び出し、その患者から採取した鼻腔拭い液を図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
3. Detection of influenza virus and RS virus (1) Sample collection and sample preparation Brushed swabs made of nylon fibers from patients clinically suspected of influenza virus or RS virus infection (water absorption in sample collection part) 90 μL; microRheologics) was used to collect 3 pharyngeal wipes and 1 nasal wipe. First of all, the nasal wiping solution was suspended in 2 mL of virus isolation medium, and this suspension was used in Example 7. (1) The presence of influenza virus gene or RS virus gene in the specimen was confirmed by the RT-PCR method described. As a result, 5 patients with influenza A virus gene were detected from the collected throat swabs, 5 patients with influenza B virus gene were detected, and 5 patients with RS virus gene detected. And 5 patients who did not detect any gene, and the sample suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0)) in which the nasal wipes collected from the patients were dispensed into a tube as shown in FIG. 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% bovine serum albumin) were suspended in 0.3 mL, and specimen samples were prepared.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
1人の患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入った3本のチューブの先端に2.で作製したA、C及びDの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
試験の結果を表8に示す。尚、結果の説明は実施例1の表3に記載したものと同じである。
(2) Detection by membrane assay 2. At the tip of three tubes containing specimen samples prepared from a throat swab collected from one patient. Each of the sample filtration filters A, C, and D prepared in 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.
The test results are shown in Table 8. The explanation of the results is the same as that described in Table 3 of Example 1.

Figure 0005639730
簡易メンブレンアッセイにおいて咽頭拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。
Figure 0005639730
It was found that the sample sample prepared from the pharyngeal wiping solution in the simple membrane assay was filtered with a sample filtration filter including a sintered filter to prevent invalidity and false positives due to clogging.

[実施例5] ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出
1.モノクローナル抗体の作製
(1)アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体(マウス)
ヒトアデノウイルスのヘキソン蛋白のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチドを免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。
[Example 5] Detection of adenovirus in throat swab by lateral flow immunochromatographic assay Production of monoclonal antibody (1) Adenovirus hexon protein monoclonal antibody (mouse)
A spleen was excised from a BALB / c mouse that had been immunized with a polypeptide obtained by synthesizing a part of the amino acid sequence of human adenovirus hexon protein and maintained for a certain period of time (Kohler et al., Nature, vol, 256 , p495-497 (1975)) and fused with mouse myeloma cells (P3 × 63).

得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、アデノウイルスヘキソン蛋白抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。   Maintain the resulting fused cells (hybridomas) in a 37 ° C incubator and purify the cells (monocloning) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an adenovirus hexon protein antigen solid phase plate. went.

取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、2種類の精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体を得た。   The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by affinity purification using Protein A column chromatography (Amersham) to obtain two types of purified anti-adenovirus hexon protein monoclonal antibodies.

2.標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体(標識物質)の作製
(1)ラテックス粒子標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち1種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate;同仁化学社)緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)%青色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基;Magsphere社)と液量比40:1になるように混合し、反応させた。次に、1(W/V)%のEDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mM Tris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン), 0.4Mトレハロース,0.2(V/V)% TritonX-100)20mL中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
2. Preparation of labeled anti-adenovirus hexon protein antibody (labeling substance) (1) Preparation of latex particle-labeled anti-adenovirus hexon protein antibody One type of anti-adenovirus hexon protein antibody is 50 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate) Dojindo Chemical Co., Ltd.) After dialysis with a buffer solution (pH 6.0), 10 mL of a solution diluted with the same buffer solution was prepared so that OD280nm = 0.5. Then 10 (W / V)% blue polystyrene latex particles (particle size 0.45 [mu] m, the surface functional group is a carboxyl group, a functional group density 65 Å 2 / COOH group; Magsphere Co.) and liquid volume ratio of 40: mixed at a 1 And reacted. Next, 1 (W / V)% EDAC (N- (3-Dimethlaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma) was added to a final concentration of 0.1%, followed by reaction for 2 hours. After washing, the suspension is suspended in 20 mL of the final suspension (5 mM Tris, 0.04 (W / V)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (V / V)% TritonX-100). (Olympus) to disperse latex particles.

3.ラテックス粒子標識抗体の乾燥化
(1)ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
2.で作製したラテックス粒子標識抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて8μL/cmの塗布量でリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を1分間吹きつけて乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製した。
3. 1. Drying of latex particle labeled antibody (1) Preparation of latex particle labeled antibody dry pad The latex particle-labeled antibody prepared in (1) was sprayed on the whole surface of a cellulose nonwoven fabric having a width of 15 mm wound in a reel at a coating amount of 8 μL / cm using a positive pressure spraying device (BioJet; BioDot). After spraying, warm air of 50 ° C. was blown for 1 minute to dry, thereby preparing a latex particle-labeled antibody drying pad.

4.メンブレン固相用抗体の調製
(1)固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
上記1.(1)で作製した精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液(10mM Tris-HCl(pH7.5))に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=4.0になるように固相液で希釈して固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を調製した。
4). Preparation of antibody for membrane solid phase (1) Preparation of anti-adenovirus hexon protein antibody for solid phase The purified anti-adenovirus hexon protein antibody prepared in (1), which was not used for labeling, was dialyzed against a solid phase solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5)), 0.22 μm filtered after dialysis, A solid phase anti-adenovirus hexon protein antibody was prepared by diluting with a solid phase solution so that OD280nm = 4.0.

5.アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図1及び図2に示すものと同様の構成のものを用いた。
5. Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Adenovirus A lateral flow membrane assay device for detection of adenovirus was used having the same configuration as that shown in FIGS.

メンブレンは、幅3cm×長さ10cmのニトロセルロースメンブレン(孔径12μm;ワットマン社製)シート(白色)を用いた(図1及び図2のd)。その長軸側の一端(この端を上流端、反対側を下流端とする)から6mm離れたeの位置に固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、22mm離れたhの位置に抗マウスIgG抗体をO.D.280nm=1.0に希釈し、1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布した。fとgの位置には何も塗布しなかった。塗布後、45℃の温風を10分間吹き付けて乾燥した。 The membrane used was a nitrocellulose membrane (pore diameter 12 μm; manufactured by Whatman) sheet (white) having a width of 3 cm and a length of 10 cm (d in FIGS. 1 and 2). Positive-pressure spraying of anti-adenovirus hexon protein antibody for solid phase at a coating amount of 1 μL / cm at a position 6 mm away from one end of the long axis (this end is the upstream end and the opposite side is the downstream end) Using a device (BioJet; BioDot), the anti-mouse IgG antibody was diluted to OD 280nm = 1.0 at a position h of 22 mm away, and a positive pressure spray device (BioJet; BioDot) was applied linearly. Nothing was applied to the positions of f and g. After the application, it was dried by blowing warm air of 45 ° C. for 10 minutes.

次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面(この面を上面とする)の反対側(この面を下面とする)にプラスチック製バッキングシート(BioDot社製)を接着した(図2のi)。   Next, in order to fix the member and increase the strength, a plastic backing sheet (BioDot) is bonded to the opposite side (this surface is the lower surface) of the membrane antibody application surface (this surface is the upper surface). (I in FIG. 2).

次に、上記3.で作製したラテックス粒子標識抗体乾燥パッド(図1及び図2のb)を幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が2mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッド(図1及び図2のa)とした。   Next, the above 3. Cut the latex particle-labeled antibody drying pad (b) in Fig. 1 and Fig. 2 into 15mm width x 10cm length, and place it on the top surface of the membrane so that the upstream end of the membrane overlaps 2mm. Cellulose filter paper (Whatman) having a width of 23 mm and a length of 10 cm was placed on the upper surface of the latex particle-labeled antibody drying pad so as to overlap 13 mm, and was attached to form a sample dropping pad (a in FIGS. 1 and 2).

次に、幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と5mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッド(図1及び図2のc)とした。   Next, cellulose filter paper (Wattman Co., Ltd.) having a width of 30 mm and a length of 10 cm is attached to the upper surface of the membrane so as to overlap the downstream end of the membrane by 5 mm, and a sample absorption pad (FIG. 1 and FIG. 2 c) and did.

次にサンプル滴下パッドの上流端の幅5mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート(Adhesive Research社)で被覆した(図2のj)。   Next, the entire upper surface was covered with a transparent plastic laminate (Adhesive Research) except for a width of 5 mm at the upstream end of the sample dropping pad (j in FIG. 2).

最後に長軸方向に沿って、5mmずつ切断し、図1及び図2に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。   Finally, the membrane assay apparatus shown in FIGS. 1 and 2 was produced by cutting along the long axis direction by 5 mm.

6.試料ろ過フィルターの作製
実施例1及び2で作製した試料ろ過フィルターのうちA、C及びDを用いた。
6). Production of Sample Filtration Filter A, C and D among the sample filtration filters produced in Examples 1 and 2 were used.

7.アデノウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にアデノウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)を用いて咽頭拭い液を4本採取した。まず、そのうち1本を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてFujimoto等の方法(Single-tube multiplex PCR for rapid and sensitive diagnosis of subgenus B and other subgenera adenovirus in clinical samples. Microbiology and Immunology. 44. 821-826, 2000)を用いたPCR法により検体中にアデノウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した咽頭拭い液中からアデノウイルス遺伝子が検出された患者を5人及びアデノウイルス遺伝子が検出されなかった患者を5人選び出し、その患者から採取した咽頭拭い液を図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
7). Detection of adenovirus (1) Collection of specimen and preparation of specimen A brush-like swab with a head of nylon fiber from a patient suspected of clinically adenovirus infection (water absorption of specimen collection part: 90μL; microRheologics) 4 pharyngeal wipes were collected. First, one of them is suspended in 2 mL of virus isolation medium, and this suspension is used to the method of Fujimoto et al. (Single-tube multiplex PCR for rapid and sensitive diagnosis of subgenus B and other subgenera adenovirus in clinical samples. Microbiology and Immunology. 44. 821-826, 2000), the presence of adenovirus gene in the specimen was confirmed by PCR. Based on the results, 5 patients with adenovirus gene detected and 5 patients with no adenovirus gene detected were selected from the collected pharyngeal wipes, and the pharyngeal wipes collected from these patients are shown in FIG. Sample suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0), 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V) )% Bovine serum albumin) each suspended in 0.3 mL to prepare a specimen sample.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
1人の患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入った3本のチューブの先端に2.で作製したA、C及びDの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
(2) Detection by membrane assay 2. At the tip of three tubes containing specimen samples prepared from a throat swab collected from one patient. Each of the sample filtration filters A, C, and D prepared in 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.

試験の結果を表9に示す。10分後、アッセイ装置を観察し、図1あるいは図2のhの位置(コントロールライン)に青色の発色が認められた場合を有効とし、eの位置に青色の発色が認められた場合にアデノウイルス陽性と判定した。またhの位置に発色が認められない場合を無効とした。   The test results are shown in Table 9. Ten minutes later, the assay apparatus is observed, and the case where blue color development is recognized at the position (control line) h in FIG. 1 or FIG. 2 is effective, and when blue color development is recognized at the position e, adeno is observed. The virus was judged positive. Also, the case where no color development was observed at the position h was regarded as invalid.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

結果の説明
アデノウイルス陽性:PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性と判定された場合
陰性:PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際に陰性と判定された場合
非特異:試験した際にPCRにて検体からアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性であると判定された場合
無効:メンブレンアッセイ法にてhの位置に発色が認められなかった場合
Description of results Adenovirus positive: Negative when adenovirus is positive when tested by membrane assay using a sample prepared from a sample in which adenovirus gene was detected by PCR: Adenovirus by PCR When it is determined to be negative when tested by a membrane assay using a sample prepared from a sample in which no viral gene was detected Non-specific: Adenoviral gene was detected from the sample by PCR when tested When it is determined to be adenovirus-positive when tested in a membrane assay using a sample prepared from a sample that did not exist Invalid: When no color development is observed at position h in the membrane assay

簡易メンブレンアッセイにおいて咽頭拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。   It was found that the sample sample prepared from the pharyngeal wiping solution in the simple membrane assay was filtered with a sample filtration filter including a sintered filter to prevent invalidity and false positives due to clogging.

[実施例6] ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる直腸拭い液中のノロウイルスの検出
1.モノクローナル抗体の作製
(1)抗ノロウイルスキャプシド蛋白モノクローナル抗体(マウス)
ノロウイルスのキャプシド蛋白をコードする遺伝子を導入した組換えバキュロウイルスによるタンパク質発現によりウイルス中空粒子(VLPs)を作製した。これを免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。
[Example 6] Detection of norovirus in rectal wipes by lateral flow immunochromatographic assay Production of monoclonal antibody (1) Anti-Norovirus capsid protein monoclonal antibody (mouse)
Viral hollow particles (VLPs) were prepared by protein expression by recombinant baculovirus introduced with a gene encoding capsid protein of Norovirus. The spleen was removed from BALB / c mice that had been immunized and maintained for a certain period of time, and mouse myeloma cells (P3 × 63) were obtained by the method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975)). )

得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、VLPs固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。   The obtained fused cells (hybridoma) were maintained in a 37 ° C. incubator, and the cells were purified (monocloned) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using a VLPs solid phase plate.

取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、2種類の精製抗ノロウイルスキャプシド蛋白モノクローナル抗体を得た。   The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by affinity purification using Protein A column chromatography (Amersham) to obtain two purified anti-norovirus capsid protein monoclonal antibodies.

2.標識抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体(標識物質)の作製
(1)ラテックス粒子標識抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体の調製
抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体のうち1種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate;同仁化学社)緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)%青色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基;Magsphere社)と液量比40:1になるように混合し、反応させた。次に、1(W/V)%のEDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mM Tris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン), 0.4Mトレハロース,0.2(V/V)% TritonX-100)20mL中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
2. Preparation of labeled anti-norovirus capsid protein antibody (labeling substance) (1) Preparation of latex particle-labeled anti-norovirus capsid protein antibody One type of anti-norovirus capsid protein antibody was buffered with 50 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate). After dialysis with a solution (pH 6.0), 10 mL of a solution diluted with the same buffer was prepared so that OD 280 nm = 0.5. Then 10 (W / V)% blue polystyrene latex particles (particle size 0.45 [mu] m, the surface functional group is a carboxyl group, a functional group density 65 Å 2 / COOH group; Magsphere Co.) and liquid volume ratio of 40: mixed at a 1 And reacted. Next, 1 (W / V)% EDAC (N- (3-Dimethlaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma) was added to a final concentration of 0.1%, followed by reaction for 2 hours. After washing, the suspension is suspended in 20 mL of the final suspension (5 mM Tris, 0.04 (W / V)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (V / V)% TritonX-100). (Olympus) to disperse latex particles.

3.ラテックス粒子標識抗体の乾燥化
(1)ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
2.で作製したラテックス粒子標識抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて8μL/cmの塗布量でリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を1分間吹きつけて乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製した。
3. 1. Drying of latex particle labeled antibody (1) Preparation of latex particle labeled antibody dry pad The latex particle-labeled antibody prepared in (1) was sprayed on the whole surface of a cellulose nonwoven fabric having a width of 15 mm wound in a reel at a coating amount of 8 μL / cm using a positive pressure spraying device (BioJet; BioDot). After spraying, warm air of 50 ° C. was blown for 1 minute to dry, thereby preparing a latex particle-labeled antibody drying pad.

4.メンブレン固相用抗体の調製
(1)固相用抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体の調製
上記1.(1)で作製した精製抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液(10mM Tris-HCl(pH8.0))に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=3.0になるように固相液で希釈して固相用抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体を調製した。
4). Preparation of antibody for membrane solid phase (1) Preparation of anti-norovirus capsid protein antibody for solid phase The purified anti-Norovirus capsid protein antibody prepared in (1), which was not used for labeling, was dialyzed against a solid phase solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)), filtered through 0.22 μm, and OD 280 nm A solid phase anti-Norovirus capsid protein antibody was prepared by diluting with a solid phase solution so that = 3.0.

5.ノロウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
ノロウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図1及び図2に示すものと同様の構成のものを用いた。
5. Production of Lateral Flow Membrane Assay Device for Detection of Norovirus A lateral flow membrane assay device for detection of norovirus was used having the same configuration as that shown in FIGS.

メンブレンは、幅3cm×長さ10cmのニトロセルロースメンブレン(孔径12μm;ワットマン社製)シート(白色)を用いた(図1及び図2のd)。その長軸側の一端(この端を上流端、反対側を下流端とする)から6mm離れたeの位置に固相用抗ノロウイルスキャプシド蛋白抗体を1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、22mm離れたhの位置に抗マウスIgG抗体をO.D.280nm=1.0に希釈し、1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布した。fとgの位置には何も塗布しなかった。塗布後、45℃の温風を10分間吹き付けて乾燥した。 The membrane used was a nitrocellulose membrane (pore diameter 12 μm; manufactured by Whatman) sheet (white) having a width of 3 cm and a length of 10 cm (d in FIGS. 1 and 2). A positive pressure spraying device with an application amount of 1 μL / cm of the anti-norovirus capsid protein antibody for solid phase at a position e of 6 mm away from one end of the long axis side (this end is the upstream end and the opposite side is the downstream end) BioJet; BioDot) was applied linearly, anti-mouse IgG antibody was diluted to OD 280nm = 1.0 at a position h of 22 mm away, and a positive pressure spray device (BioJet; BioDot) was applied at a coating amount of 1 μL / cm. ) Was applied linearly. Nothing was applied to the positions of f and g. After the application, it was dried by blowing warm air of 45 ° C. for 10 minutes.

次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面(この面を上面とする)の反対側(この面を下面とする)にプラスチック製バッキングシート(BioDot社製)を接着した(図2のi)。   Next, in order to fix the member and increase the strength, a plastic backing sheet (BioDot) is bonded to the opposite side (this surface is the lower surface) of the membrane antibody application surface (this surface is the upper surface). (I in FIG. 2).

次に、上記3(2)で作製したラテックス粒子標識抗体乾燥パッド(図1及び図2のb)を幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が2mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッド(図1及び図2のa)とした。   Next, the latex particle labeled antibody drying pad (b in FIGS. 1 and 2) prepared in 3 (2) above is cut into a width of 15 mm and a length of 10 cm so that the upstream end of the membrane overlaps with the upper surface of the membrane by 2 mm. Place and paste a cellulose filter paper (Wattman) 23 mm wide x 10 cm long on the top of the latex particle-labeled antibody drying pad so as to overlap 13 mm. A).

次に、幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と5mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッド(図1及び図2のc)とした。   Next, cellulose filter paper (Wattman Co., Ltd.) having a width of 30 mm and a length of 10 cm is attached to the upper surface of the membrane so as to overlap the downstream end of the membrane by 5 mm, and a sample absorption pad (FIG. 1 and FIG. 2 c) and did.

次にサンプル滴下パッドの上流端の幅5mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート(Adhesive Research社)で被覆した(図2のj)。   Next, the entire upper surface was covered with a transparent plastic laminate (Adhesive Research) except for a width of 5 mm at the upstream end of the sample dropping pad (j in FIG. 2).

最後に長軸方向に沿って、5mmずつ切断し、図1及び図2に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。   Finally, the membrane assay apparatus shown in FIGS. 1 and 2 was produced by cutting along the long axis direction by 5 mm.

6.試料ろ過フィルターの作製
実施例1及び2で作製した試料ろ過フィルターのうちA、C及びDを用いた。
6). Production of Sample Filtration Filter A, C and D among the sample filtration filters produced in Examples 1 and 2 were used.

7.ノロウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にノロウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)を用いて直腸拭い液を4本採取した。まず、そのうち1本を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてRT-PCR法(平成15年11月5日付食安監発第1105001号厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知に準拠)により検体中にノロウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した直腸拭い液中からノロウイルス遺伝子が検出された患者を5人及びノロウイルス遺伝子が検出されなかった患者を5人選び出し、その患者から採取した直腸拭い液を図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
7). Detection of norovirus (1) Collection of specimen and preparation of specimen using clinically suspected norovirus infection patients with a brush-like swab (90 μL of sample collection part; microRheologics) Four rectal wipes were collected. First, one of them is suspended in 2 mL of virus isolation medium, and this suspension is used to monitor the RT-PCR method (No. 1105001, food safety supervision dated November 5, 2003, Food Safety Department, Ministry of Health, Labor and Welfare, Food Safety Department) According to the section manager's notice), it was confirmed whether the norovirus gene was present in the sample. From the results, 5 patients with norovirus gene detected and 5 patients with norovirus gene detected were selected from the collected rectal wipes, and the rectal wipes collected from these patients were as shown in FIG. Sample suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0), 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% Arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% Bovine serum albumin) was suspended in 0.3 mL, and specimen samples were prepared.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
1人の患者より採取した直腸拭い液より調製した検体試料の入った3本のチューブの先端に2.で作製したA、C及びDの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
(2) Detection by membrane assay 2. At the tip of three tubes containing specimen samples prepared from rectal wipes collected from one patient. Each of the sample filtration filters A, C, and D prepared in 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.

試験の結果を表10に示す。10分後、アッセイ装置を観察し、図1あるいは図2のhの位置(コントロールライン)に青色の発色が認められた場合を有効とし、eの位置に青色の発色が認められた場合にノロウイルス陽性と判定した。またhの位置に発色が認められない場合を無効とした。   Table 10 shows the results of the test. Ten minutes later, the assay apparatus is observed, and when blue color is observed at the position h (control line) in FIG. 1 or FIG. 2, it is effective, and when blue color is observed at the position e, norovirus Positive. Also, the case where no color development was observed at the position h was regarded as invalid.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

結果の説明
ノロウイルス陽性:RT-PCRにてノロウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にノロウイルス陽性と判定された場合
陰性:RT-PCRにてノロウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際に陰性と判定された場合
非特異:試験した際にRT-PCRにて検体からノロウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にノロウイルス陽性であると判定された場合
無効:メンブレンアッセイ法にてhの位置に発色が認められなかった場合
Description of results Norovirus positive: When norovirus is positive when tested by membrane assay using a sample prepared from a sample with norovirus gene detected by RT-PCR: Negative: RT-PCR When it is judged negative when tested by membrane assay using a sample prepared from a sample in which norovirus gene was not detected Non-specific: When tested, RT-PCR detects norovirus gene from sample When norovirus is determined to be positive when tested in a membrane assay using a specimen prepared from a specimen that has not been tested, invalid: When no color is observed at position h in the membrane assay

簡易メンブレンアッセイにおいて直腸拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。   It was found that the sample sample prepared from the rectal wiping solution in a simple membrane assay was filtered with a sample filtration filter including a sintered filter to prevent invalidity and false positives due to clogging.

[実施例7] ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる糞便中のノロウイルスの検出
1.ノロウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
実施例6で用いたものを使用した。
2.試料ろ過フィルターの作製
実施例1及び2で作製した試料ろ過フィルターのうちA、C及びDを用いた。
[Example 7] Detection of norovirus in feces by lateral flow immunochromatographic assay Preparation of Lateral Flow Membrane Assay Device for Norovirus Detection The same one used in Example 6 was used.
2. Production of Sample Filtration Filter A, C and D among the sample filtration filters produced in Examples 1 and 2 were used.

3.ノロウイルスの検出
(1)検体の採取と検体試料の調製
臨床的にノロウイルス感染が疑われる患者の糞便より頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒(検体採取部分の水分吸収量90μL;microRheologics社)を用いて検体を4本採取した。まず、そのうち1本を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてRT-PCR法(平成15年11月5日付食安監発第1105001号厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知に準拠)により検体中にノロウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した糞便中からノロウイルス遺伝子が検出された患者を5人及びノロウイルス遺伝子が検出されなかった患者を5人選び出し、その患者から採取した糞便を図6に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液(20mM MES緩衝液(pH6.0)、1(W/V)% TritonX-100、5(W/V)% アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)%ウシ血清アルブミン)0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
3. Detection of norovirus (1) Collection of specimen and preparation of specimen A brush-like swab made of nylon fiber from the stool of a patient suspected of having a clinically norovirus infection (water absorption of the specimen collection part: 90μL; microRheologics) Using this, 4 specimens were collected. First, one of them is suspended in 2 mL of virus isolation medium, and this suspension is used to monitor the RT-PCR method (No. 1105001, food safety supervision dated November 5, 2003, Food Safety Department, Ministry of Health, Labor and Welfare, Food Safety Department) According to the section manager's notice), it was confirmed whether the norovirus gene was present in the sample. Based on the results, five patients with norovirus gene detected from the collected feces and five patients with no norovirus gene detected were selected, and the feces collected from the patients were placed in a tube as shown in FIG. Dispensed specimen suspension (20 mM MES buffer (pH 6.0), 1 (W / V)% TritonX-100, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1.0 (W / V)% bovine serum albumin) Sample samples were prepared by floating in 0.3 mL.

(2)メンブレンアッセイ法による検出
1人の患者より採取した糞便より調製した検体試料の入った3本のチューブの先端に2.で作製したA、C及びDの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ1個ずつ装着し、実施例1と同じ方法で試験を実施した。
(2) Detection by membrane assay 2. At the tip of three tubes containing specimen samples prepared from stool collected from one patient. Each of the sample filtration filters A, C, and D prepared in 1 was attached, and the test was performed in the same manner as in Example 1.

試験の結果を表11に示す。10分後、アッセイ装置を観察し、図1あるいは図2のhの位置(コントロールライン)に青色の発色が認められた場合を有効とし、eの位置に青色の発色が認められた場合にノロウイルス陽性と判定した。またhの位置に発色が認められない場合を無効とした。   The test results are shown in Table 11. Ten minutes later, the assay apparatus is observed, and when blue color is observed at the position h (control line) in FIG. 1 or FIG. 2, it is effective, and when blue color is observed at the position e, norovirus Positive. Also, the case where no color development was observed at the position h was regarded as invalid.

Figure 0005639730
Figure 0005639730

結果の説明
実施例6と同じ。
簡易メンブレンアッセイにおいて糞便から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。
Explanation of results Same as Example 6.
It was found that the sample sample prepared from stool in a simple membrane assay was filtered with a sample filtration filter including a sintered filter to prevent invalidity and false positives due to clogging.

本発明の方法及び装置は、被検体中の特定の物質の定量又は検出に用いることができ、疾患に関連した物質を測定することにより、疾患の検出・診断に利用することができる。   The method and apparatus of the present invention can be used for quantification or detection of a specific substance in a subject, and can be used for detection and diagnosis of a disease by measuring a substance related to the disease.

本発明の一実施態様であるラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の平面図である。It is a top view of the lateral flow type membrane assay apparatus which is one embodiment of this invention. 図1のI−I’切断端面図である。FIG. 2 is an end view taken along the line I-I ′ of FIG. 1. 従来の綿棒の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the conventional cotton swab. ブラシ状綿棒の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of a brush-shaped cotton swab. 試料ろ過フィルターの一例を示す構造図である。It is a structural diagram showing an example of a sample filtration filter. 検体チューブの一例を示す構造図である。It is a structural diagram showing an example of a sample tube.

a:サンプル滴下パッド
b:ラテックス粒子標識抗体乾燥パッド(標識物質乾燥パッド)
c:サンプル吸収パッド
d:ニトロセルロースメンブレン
e〜g:被検出物に特異的に結合する捕捉物質がd上でライン状に結合している位置
h:標識物質を結合することができる物質がd上でライン状に結合している位置
i:バッキングシート
j:透明プラスチックラミネート
k1:綿を巻き付けた綿球からなる検体採取部分
k2:繊維をブラシ状に配置した検体採取部分
l:軸部
m:頭部
n:ろ過用ノズル
o1〜o3:ろ過フィルター
p:検体浮遊液チューブ
a: Sample dropping pad b: Latex particle-labeled antibody drying pad (labeling substance drying pad)
c: Sample absorption pad d: Nitrocellulose membranes e to g: A position where a capture substance that specifically binds to an object to be detected is bound in a line on d. h: A substance that can bind a labeling substance is d. Position i connected in line above: backing sheet j: transparent plastic laminate k1: sample collection part k2 made of cotton balls wound with cotton k: sample collection part l with fibers arranged in a brush shape l: shaft part m: Head n: Filtration nozzles o1 to o3: Filtration filter p: Sample suspension tube

Claims (21)

検体中の被検出物を捕捉するための捕捉試薬が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置上で検体中の被検出物の存在を検出又は定量することを含む簡易メンブレンアッセイ法において、ヒト又は他の動物の咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液及び直腸拭い液からなる群から選択される検体を採取し、採取した検体を検体浮遊液に浮遊させ試料を調製し、調製した試料を強剛性フィルターが含まれるろ過フィルターを用いて加圧ろ過することを含み、前記強剛性フィルターは、孔径が10〜200μmであり、検体試料をろ過する時の液体または空気によるフィルターにかかる圧力が0.2[MPa]を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が5%以上とならず、または、ろ過時のフィルターの曲率半径が2cm以下とならない、フィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えた強剛性フィルターである、簡易メンブレンアッセイ方法。   In a simple membrane assay method comprising detecting or quantifying the presence of an analyte in a sample on an assay device comprising a membrane to which a capture reagent for capturing the analyte in the sample is bound, human or other Collect a specimen selected from the group consisting of animal pharyngeal wipe, nasal wipe, nasal aspirate, nasal wash, alveolar wash, stool suspension, and rectal wipe, and float the collected sample in the sample suspension Preparing a sample, and subjecting the prepared sample to pressure filtration using a filtration filter including a rigid filter, wherein the rigid filter has a pore diameter of 10 to 200 μm and is used for filtering a specimen sample. Even if the pressure applied to the filter by liquid or air exceeds 0.2 [MPa], the amount of change in thickness before filtration versus filtration does not exceed 5%, or the radius of curvature of the filter during filtration is 2 cm or less. Na Not a strong rigid filter having a hard rigid block the flow path of the filter inside the filtrate simple membrane assay method. 強剛性フィルターが、フィルターの表面だけでなく内部で混入物をトラップする強剛性フィルターである、請求項1に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to claim 1, wherein the rigid filter is a rigid filter that traps contaminants not only on the surface of the filter but also inside. 強剛性フィルターの厚さが数mm〜数cmである、請求項1又は2に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to claim 1 or 2, wherein the thickness of the rigid filter is several mm to several cm. 強剛性フィルターが検体試料をろ過する時の液体または空気によるフィルターにかかる圧力が0.2[MPa]を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が2%以上とならず、または、ろ過時のフィルターの曲率半径が2cm以下とならない強剛性フィルターである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   Even if the pressure applied to the filter by liquid or air when the rigid filter filters the specimen sample exceeds 0.2 [MPa], the amount of change in thickness before filtration vs. filtration does not exceed 2%, or The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 3, which is a highly rigid filter in which the radius of curvature of the filter during filtration does not become 2 cm or less. フレキシブルな材質からなり検体から調製した試料をろ過することができるろ過チューブの内部に前記試料を入れた状態で、内部に圧力を加えることで、検体から調製した試料を加圧ろ過することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   It is characterized by pressure-filtering a sample prepared from a specimen by applying pressure to the inside of the filtration tube made of a flexible material and capable of filtering the sample prepared from the specimen. The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 4. 強剛性フィルターが焼結フィルターである請求項1〜5のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 5, wherein the rigid filter is a sintered filter. 焼結フィルターの素材がポリプロピレン、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリスチレン、四フッ化エチレン重合体及びポリメチルメタクリレートからなる群から選択される請求項6に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to claim 6, wherein the material of the sintered filter is selected from the group consisting of polypropylene, low density polyethylene, high density polyethylene, ultrahigh molecular weight polyethylene, polystyrene, tetrafluoroethylene polymer, and polymethyl methacrylate. . 焼結フィルターの素材がポリプロピレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は50〜200μm、低密度ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は30〜70μm、高密度ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は10〜50μm、超高分子量ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は10〜20μm、ポリスチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は100〜200μm、四フッ化エチレン重合体製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は30〜100μmである、請求項7に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   When the sintered filter material is a polypropylene rigid filter, the pore size of the filter is 50-200 μm. When the low-density polyethylene rigid filter is 30-70 μm, the pore size of the filter is 30-70 μm. The pore size of the filter is 10 to 50 μm, the pore size of the filter is 10 to 20 μm in the case of ultra-high molecular weight polyethylene rigid filter, the pore size of the filter is 100 to 200 μm in the case of polystyrene rigid filter, and is made of tetrafluoroethylene polymer The simple membrane assay method according to claim 7, wherein the pore size of the filter in the case of a highly rigid filter is 30 to 100 μm. 検体中の被検出物が呼吸器感染症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質又はそれらに対する抗体である請求項1〜8のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 8, wherein the detected substance in the sample is a microorganism causing respiratory infection, a substance derived from the microorganism, or an antibody against them. 検体中の被検出物がインフルエンザウイルス、RSウイルス、アデノウイルス、A群溶連菌及び肺炎マイコプラズマからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質又はそれらに対する抗体である請求項9に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple substance according to claim 9, wherein the detected substance in the specimen is a pathogenic microorganism selected from the group consisting of influenza virus, RS virus, adenovirus, group A streptococci and mycoplasma pneumonia, a substance derived from the microorganism, or an antibody thereto. Membrane assay method. 検体中の被検出物が下痢症の原因微生物若しくは該微生物由来の物質又はそれらに対する抗体である請求項1〜8のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 8, wherein the detected substance in the sample is a microorganism causing diarrhea, a substance derived from the microorganism, or an antibody against them. 検体中の被検出物がノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及び下痢症アデノウイルスからなる群から選択される病原微生物若しくは該微生物由来の物質又はそれらに対する抗体である請求項11に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to claim 11, wherein the detected substance in the sample is a pathogenic microorganism selected from the group consisting of norovirus, rotavirus, sapovirus and diarrhea adenovirus, a substance derived from the microorganism, or an antibody thereto. . フロースルー式又はラテラルフロー式メンブレンアッセイ方法である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 12, which is a flow-through type or lateral flow type membrane assay method. ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されており、最小孔径を有するフィルターの孔径が、メンブレンを備えたアッセイ装置のメンブレンの孔径以下であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が前記メンブレンの孔径以上でありかつ200μm以下である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The filtration filter is configured by stacking a plurality of filters having different pore diameters, and the pore diameter of the filter having the minimum pore diameter is equal to or smaller than the pore diameter of the membrane of the assay device including the membrane, and the pore diameter of the filter having the maximum pore diameter is the membrane. The simple membrane assay method according to any one of claims 1 to 13, which is not less than 200 μm and not more than 200 μm. 試料を最初に最大孔径を有するフィルターを通過させ、次いでより小さい孔径を有するフィルターを通過させる請求項14に記載の簡易メンブレンアッセイ方法。   The simple membrane assay method according to claim 14, wherein the sample is first passed through a filter having a maximum pore size and then through a filter having a smaller pore size. 以下を含む、ヒト又は他の動物の咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、便懸濁液及び直腸拭い液からなる群から選択される検体中の被検出物の存在を検査するための簡易メンブレンアッセイキット;
(1)孔径が10〜200μmであり、検体試料をろ過する時の液体または空気によるフィルターにかかる圧力が0.2[MPa]を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が5%以上とならず、または、ろ過時のフィルターの曲率半径が2cm以下とならない、フィルター内部のろ液の流路を塞ぎ難い剛性を備えた強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用加圧ろ過チューブであり、及び
(2)検体中の被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置。
Objects to be detected in a specimen selected from the group consisting of a pharyngeal wipe, nasal wipe, nasal aspirate, nasal wash, alveolar wash, stool suspension, and rectal wipe from humans or other animals, including: Simple membrane assay kit to test for the presence of
(1) The pore size is 10 to 200 μm, and even if the pressure applied to the filter by liquid or air when the specimen sample is filtered exceeds 0.2 [MPa], the amount of change in the thickness before filtration versus filtration is 5%. A filtration filter constituted by a filter including a rigid filter that does not have the above or the curvature radius of the filter at the time of filtration does not become 2 cm or less and has a rigidity that is difficult to block the flow path of the filtrate inside the filter. An assay device comprising a membrane that is a pressure filtration tube for a sample and (2) a capture substance bound to capture an object to be detected in the sample.
強剛性フィルターが、フィルターの表面だけでなく内部で混入物をトラップする強剛性フィルターである、請求項16に記載の簡易メンブレンアッセイキット。   The simple membrane assay kit according to claim 16, wherein the rigid filter is a rigid filter that traps contaminants not only on the surface of the filter but also inside. 強剛性フィルターの厚さが数mm〜数cmである、請求項16又は17に記載の簡易メンブレンアッセイキット。   The simple membrane assay kit according to claim 16 or 17, wherein the thickness of the rigid filter is several mm to several cm. 検体試料をろ過する時の液体または空気によるフィルターにかかる圧力が0.2[MPa]を超えても、ろ過前対ろ過時の厚さの変化量が2%以上とならず、または、ろ過時のフィルターの曲率半径が2cm以下とならない強剛性フィルターを含むフィルターにより構成されたろ過フィルターを備えた検体試料用加圧ろ過チューブを含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイキット。   Even if the pressure applied to the filter by liquid or air when filtering the sample exceeds 0.2 [MPa], the amount of change in the thickness before filtration vs. filtration does not exceed 2%, or the filter during filtration The simple membrane assay kit according to any one of claims 16 to 18, comprising a pressure filtration tube for a specimen sample provided with a filtration filter constituted by a filter including a rigid filter whose curvature radius is not 2 cm or less. . さらに、以下の(3)から(6)の少なくとも1つを含む請求項16〜19のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイキット;
(3)検体浮遊液、
(4)洗浄液組成物、
(5)標識物質、及び
(6)コントロール液。
The simple membrane assay kit according to any one of claims 16 to 19, further comprising at least one of the following (3) to (6):
(3) Specimen suspension,
(4) Cleaning liquid composition,
(5) Labeling substance, and (6) Control solution.
ろ過フィルターが孔径の異なる複数のフィルターを重ねて構成されており、最小孔径を有するフィルターの孔径が、メンブレンを備えたアッセイ装置のメンブレンの孔径以下であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が前記メンブレンの孔径以上でありかつ200μm以下であり、強剛性フィルターが焼結フィルターであり、焼結フィルターの素材がポリプロピレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は50〜200μm、低密度ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は30〜70μm、高密度ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は10〜50μm、超高分子量ポリエチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は10〜20μm、ポリスチレン製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は100〜200μm、四フッ化エチレン重合体製強剛性フィルターの場合のフィルターの孔径は30〜100μmである、請求項16〜20のいずれか1項に記載の簡易メンブレンアッセイキット。   The filtration filter is configured by stacking a plurality of filters having different pore diameters, and the pore diameter of the filter having the minimum pore diameter is equal to or smaller than the pore diameter of the membrane of the assay device including the membrane, and the pore diameter of the filter having the maximum pore diameter is the membrane. The pore size of the filter is 50 to 200 μm when the material of the sintered filter is a polypropylene rigid filter, and the rigid filter is a low-density polyethylene strong filter. The pore size of the filter in the case of 30 to 70 μm, the pore size of the filter in the case of the high-density polyethylene strong filter is 10 to 50 μm, the pore size of the filter in the case of the ultra high molecular weight polyethylene strong filter is 10 to 20 μm, made of polystyrene In the case of a strong rigidity filter, the pore size of the filter is 100 to 200 μm, Filter having a pore size in the case of the ethylene polymer manufactured by strong rigid filter is 30 to 100 [mu] m, simple membrane assay kit according to any one of claims 16 to 20.
JP2014149854A 2006-10-19 2014-07-23 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter Active JP5639730B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014149854A JP5639730B2 (en) 2006-10-19 2014-07-23 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006285113 2006-10-19
JP2006285113 2006-10-19
JP2014149854A JP5639730B2 (en) 2006-10-19 2014-07-23 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008286739A Division JP5586842B2 (en) 2006-10-19 2008-11-07 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014216847A Division JP2015014618A (en) 2006-10-19 2014-10-24 Method and kit for simple membrane assay using sample filtration filter

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014206544A JP2014206544A (en) 2014-10-30
JP5639730B2 true JP5639730B2 (en) 2014-12-10

Family

ID=40438795

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008286739A Active JP5586842B2 (en) 2006-10-19 2008-11-07 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
JP2013106457A Active JP5602279B2 (en) 2006-10-19 2013-05-20 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
JP2014149854A Active JP5639730B2 (en) 2006-10-19 2014-07-23 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
JP2014216847A Pending JP2015014618A (en) 2006-10-19 2014-10-24 Method and kit for simple membrane assay using sample filtration filter

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008286739A Active JP5586842B2 (en) 2006-10-19 2008-11-07 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
JP2013106457A Active JP5602279B2 (en) 2006-10-19 2013-05-20 Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014216847A Pending JP2015014618A (en) 2006-10-19 2014-10-24 Method and kit for simple membrane assay using sample filtration filter

Country Status (1)

Country Link
JP (4) JP5586842B2 (en)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2263548B1 (en) 2010-04-21 2013-06-26 Puritan Medical Products Company, LLC Collection device and material
CN101907526B (en) * 2010-05-28 2012-04-25 金黑鹰 Intestine mucosa collector
JP5729929B2 (en) * 2010-07-07 2015-06-03 デンカ生研株式会社 Sample collection swab having a shaft portion formed of a flexible material
JP6150559B2 (en) * 2013-02-28 2017-06-21 旭化成株式会社 Detection method of Mycoplasma pneumonia
JP6213109B2 (en) * 2013-07-09 2017-10-18 ニプロ株式会社 Infectious disease test kit
JP6226624B2 (en) 2013-08-08 2017-11-08 田中貴金属工業株式会社 Hemolytic streptococcal diagnostic immunochromatographic reagent, kit and detection method
WO2015146682A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 シャープ株式会社 Filtration tool
ES2833077T3 (en) * 2015-02-17 2021-06-14 Bio Marketing T Ltd Bmt Devices for collecting and analyzing biological samples and methods of using them
JP6688561B2 (en) * 2015-04-28 2020-04-28 デンカ生研株式会社 Microbial antigen recovery method
EP3324185B1 (en) 2015-07-16 2020-11-18 Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. Immunoassay and immunochromatographic kit
CN107727851A (en) * 2017-11-15 2018-02-23 北京舜雷科技有限公司 The system for detecting HIT antibody that a kind of immune agglutination and colloid gold chromatographic test paper strip are combined
CN108362527B (en) * 2018-06-25 2018-10-09 湖南欧杰生物科技发展有限公司 Three chamber communication type resampling filter devices and its water flowing filtering type sampling craft
CN109224882B (en) * 2018-10-31 2021-03-23 咸宁南玻光电玻璃有限公司 Porous organic filter and preparation method thereof
CN209858244U (en) * 2019-04-23 2019-12-27 珠海科域生物工程股份有限公司 Disposable specimen collecting box
JP7259073B2 (en) 2019-10-23 2023-04-17 旭化成株式会社 polyethylene powder, molding
KR102347135B1 (en) * 2020-03-19 2022-01-05 프리시젼바이오 주식회사 Device and methods for detecting norovirus using time-resolved fluorescence
JP7167954B2 (en) * 2020-03-19 2022-11-09 Tdk株式会社 MAGNETIC SENSOR DEVICE, MANUFACTURING METHOD THEREOF, AND ROTATING OPERATION MECHANISM
CN114904397B (en) * 2021-02-09 2023-09-19 上海工程技术大学 Method for measuring pore diameter and pore diameter distribution of filter membrane
CN114923739B (en) * 2022-05-20 2022-12-09 山东省威海基础工程公司 Intelligent multiple sampling device for gold mine geological exploration

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58180425A (en) * 1982-04-16 1983-10-21 Daicel Chem Ind Ltd Blood filter
FR2540992B1 (en) * 1983-02-15 1986-03-14 Millipore Sa DEVICE FOR VERIFYING THE STERILITY OF FLUIDS AND METHOD FOR MANUFACTURING STERILITY VERIFICATION CONTAINERS
JPH0718873B2 (en) * 1986-07-04 1995-03-06 東ソー株式会社 Cleaning liquid supply / drainage nozzle device
IL96887A (en) * 1991-01-06 1996-08-04 Orgenics Ltd Apparatus for dry chemical analysis of fluids
JP2740489B2 (en) * 1995-10-31 1998-04-15 本多プラス株式会社 Feces collection container
JPH10215859A (en) * 1997-02-03 1998-08-18 Idemitsu Kosan Co Ltd Filter device for trapping microbe, microbial numbermeasuring kit and method for measuring microbial number
AUPP323798A0 (en) * 1998-04-28 1998-05-21 Chandler, Howard Milne Sample collection method
JP2001120925A (en) * 1999-10-26 2001-05-08 Mitsubishi Plastics Ind Ltd Plastic filter for separating antistatic particulate
JP4346754B2 (en) * 1999-10-26 2009-10-21 日東電工株式会社 How to make a pipette filter
JP3290168B2 (en) * 1999-12-28 2002-06-10 アークレイ株式会社 Blood test equipment
JP2001245890A (en) * 2000-03-08 2001-09-11 Olympus Optical Co Ltd System for gathering helicobacter pylori fungi
JP2002325836A (en) * 2001-04-27 2002-11-12 Asahi Medical Co Ltd Method to evaluate filter performance of leukocyte removing filter and leukocyte removing filter material
US6634243B1 (en) * 2002-01-14 2003-10-21 Rapid Medical Diagnostics Corporation Sample testing device
JP3848599B2 (en) * 2002-06-27 2006-11-22 デンカ生研株式会社 Simple membrane assay and kit
JP4286157B2 (en) * 2003-01-21 2009-06-24 デンカ生研株式会社 Membrane assay
JP4315366B2 (en) * 2003-02-03 2009-08-19 日東電工株式会社 Chip filter and chip
ITMI20030643A1 (en) * 2003-04-01 2004-10-02 Copan Innovation Ltd BUFFER FOR THE COLLECTION OF BIOLOGICAL SAMPLES
JP4810871B2 (en) * 2004-09-03 2011-11-09 パナソニック株式会社 Microorganism detection method
JP4470657B2 (en) * 2004-09-03 2010-06-02 セイコーエプソン株式会社 Printing apparatus and microarray manufacturing apparatus
WO2006098804A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
TW200643396A (en) * 2005-03-14 2006-12-16 Nipro Corp Specimen material collection liquid container
JP2006215044A (en) * 2006-03-31 2006-08-17 Denka Seiken Co Ltd Easy membrane assay method and kit

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013200313A (en) 2013-10-03
JP2009036781A (en) 2009-02-19
JP2015014618A (en) 2015-01-22
JP5602279B2 (en) 2014-10-08
JP5586842B2 (en) 2014-09-10
JP2014206544A (en) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5639730B2 (en) Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
JP4339906B2 (en) Simple membrane assay method and kit using sample filtration filter
US8404479B2 (en) Simple membrane assay method and kit
JP5845033B2 (en) Immunochromatographic test device and kit for Mycoplasma pneumoniae detection
JP2008014751A (en) Membrane assay method using colored latex particle, and kit
JP4286157B2 (en) Membrane assay
JP4976068B2 (en) Simple immunoassay specimen suspension and assay method
JP2008268043A (en) Method for forming detection part of examination device, and examination device for measuring lateral flow immunity
JP2014098715A (en) Membrane assay method and kit using colored latex particle
WO2006073153A1 (en) Simplified assay method for detecting multiple subjects
WO2006043614A1 (en) Membrane immunoassay method
JP3848599B2 (en) Simple membrane assay and kit
JP2006084351A (en) Specimen suspension liquid composition, kit and test method
JP5911404B2 (en) Simple membrane assay and kit
JP6405339B2 (en) Simple membrane assay and kit
JP2012083370A (en) Membrane assay method and kit using colored latex particle
JP2009002961A (en) Easy membrane assay method and kit
WO2015093439A1 (en) Method for detecting helicobacter pylori
JP6405269B2 (en) Simple membrane assay and kit
JP4276898B2 (en) Membrane assay
JP2010044094A (en) Simple membrane assay method and kit
JP2006215044A (en) Easy membrane assay method and kit
JP2017078723A (en) Simple membrane assay method and kit
JP2020046436A (en) Simple membrane assay method and kit
JP2007121320A (en) Flow-through assay method, kit, and system

Legal Events

Date Code Title Description
TRDD Decision of grant or rejection written
A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20140918

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140924

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20141024

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5639730

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250