JP5584082B2 - プロテアソーム活性化剤 - Google Patents
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しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
皮膚老化と関連する因子としてプロテアソーム活性の低下に伴う老化タンパクの蓄積を挙げることが出来る。皮膚由来線維芽細胞に紫外線A波を照射する事でプロテアソーム活性が低下する事、シリビンを紫外線A波照射前後に添加する事でプロテアソーム活性化(トリプシン様活性)が起こり、老化タンパクの指標である酸化カルボニルタンパクが低下した事が知られている(特許文献6:特許第3914244号公報 異常タンパク質除去用組成物)。
(1)シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
(2)シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線B波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
(3)シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線A波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
(4)シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線A波被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
(a)シリビンマルトシド
(b)シリマリンET/G(Indena S.P.A)
βマルトースもしくはβラクトースの配糖体化をHelferichの方法に従ってシリビン配糖体を合成した。
シリビン(3.0 g、 6.2 mol、東京化成工業社製)とオクタ-O-アセチル-D-マルトース(6.3 g、 9.2mol、和光純薬社製)とを180 mlのジクロロメタン−アセトニトリル(1:1、v/v、関東化学社製)の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体(1.14ml、 12.4 mmol、Merck Chemicals社製)を窒素存在下、室温で 19時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(関東化学社製)を加え、150mlジクロロメタン(関東化学社製)で2回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム(関東化学社製)処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水(1:8:1、関東化学社製)を35℃30時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンマルトシド(1.0 g, 収率20%)を得た。
(1)細胞培養および紫外線照射
新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞(NHFB、三光純薬)を5%FBS含有DMEM培地でPDL(集団倍加数)をチェックしながら継代培養した。下記に定めた線維芽細胞のPDL数に達したところでプロテアソーム活性の試験に供した。
(b)トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、200000cells/mlの細胞密度によるように調整した。
(c)6ウェル平板プレートに細胞を100000cells/wellの密度で播種し、5%FBS含有DMEMで24h培養した。
(d)紫外線照射前に、各サンプルを10μg/ml(5%FBS含有DMEM;DMSO1%含有)の濃度で添加し、24h培養した。2者併用群に関しては5μg/mlずつ添加した。
(e)培養液をHank’s(-)液に置換し、紫外線照射を行った。
(f)照射終了後、直ちにHank’s(-)液を紫外線照射前と同一濃度条件の評価検体含有5%FBS含有DMEM(DMSO1%含有)に置換し、24h培養した。
培養液を除去しPBS(−)で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン−EDTA(Sigma)を800μL添加し、37℃で5分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、10%FBS含有DMEM1.5mlでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を15ml容遠沈管に回収した。1,500rpm 5minの条件で遠沈して培養液を除去、PBS(−)で洗浄し再び1,500rpm 5minの条件で遠沈してDMEM中の色素(フェノールレッド)を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズBuffer(50mMトリス塩酸、1mM DTT、5mM MgCl2、5%(v/v)グリセリン、pH=7.5)300μLに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理(UD−201超音波破砕装置、TOMY製を使用、条件は「OUT PUT 1、DUTY40、15secを2set」)した。ホモジナイズ溶液を1.5ml容エッペンチューブに全量移し、15,000rpm 10min遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Bradford法に準拠してBSA(ウシ血清アルブミン SIGMA社製)換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はBio−Rad protein assay(脱イオン水で5倍希釈)を用いた。
平板96ウェルプレートに
プロテアソーム活性溶液/BSA 溶媒:ホモジナイズBuffer 10μl
Bio−Rad protein assay(脱イオン水で5倍希釈)200μl
を加えて10min室温にてプレートごと撹拌反応した。吸光度590nmをプレートリーダーで計測し、BSA溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Boc−Leu−Arg−Arg−MCA(ペプチド研究所)、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA(ペプチド研究所)、
をそれぞれ10mM(溶媒;DMSO)で調整し、30μLずつを分注して−20℃冷凍保存した。使用時に解凍し600μLの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
2.反応液(100mMトリス塩酸、1mM DTT、5mM MgCl2、pH= 8.0) 25μL
3.10mM ATP含有ホモジナイズBuffer 19.5μL(蛍光分析時 のATP濃度は0.975mM)
4.プロテアソーム活性サンプル(cell lysate) 20μL
上記溶液を37℃1h撹拌反応し、反応終了後に、
5.10%(w/v) SDS(反応停止液) 25μL
6.100mMトリス塩酸(pH=9.0) 100μL (全量200μL/ well)
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した7−アミノ−4−メチルクマリン(MCA)由来の蛍光強度(励起波長 Ex380nm、蛍光波長 Em440nm)を測定した。
(蛍光強度/タンパク濃度)で算出されるプロテアソーム活性について、UV(−)のコントロール群を基準(1.00)とし、平均値で他の各群と比較した。
有意差検定は紫外線照射のコントロール処理群に対する多重比較をDunett test(**:p<0.01, * p<0.05)で行った。
[実施例1]
PDL38の若い線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
(a)紫外線B波 非照射 コントロール
(b)紫外線B波 照射 コントロール
(c)紫外線B波 照射 シリマリンET/G(10μg/ml)
(d)紫外線B波 照射 シリビンマルトシド(10μg/ml)
(e)紫外線B波 照射 シリマリンET/G(5μg/ml)+シリビンマルト シド(5μg/ml)
実施例1と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いてキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価を行った。結果を図4に示す。紫外線B波非照射のコントロール(a)と比較して、紫外線B波照射によってキモトリプシン様プロテアソーム活性は37%に低下したのに対し、紫外線B波照射シリマリンET/G(10μg/ml)添加群(c)では109%、紫外線B波照射シリビンマルトシド(10μg/ml)添加群(d)では85%のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示し、それぞれ有意にプロテアソーム活性化した。一方、紫外線B波照射シリマリンET/G(5μg/ml)+シリビンマルトシド(5μg/ml)併用群(e)ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は91%を示し、紫外線B波照射コントロール群に対して有意にプロテアソーム活性化した。いずれの群においても有意なキモトリプシン様プロテアソーム活性を発揮したが、シリマリンET/Gとシリビンマルトシドとの併用効果を実証する事が出来なかった。
[実施例2]
PDL58の老化した線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
(a)紫外線B波 非照射 コントロール
(b)紫外線B波 照射 コントロール
(c)紫外線B波 照射 シリマリンET/G(10μg/ml)
(d)紫外線B波 照射 シリビンマルトシド(10μg/ml)
(e)紫外線B波 照射 シリマリンET/G(5μg/ml)+シリビンマルト シド(5μg/ml)
実施例2と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いたキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価の結果を図3に示す。キモトリプシン様プロテアソーム活性は紫外線A波照射によって50%に低下したのに対し、紫外線A波照射シリマリンET/G(10μg/ml)添加群(c)では128%、紫外線A波照射シリビンマルトシド(10μg/ml)添加群(d)では128%のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線A波照射シリマリンET/G(5μg/ml)+シリビンマルトシド(5μg/ml)併用群(e)ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は219%を示し、紫外線A波照射コントロール群(b)に対して有意にキモトリプシン様プロテアソームを活性化した。更に、併用群(e)のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンET/G、あるいはシリビンマルトシドを単独で添加した群(c)(d)と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
シリマリンET/G、シリビンマルトシド単独添加の同一濃度(10μg/ml)条件でのプロテアソームの活性化を試験条件[紫外線A波/B波×トリプシン様活性/キモトリプシン様活性]で総括すると、総じてシリマリンET/Gがシリビンマルトシドよりも優れたプロテアソーム活性を示した。これは、シリビンマルトシドが糖修飾されて分子量が大きく嵩高くなることで細胞膜に対する透過性がシリビンマルトシドでは低下した事に起因すると考えられる。
Claims (4)
- シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
- シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線B被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
- シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線A被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
- シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線A被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
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