JP5637613B2 - 核酸増幅反応器 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅反応器に関する。

ＰＣＲ法に代表される核酸増幅反応は、生物の遺伝子多型（ＳＮＰ）を調べる方法としてのみならず、細胞中への導入遺伝子の発現量を調べる方法としても有用である。また、核酸増幅反応は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、癌細胞など、特別の状態にある細胞の遺伝子発現パターンの把握や、病原体の同定にも用いられている。さらに、核酸増幅反応は、ごく微量の核酸を視覚的に捉えられる量にまで増幅することができるため、核酸増幅反応は、微生物の迅速検出法としても用いられている。例えば、イムノ−ＰＣＲ法のように分子認識試薬に標識した核酸の増幅は、微生物の極微量検出にも有用である。

近年、核酸増幅反応は、逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡの微量検出にも利用されている。この場合、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後、ｃＤＮＡを核酸増幅反応によって増幅する方法がとられている。

核酸増幅反応は、例えば、特許文献１に開示されているように、核酸増幅反応装置を用いて行われる。

核酸増幅反応装置には、一般に、サーマルサイクラーなどが備えられている。核酸増幅反応装置にサンプルチューブなどの核酸増幅反応器をセットして、サーマルサイクラーで温度管理を行うことにより、核酸増幅反応器内で核酸増幅反応が行われる。

特表２０１０−５１９８９２号公報

核酸増幅反応器には、鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヌクレオチドなどの反応組成物が入れられる。核酸増幅反応器に入れる反応組成物は、多種類の成分により構成されるため、多項目の標的核酸を同時に検出する場合や、大規模なサンプル集合を分析する場合には、反応組成物の調製が煩雑となるという問題がある。

本発明は、核酸増幅反応を簡便に行うことができる核酸増幅反応器を提供することを主な目的とする。

本発明の核酸増幅反応器は、熱可塑性ハイドロゲルが塗布された反応チャンバーを備える。熱可塑性ハイドロゲルは、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヌクレオチド及びゲル化剤を含む。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、熱可塑性ハイドロゲルのゲルからゾルへの転移温度であるゲル−ゾル転移温度が９０℃以下であり、熱可塑性ハイドロゲルのゾルからゲルへの転移温度であるゾル−ゲル転移温度が５５℃以下である。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、熱可塑性ハイドロゲルが、レポーター試薬をさらに含む。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、反応チャンバーに塗布されており、マグネシウム塩を含む熱可塑性ハイドロゲルをさらに備える。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、核酸増幅反応器は、反応チャンバーの内壁から核酸増幅反応器の外壁に至るように設けられた金属材をさらに備える。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、核酸増幅反応器が反応チャンバーを複数備える。複数の反応チャンバーのそれぞれには、オリゴヌクレオチドプライマーセットの種類が相互に異なる複数種類の熱可塑性ハイドロゲルから選ばれる１種以上の組み合わせで熱可塑性ハイドロゲルが塗布されている。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、マイクロ流路と、秤量部と、パッシブバルブとをさらに備える。秤量部は、マイクロ流路に接続されている。秤量部は、各反応チャンバーに対して設けられている。パッシブバルブは、秤量部と反応チャンバーとを接続している。

本発明の核酸増幅反応器のある特定の局面では、核酸増幅反応器が反応チャンバーを７個以上有する。７個以上の反応チャンバーのそれぞれには、相互に異なる３種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットから選ばれる１種以上を含む熱可塑性ハイドロゲルが塗布されている。７個以上の反応チャンバーのそれぞれに塗布された熱可塑性ハイドロゲルに含まれるオリゴヌクレオチドプライマーセットは、２値循環擬似乱数系列に従って選択されている。

本発明によれば、核酸増幅反応を簡便に行うことができる核酸増幅反応器を提供することができる。

図１は、第１の実施形態に係る核酸増幅反応器の模式図である。 図２は、図１の線ＩＩ−ＩＩにおける核酸増幅反応器の基板の略図的断面図である。 図３は、７ビットのＭ系列１周期により決定される行列Ｍに従ったオリゴヌクレオチドプライマーセットの配置の模式図である。 図４は、７ビットのＭ系列３周期により決定される行列Ｍに従ったオリゴヌクレオチドプライマーセットの配置の模式図である。 図５は、実施例１及び参考例１における、ＤＮＡ断片の量とサイクル数との関係を示したグラフである。 図６は、第２の実施形態に係る核酸増幅反応器の基板の略図的断面図である。

以下、本発明を実施した好ましい形態の一例について説明する。但し、下記の実施形態は、単なる例示である。本発明は、下記の実施形態に何ら限定されない。

また、実施形態などにおいて参照する各図面において、実質的に同一の機能を有する部材は同一の符号で参照することとする。また、実施形態等において参照する図面は、模式的に記載されたものであり、図面に描画された物体の寸法の比率などは、現実の物体の寸法の比率などとは異なる場合がある。図面相互間においても、物体の寸法比率などが異なる場合がある。具体的な物体の寸法比率などは、以下の説明を参酌して判断されるべきである。

（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る核酸増幅反応器の模式図である。図２は、図１の線ＩＩ−ＩＩにおける核酸増幅反応器の基板の略図的断面図である。図１及び２を参照しながら、第１の実施形態に係る核酸増幅反応器１について説明する。

核酸増幅反応器１は、ＰＣＲ法などの核酸増幅反応に用いられる反応器である。核酸増幅反応器１は、サーマルサイクラーなどを備える核酸増幅反応装置と共に用いられ、核酸増幅反応器１内で核酸増幅反応が行われる。

図１に示すように、核酸増幅反応器１は、複数の反応チャンバー２０を備える。図２に示すように、反応チャンバー２０には、熱可塑性ハイドロゲル５０が塗布されている。熱可塑性ハイドロゲル５０は、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヌクレオチド及びゲル化剤を含む。

熱可塑性ハイドロゲル５０は、ゲルからゾルへの転移温度であるゲル−ゾル転移温度になると、ゲルからゾルに相転移する。また、熱可塑性ハイドロゲル５０は、ゾルからゲルへの転移温度であるゾル−ゲル転移温度になると、ゾルからゲルに相転移する。

熱可塑性ハイドロゲル５０のゲル−ゾル転移温度は、９０℃以下であることが好ましい。また、熱可塑性ハイドロゲル５０のゾル−ゲル転移温度は、５５℃以下であることが好ましい。熱可塑性ハイドロゲル５０のゲル−ゾル転移温度及びゾル−ゲル転移温度は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）で測定することができる。

熱可塑性ハイドロゲル５０のずり弾性率は、１０^３Ｐａ〜１０^５Ｐａ程度であることが好ましい。熱可塑性ハイドロゲル５０のずり弾性率が、１０^３Ｐａ〜１０^５Ｐａ程度であることにより、塗布された熱可塑性ハイドロゲル５０を核酸増幅反応器１に固着させることができる。

熱可塑性ハイドロゲル５０は、乾燥物であってもよい。熱可塑性ハイドロゲル５０が乾燥物である場合、熱可塑性ハイドロゲル５０の乾燥物に緩衝溶液などの水分を加えることによって、ずり弾性率を変化させることができる。

熱可塑性ハイドロゲル５０は、急冷されると小さなジャンクションゾーンを多数形成し、徐冷されると大きなジャンクションゾーンを形成する傾向がある。大きなジャンクションゾーンでは、熱可塑性ハイドロゲル５０に分散されたＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット及びヌクレオチドなどが副反応しやすくなる。よって、熱可塑性ハイドロゲル５０が乾燥物である場合、熱可塑性ハイドロゲル５０は、熱可塑性ハイドロゲルを急速凍結乾燥させたものであることが望ましい。

熱可塑性ハイドロゲル５０に含まれるゲル化剤は、例えば、天然多糖類などであることが好ましい。ゲル化剤の具体例としては、アガロース、ゼラチン、カラギーナン、ジェランガム、ザンタンガム、ヒアルロン酸、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。ゲル化剤としては、これらの中でも、アガロースが好ましい。１質量％のアガロースのハイドロゲルは、約６５℃まで温度が上昇すると、ゾルに相転移する。また、１質量％のアガロースのハイドロゾルは、約３７℃まではゾルであるが、約２５℃まで温度が下がると、ゲルに相転移する。例えば、アガロースをゲル化剤とした場合、熱可塑性ハイドロゲル５０は、ゲルからゾルへの転移温度とゾルからゲルへの転移温度に大きなヒステリシスを有することがある。一般的なゼラチンを用いた場合、熱可塑性ハイドロゲル５０のゲル−ゾル転移温度は、約２６℃である。また、２質量％のκ−カラギーナンを用いた場合、熱可塑性ハイドロゲル５０のゲル−ゾル転移温度は、約５０℃である。２質量％のザンタンガムを用いた場合、熱可塑性ハイドロゲル５０のゲル−ゾル転移温度は、約４０℃である。

ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性酵素ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの具体例としては、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

オリゴヌクレオチドプライマーセットは、増幅させたい核酸の配列によって、フォアワード−プライマーとリバース−プライマーのセットが適宜選択される。また、ヌクレオチドとしては、ｄＮＴＰｓ（４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を混合したもの）などを用いることができる。

熱可塑性ハイドロゲル５０には、マグネシウム塩などの核酸増幅反応に必要な他の成分が含まれていてもよい。本実施形態においては、熱可塑性ハイドロゲル５０にマグネシウム塩が含まれる。マグネシウム塩としては、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）が挙げられる。

核酸増幅反応器１が、リアルタイムＰＣＲ法に用いられる場合、熱可塑性ハイドロゲル５０は、レポーター試薬をさらに含むことが好ましい。レポーター試薬としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＴａｑＭａｎプローブなどが挙げられる。また、核酸増幅反応器１が、ＲＴ−ＰＣＲ法に用いられる場合、熱可塑性ハイドロゲル５０は、逆転写酵素をさらに含むことが好ましい。逆転写酵素は、ＲＮＡの種類に応じて、適宜選択される。

熱可塑性ハイドロゲル５０には、ポリビニルアルコールが含まれていてもよい。冷却−加温を繰り返したポリビニルアルコールは、低温下でゲル化するようになり、熱可塑性ハイドロゲル５０を与えるゲル化剤として作用し得る。熱可塑性ハイドロゲル５０には、防腐剤、キレート剤、グリセリンほかの品質安定剤が含まれていてもよい。

反応チャンバー２０は、基板１０によって構成されている。基板１０の材質は、反応チャンバーを構成できるものであれば、特に限定されない。基板１０は、例えば、ガラス、樹脂、セラミック、金属、石材などにより構成することができる。図２に示すように、基板１０は、反応チャンバー２０の内壁２０ａから核酸増幅反応器１の外壁に至るように設けられた金属材２１をさらに備える。金属材２１を構成する金属としては、例えば、アルミニウム、スチール合金などが挙げられる。

核酸増幅反応器１では、熱可塑性ハイドロゲル５０が塗布された反応チャンバー２０に、鋳型ＤＮＡなどを含むサンプルを加えた後、核酸増幅反応器１をサーマルサイクラーなどにより加熱することにより、熱可塑性ハイドロゲル５０がゾルに相転移し、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヌクレオチド、及び鋳型ＤＮＡなどのサンプルがゾル中で拡散して核酸増幅反応が進行する。

核酸増幅反応器１は、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット及びヌクレオチドを含む熱可塑性ハイドロゲル５０が塗布された反応チャンバー２０を備える。このため、鋳型ＤＮＡなどのサンプルを反応層２０中に加えるだけで、核酸増幅反応を簡便に行うことができる。また、熱可塑性ハイドロゲル５０中にＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット及びヌクレオチドが含まれているため、これらの成分が互いに反応しにくい。よって、核酸増幅反応器１を長期間保存しても、熱可塑性ハイドロゲル５０中において、不所望の副反応が生じ難い。

核酸増幅反応器１が、反応チャンバー２０の内壁２０ａから核酸増幅反応器１の外壁に至るように設けられた金属材２１をさらに備える場合、核酸増幅反応における温度管理が容易となる。

核酸増幅反応器１は、ＤＮＡ断片の増幅だけでなく、ＲＴ−ＰＣＲ法におけるＲＮＡの微量検知にも好適に用いることができる。さらに、イムノ−ＰＣＲ法の一部として、抗原の微量検知にも用いることができる。

核酸増幅反応器１では、耐熱性酵素ＤＮＡポリメラーゼと抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いたホットスタートシステムを採用することができる。抗体を用いたホットスタートは、不所望の非特異反応の抑制に強力な効果を示す。また、抗体を用いたホットスタートでは、加熱によって速やかに抗体が失活するため、酵素の再活性化も迅速である。したがって、ホットスタートシステムを採用することにより、鋳型ＲＮＡや酵素への高温によるダメージを最小限に抑えることができる。

核酸増幅反応器１は、マイクロ流路３０と、秤量部３１と、パッシブバルブ４０とをさらに備える。マイクロ流路３０、秤量部３１、及びパッシブバルブ４０は、基板１０に形成されている。秤量部３１は、マイクロ流路３０に接続されている。秤量部３１は、各反応チャンバー２０に対して設けられている。パッシブバルブ４０は、秤量部３１と反応チャンバー２０とを接続している。

なお、本発明において、「マイクロ流体」とは、マイクロ流路を流れる液体が、表面張力と毛細管現象との影響を強く受け、通常の寸法の流路を流れる液体とは異なる挙動を示す形状寸法に形成された流路をいう。すなわち、「マイクロ流路」とは、マイクロ流路を流れる液体に所謂マイクロ効果が発現する寸法に形成された流路をいう。

但し、どのような形状寸法の流路においてマイクロ効果が発現するかは、流路に導入される液体の物性によって異なる。例えば、マイクロ流路が横断面矩形状である場合には、一般的には、マイクロ流路の横断面における高さ及び幅のうちの小さい方が５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、さらに好ましくは２００μｍ以下に設定される。マイクロ流路が横断面円形状である場合は、一般的には、マイクロ流路の直径は、５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、さらに好ましくは２００μｍ以下に設定される。

マイクロ流路３０は、核酸増幅反応器１の外部に開口する開口部３０ａを有する。核酸増幅反応器１においては、マイクロ流路３０の開口部３０ａから、鋳型ＤＮＡ、緩衝溶液などを含むサンプルがマイクロ流体となって注入される。マイクロ流路３０に注入されたサンプルは、秤量部３１を通じて、反応チャンバー２０に供給される。

具体的には、まず、サンプルがマイクロ流路３０及び秤量部３１に供給される。このとき、秤量部３１と反応チャンバー２０との間に位置するパッシブバルブ４０が細く形成されていることにより、反応チャンバー２０へはサンプルが供給されない。次に、オイル等のサンプルと互溶しない媒質を開口部３０ａから注入し、秤量部３１以外のマイクロ流路３０内の余分なサンプルをマイクロ流路３０に接続された開口部３０ｂから排出する。秤量部３１内には既定量の秤量されたサンプルが残る。次いで、開口部３０ｂを閉じた状態で、開口部３０ａから前記媒質に圧力をかけることにより、秤量部３１のサンプルが反応チャンバー２０に供給される。オイルなどのサンプルと互溶しない媒質は、ＰＣＲのサーマルサイクルにおいて反応チャンバー２０の内容物が逆流するのを防ぐ。なお、前記媒質に圧力をかける伝達媒体として、空気が介在してもよい。

核酸増幅反応器１が、マイクロ流路３０と、マイクロ流路３０に接続されており、各反応チャンバー２０に対して設けられた秤量部３１と、秤量部３１と反応チャンバー２０とを接続しているパッシブバルブ４０とを備える場合、反応チャンバー２０に鋳型ＤＮＡなどのサンプルを同時かつ定量的に加えることができる。よって、核酸増幅反応をより簡便に行うことができる。

核酸増幅反応器１が複数の反応チャンバー２０を備える場合、複数の反応チャンバー２０のそれぞれには、オリゴヌクレオチドプライマーセットの種類が相互に異なる複数種類の熱可塑性ハイドロゲル５０から選ばれる１種以上の組み合わせで、熱可塑性ハイドロゲル５０を塗布しておくことができる。これにより、オリゴヌクレオチドプライマーセットの種類が相互に異なる複数の核酸増幅反応を同時に行うことができる。

核酸増幅反応器１は、反応チャンバー２０を７個以上有することが好ましい。７個以上の反応チャンバーのそれぞれには、相互に異なる３種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットから選ばれる１種以上を含む熱可塑性ハイドロゲルが塗布されている。７個以上の反応チャンバーのそれぞれに塗布される熱可塑性ハイドロゲル５０に含まれるオリゴヌクレオチドプライマーセットは、２値循環擬似乱数系列に従って選択されている。このとき、下記式（１）によって、各反応チャンバー２０で観測されるシグナルを表す列ベクトルＳから各オリゴヌクレオチドプライマーセットに対応するテンプレートの初発濃度を表す列ベクトルＣを求めることができる。

例えば、反応チャンバー２０を７個、オリゴヌクレオチドプライマーセットを３種、２値循環擬似乱数系列として７ビットのＭ系列（Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である［１，１，１，０，０，１，０］を選んだ場合を例にとり、オリゴヌクレオチドプライマーセットを２値循環擬似乱数系列に従って選択する方法を説明する。

なお、Ｍ系列は、デジタル通信分野などで広く用いられているｎビットのシフトレジスタとフィードバックで生成される周期が２^ｎ−１の符号列である。Ｍ系列は、２値循環擬似乱数系列の一例である。

それぞれの反応チャンバー２０にテンプレートＴ０，Ｔ１，Ｔ２に対応するオリゴヌクレオチドプライマーセットＰ０，Ｐ１，Ｐ２を置くがどうかを表す７×３行の行列Ｍの具体例として、次の行列をとりあげる。

ここで、［ ］^Ｔ の表記は、行と列を入れ替えた転置操作を表す。行列Ｍのｉ行j列目の要素Ｍ_ｉ，ｊは、ｉ番目の反応チャンバー２０にｊ番目のオリゴヌクレオチドプライマーセットを入れるかどうかを２値で表している。要素が１であれば入れるという意味であり、要素が０であれば入れないという意味である。各列の要素では、２値循環擬似乱数系列のシフト量を０，２，４としているが、この組み合わせに限られるものではなく、各列のシフト量が異なっていればよい。

これを模式的に描くと、例えば図３のようになる。図３において、番号がついた枠は反応チャンバー２０を表し、その中の丸、三角、四角は、それぞれＰ０，Ｐ１，Ｐ２を含む熱可塑性ハイドロゲル５０が塗布されていることを示している。

また、別の例として、反応チャンバー２０を２８個、オリゴヌクレオチドプライマーセットを３種、２値循環擬似乱数系列として７ビットのＭ系列３周期である［１，１，１，０，０，１，０，１，１，１，０，０，１，０，１，１，１，０，０，１，０］を選んだ場合には、行列Ｍは次のようになる。

これを模式的に描くと、図４のようになる。
行列Ｍにしたがって配置されたプライマーセットの組み合わせによって、三種類以上のテンプレートを列ベクトルＣで表される量比で含む未知試料にリアルタイムＰＣＲを施した結果としてシグナルＳが得られる。このときの装置関数を行列Ａで表記することにすると、この関係は次式のように書ける。

ここで、Ｃは、３種以上のテンプレートの初発濃度に関する列ベクトルであり、テンプレートが３つならば、３成分（ｃ_１，ｃ_２，ｃ_３）をその要素として持ち、それらは通常、対数スケールである。また、Ｓは、Ｎ個の反応チャンバーで検知されたシグナルの大きさを表す列ベクトルである。Ｓは、反応チャンバー２０の数に応じたＮ個の成分（ｓ_１，ｓ_２，ｓ_３，・・・，ｓ_Ｎ）を要素としてもつ。

次に、多数のテンプレートの初発濃度Ｃをいかにして求めるかを以下に説明する。

数３に示した式（１）の両辺に左から行列Ｍ^＊を掛けると式（１）は次のようになる。

行列（Ｍ^＊ＡＭ）が正則行列となるようにＭ^＊を決定すれば、行列（Ｍ^＊ＡＭ）は逆行列を求めることができるから、式（２）から容易に列ベクトルＣを求めることができる。数１で示した７ビットＭ系列１周期による行列Ｍに対応するこのような行列Ｍ^＊の一例として、

がある。この行列Ｍ^＊は、行列Ｍのｉ行ｊ列の各要素Ｍ_ｉ，ｊを次の規則により置き換えることで得られる。

装置関数である行列Ａは、シグナルと初発濃度との関係のみならず、照明の偏りや撮像素子の感度ムラといった装置特性をも含む装置固有の特性を表す行列である。この行列は、キャリブレーションテストにより決められるものであるが、理想的な装置では対角成分のみが１の単位行列となる。

Ｍ^＊ＡＭは、正方行列であり、特に上記の理想的な装置の例の場合、下記式で表される。

これで、式（２）における列ベクトルＣ以外の量が全て既知となったので、式（２）は、列ベクトルＣについて解くことができる。すなわち、各反応チャンバー２０で観測されるシグナルＳから、各オリゴヌクレオチドプライマーセットに対応するテンプレートの初発濃度Ｃを求めることができる。

また、Ｓ＝［１，１，１，…１］^Ｔ として、Ｍ^＊Ｓを計算すると、その値がゼロとなることが確認できる。これは、核酸増幅反応前に生じる不所望の副反応に基づくようなバックグランドシグナルやランダムノイズに対しては、列ベクトルＣを求める計算から、その寄与が強くキャンセルされることを示している。

図３で示した例では、この一周期の中で、各オリゴヌクレオチドプライマーセットにつき、４回のテストが行われている。１周期よりも多くの数の反応チャンバー２０を用いれば、一試薬あたりの実質的なテストのｎ数が増えて、誤差の幅は、１／√ｎに比例して小さくなる。図４で示した例のように３周期行った場合には、ｎ＝１２となり、誤差の幅は、ｎ＝１のテストに比べ４分の１に改善される。例えば、対比のために、互いに独立した反応チャンバー２０でテンプレートの種類毎に別々に核酸増幅反応をさせるとして、３種類のテンプレートにつき各４回のテストと、ポジコン、ネガコンを実施とすると、反応チャンバー２０が少なくとも１４個必要となる。また、３種類のテンプレートにつき各２回のテストと、ポジコン、ネガコンを実施すると、反応チャンバー２０が少なくとも８個必要となる。本実施形態のように、３種以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットから選ばれた１種以上の組み合わせを含み、各反応チャンバー２０が特定のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むかどうかについて、２値循環擬似乱数系列に従うように選択することにより、必要な反応チャンバー２０の数を大きく削減することができる。

次に行列Ａのキャリブレーションの方法について述べる。

リアルタイムＰＣＲにおいては、テンプレートの初発濃度によって相対蛍光強度の立ち上がり時間（以下「Ｃｔ値」という）が変わってくる。初発のＤＮＡ量が多いほど、増幅産物量は早く検出可能な量に達するので、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。よって、段階希釈したスタンダードサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、初発のＤＮＡ量が多い順番に等間隔で並んだ増幅曲線が得られる。ここで、適当なところに閾値を設定すると、閾値と増幅曲線が交わる点：Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）が算出される。Ｃｔ値として得られるシグナルｓとＤＮＡの初発濃度の対数値ｃの間には、ｃ＝ａｓ＋b なる直線関係があり、検量線を作成することができる。通常のリアルタイムＰＣＲではこの検量線から未知濃度サンプルについてテンプレートの初発濃度を求める。しかしながら、本実施形態においては、この検量線は必要ない。代りに行列Ａのキャリブレーションを行う。

Ｎ個の反応チャンバーで検知されたシグナルの大きさを表す列ベクトルＳの各要素の値には、各反応チャンバーで観測されたＣｔ値を用いる。すなわち、Ｓ＝〔ｓ_１，ｓ_２，ｓ_３，・・・，ｓ_Ｎ〕^Ｔ である。装置関数である行列Ａでは、１次の近似をおくならば、対角要素が全て １／ａ の行列である。ａは従来の検量線の傾きに対応する。しかし、より高次の帯行列を考えることにより、より高い精度でキャリブレーションが可能である。行列Ａについて、二次の近似であれば最低３回、四次の近似でも7回のテストで行列Ａを決定することができる。

７回のテストを一つの行列で書けば、例えば次のようになる。

この行列Ｄは、T0,T1,T2のテンプレートの組を各テストでどのような量比で組み合わせるかを示している。すなわち、１回め（１，１，０），２回め（２，１，１），３回め（３，１，１），４回め（３，２，２），５回め（３，２，３），６回め（４，３，４），７回め（４，４，４）である。
このとき、関係式は次の式（３）のように表される。

既知の初発濃度〔ｃ_１，ｃ_２，ｃ_３〕のテンプレートを行列Ｄにしたがって反応チャンバーに配置してシグナルＳを測定することにより、式（３）から行列Ａを決定することができる。ここで用いた行列Ｄは一例であり、行列Ｄの各行は、行列Ｍの各行の加減算により作られる組み合わせにおいて自在である。

２値循環擬似乱数系列では、その系列のメンバをｍ［ｎ］と書くとき、ｍ［ｎ］をｄ１だけ循環シフトさせたｍ［ｎ−ｄ１］の要素ごとの積が、元の数列ｍ［ｎ］をｄ２だけ循環シフトさせた数列ｍ［ｎ−ｄ２］になる。すなわち、ｍ［ｎ−ｄ２］＝ｍ［ｎ］ｍ［ｎ−ｄ１］という性質をもつものとして定義する。この代表例がＭ系列である。２値循環擬似乱数系列としては、Ｍ系列のほかＧｏｌｄ系列やその他の系列もある。本発明でオリゴヌクレオチドプライマーセット配置の決定に用いる系列は、２値循環擬似乱数系列であればよい。

Ｍ系列は、次の線形漸化式で発生される１ビットの数列である。

この線形漸化式において、各項の値は０か１である。「＋」記号は、排他的論理和（ＸＯＲ：Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ＯＲ）である。つまり、ｎ番目の項は、ｎ−ｐ番目とｎ−ｑ番目の項とをＸＯＲ演算することによって得られる。

なお、核酸増幅反応器１には、反応チャンバー２０が１つだけ設けられていてもよい。また、核酸増幅反応器１の形状は、本実施形態のものに限定されず、マイクロ流路３０、開口部３０ａ，３０ｂ、秤量部３１、パッシブバルブ４０を有しないチューブ状、マルチプレート状のものであってもよい。

（第２の実施形態）
上記の第１の実施形態においては、熱可塑性ハイドロゲル５０がマグネシウム塩を含む場合について説明した。但し、本発明は、この形態に限定されない。図６は、第２の実施形態に係る核酸増幅反応器の基板の略図的断面図である。図６に示すように、第２の実施形態において、核酸増幅反応器１は、反応チャンバー２０に塗布されており、マグネシウム塩を含む熱可塑性ハイドロゲル６０をさらに備える。マグネシウム塩を含む熱可塑性ハイドロゲル６０としては、熱可塑性ハイドロゲル５０と同じものが使用できる。

核酸増幅反応器１において、マグネシウム塩が熱可塑性ハイドロゲル６０に含まれている場合、マグネシウム塩が、熱可塑性ハイドロゲル５０に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット及びヌクレオチドなどと接触しにくいため、不所望の副反応が生じ難い。

以下、本発明について、具体的な実験例に基づいて、さらに詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実験例に何ら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更して実施することが可能である。

（実施例１）
下記の条件となるように（１）〜（９）を５５℃下で混合して、ＰＣＲ反応液（合計２０μＬ）を調製した。

（１）超純水 １４μＬ
（２）１０×ＰＣＲバッファー ２μＬ
（３）ＭｇＣｌ_２水溶液（２５ｍＭ） １．２μＬ（終濃度１．５ｍＭ）
（４）ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ） １．６μＬ（終濃度０．２ｍＭ）
（５）フォアワード−プライマー（１００ｐｍｏｌｅ） ０．２μＬ（終濃度１ｐｍｏｌｅ）
（６）リバース−プライマー（１００ｐｍｏｌｅ） ０．２μＬ（終濃度１ｐｍｏｌｅ）
（７）ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ ０．１μＬ
（８）１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ０．５μＬ
（９）アガロース（岩井化学薬品株式会社社製のアガロースＭＥ）０．２μＬ

フォアワード−プライマーとして、“ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＴＡ”の核酸配列、リバース−プライマーとして、“ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＣＧ ＣＴＧ Ｃ”の核酸配列を用いた。なお、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、インフルエンザのＭＰゲノムのＲＮＡに対応するｃＤＮＡを標的核酸（テンプレート）としたものである。

得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ用のマルチプレートに２．０μＬずつ分注し、４℃雰囲気下で冷やし固めた。ＰＣＲ反応液は、マルチプレートのウェルの底でゲル化し固着された。このゲルは、熱可塑性ハイドロゲルである。

次に、サンプルとなる標的核酸は、ＭＰゲノムに対応する合成ｃＤＮＡを１０ｎｇ含む水溶液５μＬを調製した。

次に、ＰＣＲ反応液が塗布されたマルチプレートのウェルに、サンプル水溶液０．５μＬを加え、以下の［操作１］から［操作３］のサイクルを４０回繰り返してサンプルのＤＮＡ断片を増幅させた。なお、ＰＣＲ反応液が塗布されたマルチプレートとして、ＰＣＲ反応液を塗布してから１２時間経過したものを使用した。

［操作１］
９５℃まで昇温したのち３０秒間保持し、ＤＮＡを１本鎖に変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させる。初回の昇温時に、ゲルが融解し、サンプルと混じり合う。補助的にピエゾバイブレータで振動を加えてもよい。

［操作２］
６０℃程度（オリゴヌクレオチドプライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、そのまま３０秒間保持して操作１で得られた１本鎖ＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーとをアニーリングさせる。

［操作３］
７２℃まで再び加熱し、１０秒間維持する。なお、この温度では、オリゴヌクレオチドプライマーの分離が起きない。この温度は、ＤＮＡポリメラーゼの活性に適した温度帯であり、実験目的により、６０℃〜７２℃程度に設定する。

操作２と操作３が同じ温度で行われる場合、同温度の場合、サイクルは２ステップとなる。ＤＮＡ断片の量とサイクル数との関係を示したグラフを図５に示す。なお、図５のグラフにおいて、縦軸はＲＦＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｕｎｉｔ）値、横軸は操作１〜３のサイクル数である。

（参考例１）
アガロースの代わりに、同量の純水を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、サンプルのＤＮＡ断片を増幅させた。ＤＮＡ断片の量とサイクル数との関係を示したグラフを図５に示す。

実施例１及び参考例１の結果から明らかな通り、アガロースを含むＰＣＲ反応液を用いた場合にも、アガロースを用いなかった場合と同様に、ＤＮＡ断片を増幅することができた。

１…核酸増幅反応器
１０…基板
２０…反応チャンバー
２０ａ…内壁
３０…マイクロ流路
３０ａ，３０ｂ…開口部
３１…秤量部
４０…パッシブバルブ
５０，６０…熱可塑性ハイドロゲル

Claims (6)

1. ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヌクレオチド及びゲル化剤を含む熱可塑性ハイドロゲルが塗布された反応チャンバーと、
   マイクロ流路と、
   前記マイクロ流路に接続されており、前記反応チャンバーに対して設けられた秤量部と、
   前記秤量部と前記反応チャンバーとを接続しているパッシブバルブと、
   を備え、
   前記反応チャンバーを７個以上有し、
   前記７個以上の反応チャンバーのそれぞれには、相互に異なる３種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットから選ばれる１種以上を含む熱可塑性ハイドロゲルが塗布されており、
   前記７個以上の反応チャンバーのそれぞれに塗布された熱可塑性ハイドロゲルに含まれるオリゴヌクレオチドプライマーセットは、２値循環擬似乱数系列に従って選択されている、核酸増幅反応器。
2. 前記核酸増幅反応器は、前記反応チャンバーの内壁から前記核酸増幅反応器の外壁に至るように設けられた金属材をさらに備える、請求項１に記載の拡散増幅反応器。
3. 前記熱可塑性ハイドロゲルのゲルからゾルへの転移温度であるゲル−ゾル転移温度が９０℃以下であり、前記熱可塑性ハイドロゲルのゾルからゲルへの転移温度であるゾル−ゲル転移温度が５５℃以下である、請求項１又は２に記載の核酸増幅反応器。
4. 前記熱可塑性ハイドロゲルが、レポーター試薬をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸増幅反応器。
5. 前記７個以上の反応チャンバーのそれぞれに塗布されており、マグネシウム塩を含む熱可塑性ハイドロゲルをさらに備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸増幅反応器。
6. 前記秤量部が、前記７個以上の反応チャンバーのそれぞれに対して設けられている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸増幅反応器。

Images