JP3848599B2 - Simple membrane assay and kit - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる検体の検査方法に関し、特に臨床上使用し得る簡易なメンブレンアッセイ法及びこの方法に使用されるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、抗原抗体反応や酵素反応等を利用した、ウイルスや細菌等の病原体への感染、妊娠の有無、血糖値など様々な測定項目を数分から数十分の短時間で検出あるいは定量する簡易検査試薬またはキットが開発されている。病原体構成蛋白質、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血糖等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬はＯＴＣとして一般薬局で販売されている。また病原体への感染を測定する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、症状が早期のうちに治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
現在、簡易検査方法として、メンブレンアッセイ法、特にニトロセルロース等の膜やフィルター等のメンブレンを用いたアッセイ方法が一般に知られており、フロースルー式とラテラルフロー式メンブレンアッセイ法に大別される。前者は被測定物を含む溶液を被測定物に対する検出用物質が塗布された膜を垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。いずれの場合も被測定物に特異的に結合する膜固相物質、被測定物、被測定物に特異的に結合する標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被測定物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。
しかし、このような膜やフィルターを用いるメンブレンアッセイ法による簡易検査方法では、患者から実際に採取された検体の分析において、被測定物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が生じることがある。病原体の感染を測定する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。したがって偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。従来、この問題を解決するため、検体を浮遊あるいは希釈させる緩衝液として界面活性剤を含有する緩衝液を用いたり、試料を添加する際に濾過フィルターを通すなどの工夫がなされてきたが、必ずしも満足のゆくものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、メンブレンアッセイ法を用いた検体の簡易な検査方法において、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出あるいは定量を可能にする方法及びそのような方法において使用されるキットを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
メンブレンアッセイ法を用いた被測定物の検出、定量を行うにあたり、被測定物を含有する可能性がある検体試料を、濾過フィルターを通して濾過することにより、偽陽性の発生が大きく抑制されることが見出された。
すなわち本発明の課題は、被測定物を捕捉するための捕捉試薬が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被測定物の簡易メンブレンアッセイ法であって、検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後にメンブレン上に滴下し、前記検体試料中の被測定物の存在を検出することを特徴とする方法、により解決される。
また、本発明の課題は、以下を含む、検体試料中の被測定物の存在を検査するための簡易メンブレンアッセイキット；
（１）濾過フィルターを備えた検体試料用濾過チューブ、及び
（２）被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置、
により解決される。
【０００５】
本発明の他の実施態様は、濾過フィルターの材質が、不織布、紙、ガラス繊維、シリカ繊維、ニトロセルロース、セルロースエステル、ニトロセルロースとセルロースエステルの混合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６、ポリエステル、コットン、ステンレススチール繊維及びこれらの組み合わせからなる群より選ばれることを特徴とする、上記方法またはキットに関する。
本発明の好ましい実施態様は、上記濾過フィルターの孔径または保留粒子径が０．２〜２．０μｍ、特に０．２〜０．６μｍである、上記方法またはキットである。
また、本発明の他の好ましい実施態様は、上記濾過フィルターが、ガラス繊維フィルター、ニトロセルロースフィルター、またはガラス繊維フィルターとニトロセルロースフィルターの組み合わせである、上記方法またはキットである。
さらに、本発明の他の好ましい実施態様は、上記メンブレンの材質が不織布、紙、ニトロセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６及びセルロースエステルとニトロセルロースの混合物からなる群より選ばれること、及び前記メンブレンの孔径または保留粒子径が該濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上でありかつ０．３〜１０μｍである、上記方法またはキットである。
本発明のさらに好ましい実施態様は、上記メンブレンの材質がニトロセルロースであり、かつその孔径が０．５〜７μｍである、上記方法またはキットである。
また、本発明の他の好ましい実施態様は、検体試料中の被測定物がインフルエンザウイルスである、上記方法またはキットである。
また、本発明の特に好ましい実施態様は、フロースルー式またはラテラルフロー式簡易メンブレンアッセイ法に関する上記方法及びキットである。
【０００６】
本発明の方法により、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる簡易メンブレンアッセイ法において偽陽性の発生を大きく減らすことができた。これは以下のような理由によると考えられる。被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる簡易メンブレンアッセイ法では、被測定物が存在すると予測される部位、例えば患者の咽頭や鼻腔等から拭い液を採取して緩衝液に浮遊したり、被測定物を含む鼻汁や尿等の分泌物や排泄物から一部を採取し、緩衝液で希釈して、メンブレンアッセイ用の試料を作製するが、この場合、前記試料中に被測定物の他、検体採取部位から剥落した細胞や分泌物、排泄物の成分等が混入することがある。このような混入物にはプロテオグルカン、糖脂質等の粘性物質をはじめ、様々な生体成分が含まれているため、前記試料をそのまま膜等のメンブレン上に添加すると、上記成分の一部がメンブレン上あるいはメンブレン中に付着すると考えられる。特にメンブレンとして孔径または保留粒子径が０．１〜１０μｍのものが使用されることが多いが、この孔径または保留粒子径に匹敵する大きさの成分が添加されると、メンブレン中の細孔を塞ぎ溶液中の成分の移動を阻害することが考えられる。このような現象により非特異的な反応が起こり、被測定物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が起こると考えられる。本発明の方法によりこのような偽陽性を効率よく抑制することができ、信頼性の高い簡易検査方法を確立することができた。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳しく説明する。
（簡易メンブレンアッセイ方法）
本発明の方法は、被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被測定物の簡易メンブレンアッセイ法であって、検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に前記メンブレン上に滴下し、前記検体試料中の被測定物の存在を検出あるいは定量することを特徴とする方法である。
本明細書において“簡易メンブレンアッセイ法”とは、被測定物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含むアッセイ装置を用いて検体試料中の被測定物の存在の有無を短時間に簡便に検査する方法である。典型的には、被測定物と、前記捕捉物質及び標識化検出試薬を反応させてサンドイッチ状の複合体をメンブレン上に形成させ、前記標識物を検出することによりこの複合体の存在を検出する方法である。被測定物と前記捕捉物質及び標識化検出試薬との反応としては、抗原抗体反応、その他の受容体とレセプターの反応、ビオチンとアビジンの特異的結合反応、相補的配列を持つＤＮＡ同士の反応等が挙げられる。また、本発明の簡易検査方法は、このような方法に用いるものであれば、被測定物、メンブレン、標識物の種類について限定されるものではない。
【０００８】
本発明のメンブレンアッセイ法は、２種類のメンブレンアッセイ法、すなわちフロースルー式メンブレンアッセイ法またはラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用するものであることが、簡便かつ迅速であるため好ましい。フロースルー式メンブレンアッセイ法は被測定物を含む溶液を、被測定物と特異的に結合する捕捉試薬や検出用物質が塗布されたメンブレンに対して垂直方向に通過させるものであり、被測定物に特異的に結合する捕捉物質、被測定物、被測定物に特異的に結合する標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被測定物の検出あるいは定量を行う。ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法は、同様なメンブレンを用いて、メンブレンに対して被測定物を含む溶液を水平方向に展開させる点でフロースルー式メンブレンアッセイ法と異なるが、被測定物の検出原理は同様である。
【０００９】
以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
（１）ウイルスや細菌等に感染した患者の咽頭あるいは鼻腔等から採取した検体試料を後述するような検体浮遊液に浮遊させる。
（２）この浮遊液を、濾過フィルターを備えた検体試料用濾過チューブ中にいれて濾過する。
（３）この濾過液を、メンブレンを備えたアッセイ装置中の被測定物に特異的に結合して被測定物を捕捉する捕捉試薬が結合したメンブレンに滴下して、被測定物をメンブレン上に捕捉させる。
（４）前記メンブレン上に、被測定物に特異的に結合する標識化検出試薬を滴下し、捕捉試薬／被測定物／標識化検出試薬の複合体を形成させる。
（５）前記複合体中の標識化検出試薬により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被測定物の有無を測定する。
【００１０】
（濾過フィルター）
本発明の方法において、患者から採取した検体試料は検体浮遊液に浮遊させた後、濾過フィルターを用いて濾過される。濾過フィルターの孔径（直径）または保留粒子径は０．２〜２．０μｍ、好ましくは０．２〜０．６μｍである。濾過フィルターの孔径あるいは保留粒子径は、本発明の効果において重要である。孔径あるいは保留粒子径が大きすぎると、メンブレン上で非特異的結合が起こって偽陽性を示す場合がある。逆に小さすぎると試料中に存在する粘性物や凝集物のためにフィルター自身が詰まってしまい濾過が不可能であるか、あるいはフィルター面積をかなり広くしなければならず、簡易検査方法に用いるという目的から見て不適切である。従って、本発明の濾過フィルターの孔径あるいは保留粒子径の範囲は０．２〜２．０μｍであり、０．２〜０．６μｍの範囲のものがより好ましい。
濾過フィルターは１種類だけではなく、材質の異なるもの、孔径あるいは保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせても良い。その場合、フィルターを構成するもののうち、最も小さな孔径あるいは保留粒子径のものが、そのフィルターの孔径あるいは保留粒子径となる。したがって組み合わせのうち、一つでも孔径あるいは保留粒子径が０．２〜２．０μｍの範囲にあれば、他のものがその範囲を越えていたとしても問題はない。
また、同じフィルターを２枚以上組み合わせることにより孔径または保留粒子径にばらつきのあるフィルターを使用しても一定の効果を得ることができるという利点が得られる。さらに強度的に不十分なフィルターを用いる場合に、２枚以上重ねてフィルターの強度を上げることも出来る。しかし、フィルターの種類によっては複数枚重ねることによりフィルターが詰まりやすくなり、濾過するための圧力が大きくなり、簡便性が損なわれるという欠点も有する。
【００１１】
濾過フィルターの材質は、不織布、紙、ガラス繊維、シリカ繊維、ニトロセルロース、セルロースエステル、ニトロセルロースとセルロースエステルの混合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６、ポリエステル、コットン、ステンレススチール繊維等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはガラス繊維とニトロセルロースである。
一般に濾過フィルターは、捕集機構上、デプスフィルターとスクリーンフィルターに分かれる。デプスフィルターはフィルター内部で固形物を捕集するものであり、スクリーンフィルターはフィルター表面で固形物を捕集するものであるが、どちらの機構のものでも好適に用いることができる。
【００１２】
（濾過チューブ）
上記濾過フィルターは、本発明の簡易メンブレンアッセイ法またはキットにおいて、検体試料用濾過チューブの先端に取り付けて使用されることが好ましい。すなわち、濾過チューブ中に浮遊液に浮遊させた検体試料をいれて、先端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をメンブレンアッセイ装置中のメンブレンに滴下する方法が簡便であり、好ましい。この濾過チューブの一実施態様の模式図を図３及び図４に示す。濾過チューブは例えば図３に記載されるように先端部と本体部からなる形状であり、先端部の内部に図４に示されるように濾過フィルターが備えつけられている。本体部に浮遊液に浮遊させた検体試料を入れ、本体部に濾過フィルターを備えた先端部を取り付ける。濾過フィルターを通して検体試料を濾過し、濾液をメンブレンアッセイ装置に滴下する。本体部がポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィルターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料を濾過することができるため、好ましい。
【００１３】
（アッセイ装置）
本明細書にいうメンブレンを備えたアッセイ装置（メンブレンアッセイ装置ともいう）とは、被測定物に特異的に結合する捕捉物質が固相化されたメンブレンを含む装置である。このようなアッセイ装置としては、フロースルー式メンブレンアッセイ法またはラテラルフロー式メンブレンアッセイ法を利用する装置であることが好ましい。フロースルー式メンブレンアッセイ法を利用するアッセイ装置の具体例は、例えば図１及び２に示されるような装置である。
図１は装置の平面図であり、図２は、図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。図１及び２において、ａは、調製した検体試料を滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴（Ａホール及びＢホール）を備えたアダプターである。ｂは被測定物に特異的に結合する捕捉物質が結合したメンブレンであり、ｃは液体を吸収する部材である。
【００１４】
（メンブレン）
メンブレンアッセイ装置中のメンブレンの材質としては、不織布、紙、ニトロセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、四フッ化エチレン樹脂、フッ化ビニリデン樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン６，６及びセルロースエステルとニトロセルロースの混合物からなる群が挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質が挙げられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブレンの孔径あるいは保留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上でありかつ０．３〜１０μｍであることが好ましく、０．５〜７μｍが特に好ましい。また、メンブレンの厚さは特に限定されないが、通常、１００〜２００μｍ程度である。
【００１５】
（被測定物）
本明細書にいう被測定物にはインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｃ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンO抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β-グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＲＦ抗体、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の検査方法により分析するための検体試料は、咽頭あるいは鼻腔拭い液を適当な緩衝液中に浮遊させた溶液、鼻腔吸引液、便懸濁液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、髄液、膿、臓器抽出液、各種組織抽出液等の生体試料、食品抽出液、培養上清、上水、下水、湖水、河川水、海水、土壌抽出液、汚泥抽出液及びそれらを適当な緩衝液で希釈した溶液を用いることができるがこれらに限定されない。また前記緩衝液には０．０１〜２０質量％の界面活性剤を含有させることができる。界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル（ナカライテスク（株））、Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク（株））、Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ナカライテスク（株））、ＮＰ−４０：ノニデット Ｐ−４０（ナカライテスク（株））、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４（カルビオケム（株））、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク（株））、ＣＨＡＰＳ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸（同仁化学（株））等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。
【００１７】
（捕捉物質）
被測定物を捕捉するための捕捉物質は、被測定物と、抗原抗体反応のような特異的反応により結合して、複合体を形成する物質である。従って、被測定物により使用する捕捉物質が異なることは当然であるが、一般には被測定物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。そのほか、ウイルス抗原、ウイルス中空粒子、遺伝子組換え大腸菌発現タンパク質、遺伝子組換え酵母発現タンパク質等が挙げられる。このような捕捉物質を上述したメンブレン表面に結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または化学的な結合によるものであってもよい。捕捉物質が結合したメンブレンの調製は、例えば、捕捉物質を緩衝液等に希釈した溶液をメンブレンに吸着してその後乾燥することにより行われる。
【００１８】
（簡易メンブレンアッセイキット）
本発明の簡易メンブレンアッセイキットは、上述した本発明の簡易メンブレンアッセイ法に用いるキットである。本発明の簡易メンブレンアッセイキットは少なくとも以下の▲１▼及び▲２▼を含む。
▲１▼濾過フィルター、及び
▲２▼被測定物を捕捉するための捕捉物質が結合したメンブレンを備えたアッセイ装置。
上記濾過フィルターは、さらに上述した検体試料用濾過チューブに取り付けられていることが好ましい。
キットはさらに必要により、検体浮遊液、洗浄液組成物、および／または標識化検出試薬を含んでいてもよい。また、標識化検出試薬の標識が酵素標識である場合には、後述する酵素の基質、反応停止液等を含むことができる。
また、必要に応じて、キットの活性を検査するためのバッファーのみからなる陰性コントロール液、抗原性物質などの被測定物を含むバッファーからなる陽性コントロールを含んでいてもよい。さらに、滅菌綿棒等の検体採取器具を含んでいてもよい。
【００１９】
（検体浮遊液）
検体は、例えば患者の咽頭・鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取するか、または鼻腔吸引液等を用いることができるが、このようにして得られた検体は、通常検体浮遊液に浮遊させてアッセイを行う。検体浮遊液としては、免疫拡散法、酵素免疫測定法、凝集法等の免疫学的手法による試料検出または定量法において通常使用されるバッファー類等を使用することができる。
より具体的には、生理食塩水、リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）、ゼラチン添加ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ、グッドの緩衝液、子牛インフュージョンブロス（ＶＩＢ）、ハートインフュージョンブロス、イーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ＢＳＡ添加ＥＭＥＭなどが挙げられるがこの限りではない。また、上記バッファー類は２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
また、さらに上記組成に加えて、塩基性アミノ酸、無機塩類および／または界面活性剤を添加することもできる。塩基性アミノ酸、無機塩類および界面活性剤の少なくとも二種類を含む検体浮遊液を使用することにより、検体中に含まれる被測定物以外の成分の、メンブレン自体への結合やメンブレン上の捕捉物質への非特異的な結合を軽減させることができ好ましい。
【００２０】
（検出試薬）
本明細書において、検出試薬とは、被測定物に特異的に結合し、被測定物と複合体を形成しうるものである。また、標識化検出試薬とは、被測定物と複合体を形成した後に何らかの手段で検出可能なように標識された検出試薬を意味する。例えば、被測定物がウイルス等の抗原物質である場合には、そのウイルスに対する抗体であって、酵素等で標識化された抗体が挙げられる。このように酵素で標識された場合には、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。標識化される前の検出試薬としては、捕捉試薬について述べたものと同じものが挙げられる。また、標識は、酵素、蛍光発光性標識、磁性体標識、放射性同位元素、金コロイド、着色ラテックス等が挙げられる。
酵素標識を用いる場合には、使用される酵素としては例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素が挙げられる。
【００２１】
（基質）
標識化検出試薬の標識として酵素標識を用いた場合には、通常その酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものを添加する。具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコース‐６‐リン酸ＮＡＤ＋が挙げられる。
【００２２】
（反応停止液）
本発明のキットにはさらに必要により、例えば酵素と基質との反応を停止させるための反応停止液が含まれていてもよい。このような反応停止液としては、例えば、クエン酸、硫酸等が挙げられる。
【００２３】
【実施例】
［実施例１］
１．モノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。
得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からそれぞれ硫安分画法によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を得た。
【００２４】
（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）
精製Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）は、３７℃でインキュベーター中で維持し、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫安分画法によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を得た。
【００２５】
２．標識抗インフルエンザ抗体液の作製
（１）標識抗Ａ型インフルエンザ抗体液の作製
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち１種類について２０ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ′消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザＦ（ａｂ′）2精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザＦａｂ′精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ１．５ｍＬを５０ｍＭホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ；同仁化学（株））０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリフォスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
【００２６】
濃縮した抗Ａ型インフルエンザＦａｂ′とマレイミド−アルカリフォスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザＦａｂ′を得た。反応液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂ′を得た。
精製アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂ′を４．５（Ｗ／Ｖ）％ウシ血清アルブミン、５．２５（Ｗ／Ｖ）％ポリエチレングリコール６０００、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５（Ｗ／Ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛の組成を有する標識抗体希釈液で１．０μｇ／ｍＬに希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、標識抗Ａ型インフルエンザ抗体液を得た。
【００２７】
（２）標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体液の作製
精製抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体のうち１種類について２０ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃１時間でＦａｂ′消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画して抗Ｂ型インフルエンザＦ（ａｂ′）2精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理した。処理液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画して抗Ｂ型インフルエンザＦａｂ′精製画分を得た後、約１ｍＬになるまで濃縮した。
濃縮した抗Ｂ型インフルエンザＦａｂ′と２−（１）で作製したマレイミド−アルカリフォスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃、２０時間で穏やかに撹拌して反応させ、アルカリフォスファターゼ標識抗Ｂ型インフルエンザＦａｂ′を得た。反応液をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂ′を得た。
【００２８】
精製アルカリフォスファターゼ標識Ｆａｂ′を４．５（Ｗ／Ｖ）％ウシ血清アルブミン、５．２５（Ｗ／Ｖ）％ポリエチレングリコール６０００、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５（Ｗ／Ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛の組成を有する標識抗体希釈液で１．０μｇ／ｍＬに希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体液を得た。
【００２９】
３．インフルエンザウイルス検出用メンブレンアッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用メンブレンアッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブレンは、孔径３μｍを有するニトロセルロースメンブレン（サイズ２×３ｃｍ、厚さ１２５μｍ）を用いた。
メンブレンへの固相は、２種の抗体溶液をニトロセルロースメンブランヘスポットして行った。装置のＡホールには精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち標識に用いなかったもの０．２ｍｇ／ｍＬが含まれる溶液を１２μＬ、Ｂホールには精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体のうち標識に用いなかったもの１ｍｇ／ｍＬが含まれる溶液１２μＬを０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、それぞれスポットした。抗体を希釈する緩衝液は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いた。スポット後、４５℃の乾燥室で４０分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用メンブレンアッセイ装置を作製した。
【００３０】
４．インフルエンザウイルスの検出
（１）メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が疑われる患者１１５人の鼻腔より滅菌綿棒を用いて拭い液を採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ塩化ナトリウム、１（Ｗ／Ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５（Ｗ／Ｖ）％ウシ血清アルブミンの組成を有する溶液１．５ｍＬ中に浮遊し、試験用試料を作製した。試験用試料をよく懸濁させた後、３つの検体試料用濾過チューブに４００μＬずつ三等分し、それぞれのチューブの先端に下記の３種類のノズルを装着した。ノズル▲１▼には２枚の孔径（保留粒子径）０．６７μｍのガラス繊維の間に孔径０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンを挟んだフィルターを装填し、ノズル▲２▼には孔径（保留粒子径）０．６７μｍのガラス繊維を３枚重ねにしたフィルターを装填し、ノズル▲３▼にはフィルターを装填しなかった。
【００３１】
検体試料を各ノズルを通過して濾過した後、３．で作成したメンブレンアッセイ装置のＡホールとＢホールにそれぞれ１５０μＬずつ滴加し、ニトロセルロースメンブレンの下部に備えられた液体吸収部材に試料が完全に吸収されるまで放置した。次にＡホールには標識抗Ａ型インフルエンザ抗体液を、Ｂホールには標識抗Ｂ型インフルエンザ抗体液を、それぞれ１８０μＬずつ滴加後、前記抗体液が液体吸収部材に完全に吸収されるまで放置した。次にアダプターを除去し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５（Ｗ／Ｖ）％アルギニン塩酸塩、１（Ｗ／Ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の組成を有する洗浄液をＡホールとＢホールにそれぞれ１５０μＬずつ滴加後、前記洗浄液が液体吸収部材に完全に吸収されるまで放置した。続いて、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質液（Ｓｉｇｍａ社製）をＡホールとＢホールにそれぞれ２５０μＬ滴加し、発色反応を開始させた。１０分後、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をＡホールとＢホールにそれぞれ１５０μＬずつ滴加し反応を停止させた。反応停止直後にＡホールとＢホールを鉛直上方から観察し、Ａホールにのみ発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、Ｂホールにのみ発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、ＡＢ両ホールに発色が認められた場合はＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス陽性、ＡＢ両ホールとも発色が認められない場合は陰性と判定した。
【００３２】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による検出
５−（１）で作製した試験用試料の残りを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により検体中にインフルエンザウイルス遺伝子が存在するかを確認した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、清水の方法（感染症学雑誌、第７１巻、第６号、ｐ５２２−５２６）で実施した。
（３）簡易メンブレンアッセイ法とＲＴ−ＰＣＲ法の比較
本発明の簡易メンブレンアッセイ法と上述したＲＴ−ＰＣＲ法の判定結果を比較を表１から表３に示す。ＲＴ−ＰＣＲ法は感度及び特異性が極めて高い測定法であることが知られており、ＲＴ−ＰＣＲ法の結果と異なる判定となった場合に偽陽性または偽陰性とみなした。
【００３３】
【表１】
【表２】
【表３】
ノズル▲１▼を用いた場合にはＲＴ−ＰＣＲ法による判定と完全に一致し、偽陽性は見られなかった。ノズル▲２▼を用いた場合は偽陽性発生率が７％（１１５検体中８検体（表２中、□で囲まれた偽陽性検体の合計））であり、それ以外はＲＴ−ＰＣＲ法による判定と一致した。一方、ノズル▲３▼を用いた場合には偽陽性発生率は８３％（１１５検体中９６検体（表３中、□で囲まれた偽陽性検体の合計））であった。
【発明の効果】
本発明の方法及びキットにより、偽陽性の発生を防止することができ、信頼性の高い簡易メンブレンアッセイ法を確立することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施態様であるメンブレンアッセイ装置の平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。
【図３】本発明において使用される検体試料用濾過チューブの一実施態様を示す。
【図４】図３の検体試料用濾過チューブ先端部の透視図を示す。
【符号の説明】
Ａ：穴
Ｂ：穴
ａ：アダプター
ｂ：メンブレン
ｃ：液体吸収部材
ｄ：濾過チューブ先端部
ｅ：濾過チューブ本体部
ｆ：濾過フィルター[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a specimen inspection method using an assay device equipped with a membrane, and more particularly to a simple membrane assay method that can be used clinically and a kit used in this method.
[0002]
[Prior art]
Recently, a simple test that uses antigen-antibody reaction or enzyme reaction to detect or quantify various measurement items such as infection with pathogens such as viruses and bacteria, presence of pregnancy, blood glucose level in a few minutes to tens of minutes. Reagents or kits have been developed. Pathogen constituent proteins, human ciliary gonadotropin (hCG), blood glucose, and the like are targets for detection or quantification. Many of the simple test reagents are characterized by the fact that they do not require special equipment, are easy to operate, and are inexpensive. For example, simple test reagents for pregnancy diagnosis are sold as OTC at general pharmacies. Unlike other test reagents, simple test reagents for measuring infection with pathogens are widely used in general hospitals and clinics in addition to large hospitals and medical test centers. These facilities are often the first medical institutions visited by patients, and if specimens collected from patients are found to be infected on the spot, symptoms can be treated as soon as possible. The importance of test reagents in medicine is increasing.
Currently, membrane assay methods, particularly assay methods using membranes such as nitrocellulose and membranes such as filters, are generally known as simple inspection methods, and are roughly classified into flow-through type and lateral flow type membrane assay methods. The former allows a solution containing the object to be measured to pass through a film coated with a substance for detection on the object to be measured in the vertical direction, and the latter allows the solution to be developed in the horizontal direction. In either case, a membrane solid phase substance that specifically binds to the analyte, a analyte, or a complex of a label substance that specifically binds to the analyte is formed on the membrane to detect or quantify the label. This is common in that the object to be measured is detected or quantified.
However, in such a simple test method using a membrane assay method using a membrane or a filter, in the analysis of a sample actually collected from a patient, it is determined that the object to be measured is positive even though it is not present in the sample. So-called false positives may occur. If a false positive reaction occurs when measuring the infection of a pathogen, it will give incorrect information about the disease, so it will not only delay the cause identification but also take inappropriate measures, making the medical condition more serious, etc. It can have serious consequences. Therefore, suppressing false positives is an extremely important issue in view of the main purpose of the simple test method. Conventionally, in order to solve this problem, contrivances have been made such as using a buffer containing a surfactant as a buffer for suspending or diluting a specimen, or passing a filtration filter when adding a sample. It was not satisfactory.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a simple test method for a specimen using a membrane assay method, which prevents false positives and enables highly accurate detection or quantification of an object to be measured, and is used in such a method. Is to provide a kit.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In the detection and quantification of analytes using membrane assay methods, the occurrence of false positives can be greatly suppressed by filtering specimen samples that may contain analytes through a filtration filter. It was found.
That is, an object of the present invention is a simple membrane assay method for an object to be measured in a sample sample using an assay apparatus including a membrane to which a capture reagent for capturing the object to be measured is bound, and the sample sample is filtered This is solved by a method characterized by detecting the presence of an object to be measured in the specimen sample after being filtered using a filter.
Moreover, the subject of this invention is the simple membrane assay kit for test | inspecting presence of the to-be-measured object in a sample sample including the following;
(1) a specimen sample filtration tube equipped with a filtration filter, and (2) an assay device comprising a membrane bound with a capture substance for capturing the analyte.
It is solved by.
[0005]
In another embodiment of the present invention, the material of the filter is nonwoven fabric, paper, glass fiber, silica fiber, nitrocellulose, cellulose ester, a mixture of nitrocellulose and cellulose ester, polyethersulfone, polysulfone, tetrafluoroethylene resin Or a vinylidene fluoride resin, polycarbonate, polypropylene, polyamide, nylon 6,6, polyester, cotton, stainless steel fiber, and a combination thereof.
A preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the filtration filter has a pore size or retained particle size of 0.2 to 2.0 μm, particularly 0.2 to 0.6 μm.
Another preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the filtration filter is a glass fiber filter, a nitrocellulose filter, or a combination of a glass fiber filter and a nitrocellulose filter.
Furthermore, in another preferred embodiment of the present invention, the material of the membrane is nonwoven fabric, paper, nitrocellulose, glass fiber, silica fiber, cellulose ester, polyethersulfone, polysulfone, tetrafluoroethylene resin, vinylidene fluoride resin, It is selected from the group consisting of polycarbonate, polypropylene, polyamide, nylon 6,6 and a mixture of cellulose ester and nitrocellulose, and the pore diameter or retained particle diameter of the membrane is equal to or larger than the pore diameter or retained particle diameter of the filter. The above method or kit, which is 3 to 10 μm.
A further preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the material of the membrane is nitrocellulose and the pore diameter is 0.5 to 7 μm.
Another preferred embodiment of the present invention is the above method or kit, wherein the analyte in the sample sample is influenza virus.
A particularly preferred embodiment of the present invention is the above method and kit relating to a simple membrane assay method using flow-through or lateral flow.
[0006]
According to the method of the present invention, it was possible to greatly reduce the occurrence of false positives in a simple membrane assay method using an assay device including a membrane to which a capture substance for capturing an object to be measured is bound. This is considered to be due to the following reasons. In a simple membrane assay method using an assay device equipped with a membrane to which a capture substance is bound to capture the object to be measured, the wiping fluid is collected from the site where the object is expected to be present, such as the patient's pharynx or nasal cavity. In this case, a sample for membrane assay is prepared by floating in the buffer solution or collecting a part from secretions and excrement such as nasal discharge and urine containing the measurement object and diluting with buffer solution. In addition to the object to be measured, the cells, secretions, excrement components, and the like that have fallen from the specimen collection site may be mixed in the sample. Since such contaminants include various biological components including viscous substances such as proteoglucan and glycolipid, when the sample is added as it is onto a membrane such as a membrane, a part of the above components is membrane. It is thought that it adheres to the top or in the membrane. In particular, a membrane having a pore size or retained particle size of 0.1 to 10 μm is often used. When a component having a size comparable to this pore size or retained particle size is added, pores in the membrane are removed. It is conceivable to inhibit the movement of components in the plugging solution. It is considered that a non-specific reaction occurs due to such a phenomenon, and a so-called false positive occurs in which the object to be measured is determined to be positive even though it is not present in the sample. Such false positives can be efficiently suppressed by the method of the present invention, and a simple and reliable test method can be established.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
(Simple membrane assay method)
The method of the present invention is a simple membrane assay method for an analyte in a specimen sample using an assay device including a membrane to which a capture substance for capturing the analyte is bound. It is a method characterized by detecting or quantifying the presence of an object to be measured in the specimen sample by dropping it onto the membrane after filtration.
In this specification, the “simple membrane assay method” refers to the presence or absence of an analyte in a sample using an assay device including a membrane on which a capture substance that specifically binds to the analyte is immobilized. This is a simple inspection method in a short time. Typically, the presence of the complex is detected by reacting the analyte, the capture substance and the labeled detection reagent to form a sandwich complex on the membrane and detecting the label. Is the method. Examples of the reaction between the analyte and the capture substance and the labeled detection reagent include antigen-antibody reaction, other receptor-receptor reaction, biotin-avidin specific binding reaction, reaction between complementary DNA sequences, etc. Is mentioned. In addition, the simple inspection method of the present invention is not limited to the type of the object to be measured, the membrane, and the label as long as it is used for such a method.
[0008]
The membrane assay method of the present invention preferably uses two types of membrane assay methods, namely, a flow-through type membrane assay method or a lateral flow type membrane assay method because it is simple and rapid. In the flow-through membrane assay method, a solution containing an object to be measured is passed in a direction perpendicular to a membrane coated with a capture reagent or detection substance that specifically binds to the object to be measured. By forming a complex of a capture substance that specifically binds to the target substance, the analyte, and a label substance that specifically binds to the analyte, and detecting or quantifying the label, Perform quantification. The lateral flow membrane assay method differs from the flow-through membrane assay method in that the same membrane is used and the solution containing the sample is spread horizontally with respect to the membrane. It is the same.
[0009]
Below, an example of a more specific procedure is shown about the method of this invention, and this invention is demonstrated.
(1) A specimen sample collected from a pharynx or nasal cavity of a patient infected with a virus or bacteria is suspended in a specimen suspension as described later.
(2) The suspended liquid is filtered in a specimen sample filtration tube equipped with a filtration filter.
(3) The filtrate is dropped on a membrane bound with a capture reagent that specifically binds to the analyte in the assay device equipped with the membrane and captures the analyte, and the analyte is placed on the membrane. Capture.
(4) A labeled detection reagent that specifically binds to the analyte is dropped on the membrane to form a capture reagent / analyte / labeled detection reagent complex.
(5) The presence / absence of the analyte in the sample is measured by detecting the presence of the complex with the labeled detection reagent in the complex.
[0010]
(Filtration filter)
In the method of the present invention, a specimen sample collected from a patient is suspended in a specimen suspension and then filtered using a filtration filter. The pore size (diameter) or retained particle size of the filtration filter is 0.2 to 2.0 μm, preferably 0.2 to 0.6 μm. The pore size or retained particle size of the filtration filter is important in the effect of the present invention. If the pore size or retained particle size is too large, non-specific binding may occur on the membrane, which may indicate false positives. On the other hand, if it is too small, the filter itself will be clogged due to viscous substances and agglomerates present in the sample and filtration will be impossible, or the filter area will have to be considerably widened, and it will be used for simple inspection methods. Inappropriate for the purpose. Therefore, the pore size or retained particle size of the filtration filter of the present invention is 0.2 to 2.0 μm, and more preferably 0.2 to 0.6 μm.
The filtration filter is not limited to a single type, but may be a combination of several different materials, or different pore diameters or retained particle diameters. In that case, among the constituents of the filter, the one having the smallest pore diameter or retained particle diameter is the pore diameter or retained particle diameter of the filter. Therefore, if at least one of the combinations has a pore diameter or a retained particle diameter in the range of 0.2 to 2.0 μm, there is no problem even if the others exceed the range.
Further, by combining two or more of the same filters, there is an advantage that a certain effect can be obtained even if a filter having a variation in pore diameter or retained particle diameter is used. Furthermore, when using a filter with insufficient strength, the strength of the filter can be increased by stacking two or more sheets. However, depending on the type of filter, there is a disadvantage that the filter is easily clogged by stacking a plurality of filters, the pressure for filtering increases, and the convenience is impaired.
[0011]
The material of the filtration filter is nonwoven fabric, paper, glass fiber, silica fiber, nitrocellulose, cellulose ester, mixture of nitrocellulose and cellulose ester, polyethersulfone, polysulfone, tetrafluoroethylene resin, vinylidene fluoride resin, polycarbonate, polypropylene , Polyamide, nylon 6,6, polyester, cotton, stainless steel fiber, and the like, but are not limited thereto. Preferred are glass fiber and nitrocellulose.
In general, a filtration filter is divided into a depth filter and a screen filter due to a collection mechanism. The depth filter collects solid matter inside the filter, and the screen filter collects solid matter on the filter surface, but either mechanism can be suitably used.
[0012]
(Filtration tube)
In the simple membrane assay method or kit of the present invention, the filtration filter is preferably attached to the tip of a specimen sample filtration tube. That is, a method of placing a specimen sample suspended in a suspension in a filtration tube, filtering through a filtration filter attached to the tip, and dropping the filtrate onto a membrane in a membrane assay device is simple and preferable. The schematic diagram of one embodiment of this filtration tube is shown in FIG.3 and FIG.4. For example, as shown in FIG. 3, the filtration tube has a shape composed of a tip portion and a main body portion, and a filtration filter is provided inside the tip portion as shown in FIG. Place the specimen sample suspended in the suspension in the main body, and attach the tip with a filtration filter to the main body. The specimen sample is filtered through a filtration filter, and the filtrate is dropped onto the membrane assay device. When the main body portion is made of a flexible material such as polyethylene or polyethylene terephthalate (PET), it is preferable because the specimen sample can be easily filtered by applying pressure to the inside by a hand or the like with the filtration filter attached. .
[0013]
(Assay device)
An assay device (also referred to as a membrane assay device) having a membrane as used in the present specification is a device including a membrane on which a capture substance that specifically binds to a measurement object is immobilized. Such an assay device is preferably a device utilizing a flow-through membrane assay method or a lateral flow membrane assay method. A specific example of an assay device using a flow-through membrane assay is a device as shown in FIGS. 1 and 2, for example.
FIG. 1 is a plan view of the apparatus, and FIG. 2 is a cross-sectional end view taken along the line II ′ of FIG. 1 and 2, a is an adapter having an opening for dropping the prepared specimen sample and having holes (A hole and B hole) through which the sample passes on the bottom surface. b is a membrane to which a capture substance that specifically binds to the object to be measured is bound, and c is a member that absorbs liquid.
[0014]
(Membrane)
The material of the membrane in the membrane assay device includes nonwoven fabric, paper, nitrocellulose, glass fiber, silica fiber, cellulose ester, polyethersulfone, polysulfone, tetrafluoroethylene resin, vinylidene fluoride resin, polycarbonate, polypropylene, polyamide, Mention may be made of the group consisting of nylon 6,6 and mixtures of cellulose esters and nitrocellulose, particularly preferably microporous materials made from nitrocellulose. Moreover, the mixture of the said cellulose ester and nitrocellulose can also be used suitably. The pore diameter or retained particle diameter of the membrane is not less than the pore diameter or retained particle diameter of the filtration filter, preferably 0.3 to 10 μm, particularly preferably 0.5 to 7 μm. Moreover, although the thickness of a membrane is not specifically limited, Usually, it is about 100-200 micrometers.
[0015]
(Measurement object)
The analytes referred to in this specification include virus antigens such as influenza virus, adenovirus, RS virus, HAV, HBc, HCV, HIV, EBV, Norwalk-like virus, Chlamydia trachomatis, Streptococcus, Bordetella pertussis, Helicobacter Pylori, Leptospira, Treponema Paridam, Toxoplasma gondii, Borrelia, Bacillus anthracis, MRSA and other bacterial antigens, Mycoplasma lipid antigens, peptide hormones such as human ciliary gonadotropin, steroids such as steroid hormones, physiologically active amines such as epinephrine and morphine , Vitamins such as vitamin B, antibiotics such as prostaglandins, tetracycline, toxins produced by bacteria, various tumor markers, pesticides, anti-E. Coli antibodies, anti-Salmonella antibodies, anti-staphylococcal antibodies, anti-camphorova Antibody, anti-C. Perfringens antibody, anti-V. Parahaemolyticus antibody, anti-verotoxin antibody, anti-human transferrin antibody, anti-human albumin antibody, anti-human immunoglobulin antibody, anti-microglobulin antibody, anti-CRP antibody, anti-troponin antibody, anti-HCG antibody Anti-Chlamydia trachomatis antibody, anti-streptolysin O antibody, anti-Helicobacter pylori antibody, anti-β-glucan antibody, anti-HBe antibody, anti-HBs antibody, anti-adenovirus antibody, anti-HIV antibody, anti-rotavirus antibody, anti-influenza Examples include, but are not limited to, viral antibodies, anti-parvovirus antibodies, anti-RS virus antibodies, anti-RF antibodies, nucleotides complementary to nucleic acid components derived from pathogenic microorganisms, and the like.
[0016]
Specimen samples for analysis by the test method of the present invention are solutions in which a pharyngeal or nasal wipe is suspended in an appropriate buffer, nasal aspirate, fecal suspension, plasma, serum, urine, saliva, amniotic fluid, Biological samples such as cerebrospinal fluid, pus, organ extracts, various tissue extracts, food extracts, culture supernatants, clean water, sewage, lake water, river water, seawater, soil extracts, sludge extracts and appropriate A solution diluted with a buffer can be used, but is not limited thereto. The buffer solution may contain 0.01 to 20% by mass of a surfactant. As the surfactant, Triton X-100: polyethylene glycol mono-р-isooctyl phenyl ether (Nacalai Tesque), Tween 20: polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Nacalai Tesque), Tween 80: polyoxyethylene Sorbitan monooleate (Nacalai Tesque), NP-40: Nonidet P-40 (Nacalai Tesque), Zwittergent: Zwittergent 3-14 (Calbiochem), SDS: Sodium dodecyl sulfate (Nacalai Tesque) Co.), CHAPS: 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propane sulfonic acid (Dojindo Chemical Co., Ltd.) or a mixture of two or more of these may be used. Is Absent.
[0017]
(Capture substance)
A capture substance for capturing a measurement object is a substance that binds to the measurement object by a specific reaction such as an antigen-antibody reaction to form a complex. Therefore, it is natural that the capture substance to be used differs depending on the object to be measured. In general, when the object to be measured is bacteria, viruses, hormones, other clinical markers, etc., they react specifically and bind to them. Polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and the like. In addition, virus antigens, virus hollow particles, recombinant E. coli expressed protein, recombinant yeast expressed protein and the like can be mentioned. As a method for binding such a capturing substance to the above-described membrane surface, physical adsorption may be used, or chemical binding may be used. The membrane to which the capture substance is bound is prepared, for example, by adsorbing a solution obtained by diluting the capture substance in a buffer solution or the like and then drying the membrane.
[0018]
(Simple membrane assay kit)
The simple membrane assay kit of the present invention is a kit used in the above-described simple membrane assay method of the present invention. The simple membrane assay kit of the present invention comprises at least the following (1) and (2).
(1) An assay device comprising a filtration filter and (2) a membrane to which a capture substance for capturing a measurement object is bound.
The filtration filter is preferably attached to the specimen sample filtration tube described above.
The kit may further contain a sample suspension, a cleaning solution composition, and / or a labeled detection reagent, if necessary. Further, when the label of the labeled detection reagent is an enzyme label, it can contain an enzyme substrate, a reaction stop solution, etc., which will be described later.
Further, if necessary, a negative control solution consisting only of a buffer for examining the activity of the kit, and a positive control consisting of a buffer containing an analyte such as an antigenic substance may be included. Furthermore, a sample collection device such as a sterile cotton swab may be included.
[0019]
(Sample suspension)
The sample can be collected from a patient's pharynx, nasal cavity, etc. using a sample collection device such as a sterile cotton swab, or a nasal aspirate can be used. Suspend in suspension and perform assay. As the specimen suspension, buffers or the like usually used in sample detection or quantification methods by immunological techniques such as immunodiffusion method, enzyme immunoassay method, and aggregation method can be used.
More specifically, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), gelatin-added PBS, bovine serum albumin (BSA) -added PBS, Good's buffer, calf infusion broth (VIB), heart-in Examples include, but are not limited to, fusion broth, Eagle's minimum essential medium (EMEM), and BMEM-added EMEM. Moreover, you may use the said buffers in combination of 2 or more types.
Further, in addition to the above composition, basic amino acids, inorganic salts and / or surfactants may be added. By using a sample suspension containing at least two types of basic amino acids, inorganic salts, and surfactants, components other than the analyte in the sample can be bound to the membrane itself or captured on the membrane. This is preferable because it can reduce non-specific binding.
[0020]
(Detection reagent)
In this specification, the detection reagent is capable of specifically binding to the analyte and forming a complex with the analyte. The labeled detection reagent means a detection reagent labeled so that it can be detected by some means after forming a complex with the analyte. For example, when the object to be measured is an antigenic substance such as a virus, an antibody against the virus and labeled with an enzyme or the like can be used. When labeled with an enzyme in this way, the complex can be detected by adding a substrate of the enzyme that produces a substance detectable by a colorimetric method or a fluorescence method by a reaction catalyzed by the enzyme. It can be carried out. Examples of the detection reagent before labeling are the same as those described for the capture reagent. Examples of the label include an enzyme, a fluorescent label, a magnetic label, a radioisotope, a gold colloid, and a colored latex.
When an enzyme label is used, examples of the enzyme used include alkaline phosphatase, peroxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase.
[0021]
(Substrate)
When an enzyme label is used as a label for the labeled detection reagent, it is usually a substrate for the enzyme that generates a substance that can be detected by a colorimetric or fluorescent method by a reaction catalyzed by the enzyme. Added. Specific examples include 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) / nitrotetrazolium blue (NBT), tetramethylbenzidine (TMB), and glucose-6-phosphate NAD +.
[0022]
(Reaction stop solution)
The kit of the present invention may further contain a reaction stop solution for stopping the reaction between the enzyme and the substrate, for example, if necessary. Examples of such a reaction stop solution include citric acid and sulfuric acid.
[0023]
【Example】
[Example 1]
1. Preparation of monoclonal antibody (1) Preparation of anti-influenza A virus NP monoclonal antibody (mouse) The spleen was excised from BALB / c mice immunized with purified influenza A virus antigen and maintained for a certain period of time. et al., Nature, vol, 256, p495-497 (1975)) and fused with mouse myeloma cells (P3 × 63).
The obtained fused cells (hybridomas) are maintained in a 37 ° C. incubator, and purification of the cells (monocloning) is performed while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an influenza A virus NP antigen solid phase plate. went.
The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by an ammonium sulfate fractionation method to obtain two types of purified anti-influenza A virus NP monoclonal antibodies.
[0024]
(2) Anti-influenza B virus NP monoclonal antibody (mouse)
The spleen was excised from BALB / c mice immunized with purified influenza B virus antigen and maintained for a certain period of time, and mouse myeloma was obtained by the method of Keller et al., Nature, vol. 256, p495-497 (1975). Fused with cells (P3x63). The obtained fused cells (hybridomas) are maintained in an incubator at 37 ° C., and purification of the cells (monocloning) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using an influenza B virus NP antigen solid phase plate Went. The obtained two cell lines were each intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. IgG was purified from the obtained ascites by an ammonium sulfate fractionation method to obtain two types of purified anti-type B influenza virus NP monoclonal antibodies.
[0025]
2. Production of labeled anti-influenza antibody solution (1) Production of labeled anti-influenza A antibody solution After dialyzing 20 mg of purified anti-influenza A virus NP monoclonal antibody with 0.1 M acetate buffer (pH 3.8), 10 mg of pepsin was added, and Fab ′ digestion was performed at 37 ° C. for 1 hour. The treated solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column to obtain a purified anti-influenza A influenza F (ab ′) 2 fraction. The fraction was concentrated to about 10 mg / mL, mixed with 0.1 M mercaptoethylamine at a volume ratio of 10: 1, and reduced at 37 ° C. for 90 minutes. The treatment solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column to obtain a purified anti-influenza A Fab ′ purified fraction, and then concentrated to about 1 mL.
After dialyzing 1.5 mL of 10 mg / mL alkaline phosphatase into 50 mM borate buffer (50 mM boric acid (pH 7.6), 1 mM magnesium chloride, 0.1 mM zinc chloride), N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS; Dojin Chemical Co., Ltd.) 0.7 mg was added and treated at 30 ° C. for 1 hour. The treated solution was fractionated on a Sephadex G-25 column, the first peak was collected to obtain maleimide-alkaline phosphatase, and then concentrated to about 1 mL.
[0026]
Concentrated anti-influenza A Fab ′ and maleimide-alkaline phosphatase were mixed at a protein ratio of 1: 2.3 and reacted with gentle stirring at 4 ° C. for 20 hours to obtain alkaline phosphatase-labeled anti-influenza Fab ′. It was. The reaction solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column, and unreacted substances were removed to obtain purified alkaline phosphatase-labeled Fab ′.
Purified alkaline phosphatase-labeled Fab ′ is 4.5 (W / V)% bovine serum albumin, 5.25 (W / V)% polyethylene glycol 6000, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 1. After diluting to 1.0 μg / mL with a labeled antibody diluent having a composition of 5 (W / V)% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride and 0.15 mM zinc chloride, it is filtered through a 0.22 μm pore size filter. Thus, a labeled anti-influenza A antibody solution was obtained.
[0027]
(2) Preparation of labeled anti-influenza B antibody solution 20 mg of one purified anti-influenza B virus antibody was dialyzed with 0.1 M acetate buffer (pH 3.8), 10 mg of pepsin was added, Fab ′ digestion was performed over time. The treatment solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column to obtain an anti-influenza B influenza F (ab ′) 2 purified fraction. The fraction was concentrated to about 10 mg / mL, mixed with 0.1 M mercaptoethylamine at a volume ratio of 10: 1, and reduced at 37 ° C. for 90 minutes. The treatment solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column to obtain an anti-type B influenza Fab 'purified fraction, and then concentrated to about 1 mL.
Concentrated anti-influenza type Fab Fab ′ and maleimide-alkaline phosphatase prepared in 2- (1) were mixed at a protein ratio of 1: 2.3 and reacted with gentle stirring at 4 ° C. for 20 hours to obtain alkaline phosphatase. A labeled anti-type B influenza Fab 'was obtained. The reaction solution was fractionated with an Ultrogel AcA44 column, and unreacted substances were removed to obtain purified alkaline phosphatase-labeled Fab ′.
[0028]
Purified alkaline phosphatase-labeled Fab ′ is 4.5 (W / V)% bovine serum albumin, 5.25 (W / V)% polyethylene glycol 6000, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 1. After diluting to 1.0 μg / mL with a labeled antibody diluent having a composition of 5 (W / V)% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride and 0.15 mM zinc chloride, it is filtered through a 0.22 μm pore size filter. Then, a labeled anti-B influenza antibody solution was obtained.
[0029]
3. Production of Influenza Virus Detection Membrane Assay Device An influenza virus detection membrane assay device having the same structure as that shown in FIGS. 1 and 2 was used. As the membrane, a nitrocellulose membrane (
The solid phase on the membrane was obtained by spotting two antibody solutions onto a nitrocellulose membrane. In the A hole of the apparatus, 12 μL of a solution containing 0.2 mg / mL of the purified anti-influenza A virus NP monoclonal antibody not used for labeling, in the B hole, out of the purified anti-influenza B virus NP monoclonal antibody 12 μL of a solution containing 1 mg / mL not used for labeling was filtered through a 0.22 μm pore size filter and spotted. As a buffer for diluting the antibody, a 10 mM citrate buffer (pH 4.0) was used. After spotting, the membrane was dried in a 45 ° C. drying room for 40 minutes to produce a membrane assay device for detecting influenza virus.
[0030]
4). Detection of influenza virus (1) Detection by membrane assay A wiping solution was collected from the nasal cavity of 115 patients clinically suspected of influenza virus infection using a sterile cotton swab, and 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1 A test sample was prepared by floating in 1.5 mL of a solution having a composition of 5 M sodium chloride, 1 (W / V)% Triton X-100, 0.5 (W / V)% bovine serum albumin. After thoroughly suspending the test sample, 400 μL each was divided into three equal parts into three specimen sample filtration tubes, and the following three types of nozzles were attached to the tips of the tubes. Nozzle (1) is loaded with a filter in which a nitrocellulose membrane with a pore diameter of 0.45 μm is sandwiched between two glass fibers with a pore diameter (retained particle diameter) of 0.67 μm, and nozzle (2) has a pore diameter (retained particles). A filter in which three glass fibers having a diameter of 0.67 μm were stacked was loaded, and the filter was not loaded in the nozzle (3).
[0031]
2. After the specimen sample is filtered through each nozzle, 150 μL was added dropwise to each of the A hole and B hole of the membrane assay device prepared in the above, and the sample was left until the sample was completely absorbed by the liquid absorbing member provided at the bottom of the nitrocellulose membrane. Next, after adding 180 μL each of the labeled anti-influenza A antibody solution to the A hole and 180 μL of the labeled anti-B influenza antibody solution to the B hole, the solution is allowed to stand until the antibody solution is completely absorbed by the liquid absorbing member. did. Next, the adapter was removed, and a washing solution having a composition of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride, 5 (W / V)% arginine hydrochloride, 1 (W / V)% Triton X-100. Was added dropwise to each of the A hole and the B hole, and then allowed to stand until the cleaning solution was completely absorbed by the liquid absorbing member. Subsequently, 250 μL of BCIP / NBT substrate solution (manufactured by Sigma) was added dropwise to the A hole and the B hole, respectively, to initiate the color reaction. Ten minutes later, 100 μL of 100 mM citrate buffer (pH 3.0) was added dropwise to each of A hole and B hole to stop the reaction. Immediately after the reaction is stopped, A hole and B hole are observed from above, and if color is observed only in A hole, influenza A virus is positive. If color is observed only in B hole, influenza B virus. When coloration was observed in both positive and AB holes, it was determined as positive for influenza A and B influenza viruses, and negative when neither color was observed in both AB holes.
[0032]
(2) Detection by RT-PCR method Using the remainder of the test sample prepared in 5- (1), it was confirmed by RT-PCR method whether an influenza virus gene was present in the specimen. The RT-PCR method was performed by the method of Shimizu (Infectious Diseases Journal, Vol. 71, No. 6, p522-526).
(3) Comparison of Simple Membrane Assay Method and RT-PCR Method Tables 1 to 3 show a comparison of the determination results of the simple membrane assay method of the present invention and the RT-PCR method described above. The RT-PCR method is known to be a measurement method with extremely high sensitivity and specificity, and when it was judged to be different from the result of the RT-PCR method, it was regarded as false positive or false negative.
[0033]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
When the nozzle (1) was used, it completely coincided with the determination by the RT-PCR method, and no false positive was observed. When nozzle (2) is used, the false positive incidence is 7% (8 samples out of 115 samples (total of false positive samples surrounded by □ in Table 2)), otherwise the RT-PCR method is used Matched with the judgment. On the other hand, when nozzle (3) was used, the false positive rate was 83% (96 samples out of 115 samples (total of false positive samples surrounded by □ in Table 3)).
【The invention's effect】
With the method and kit of the present invention, it was possible to prevent the occurrence of false positives and to establish a highly reliable simple membrane assay method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of a membrane assay apparatus according to an embodiment of the present invention.
2 is a cross-sectional end view taken along the line II ′ of FIG.
FIG. 3 shows one embodiment of a specimen sample filtration tube used in the present invention.
4 shows a perspective view of the distal end portion of the specimen sample filtration tube of FIG. 3. FIG.
[Explanation of symbols]
A: Hole B: Hole a: Adapter b: Membrane c: Liquid absorbing member d: Filtration tube tip e: Filtration tube main body f: Filtration filter
Claims (12)
（３）検体浮遊液
（４）洗浄液組成物、
（５）標識化検出試薬、
（６）検体採取器具、及び
（７）コントロール液。The kit according to claim 7 , further comprising:
(3) specimen suspension (4) cleaning solution composition,
(5) labeled detection reagent,
(6) Specimen collection instrument, and (7) Control solution.
（３）検体浮遊液、(3) Specimen suspension,
（４）洗浄液組成物、(4) Cleaning liquid composition,
（５）標識化検出試薬、(5) labeled detection reagent,
（６）検体採取器具、または(6) Sample collection device, or
（７）コントロール液。(7) Control solution.
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