JP5610313B2 - 光学的観察用チャンバー及び試料の光学的観察方法、並びに下側透明板の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、顕微鏡などの光学的観察手段を用いて試料を観察する際に、試料を保持させるのに適した光学的観察用チャンバーと、この光学的観察用チャンバーを用いて行う試料の光学的観察方法と、光学的観察用チャンバーにおける下側透明板を製造するための下側透明板の製造方法とに関する。
近年、豚や牛を始めとする各種の家畜において、人工授精による品質改良が盛んに行われるようになってきている。人工授精による家畜の品質改良は、優良な家畜の精液を選択的に使用することにより、家畜の改良増進を図るものである。このため、品質改良に供される人工授精用の精液は、市場に流通するよりも前に、その品質検査が行われている。この品質検査における精液の評価基準は様々であるが、重要な評価基準の一つとして、精液に含まれる精子の運動性が挙げられる。精液の運動性を評価するための装置や方法も、各種のものが提案されている。
例えば、精液が入れられる精液受容部（チャンバー）内における対向位置に光源と光センサを配した精子活性度評価器が知られている（特許文献１）。この精子活性度評価器は、微弱な光を光源から精液に照射し、その際の散乱光を光センサで検知することにより、精液に含まれる精子の活性度を測定するものとなっている。しかし、この精子活性度評価器では、近似的な精子の数や、多数の精子の全体としての活性度が分かるだけであり、個々の精子の運動性を知ることができない。
このため、人工授精用の精液の評価においては、顕微鏡によって精液を観察し、それに含まれる個々の精子の運動を評価することが今でも一般的に行われている。しかし、プレパラートを用いた観察では、スライドガラスとカバーガラスの隙間から精液の水分が蒸発していくため、精液を長時間観察できないという欠点があった。このような問題を解決できるものとして、特許文献２には、カバーガラスの片面における周辺部と、試料保持領域を備えた下部材（スライドガラスなど）との間をシーリング材で接着したプレパラートが提案されている。特許文献２には、前記シーリング材として、細胞などに対する影響の少ないシロキサン結合を主鎖とする高分子溶液（シリコーンアルコール溶液）が好ましい点も記載されている。
特許文献２のプレパラートは、試料（細胞など）の蒸発を防ぐことはできるものの、精液を試料として用いた場合には、それに含まれる精子の運動性を正当に評価することができないという欠点があった。というのも、精子は、スライドガラスやカバーガラスに吸着されやすく、この吸着によってその運動が阻害されてしまうからである。
また、顕微鏡による精液の観察では、専用のチャンバー（米国のダイアグノスティクス社製の「マクラーカウンティングチャンバー」（非特許文献１）が有名）に精液を入れることも行われている。しかし、この種のチャンバーも、ガラスや樹脂といった、精子を吸着しやすい素材で形成されていることには変わらず、精子の運動性を正当に評価できないことに関しては、プレパラートを用いた場合と同様であった。加えて、専用のチャンバーは高価で入手しにくいという欠点もあった。
このような実状に鑑みてか、これまでには、スライドガラスやカバーガラスの表面に、ウシ血清アルブミンなど、精子が吸着しにくい蛋白質を塗布することも行われている。これにより、スライドガラスやカバーガラスに精子が吸着しないようにすることができるので、精子の運動が前記観察部品に阻害されなくなるという利点がある。しかし、スライドガラスやカバーガラスの表面に蛋白質を均一に塗布することは必ずしも容易ではなく、場所によってむらが生じやすかった。このため、このむらが観察像を不鮮明なものとし、精子の運動性の評価に悪影響を及ぼすおそれがあった。
ところで、特許文献３には、チャンバーの下面にシリコーン膜を配し、そのシリコーン膜の上に細胞を載せて観察するようにした顕微鏡用細胞観察装置が記載されている。しかし、特許文献３には、試料として精液を採用することや、試料の蒸発を防ぐための工夫については何ら記載されていない。また仮に、特許文献３の顕微鏡用細胞観察装置のチャンバーに精液を入れて該チャンバーの上面に蓋をし、精液の蒸発を防いだとしても、その蓋で精液を薄く引き伸ばすことができないため、精液の厚さが場所によって不均一になってしまう。したがって、多数の精子が上下に重なったり、顕微鏡の焦点が合わないことなどにより、個々の精子の運動性を正確に評価することができないといった不具合が生じるおそれもある。
"MAKLER COUNTING CHAMBER"、［Online］、MidAtlantic DIAGNOSTICS,INC.、［平成21年6月11日検索］、インターネット＜http://www.midatlanticdiagnostics.com/documentation/pdf/makler/MaklerCountingChamber.pdf＞
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、それに入れた試料が蒸発しにくいだけでなく、試料が吸着しにくく、試料の運動性などをより正確に評価することのできる光学的観察用チャンバーを提供するものである。特に、精液に含まれる精子など、ガラスやプラスチックに吸着しやすい物質を含む試料の光学的観察を行う際に好適に使用することのできる光学的観察用チャンバーを提供することを目的とする。また、簡素な構造で製造が容易であり、低価格で入手でき、取り扱いも容易な光学的観察用チャンバーを提供することも本発明の目的である。さらに、この光学的観察用チャンバーを用いて行う試料の観察方法を提供することも本発明の目的である。さらにまた、この光学的観察用チャンバーにおける下側透明板を容易に製造するための下側透明板の製造方法を提供することも本発明の目的である。
上記課題は、試料を載せるための下側透明板と、試料の上側に被せるための上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーであって、下側透明板が可撓性を有する素材によって形成され、下側透明板の中央部に試料を載せて上側透明板を試料に被せた際に、下側透明板の中央部が自重及び試料の重さによって窪み、その状態で下側透明板の周縁部が上側透明板に接触することにより、上側透明板と下側透明板とで試料を密封できるようにしたことを特徴とする光学的観察用チャンバーを提供することによって解決される。
これにより、上側透明板と下側透明板という２つの単純な部材のみで、試料を密封することが可能になる。したがって、製造が容易で低価格で入手でき、取り扱いが容易でありながらも、試料が蒸発しにくく、精液などの蒸発しやすい試料であっても長時間観察することのできる光学的観察用チャンバーを提供することが可能になる。本発明の光学的観察用チャンバーにおいて、上側透明板は、特に可撓性を要求されないが、この上側透明板も、可撓性を有する素材によって形成すると好ましい。これにより、上側透明板と下側透明板の密封性をさらに高めることが可能になる。
また、本発明の光学的観察用チャンバーにおいて、下側透明板の下面における周縁部から下方に突出して脚部を設け、下側透明板に試料を載せた際に、下側透明板の自重及び試料の重量によって下側透明板の中央部が押し下げられるようにすると好ましい。このように、下側透明板の中央部が沈み込むようにすることで、試料に被せる上側透明板の撓み量を大きく確保できない場合であっても、上側透明板と下側透明板とで試料を好適に密封することが可能になる。
このとき、下側透明板の平面視形状は、特に限定されない。しかし、下側透明板の平面視形状は、長方形や楕円形など、ある一の方向における長さと、該一の方向に直交する他の方向の長さとが異なる形状とし、前記脚部を下側透明板の周縁部に沿って設けると好ましい。例えば、下側透明板を平面視略矩形状とし、前記脚部を下側透明板の周縁部に沿って平面視略矩形状に設けた場合などが該当する。これにより、下側透明板における試料を保持させる空間（試料保持領域）に異方性を持たせることが可能になる。したがって、後述するように、試料に含まれる精子の移動する方向などを操作しやすくして、精子の運動性の評価をより容易に行うことも可能になる。
本発明の光学的観察用チャンバーにおいて、上側透明板や下側透明板の素材は、透明で可撓性を有するものであれば特に限定されない。しかし、上側透明板や下側透明板を撥水性に乏しい素材で形成してしまうと、上側透明板や下側透明板に試料（運動精子など）が吸着されやすくなり、観察対象の運動性などを正確に観察できなくなるおそれがある。このため、上側透明板及び／又は下側透明板は、水接触角７０°以上の素材によって形成すると好ましい。上側透明板及び／又は下側透明板の水接触角は、８０°以上であるとより好ましく、９０°以上であるとさらに好ましい。
上側透明板や下側透明板には、このように撥水性に優れた各種の素材を使用することができる。しかし、精子や細胞などの生体（運動性物質）が試料に含まれる場合には、上側透明板や下側透明板には、撥水性だけでなく、それらの生体に害を与えない素材であることが要求される。このような素材としては、具体的に、シロキサン結合による主骨格を持つシリコーンエラストマーなどが例示される。シリコーンエラストマーは、透明で可撓性を有していることに加えて、撥水性に優れて精子などを吸着せず、さらに精子などに害を及ぼす心配もないので、上側透明板や下側透明板の素材として好適に用いることができる。
ところで、上記課題は、下側透明板と上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーに試料を挟んだ状態で該試料を光学的観察手段によって観察する試料の光学的観察方法であって、可撓性を有する素材によって形成した上側透明板を試料に被せて、上側透明板の周縁部を自重によって垂れ下がらせて下側透明板に接触させることにより、上側透明板と下側透明板とで試料を密封した状態で試料を観察することを特徴とする試料の光学的観察方法を提供することによっても解決される。この光学的観察方法は、上述した本発明の光学的観察用チャンバーを用いて好適に行うことができる。
また、上記課題は、試料を載せるための下側透明板と、試料の上側に被せるための上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーにおける下側透明板の製造方法であって、脚部形成用凹部が設けられた下側透明板成形用型枠に透明な熱硬化性樹脂を未硬化の状態で流し込んだ後、熱硬化性樹脂を下側透明板成形用型枠とともに加熱して硬化させることにより、脚部形成用凹部で下側透明板の下面における周縁部から下方に突出した脚部を形成することを特徴とする下側透明板の製造方法を提供することによっても解決される。これにより、上述した本発明の光学的観察用チャンバーにおける下側透明板を容易かつ低コストで製造することが可能になる。また、下側透明板を大量生産することも容易となる。
下側透明板成形用型枠は、それに設けられた脚部形成用凹部によって、下側透明板の下面における周縁部から下方へ突出した脚部を形成できるものであれば特に限定されない。しかし、下側透明板成形用型枠として、その脚部形成用凹部の底部に複数本の微細な溝が形成されたものを用いると好ましい。これにより、硬化後の熱硬化性樹脂（下側透明板）を下側透明板成形用型枠から剥がしやすくすることが可能になる。したがって、下側透明板の製造方法をより大量生産に適したものとすることが可能になる。また、下側透明板を下側透明板成形用型枠から剥がす際に下側透明板が破れにくくなるので、歩留まりを向上することも可能になる。
以上のように、本発明によって、それに入れた試料が蒸発しにくいだけでなく、試料が吸着しにくく、試料の運動性などをより正確に評価することのできる光学的観察用チャンバーを提供することが可能になる。この本発明の光学的観察用チャンバーは、特に、精液に含まれる精子など、ガラスやプラスチックに吸着しやすい物質を含む試料の光学的観察を行う際に好適に使用することができる。また、簡素な構造で製造が容易であり、低価格で入手でき、取り扱いも容易である。さらに、本発明の光学的観察用チャンバーを用いて行う試料の観察方法を提供することも可能になる。さらにまた、この光学的観察用チャンバーにおける下側透明板を容易に製造するための下側透明板の製造方法を提供することも可能になる。
本発明の光学的観察用チャンバーの好適な実施態様について、図面を用いてより詳しく説明する。図１は、本発明の光学的観察用チャンバー１０における下側透明板１１と上側透明板１２とを分離した状態を示した斜視図である。図２は、本発明の光学的観察用チャンバー１０における下側透明板１１を裏返した状態を示した斜視図である。図３は、本発明の光学的観察用チャンバー１０に試料２０を密封している途中の状態を示した斜視図である。図４は、本発明の光学的観察用チャンバー１０に試料２０を密封した状態を中心部で切断した状態を模式的に示した断面図である。
本実施態様の光学的観察用チャンバー１０は、図１に示すように、試料２０を載せるための下側透明板１１と、試料２０の上側に被せるための上側透明板１２とを備えたものとなっている。下側透明板１１と上側透明板１２はいずれも、可撓性を有する素材によって形成されている。
下側透明板１１と上側透明板１２の素材は、透明性と可撓性を兼ね備えたものであれば特に限定されない。下側透明板１１と上側透明板１２の素材は、試料２０の種類に応じて適宜決定される。本実施態様の光学的観察用チャンバー１０は、試料２０として精液を想定したものとなっており、下側透明板１１と上側透明板１２は、シロキサン結合による主骨格を持つシリコーンエラストマーで形成されたものとなっている。このため、下側透明板１１と上側透明板１２は、透明性と可撓性に優れているだけでなく、撥水性にも優れ、精子などの運動性物質（ガラスには吸着するガラス吸着性物質）を吸着しにくいものとなっている。また、精子などの生体にも無害なものとなっている。
下側透明板１１や上側透明板１２を形成する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
［１］ ポリアルキルアルケニルシロキサンと白金化合物からなる混合液（例えば、ジーイー東芝シリコーン株式会社製のＴＳＥ３０３２（Ａ液））とポリアルキルアルケニルシロキサン及びポリアルキル水素シロキサンからなる混合液（例えば、ジーイー東芝シリコーン株式会社製ＴＳＥ３０３２（Ｂ液））とを所定の比率（例えば１０対１）で混合する。
［２］ 上記［１］で得られた混合液を真空デシケータ内で脱泡する。
［３］ 上記［２］で脱泡された混合液をスピンコーター（例えば、ミカサ株式会社製のＯｐｔｉｃｏａｔ ＭＳ−Ａ１００）を使用して薄膜にする。
［４］ 上記［３］で得られた薄膜に上から型枠を接着させた後、オーブンに入れて、所定温度（例えば７０℃）で所定時間（例えば１時間）加熱して硬化させる。
［５］ 上記［４］で硬化した薄膜を所定寸法に切断する。
この方法は、非常に容易に下側透明板１１と上側透明板１２を成形できるという利点がある。
［１］ ポリアルキルアルケニルシロキサンと白金化合物からなる混合液（例えば、ジーイー東芝シリコーン株式会社製のＴＳＥ３０３２（Ａ液））とポリアルキルアルケニルシロキサン及びポリアルキル水素シロキサンからなる混合液（例えば、ジーイー東芝シリコーン株式会社製ＴＳＥ３０３２（Ｂ液））とを所定の比率（例えば１０対１）で混合する。
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［４］ 上記［３］で得られた薄膜に上から型枠を接着させた後、オーブンに入れて、所定温度（例えば７０℃）で所定時間（例えば１時間）加熱して硬化させる。
［５］ 上記［４］で硬化した薄膜を所定寸法に切断する。
この方法は、非常に容易に下側透明板１１と上側透明板１２を成形できるという利点がある。
また、上記［３］以降の工程を、
［３’］ 上記［２］で脱泡された混合液を、鏡面加工が施された型枠に流し込む。
［４’］ 上記［３’］で混合液が流し込まれた型枠をオーブンに入れて、所定温度（例えば７０℃）で所定時間（例えば１時間）加熱して硬化させる。
［５’］ 上記［４’］で硬化して薄膜状となった混合液を型枠から剥がし取る。
という工程で差し替えても、下側透明板１１や上側透明板１２を成形することができる。この方法は、後述するように、下側透明板１１に脚部１１ａがあるなど、下側透明板１１や上側透明板１２が複雑な形状を有する場合にも好適に使用できる。また、上記［３’］で使用する型枠として、血球計算盤を使用すれば、下側透明板１１や上側透明板１２に血球計算盤の目盛りを転写することができ、後述する精子運動解析装置などを使用しなくても、精子の運動を解析することができるようになるという利点もある。
［３’］ 上記［２］で脱泡された混合液を、鏡面加工が施された型枠に流し込む。
［４’］ 上記［３’］で混合液が流し込まれた型枠をオーブンに入れて、所定温度（例えば７０℃）で所定時間（例えば１時間）加熱して硬化させる。
［５’］ 上記［４’］で硬化して薄膜状となった混合液を型枠から剥がし取る。
という工程で差し替えても、下側透明板１１や上側透明板１２を成形することができる。この方法は、後述するように、下側透明板１１に脚部１１ａがあるなど、下側透明板１１や上側透明板１２が複雑な形状を有する場合にも好適に使用できる。また、上記［３’］で使用する型枠として、血球計算盤を使用すれば、下側透明板１１や上側透明板１２に血球計算盤の目盛りを転写することができ、後述する精子運動解析装置などを使用しなくても、精子の運動を解析することができるようになるという利点もある。
本実施態様の光学的観察用チャンバー１０において、下側透明板１１は、上記［３’］における型枠として、図１０と図１１に示す下側透明板成形用型枠１００を用いて成形している。図１０は、本発明の光学的観察用チャンバー１０を構成する下側透明板１１を成形する際に用いる下側透明板成形用型枠１００を示した斜視図である。図１１は、下側透明板成形用型枠１００の脚部形成用凹部１１０の底部に設けられた微細な溝１１１を溝１１１に垂直な面で切断した状態を示した断面図である。この下側透明板成形用型枠１００は、図１０に示すように、盤状のものとなっており、その片面に、下側透明板１１（図２を参照。）における下面の周縁部に脚部１１ａを形成するための脚部形成用凹部１１０と、下側透明板１１における下面の中央部１１ｂに窪みを形成するための中央部形成用凸部１２０と、下側透明板成形用型枠１００の外周部を囲う枠部１３０とが設けられたものとなっている。本実施態様の下側透明板成形用型枠１００において、脚部形成用凹部１１０は格子状に設けられており、格子状の脚部形成用凹部１１０によって区切られた部分が中央部形成用凸部１２０となっている。脚部形成用凹部１１０は、縦方向に平行に５本、横方向に平行に５本、溝状に設けられており、中央部形成用凸部１２０は、平面視矩形のものが４行４列に形成されており、一つの下側透明板成形用型枠１００で一度に１６個の下側透明板１１を成形できるようになっているが、この態様に限定されるものでなく、溝状の脚部形成用凹部１１０の本数や、形成される中央部形成用凸部１２０の個数は、適宜変更することができる。
下側透明板成形用型枠１００は、未硬化の熱硬化性樹脂を成形できるものであれば、特に限定されないが、金属板の片面に切削加工（フライス加工など）を施すことにより、脚部形成用凹部１１０となる溝を形成したものを採用すると好ましい。この場合、切削された溝の底部には、フライス加工機などの切削装置における回転切削刃が切削する際に形成される多数本の微細溝が形成されるが、鏡面加工などを施すことなく、削り出したままの状態としておくと好ましい。このように、溝の底部に多数の微細溝を残しておくことにより、熱硬化性樹脂と下側透明板成形用型枠１００の接触面積を減らし、下側透明板１１の脚部１１ａの底面を下側透明板成形用型枠１００に貼り付きにくくすることができるので、硬化後の下側透明板１１を下側透明板成形用型枠１００から剥がしやすくすることができる。本実施態様の下側透明板成形用型枠１００も、図１０に示すように、脚部形成用凹部１１０の底部に、回転切削刃が脚部形成用凹部１１０を切削した際に形成された多数の微細溝１１１が残ったままの状態のものを使用している。
下側透明板成形用型枠１００の脚部形成用凹部１１０の底部に形成する微細溝１１１のピッチＰ（微細溝１１１の隣り合う山部１１１ａの間隔。図１１を参照。）や高さ（深さ）Ｈ（微細溝１１１の谷部１１１ｂから山部１１１ａの高さ。図１１を参照。）は、特に限定されない。ピッチＰや高さＨは、回転切削刃の形状や送り速度を変えることにより、変更することができる。しかし、微細溝１１１のピッチＰを狭くするのは限界があるため、ピッチＰは、通常、０．５５μｍ以上とされる。ピッチＰは、１μｍ以上であると好ましく、２μｍ以上であるとより好ましい。一方、ピッチＰを広くしすぎると、未硬化の熱硬化性樹脂が微細溝１１１の谷部１１１ｂに入りこむようになり、逆に、硬化後の下側透明板１１を下側透明板成形用型枠１００から剥がしにくくなるおそれがある。このため、ピッチＰは、通常、１００μｍ以下とされる。ピッチＰは、５０μｍ以下であると好ましく、２０μｍ以下であるとより好ましい。また、微細溝１１１の高さＨを低くしすぎると、未硬化の熱硬化性樹脂が微細溝１１１の谷部１１１ｂに入りこむようになり、やはり、硬化後の下側透明板１１を下側透明板成形用型枠１００から剥がしにくくなるおそれがある。このため、高さＨは、通常、０．５μｍ以上とされる。高さＨは、１μｍ以上であると好ましく、２μｍ以上であるとより好ましい。一方、高さＨを高くしすぎると、微細溝１１１の山部１１１ａが強度的に脆弱になるおそれがある。このため、高さＨは、通常、１００μｍ以下とされる。高さＨは、５０μｍ以下であると好ましく、２０μｍ以下であるとより好ましい。
下側透明板１１や上側透明板１２の形状は、特に限定されない。本実施態様の光学的観察用チャンバー１０においては、図１に示すように、下側透明板１１と上側透明板１２は、いずれも略矩形の板状体となっている。このうち、上側透明板１２は、その上下面が平坦に形成されているものの、下側透明板１０は、図２に示すように、その下面の周縁部に他の部分よりも突き出た脚部１１ａが設けられている。脚部１１ａは、略矩形状の下側透明板１１の四辺部の全周に沿って環状に設けられている。これにより、下側透明板１１と上側透明板１２とで試料２０をより密封しやすくすることが可能となっている。すなわち、図４に示すように、下側透明板１１の中央部１１ｂに試料２０を載せた際に、下側透明板１１の中央部１１ｂが、その自重及び試料２０の重さによって下側に窪みやすくなるため、下側透明板１１の周縁部と上側透明板１２の周縁部とが密着しやすくなる。試料２０の上側に被せられた上側透明板１２は、試料２０の上面形状に沿って撓む。
この際、試料２０が厚く、試料２０の最も高い点が下側透明板１１の周縁部よりも高く突き出た状態となっている場合には、図４に示すように、上側透明板１２は、その周縁部が垂れ下がって下側透明板１１の周縁部に密着する。逆に、試料２０が薄く、試料２０における最も高い点が下側透明板１１の周縁部よりも低くなっている場合には、上側透明板１２の中央部が下方へ窪み、上側透明板１２の周縁部が高くなった状態で下側透明板１１の周縁部に密着する。いずれの場合も、下側透明板１１の周縁部と上側透明板１２の周縁部は、密着した状態となり、それに密封された試料２０が蒸発するのを防ぐことができる。
また、下側透明板１１と上側透明板１２を略矩形状としたことによって、試料２０に含まれる運動性物質（精子など）の移動する方向を操作しやすくして、精子の運動性の評価をより容易に行うことも可能になる。すなわち、図３に示すように、試料２０に対して上側透明板１２をｘ軸負側からｘ軸正側へ被せていくと、試料２０に含まれる精子はｘ軸負側からｘ軸正側へ移動するものが多くなるのであるが、下側透明板１１を略矩形状とし、その長軸方向が上側透明板１２を被せる方向と一致するようにすることによって、精子の運動を長時間観察することができるようになる。
下側透明板１１と上側透明板１２の各辺の長さは、試料２０の種類や、使用する顕微鏡の種類などによっても異なり、特に限定されないが、通常、その一辺が５〜５０ｍｍ、好ましくは１０〜３０ｍｍ程度とされる。また、下側透明板１１と上側透明板１２の厚さは、それを形成する素材によっても異なり、その透明性や可撓性を阻害しない程度であれば特に限定されないが、通常、１０μｍ〜２ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、１００〜５００μｍ、さらに好ましくは１５０〜３００μｍとされる。本実施態様の光学的観察用チャンバー１０において、下側透明板１１と上側透明板１２はいずれも、縦の長さ（図１のｙ軸方向の長さ）が１５ｍｍ、横の長さ（図１のｘ軸方向の長さ）が１０ｍｍで、その厚さ（下側透明板１１にあってはその中央部１１ｂの厚さ）は約２００μｍとなっている。
下側透明板１１における中央部１１ｂの凹み（観察部）の寸法も、特に限定されないが、小さくしすぎると、試料２０を狭い範囲でしか観察できなくなる。このため、下側透明板１１における観察部の短辺の長さは、通常、２ｍｍ以上とされる。観察部の短辺の長さは、５ｍｍ以上であると好ましく、７ｍｍ以上であるとより好ましい。同様の理由で、観察部の長辺の長さは、通常、５ｍｍ以上とされる。観察部の長辺の長さは、６ｍｍ以上であると好ましく、７ｍｍ以上であるとより好ましい。一方、観察部の寸法を大きくしすぎると、使用する熱可塑性樹脂の量が多くなり経済的でないばかりか、下側透明板１１の当該部分が破れやすくなるなどの不具合が生じるおそれもある。加えて、試料２０の観察のしやすさに関しても大きなメリットはなくなる。このため、観察部の短辺の長さは、通常、２０ｍｍ以下とされる。観察部の短辺の長さは、１５ｍｍ以下であると好ましく、１０ｍｍ以下であるとより好ましい。同様の理由で、観察部の長辺の長さは、通常、４０ｍｍ以下とされる。観察部の長辺の長さは、３０ｍｍ以下であると好ましく、２０ｍｍ以下であるとより好ましい。
下側透明板１１における中央部１１ｂの凹み（観察部）の短辺の長さ（Ｌ１とする。）に対する長辺の長さ（Ｌ２とする。）の比（Ｌ２／Ｌ１）は、１よりも大きければ特に限定されない。しかし、上述したように精子の運動を操作するためには、比（Ｌ２／Ｌ１）は、１．２以上とすると好ましい。比（Ｌ２／Ｌ１）は、１．５以上であるとより好ましく、１．７以上であるとさらに好ましい。一方、比（Ｌ２／Ｌ１）を大きくしすぎてもあまり意味がない。このため、比（Ｌ２／Ｌ１）は、通常、１０以下とされる。比（Ｌ２／Ｌ１）は、５以下であると好ましく、３以下であるとより好ましい。本実施態様の光学的観察用チャンバー１０において、下側透明板１１における観察部の短辺の長さは５ｍｍ、比（Ｌ２／Ｌ１）は２となっている。
下側透明板１１における脚部１１ａの高さは、下側透明板１１の寸法などによっても異なり、特に限定されない。しかし、脚部１１ａを低くしすぎると、脚部１１ａを設けた意義がなくなってしまう。このため、脚部１１ａの高さは、通常、５０μｍ以上とされる。脚部１１ａの高さは、１００μｍ以上であると好ましく、１５０μｍ以上であるとより好ましい。一方、脚部１１ａが高すぎると、下側透明板１１が歪な形に変形しやすくなるおそれがある。また、下側透明板１１の設置安定性が悪くなるおそれがある。このため、脚部１１ａの高さは、通常、１ｍｍ以下とされる。脚部１１ａの高さは、５００μｍ以下であると好ましく、３００μｍ以下であるとより好ましい。本実施態様の光学的観察用チャンバー１０において、脚部１１ａの高さは、約２００μｍとなっている。
また、下側透明板１１と上側透明板１２とで挟んだ際の試料２０の厚さ（最も厚い部分の厚さ。以下同じ。）も肝要である。というのも、試料２０が薄くなりすぎると、試料２０が存在しない場所ができて観察を適切に行えなくなるおそれがある。このため、試料２０の厚さは、通常、５μｍ以上とされる。試料２０の厚さは、５０μｍ以上であると好ましく、１００μｍ以上であるとより好ましい。一方、試料２０が厚くなりすぎると、使用する顕微鏡などの光学的観察手段の被写界深度を超えた場所にも試料２０が存在するようになり、観察画像が不鮮明になるおそれがある。このため、試料２０の厚さは、通常、１ｍｍ以下とされる。試料２０の厚さは、７００μｍ以下であると好ましく、５００μｍ以下であるとより好ましい。
続いて、本発明の光学的観察用チャンバーの効果を調べるために、スライドガラスとカバーガラスに試料を挟んで作製したプレパラート（比較例）と、本発明の光学的観察用チャンバーに試料を密封して作製したプレパラート（実施例）とを用いて、前記試料に含まれる各運動性物質の運動性を評価する実験を行った。比較例のプレパラートにおけるスライドガラスとカバーガラスの水接触角は、約３０°である。一方、実施例のプレパラートにおける本発明の光学的観察用チャンバーの下側透明板と上側透明板の水接触角は、約１００°である。また、比較例と実施例のいずれの場合においても、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するＨＥＰＥＳ−緩衝タイロードの乳酸（ＴＬ−ＨＥＰＥＳ）培養液で５倍に希釈した豚の精液（２μＬ）を試料として用いた。したがって、ここでいう「運動性物質」とは「豚の精子」のことである。
本実験においては、比較例のプレパラートと実施例のプレパラートのそれぞれが精子（運動性物質）の直進速度と頭部振幅にどのような影響を及ぼすかについて調べてみた。精子の直進速度及び頭部振幅は、比較例と実施例のそれぞれのプレパラートを顕微鏡のステージ上のスライドガラス３０（図４の符号３０）に載せ、該顕微鏡の観察画像を、精子運動解析装置（Ｓｐｅｒｍ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ：ＳＭＡＳ）で解析することにより求めた。顕微鏡は、正立顕微鏡（例えば、オリンパス株式会社製の生物顕微鏡ＣＸ４１）を用いてもよいが、ここでは、倒立顕微鏡（株式会社ニコン製のエクリプス）を用いた。精子運動解析装置は、加賀電子株式会社製のものを用いた。倒立顕微鏡のレンズには、株式会社ニコン製の１０倍対物レンズ（品名：ＢＭ１０×Ａ）を使用した。スライドガラスには、松浪硝子工業株式会社製のものを用いた。
図５は、比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後の精子運動解析装置の解析画像を撮影した写真である。図６は、実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後の精子運動解析装置の解析画像を撮影した写真である。図５と図６においては、当該解析画像が撮影された直前の１秒間に亘る各精子の運動軌跡が線で示されてある。以下においては、精子の運動軌跡を表すこの線のことを「移動経路線」と呼ぶ。
図７は、精子（運動性物質）の移動経路線から精子の直進速度と頭部振幅を求めるアルゴリズムを説明する図である。精子の直進速度は、図７に示すように、精子の移動経路線の始点と終点とを結ぶ線分（直進経路）の長さを求め、該直進経路の長さを、精子が前記始点から終点に至るまでに要した時間（本実験においては最大１秒間）で序することによって求める。この方法によって、各精子の直進速度を求め、その分布を求めた。また、精子の頭部振幅は、図７に示すように、移動経路線の包絡線の間隔を測定することにより求めた。この方法によって、各精子の頭部振幅を求め、その分布を求めた。
図８は、
比較例のプレパラートを作製した直後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ａ）と、
比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ｂ）と、
実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ｃ）と、
をそれぞれ示したグラフである。このうち、折れ線Ａの直進速度の分布は、プレパラートを作製した直後において、上述した方法と同様の方法で精子の直進速度を求めることにより得たものである。
比較例のプレパラートを作製した直後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ａ）と、
比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ｂ）と、
実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の直進速度の分布（折れ線Ｃ）と、
をそれぞれ示したグラフである。このうち、折れ線Ａの直進速度の分布は、プレパラートを作製した直後において、上述した方法と同様の方法で精子の直進速度を求めることにより得たものである。
図８の折れ線Ａを見ると、直進速度が５μｍ／ｓ未満の精子が約２％、直進速度が５〜１０μｍ／ｓ未満の精子が約４％と、直進速度の遅い精子が非常に少ないことが分かる。折れ線Ａにおいては、直進速度が１０〜１５μｍ／ｓ、１５〜２０μｍ／ｓ、２０〜２５μｍ／ｓ、２５〜３０μｍ／ｓ、３０〜３５μｍ／ｓ、３５〜４０μｍ／ｓ、４０〜４５μｍ／ｓの精子は、それぞれ１０％前後で推移しており、直進速度が４５μｍ／ｓ以上の精子は２５％以上も存在している。比較例のプレパラートを作製した直後における各精子の直進速度の平均値は、約３４．３μｍ／ｓであった。このことから、比較例のプレパラートであっても、該プレパラートを作製した直後においては、精液（試料）中の精子（運動性物質）が活発に運動していることが分かった。
これに対し、図８の折れ線Ｂを見ると、直進速度が２０μｍ／ｓ以上の精子が略皆無となっていることが分かる。その反面、折れ線Ｂにおいては、直進速度が２０μｍ／ｓ未満の精子が約９８％を占めており、直進速度の遅い精子ばかりであることが分かる。比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後における各精子の直進速度の平均値は、約７．９μｍ／ｓであった。折れ線Ａと折れ線Ｂは、同じプレパラートを用いた結果であるにもかかわらず、このように、精子の直進速度の分布に大きな差が生じたのは、時間が経過するにつれて精子が比較例のプレパラートを形成するスライドガラスやカバーガラスに吸着してしまい、運動できなくなったことが原因であると考えられる。
一方、図８の折れ線Ｃを見ると、折れ線Ｃが折れ線Ａに略一致しており、実施例のプレパラートにおいては、直進速度の遅い精子が非常に少ないことが分かる。実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後における各精子の直進速度の平均値は、約３３．３μｍ／ｓであり、比較例のプレパラートを作製した直後の数値と比較して有意差（有意水準０．０５）は認められなかった。プレパラートを作製してから約１５分が経過しているにもかかわらず、本発明の光学的観察用チャンバーを用いた実施例のプレパラートにおいて、精子の直進速度に殆ど影響が見られなかったのは、本発明の光学的観察用チャンバーの下側透明板や上側透明板に精子が殆ど吸着せず、各精子の運動が阻害されなかったことが原因であると考えられる。以上の結果から、本発明の光学的観察用チャンバーが、精液に含まれる精子など、ガラスやプラスチックに吸着しやすい物質を含む試料の光学的観察を行う際に好適に使用できるものであることが分かった。
図９は、
比較例のプレパラートを作製した直後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｄ）と、
比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｅ）と、
実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｆ）と、
をそれぞれ示したグラフである。このうち、折れ線Ｄの頭部振幅の分布は、プレパラートを作製した直後において、上述した方法と同様の方法で精子の頭部振幅を求めることにより得たものである。
比較例のプレパラートを作製した直後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｄ）と、
比較例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｅ）と、
実施例のプレパラートを作製してから１５分経過後における精液（試料）中の精子（運動性物質）の頭部振幅の分布（折れ線Ｆ）と、
をそれぞれ示したグラフである。このうち、折れ線Ｄの頭部振幅の分布は、プレパラートを作製した直後において、上述した方法と同様の方法で精子の頭部振幅を求めることにより得たものである。
図９を見ると、本発明の光学的観察用チャンバーを用いた実施例のプレパラートにおけるプレパラートを作製してから１５分経過後の頭部振幅の分布（折れ線Ｆ）は、スライドガラスとカバーガラスに試料を挟んで作製した比較例のプレパラートにおけるプレパラートを作製した直後の頭部振幅の分布（折れ線Ｄ）よりは全体的に小さくなる方向にシフトしているものの、該比較例のプレパラートにおけるプレパラートを作製してから１５分経過後の頭部振幅の分布（折れ線Ｅ）よりは全体的に大きくなっていることが分かる。折れ線Ｄ，Ｅ，Ｆにおける頭部振幅の平均値は、それぞれ、５．４μｍ、２．１μｍ、３．７μｍであった。以上の結果からも、本発明の光学的観察用チャンバーが、精液に含まれる精子など、ガラスやプラスチックに吸着しやすい物質を含む試料の光学的観察を行う際に好適に使用できるものであることが定量的に裏付けられた。
本発明の光学的観察用チャンバーは、各種の試料を観察する際に用いることができる。なかでも、精子や細胞などの生体（運動性物質）を観察する際に用いると好適である。また、精子や細胞などは、ガラスに吸着されやすく、ガラス（スライドガラスやカバーガラス）を試料に接触させる従来のプレパラートでは、その運動性を評価しにくいものの、本発明の光学的観察用チャンバーにおいては、下側透明板や上側透明板には、精子などのガラス吸着性物質が吸着しにくくなる。本発明の光学的観察用チャンバーは、精子などのガラス吸着性物質を観察する際に好適に使用することができる。本発明の光学的観察用チャンバーは、豚などの家畜の精子だけでなく、人間の精子を観察する際にも使用することができる。
１０ 光学的観察用チャンバー
１１ 下側透明板
１１ａ 脚部
１１ｂ 中央部
１２ 上側透明板
２０ 試料
３０ スライドガラス
１００ 下側透明板成形用型枠
１１０ 脚部形成用凹部
１１１ 微細溝
１１１ａ 山部
１１１ｂ 谷部
１２０ 中央部形成用凸部
１３０ 枠部
Ｐ 溝のピッチ
Ｈ 溝の高さ（深さ）
１１ 下側透明板
１１ａ 脚部
１１ｂ 中央部
１２ 上側透明板
２０ 試料
３０ スライドガラス
１００ 下側透明板成形用型枠
１１０ 脚部形成用凹部
１１１ 微細溝
１１１ａ 山部
１１１ｂ 谷部
１２０ 中央部形成用凸部
１３０ 枠部
Ｐ 溝のピッチ
Ｈ 溝の高さ（深さ）
Claims (9)
- 試料を載せるための下側透明板と、試料の上側に被せるための上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーであって、
下側透明板が可撓性を有する素材によって形成され、下側透明板の中央部に試料を載せて上側透明板を試料に被せた際に、下側透明板の中央部が自重及び試料の重さによって窪み、その状態で下側透明板の周縁部が上側透明板に接触することにより、上側透明板と下側透明板とで試料を密封できるようにしたことを特徴とする光学的観察用チャンバー。 - 下側透明板の下面における周縁部から下方に突出して脚部が設けられ、下側透明板に試料を載せた際に、下側透明板の自重及び試料の重量によって下側透明板の中央部が押し下げられるようにした請求項１記載の光学的観察用チャンバー。
- 下側透明板が平面視略矩形状とされ、前記脚部が平面視略矩形状に設けられた請求項２記載の光学的観察用チャンバー。
- 上側透明板が可撓性を有する素材によって形成された請求項１〜３いずれか記載の光学的観察用チャンバー。
- 上側透明板及び／又は下側透明板が、水接触角７０°以上の素材によって形成された請求項１〜４いずれか記載の光学的観察用チャンバー。
- 上側透明板及び／又は下側透明板が、シリコーンエラストマーである請求項５記載の光学的観察用チャンバー。
- 下側透明板と上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーに試料を挟んだ状態で該試料を光学的観察手段によって観察する試料の光学的観察方法であって、
可撓性を有する素材によって形成した下側透明板の中央部に試料を載せて上側透明板を試料に被せて、下側透明板の中央部を自重及び試料の重さによって窪ませ、その状態で下側透明板の周縁部を上側透明板に接触させることにより、上側透明板と下側透明板とで試料を密封した状態で試料を観察することを特徴とする試料の光学的観察方法。 - 試料を載せるための下側透明板と、試料の上側に被せるための上側透明板とを備えた光学的観察用チャンバーにおける下側透明板の製造方法であって、
脚部形成用凹部が設けられた下側透明板成形用型枠に透明な熱硬化性樹脂を未硬化の状態で流し込んだ後、熱硬化性樹脂を下側透明板成形用型枠とともに加熱して可撓性を有する状態で硬化させることにより、脚部形成用凹部で下側透明板の下面における周縁部から下方に突出した脚部を形成し、使用時においてその中央部に試料を載せて上側透明板を試料に被せた際にその中央部が自重及び試料の重さによって窪む構造の下側透明板を得ることを特徴とする下側透明板の製造方法。 - 下側透明板成形用型枠として、その脚部形成用凹部の底部に複数本の微細な溝が形成されたものを用いる請求項８記載の下側透明板の製造方法。
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| JP2011523592A JP5610313B2 (ja) | 2009-07-21 | 2010-06-24 | 光学的観察用チャンバー及び試料の光学的観察方法、並びに下側透明板の製造方法 |
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