JP5602164B2

JP5602164B2 - 抗炎症剤

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Publication number: JP5602164B2
Application number: JP2011551859A
Authority: JP
Inventors: 伸二郎今井; 啓子田中
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: WO2011093290A1; JPWO2011093290A1

Description

本発明は、抗炎症剤、それを含有する飲食品等及び抗炎症剤の製造方法に関する。

抗炎症剤は、胃炎及び潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチ及び変性性骨関節炎等の関節炎、並びに花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアトピー性皮膚炎等の炎症症状の治療に有用である。医薬品としての抗炎症剤には、これまでステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬及び免疫抑制剤等が知られている。しかし、いずれも強い副作用があるため、医師の指導や管理の下での慎重な投与を要するという問題がある。

一方、これらの医薬品に代えて、抗炎症作用を示すいわゆる健康食品、例えば、保険機能食品等を摂取することによって炎症性疾患や炎症症状を改善しようとする試みも行われている。例えば、甜茶、グルコサミン、コンドロイチン、アスタキサンチン、カテキン等又はそれを添加した食品が挙げられる。しかし、これらの健康食品は、医薬品に比べて副作用は少ないものの、炎症の改善効果も弱いため十分な抗炎症効果があるとは言い難かった。

したがって、日常的に服用が可能で、しかも効果的に炎症性疾患や炎症症状を緩和できる抗炎症剤の開発が望まれている。

ところで、大豆は、豆腐、醤油、納豆等の原料としてよく知られており、大豆種子から機能性成分を得る試みが盛んに行われている。例えば、特許文献１には、スタキオースを有効成分とするアトピー性皮膚炎モデル動物の炎症症状を改善する抗アレルギー性組成物が開示されており、スタキオースは大豆種子から抽出できることが記載されている。しかし、大豆種子に含まれるスタキオースは極めて量が少なく、通常の抽出操作を行っただけでは十分な量を得ることができない。それ故、効果の認められる98％以上の濃度に濃縮するには、クロマトグラフィー等の複雑な精製工程を行う必要があり、その結果、コストがかかり過ぎるという問題があった。また、スタキオースは難消化性であり、高濃度で摂取すると下痢等を発症する恐れがあるという問題もあった。

特開2003-321372号公報

本発明の課題は、安全、安価かつ簡便に日常的に継続して摂取することができ、かつ顕著な炎症抑制作用を有し、種々の炎症性疾患、炎症症状の予防及び／又は改善に有効な天然素材を開発し、提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、青大豆種子の溶媒抽出物を光によって活性化した組成物が、極めて強力なインターロイキン2（以下、IL-2という）産生抑制作用を示すと共に、炎症を改善できることを見出した。

すなわち、本発明は以下の事項に関する。

（１）青大豆種子の溶媒抽出物に由来する光活性化処理物質を含んでなる抗炎症剤。

（２）光活性化処理物質は、前記溶媒抽出物質に光照射処理をすることによって得ることのできる、（１）に記載の抗炎症剤。

（３）光照射処理は、照度（キロルクス：klx）と照射時間（hr）の積が40klx・hr以上となるように光を照射する処理である、（２）に記載の抗炎症剤。

（４）光照射処理における光の波長が200nm〜800nmである、（２）又は（３）に記載の抗炎症剤。

（５）前記溶媒が極性溶媒である、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗炎症剤。

（６）極性溶媒が水、低級アルコール、クロロホルム又はジメチルスルホキシドから選択される1種以上である、（５）に記載の抗炎症剤。

（７）IL-2産生を抑制する、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗炎症剤。

（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗炎症剤を含有する、抗炎症用飲食品、飼料及び化粧料。

（９）（ａ）青大豆種子から溶媒抽出物質を抽出する工程、及び（ｂ）前記溶媒抽出物に光活性化処理をする工程、を含む、抗炎症剤の製造方法。

（１０）（ｂ）において照度（キロルクス：klx）と照射時間（hr）の積が40klx・hr以上となるように光を照射する、（９）に記載の製造方法。

（１１）（ｂ）において光照射処理の光の波長が200nm〜800nmである、（９）又は（１０）に記載の製造方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-014519号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

本発明により、安全・安価かつ簡便に日常的に継続して摂取することができ、かつ顕著な抗炎症作用を有し、種々の炎症性疾患、炎症症状の予防及び／又は改善に有効な抗炎症剤を提供することができる。

各種大豆種子の溶媒抽出物由来の抗炎症剤によるIL-2産生抑制作用を示す。照射時間とIL-2産生抑制作用の関係を示す。抗炎症剤によるマウスの皮膚炎症改善作用をグラフ化したものである。抗炎症剤によるマウスの皮膚炎症の実際の改善作用を示す。

１．抗炎症剤
本発明の第一の態様は、抗炎症剤である。本発明の抗炎症剤は、青大豆種子の溶媒抽出物質に由来する光活性処理物質を有効成分として含んでなることを特徴とする。以下、本発明の抗炎症剤について、具体的に説明をする。

１−１．抗炎症剤の実施形態
本明細書において「抗炎症剤」とは、抗炎症作用を有する物質をいう。「抗炎症」とは、サイトカインの一種であるIL-2（インターロイキン2）の産生によって生じる様々な有害作用を予防、治療、減少又は緩和させることをいう。IL-2は、T細胞やNK細胞（ナチュラルキラー細胞）によって産生され、T細胞、B細胞及びNK細胞の増殖、活性化、B細胞における抗体産生の亢進並びに細胞障害活性の増強に機能することが知られている。「IL-2の産生によって生じる様々な有害作用」とは、例えば、IL-2によって活性化された炎症性細胞により発症する局所的な又は全身的な炎症症状及びそれらによって誘発される様々な二次的症状をいう。具体的には、胃炎及び潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチ及び変性性骨関節炎等の関節炎、並びに花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアトピー性皮膚炎等の種々のアレルギー性炎症疾患が該当する。ただし、ここでいうアレルギー性炎症疾患には、即時型アレルギー反応とも呼ばれる、IgEを介したI型アレルギー反応による疾患は含まない。したがって、例えば、前記アトピー性皮膚炎における症状において、丘疹や色素沈着は「IL-2の産生によって生じる様々な有害作用」の一つに含まれるが、掻痒は含まれない。

本明細書において「青大豆」とは、完熟した状態における種子の種皮及び／又は胚の全部又は一部が緑色を呈するダイズ（Glycine max）の品種の総称である。例えば、あきたみどり、キヨミドリ、越後みどり（エチゴミドリ）、大袖の舞、早生緑、くらかけ、スズカリ、青丸くん、青目大豆、秋試緑1号、双青、青入道、青仁大豆（Chinease green soybean）、あやみどり、信濃青豆、黒神、岩手みどり、秘伝、ひたし豆、天津青大豆等の品種が該当する。一般に、青大豆には、あきたみどりのように種皮及び胚が緑色を呈する品種、くらかけのように種皮が緑地で一部黒色が混じり、胚は緑色を呈する品種又は大袖振のように種皮のみが緑色を呈する品種が知られているが、本発明の青大豆は、少なくとも胚が緑色を呈する品種であればいずれの品種であってもよい。好ましくは種皮及び胚が緑色を呈する品種である。また、青大豆であっても「臍」の色は、品種により黄、緑、暗褐色、黒と様々であるが、特に制限しない。「完熟した状態」とは、種子が発芽能力を有するまでに十分に成熟した状態をいう。したがって、青大豆以外の大豆であっても一般に枝豆と称される未成熟な状態の大豆種子は緑色を呈しているが、このような未成熟状態時のみに緑色を呈する品種は、本発明の青大豆には該当しない。また、ここでいう「緑色」とは、波長490nm〜570nmの反射光に基づいてヒトの目によって認識される色彩をいう。したがって、前記波長の範囲内であれば、その濃淡を制限するものではなく、例えば、淡緑色、黄緑色、緑及び青緑色を包含する。

前記「種子」は、種皮及び／又は胚を含み、胚は、子葉及び胚軸を含む。

本明細書において「青大豆種子の溶媒抽出物」とは、青大豆の種子に含まれる成分を溶媒中に溶出させた後の溶液（抽出液）、その乾燥物（粉末又は固形物を問わない）、前記乾燥物の再溶解液又はその組合せをいう。溶媒は、特に限定はしないが、好ましくは極性溶媒であり、例えば、水、低級アルコール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド（DMSO）又はそれらの組合せがより好ましい。中でも水、エタノール又はそれらの組合せはヒトを含む動物に投与しても有害性がないか又は極めて低いことから特に好ましい。光活性処理前の青大豆種子の溶媒抽出物は、光活性処理物質の前駆体を含有する。

本発明において「光活性化処理物質」とは、本発明の抗炎症剤の有効成分であり、IL-2の産生抑制効果を有する。光活性化処理物質は、前記青大豆種子の溶媒抽出物、より具体的にはその抽出物に含まれる光活性化処理物質の前駆体に光照射処理をすることによって得ることができる。光活性化処理物質の前駆体を得るために、必ずしも溶媒抽出物を精製処理する必要性はなく、他の成分が混在するクルードな状態であってもよい。

本発明において「光活性化処理」とは、青大豆種子の溶媒抽出物に光を照射する事によって、光活性化処理物質の前駆体を光活性化処理物質に変換する処理をいう。ここでいう「光」とは、可視光線のみならず、赤外線及び紫外線等の不可視光線も含む。具体的には、例えば、200nm〜800nm、好ましくは280〜700nm、さらに好ましくは360〜650nmの波長を有する光線をいう。光活性化処理は、光活性化処理物質の前駆体に光を照射することができれば具体的な処理方法は、特に限定はしない。好ましくは、青大豆種子の溶媒抽出物に対する照度（キロルクス：klx）及び照射時間（hr）の積が40klx・hr以上となるように光を照射する処理である。後述する実施例で示すように、この処理によってIL-2の産生率を約20％以上低下することができるからである。青大豆種子の溶媒抽出物が抽出液の乾燥物（粉末、固形物を含む）である場合、光活性化処理前にそれを再度溶媒中に溶解させておくことが好ましい。液体状態にすることで、光照射の際に青大豆種子の溶媒抽出物全体に十分に光を行き渡らせることができるからである。なお、光活性化処理によって、青大豆種子の溶媒抽出物中に含まれる全ての光活性化物質の前駆体が光活性化処理物質に変換される必要はない。例えば、好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上、一層好ましくは50％以上の前記前駆体が光活性化処理物質に変換されていればよい。

本発明の抗炎症剤は、光活性化処理をした青大豆種子の溶媒抽出物単独で、又は抗炎症作用を有する一以上の他の物質と組み合わせて構成されていてもよい。

本発明の抗炎症剤を使用する場合、その投与量又は摂取量は、乾燥質量基準として、前記光活性化処理物質が成人1日当たり0.01〜100gの範囲となるようにすればよい。例えば、光活性化処理済みの青大豆種子の溶媒抽出物を単独で使用する場合、その溶媒抽出物中に約20％程度の光活性化処理物質が含まれるのであれば、溶媒抽出物を1日当たり0.05g〜500g投与又は摂取すればよい。経口投与の場合、光活性化処理物質の一般的な1日当たりの摂取量は、0.1〜50gであるが、該処理物質は、大豆種子に由来する安全性の高いものであるため、その摂取量をさらに増やすこともできる。1日当たりの摂取量は、1回で摂取してもよいが、数回に分けて投与又は摂取することもできる。

本発明の抗炎症剤は、医薬組成物として用いることができる。医薬組成物として用いる場合、その剤型として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤及び懸濁剤のような経口剤、吸入剤、坐剤等の経腸製剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤のような皮膚外用剤、点滴剤、注射剤等が挙げられる。これらのうち、経口剤が手軽に使用できることから好ましい。

このような剤型は、光活性化物質を含む青大豆種子の溶媒抽出物に、慣用される担体、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。錠剤、顆粒剤の場合には周知の方法でその表面をコーティングしてもよい。また、液剤、懸濁等の液体製剤は、水又はエタノールのような適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。

医薬組成物における青大豆種子の溶媒抽出物の光活性化処理物質の含有量は、その剤型により異なるが、乾燥質量を基準として、通常は、0.001〜99質量％、好ましくは0.01〜80質量％の範囲であり、上述した成人1日当たりの摂取量を摂取できるよう、1日当たりの投与量が管理できる形にすることが望ましい。

１−２．効果
本発明の抗炎症剤によれば、そのまま単独で、あるいは他の抗炎症剤と共に継続的に使用することにより、IL-2の産生量を抑制することができるため、炎症性細胞や免疫細胞の機能を低下させることが可能となる。そのため、胃炎及び潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチ及び変性性骨関節炎等の関節炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアトピー性皮膚炎等の炎症症状に対しての予防及び／又は改善、健康の増進若しくは滋養強壮の促進に有用である。

本発明の抗炎症剤は、後述する実施例で示すように、強力なIL-2産生抑制作用を有するため免疫抑制剤としての効果も有する。それ故、例えば、臓器移植時／後の副作用防止等にも有用である。

さらに、本発明の抗炎症剤は、食品として使用される青大豆種子を原料としているため、安全性が高く、風味もよいことから、そのまま単独でも充分に経口摂取することが可能であり、長期間の日常的な継続的投与が可能である。さらに様々な医薬品、食品、飼料の形態として長期間の継続的摂取も容易である。しかも本発明の抗炎症剤の有効成分は、青大豆種子の溶媒抽出物を光により活性化するという簡便な操作で製造することができるうえ、効果が高いため、経済的にも優れている。

２．抗炎症用飲食品、飼料及び化粧料
本発明の第二の態様は、抗炎症用飲食品、飼料及び化粧料である。本発明の抗炎症用飲食品、飼料及び化粧料は、前記第一態様の抗炎症剤を一以上含有することを特徴とする。以下、各組成物について説明をする。

２−１．飲食品及び飼料
本発明の抗炎症用飲食品及び飼料（以下「本発明の抗炎症用飲食品等」とする）は、本発明の抗炎症剤を有効成分として含有する飲食品及び飼料である。飲食品等として調製する場合、その形態は特に制限されず、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、あるいは家畜、競走馬若しくは鑑賞動物等の飼料又はペットフード等の他、本発明の抗炎症剤を配合できる全ての飲食品又は飼料が含まれる。これらは、より具体的には、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤及び経管経腸栄養剤等の流動食等の各種製剤形態とすることができる。製剤形態の飲食品等は、前記医薬組成物と同様の方法で製造することができる。さらに飲食品は、緑茶、ウーロン茶や紅茶等の茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、精製水等の飲料、バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等のスプレッド類、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープ又はソース類、菓子（たとえばビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）等として調製してもよい。

また、本発明の飼料は、本発明の前記飲食品とほぼ同様の組成・形態で利用できることから、本明細書における飲食品に関する記載を飼料についても同様に当てはめることができる。

食品は、さらに、食品の製造に用いられる他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（たとえば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、pH調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合して、常法に従って製造することができる。また、通常食されている食品に本発明の剤を配合することにより、本発明に係る食品を製造することもできる。

食品中における青大豆種子の溶媒抽出物由来の光活性化処理物質の含有量は、食品の形態により異なるが、乾燥質量を基準として、通常は、0.001〜80質量％、好ましくは0.01〜50質量％、より好ましくは1〜50質量％の範囲である。1日当たりの摂取量を1回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。上述した、成人1日当たりの摂取量を飲食できるよう、1日当たりの摂取量を管理できる形状にするのが好ましい。

２−２．化粧料
本発明の抗炎症剤は、化粧料としても用いることができる。化粧料を調製する場合、青大豆種子の溶媒抽出物由来の光活性化処理物質をそのまま化粧料として利用してもよく、又はそれを汎用の方法で配合し、乳液、化粧液、クリーム、ローション、エッセンス、パック及びシート、ファンデーション、おしろい、頬紅、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、洗顔料、皮膚洗浄料、ゲル剤、ジェル剤、美肌剤、ボディシャンプー等の洗浄料、シャンプー、リンス等の毛髪化粧料、頭髪料、ヘアートリートメント、養毛剤、浴用剤、軟膏、医薬部外品、あぶら取り紙等の形態で調製してもよい。

化粧料は、青大豆種子の溶媒抽出物由来の光活性化処理物質のほかに、所望する剤型に応じて公知の賦形剤や香料を初め、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、pH調節剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合して、常法に従って製造することができる。

化粧料における青大豆種子の溶媒抽出物由来の光活性化処理物質の含有量は、特に限定されないが、乾燥質量を基準として通常は、0.001〜80質量％、好ましくは0.01〜50質量％の範囲内である。

さらに本発明の抗炎症剤を含有する食品、飼料及び化粧料には、上記以外にも例えば、共役リノール酸、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムQ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、トウガラシエキス、ショウガエキス、カカオエキス、ガラナエキス、ガルシニアエキス、テアニン、γ−アミノ酪酸、カプサイシン、カプシエイト、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖等の難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドン等を配合してもよい。

それら添加剤の配合量は、組成物の形態、添加剤の種類及び所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、本発明の剤、食品、飼料及び化粧料中、0.01〜70質量％の範囲内であり、好ましくは0.1〜50質量％の範囲内である。

２−３．効果
本発明の食品、飼料又は化粧料は、前記態様の本発明の抗炎症剤を有効成分として含有することから、継続的に適用すると前記抗炎症剤と同様の効果を得ることができる。すなわち、IL-2の産生量を抑制し、炎症性細胞や免疫細胞の機能を低下させることが可能となる。そのため、胃炎及び潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチ及び変性性骨関節炎等の関節炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアトピー性皮膚炎等の炎症症状に対しての予防及び／又は改善、健康の増進若しくは滋養強壮の促進に有用である。さらに本発明の抗炎症剤は、免疫抑制剤としても有用であり、例えば臓器移植時／後の副作用防止等に有用である。また本発明の剤は、食品として使用される青大豆種子を原料としているため、安全性が高く、また風味もよいことから、そのまま単独でも充分に経口摂取したり、化粧料として適用することが可能であり、食品、飼料の形態として長期間の継続的摂取も容易である。

３．抗炎症剤の製造方法
本発明の第三の態様は、抗炎症剤の製造方法である。

３−１．抗炎症剤の製造工程
本発明の製造方法は、（１）抽出工程、及び（２）光活性化処理工程を含む。以下、各工程について詳細に説明する。

（１）抽出工程
本工程は、青大豆種子から溶媒抽出物を抽出する工程である。青大豆種子は、一又は二以上の品種を使用することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、抽出の際に青大豆以外の大豆（例えば、黄大豆、黒大豆）の種子を含むこともできる。

本工程に使用する青大豆種子の状態は、特に制限はしない。例えば、未成熟なもの（いわゆる枝豆状態）、成熟したもの（乾燥及び未乾燥状態のものを含む）、発芽したもの（発根後、子葉が開く前までのものを含む）又はそれらの組合せを使用することができる。また、種子全部の他、胚のみを使用してもよい。好ましくは、種子全部の使用である。また本工程で使用する青大豆種子の形状は、莢から取り出した種子そのままの状態又は種子を断片化したものでも使用できなくはないが、好ましくは粉砕したもの、圧搾抽出した搾汁又はそれらの組合せである。これは、青大豆種子に含まれる光活性化処理物質の前駆体のより多くに、光活性処理を施すためである。

本工程で用いることができる溶媒は、特に限定はしないが、水又は有機溶媒が好ましい。具体的には、水としては、純水、蒸留水、水道水、酸性水、アルカリ水、中性水等が挙げられる。また、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等の低級アルコール、及び1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール等の室温で液体であるアルコール；ジエチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル；クロロホルム、DMSO等の極性有機溶媒が好ましい。前記溶媒を単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、後述する含水有機溶媒が挙げられる。上記の有機溶媒の中では、操作性や環境性の点から、室温で液体であるアルコール、例えば、炭素原子数1〜4の低級アルコールを用いるのが好ましく、残留溶媒による安全性の観点からはエタノールを用いるのがより好ましい。抽出効率を高く保持する観点からは、上記含水有機溶媒中の水性成分の含有量は、通常80体積％以下、好ましくは65体積％以下、より好ましくは50体積％以下であるのが望ましい。

本工程において、青大豆種子と溶媒を抽出槽中に入れる順序は、特に制限はない。溶媒の入った槽中に青大豆種子を入れてもよいし、青大豆種子を入れた槽中に溶媒を加えてもよい。又は、それらを同時に抽出槽に入れても構わない。また、青大豆種子と溶媒のいずれか一方又は両方の一部を抽出槽に先に入れ、残りを本工程の途中で追加することもできる。

抽出方法は、特に制限されないが、青大豆種子を抽出溶媒中に浸漬、攪拌又は還流等する方法、あるいは超臨界流体抽出法等の公知の方法を挙げることができる。

具体的な抽出方法としては、青大豆種子を、減圧、常圧あるいは加圧下で、室温あるいは加温した溶媒中に加え、浸漬や攪拌しながら抽出する方法、溶媒中で還流しながら抽出する方法等が挙げられる。その際、抽出温度は5℃から溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、使用する溶媒の種類や抽出条件、含水有機溶媒の場合にはさらに水性成分含有量によっても異なるが、30分〜72時間程度とするのが適切である。還流操作により抽出を行う場合は、青大豆種子の抽出物が変性や熱分解を起こさないように低沸点の溶媒を用いるのが好ましい。また、二酸化炭素等を用いる超臨界流体抽出法により抽出操作を実施することもできる。

ついで、抽出液及び残渣を含む混合物を、必要に応じて濾過あるいは遠心分離等に供し、残渣である固形成分を除去した抽出液を得る。なお、除去した固形成分を再度、同種の溶媒、又は異種の溶媒を用いて抽出操作に供することもでき、さらにこの操作を何回か繰り返してもよい。

このようにして得られた抽出液をそのまま青大豆種子の溶媒抽出物として後述する光活性化処理工程に供することができる。さらに、必要に応じて、凍結乾燥やスプレードライ等の方法により、乾燥、粉末化することもできる。乾燥、粉末化した溶媒抽出物は、光活性化処理工程に供するまでに時間が開く場合又は光活性化処理工程を抽出工程と異なる場所で行う場合等に保存又は運搬面において便利である。

抽出液を乾燥する場合、具体的な乾燥方法は、青大豆種子の溶媒抽出物が変性や熱分解を起こさない条件下で行い得る方法あれば、どのような方法でもよく、例えば、必要に応じて賦形剤を添加し、濾過、遠心分離、遠心濾過、スプレードライ、スプレークール、ドラムドライ、真空乾燥、凍結乾燥等の方法が挙げられ、これらの方法を単独で又は組み合わせて採用できる。

（２）光活性化処理工程
本工程は、前記抽出工程で得られた青大豆種子の溶媒抽出物に光活性化処理をする工程である。

本工程の青大豆種子の溶媒抽出物は、青大豆種子の溶媒抽出物を抽出液そのままの状態で、抽出液を乾燥させて固化若しくは粉末化した状態で、又は一旦粉末若しくは固形状態にした後に溶媒に再溶解、再懸濁又は再分散した液体状態で供することができる。好ましくは前記いずれかの液体状態で供されることである。液体状態であれば、抽出物に含まれる光活性化処理物質の前駆体に均一に光があたるようにそれを配置することが可能だからである。一旦粉末若しくは固化された青大豆種子の溶媒抽出物を再度液体状態にする場合には、再溶解等に使用する溶媒の容量を抽出工程後の抽出液の容量よりも少なくすれば、溶媒抽出物中の光活性化処理物質の前駆体量を濃縮することができるので便利である。

光活性化処理に使用する光源は、200〜800nm、好ましくは280〜700nm、さらに好ましくは360〜650nmの波長の光線を発することのできるものであれば特に制限はしない。例えば、蛍光灯（ブラックライトを含む）、水銀灯（HIDランプを含む）、LED（発光ダイオード）、白熱球、及びこれらの組合わせが挙げられる。本発明によって得られる抗炎症作用の強さは、光活性化処理の照度及び照射時間によって変化するため、照射する光の照度、照射時間を調節するのが好ましい。調節手段としては、青大豆種子の溶媒抽出物に対する照度と照射時間を乗じた積が一定以上となるようにする方法が挙げられる。例えば、照度（klx）と照射時間（hr）の積が40klx・hr以上、好ましくは80klx・hr以上、さらに好ましくは150klx・hr以上となるように調節することである。

３−２．効果
本発明の抗炎症剤の製造方法によれば、青大豆種子から、簡便に、かつ比較的安価で抗炎症効果の高い抗炎症剤を製造することができる。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、以下の実施例は単なる例示に過ぎず本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例１：各種大豆種子における溶媒抽出物の調製と本発明の抗炎症剤の製造＞
（１）各種大豆種子のエタノール抽出物に由来する抗炎症剤の製造
まず、表１に示す各種大豆種子の粉砕物1.4gに脱脂処理を行い、続いて、脱脂後の粉砕物に大豆種子の溶媒抽出物を調製するため5倍量のエタノールを加え、2時間室温で振とう抽出した後、濾過して不溶物を除きエタノール抽出液を回収した。エタノールを留去し、それぞれの大豆種子から約20〜40mgの溶媒抽出物を得た。次いで、この溶媒抽出物にDMSOを加えて総量を200μLとし、蛍光灯下、冷蔵にて2ヶ月間光活性化処理を行った。光活性化の処理量は、3.7klxで2ヶ月、すなわち、5328klx・hrであった。得られた光活性化処理物質を含む大豆種子溶媒抽出物のうち、青大豆種子由来のものを抗炎症剤の試験サンプル1として、他の大豆（黒大豆、黄大豆、その他の色大豆）種子由来のものを比較サンプル1として、下記実施例２に用いた。

（２）青大豆種子のエタノール抽出物に由来する抗炎症剤の製造
青大豆（エチゴミドリ）種子の破砕物50gに脱脂処理を行い、続いて、脱脂後の粉砕物に大豆種子の溶媒抽出物を調製するため5倍量のエタノールを加え、2時間室温で振とう抽出した後、濾過して不溶物を除き、エタノール抽出液を回収した。エタノールを留去し、粉末状の溶媒抽出物1.2gを得た。次いでこの粉末1.2gにDMSOを添加、溶解して7mLの試料溶液とした。24ウェル培養プレート（BD Falcon製）の各ウェルに100μLずつ試料溶液を分注した。得られたサンプルを試験サンプル2として、下記実施例３で詳述する条件にしたがって光活性化処理を行った。

（３）青大豆種子の水抽出物に由来する抗炎症剤の製造
青大豆（エチゴミドリ）種子の破砕物350gに水1750mLを加え、97℃で60分間加熱して抽出を行った。遠心分離して得られた水抽出液を凍結乾燥して粉末83.9gを得た。次いで、この粉末を蛍光灯の30cm下、72時間光活性化処理を行った。光活性化の処理量は、3.7klxで72時間、すなわち、266.4klx・hrであった。

（４）青大豆種子の含水エタノール抽出物に由来する抗炎症剤の製造
青大豆（エチゴミドリ）種子の破砕物3kgに脱脂処理を行い、続いて、脱脂後の粉砕物に大豆種子の溶媒抽出物を調製するため5倍量のエタノールを加え、室温、300rpmで2時間攪拌抽出した後、濾過して不溶物を除きエタノール抽出液を回収した。エタノールを留去し、粉末状の溶媒抽出物86.7gを得た。次いで、この粉末を蛍光灯の30cm下、72時間光活性化処理を行った。光活性化の処理量は、3.7klxで72時間、すなわち、266.4klx・hrであった。

＜実施例２：in vitroにおける本発明の抗炎症剤によるIL-2産生抑制作用の検証（１）＞
Jurkat細胞は、凍結保管してあるワーキングストックを用いた。このストック細胞は、継代回数は、10回を超えない範囲で使用した。培地は、RPMI1640を基礎培地とし、これに、56℃、30分加熱により非働化した牛胎児血清を10％添加した。培養は炭酸ガスインキュベータ内で100％湿潤下、5％炭酸ガス濃度、37℃で行った。試験にはセミコンフルエントとなる培養状態のものを使用した。細胞を2×10⁵/mLの濃度で25mL調製懸濁して、これに10μg/mLのPhorbol myristate acetage (PMA)を12.5μL及び500μg/mLのCa²⁺ イオノフォア A23187を7.5μL添加して再度懸濁した。この細胞懸濁液を24ウェル培養プレート（BD Falcon製）に1mL／ウェルで分注し、ここに実施例１の各試験サンプル1及び比較サンプル1を1ウェルあたり1μLずつ添加した。炭酸ガスインキュベータ内で約24時間培養した後、培養上清中に含まれるIL-2量をELISA法によって測定した。ELISAにはDuoSet ELISA Development System human IL-2 (R&D Systems )を用いた。なお、無刺激例としてPMA、A23187及び試験サンプルのいずれも無添加の例を、刺激例として試験サンプルのみ無添加の例を設定した。

結果を図１に示す。この図からも明らかなように、青大豆種子の溶媒抽出物に由来する抗炎症剤は、他の大豆種子の溶媒抽出物と比較して、Jurkat細胞に強いIL-2産生抑制作用を及ぼすことが明らかとなった。

＜実施例３：本発明の抗炎症剤によるIL-2産生抑制作用の検証（２）＞
照射時間とIL-2産生抑制作用の関係を明らかにするため、実施例１の（２）で調製した試験サンプル2に光照射条件をそれぞれ変えて光活性化処理を行った。24ウェル培養プレート（BD Falcon製）の各ウェルに100μLずつDMSO試料溶液を分注したものを5枚用意した。各プレートを蛍光灯スタンドから一定の距離（表２）に設置し、36時間静置して光を照射した。距離と照度の関係を表２に示す。照度は、プレート設置位置に照度計（照度データロガ：PHR-51、ティアンドティ社）を置き、測定した。光活性化処理中、3、6、12、24、36時間後に各プレートの一部のウェルからサンプルを取り出し、前記実施例２と同様の方法にてIL-2産生抑制作用を測定した。

結果を図２に示す。図縦軸は、光活性化未処理状態のサンプルにおけるIL-2産生率を100としたときの相対値（％）を示す。蛍光スタンドから2cmの距離のサンプルでは、24及び36時間後のIL-2産生抑制作用を、また57cmの距離のサンプルでは、3時間後のIL-2産生抑制作用をそれぞれ測定できていないが、いずれも蛍光灯からの距離が近いほど短い照射時間でIL-2産生抑制作用が向上することが明らかとなった。また、表２に示すように、照度と照射時間の積（klx・hr）が40以上のときは、未処理状態と比べて約20％以上のIL-2産生率低下作用があることが判明した。

＜実施例４：炎症モデル動物を用いた本発明の抗炎症剤の評価＞
アトピー性皮膚炎モデルであるNC／Ngaマウスに抗原を反復塗布する事によって発症する皮膚炎に対する本発明の抗炎症剤の効果を検討した。

マウス（NC／Nga、♂、６週齢；日本ＳＬＣ製）を馴化後に使用した。AIN-76精製飼料で飼育を行い、8匹ごと表３に示す3群（対照群、水抽出群及びエタノール抽出群）に群分けし、群分け後は同表に示す各試験飼料を給餌した。抗原溶液として、ビオスタAD（コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）由来成分のタンパク質を含有する；株式会社ビオスタ製）を用い、試験飼料の給餌開始日から抗原溶液の塗布を開始し、以後7日毎に塗布した。塗布は背部に行い、塗布前に、背部をバリカン及びシェーバーを用いて剃毛してサージカルテープを用いて毛を剥がし、4％SDS水溶液100μLを塗布した後、100mgのビオスタADを塗布した。本発明の抗炎症剤は混餌にて投与した。塗布開始から4、5、6週後（それぞれ5、6、7回塗布終了後）、各動物の皮膚炎症状を表４にしたがってスコアー化した。

スコアー結果を図３に、また本実施例に用いた対象群、（熱）水抽出群及びエタノール抽出群のマウスにおける塗布開始6週間後の背面図（剃毛済）を図４に示す。対照群は、背面部が広範囲で炎症を起こしているのがわかる（図中矢印）。一方、水抽出群とエタノール抽出群には、そのような炎症は見られない。この結果から、本発明の抗炎症剤を餌に混合した水抽出群とエタノール抽出群は、対照群と比較すると有意に皮膚炎症の発症を抑制できることが明らかとなった。

＜実施例５：錠剤の製造＞
前記実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤85g、結晶セルロース（旭化成）10g及びポリビニルピロリドン（BASF）4gを混合し、これにエタノール30mLを添加して、湿式法により常法に従って顆粒を製造した。この顆粒を乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム1.2gを加えて打錠用顆粒末とし、打錠機を用いて打錠し、1錠が1gの錠剤100個を製造した。

＜実施例６：顆粒剤の製造＞
前記実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤100g、乳糖（DMV）100g及び結晶セルロース（旭化成）40gを混合し、これにエタノール130mLを練合機に添加し、通常の方法により5分間練合した。練合終了後、10メッシュで篩過し、乾燥機中にて50℃で乾燥した。乾燥後、整粒し、顆粒剤240gを得た。

＜実施例７：シロップ剤の製造＞
精製水400gを煮沸し、これをかき混ぜながら、白糖750g及び前記実施例１（４）と同様にして得られた処理物質100gを加えて溶解し、熱時に布ごしし、これに精製水を加えて全量を1000mLとしてシロップ剤を製造した。

＜実施例８：流動食の製造＞
約65℃の純水700gにカゼインナトリウム（DMV）40g、マルトデキストリン（三和デンプン）160g及び前記実施例１（４）と同様にして得られた抗炎症剤50gを添加して溶解させ、ついでビタミンミックス及び微量ミネラルの各成分混合液を添加した。得られた混合液をホモミキサーに投入し、約8,000rpmにて15分間粗乳化した。得られた乳化液を約20℃に冷却し、香料を添加後、最終メスアップを行い、この液をパウチへ本液230g充填後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、121℃で15分間殺菌を行って流動食を得た。

＜実施例９：パンの製造＞
小麦粉（強力粉）160gとドライイースト2gを混合した。これとは別に、実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤5g、砂糖25g、食塩3g、脱脂粉乳6gを温湯70gに溶かし、鶏卵1個を添加してよく混合した。これを上記の小麦粉とドライイーストの混合物に加え、よく手でこねた後、バター約40gを加えてさらによくこね、20個のロールパン生地を作り、次いで、これらのパン生地を発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて180℃で約15分焼き、ロールパンを作成した。

＜実施例１０：菓子の製造＞
マーガリンと砂糖を混合してミキサーを用いてよく攪拌し、ホイップを調製した。これに半量の全卵を添加してクリーム状とした。これに実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤を加え、軽い混合をして生地を作製した。生地を成形し、オーブンで150℃にて25分間焼成し、菓子を作成した。

＜実施例１１：菓子の製造＞
全卵を泡立て器でほぐし、砂糖90g分の甘味料を入れてよく混合した。これに実施例１（４）と同様にして得られた抗炎症剤10g、小麦粉40gとベーキングパウダーを加え、攪拌混合し、さらにバター及びラム酒を加えてよく混合し、生地を作成した。生地を型に入れ、オーブンで170℃にて15分間焼成し、菓子を作成した。

＜実施例１２：レトルトご飯の製造＞
お米2合を用いて一般的な水量に対し、実施例１（４）と同様にして得られた抗炎症剤2.5gを加えて炊飯し、これを慣用の方法に従ってレトルト用パックに充填した後、窒素置換を行いながら密封し、121℃で15分間殺菌を行ってレトルトご飯を得た。

＜実施例１３：パスタ用ソースの製造＞
パスタ用のミートソース一人前（150g）を鍋に入れ、これに実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤1gを加えて加温混合した。このソースをパウチへ充填した後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、121℃で15分間殺菌を行って、パスタ用ミートソースを得た。

＜実施例１４：野菜ジュースの製造＞
市販の野菜ジュースに実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤を5質量％になるよう添加・混合し、野菜ジュースを調製した。

＜実施例１５：コンソメスープの製造＞
タマネギ100g、ニンジン100g、長ネギ100g、セロリ50g、及びトマト100gの各スライスを鍋に入れ、ここに牛の挽き肉500g、卵の白味2個分、ビーフブイヨン1kgを加え、火にかけて沸騰したら火を弱め、表面浮いてきたアクや脂肪分を除去しながら弱火で1時間煮て、実施例１（３）と同様にして得られた抗炎症剤50gを加えてさらに30分間煮て、布でこし、コンソメスープを得た。

＜実施例１６：軟膏剤の製造＞
A液．
・実施例４と同様にして得られた処理物質： 1質量％
・プロピレングリコール： 5質量％
・パラオキシ安息香酸メチル： 0.2質量％
・カルボキシビニルポリマー： 0.5質量％
B液．
・アジピン酸ジイソプロピル： 10質量％
・セタノール： 2質量％
・ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60： 2質量％
・モノステアリン酸ポリエチレングリコール： 1質量％
・パラオキシ安息香酸ブチル： 0.1質量％
C液．
・精製水：100質量％まで適量
B液を70℃で加熱溶解しながら混合し油相とする。A液を70℃で加熱溶解しながら混合し、これにB液の油相を加えて混合乳化し、その後C液を加えながら冷却処理をしてよく混合し、軟膏を得た。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

青大豆種子の溶媒抽出物に含まれる光活性化処理物質前駆体に、光照射することによって得ることができる光活性化処理物質を含んでなる抗炎症剤。
光活性化処理物質は、前記溶媒抽出物に光照射処理をすることによって得ることのできる、請求項１に記載の抗炎症剤。
光照射処理は、照度（キロルクス：klx）及び照射時間（hr）の積が40klx・hr以上となるように光を照射する処理である、請求項２に記載の抗炎症剤。
光照射処理における光の波長が200nm〜800nmである、請求項２又は３に記載の抗炎症剤。
前記溶媒が極性溶媒である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
極性溶媒が水、低級アルコール、クロロホルム又はジメチルスルホキシドから選択される1種以上である、請求項５に記載の抗炎症剤。
IL-2産生を抑制する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
（１）青大豆種子から溶媒抽出物を抽出する工程、及び
（２）前記溶媒抽出物に光活性化処理をする工程
を含む、抗炎症剤の製造方法。
（２）において照度（キロルクス：klx）と照射時間（hr）の積が40klx・hr以上となるように光を照射する、請求項８に記載の製造方法。
（２）において光照射処理の光の波長が200nm〜800nmである、請求項８又は９に記載の製造方法。