KR101172529B1

KR101172529B1 - Ｐａｒ-2 저해활성을 갖는 신규의 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101172529B1
Application number: KR1020100037674A
Authority: KR
Inventors: 김보라; 김진은; 이수민; 김혁; 이주동; 정대현; 모상현; 이정훈; 김형식
Original assignee: 엔프라니 주식회사
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2012-08-10
Also published as: KR20110118210A

Abstract

본 발명은 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성을 갖는 신규의 펩타이드 화합물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드 화합물은 뛰어난 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성 및 티로신 저해 활성을 가져 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선 효과를 나타내므로, 이러한 질환 개선을 위한 화장료, 약학적 제제 및 건강기능식품 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＰＡＲ-2 저해활성을 갖는 신규의 펩타이드 및 그의 용도{Novel peptide with PAR-2 inhibitory activity and uses thereof}

본 발명은 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성을 갖는 신규의 펩타이드 및 이를 이용한 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선을 위한 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

여성들은 미의 기준으로 젊고 하얀 피부색을 갖고 싶어하는 욕구가 늘어나고 있다. 특히 아시아의 경우 일본 여성의 약 60 %, 중국 여성의 약 75 %가 정도가 하얀 피부를 원하며 이는 한국 여성도 비슷하다. 이러한 요구에 발맞추어 현재 화장품 산업에도 미백 기능성 화장품에 대한 관심이 높아지고 있으며 최근 멜라닌 색소 침착의 기전이 다수 밝혀짐에 따라 여러 가지 종류의 미백제가 개발되고 있다.

피부의 색은 멜라닌과 같은 피부 색소의 양과 분포에 따라 결정되며 멜라닌은 피부가 자외선에 노출되면 멜라노사이트(Melanocyte)의 멜라노좀(Melanosome)에서 티로신(Tyrosine)이 티로시나아제(Tyrosinase)라고 하는 효소에 의해 산화되어 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노사이트의 덴드라이트(Dendrite)를 통해 각질 형성 세포로 전달되게 된다. 멜라닌은 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는 중요한 역할을 하지만 특정 요인에 의해 생성량이 증가되면 이로 말미암아 생성된 다량의 멜라닌이 케라티노사이트로 전달됨으로써 피부 표피층에 멜라닌이 축적되어 기미, 주근깨 등의 색소 침착을 일으킨다.

색소침착을 저해하기 위해 티로시나아제의 활성을 억제시키거나 분해시키는 방법, 티로시나이제의 전사(Transcription)이나 당화(Glycosylation)을 억제시키는 방법, 멜라닌 색소자체를 환원시키거나 항산화 작용을 갖고 있는 물질을 적용시켜 산화형 멜라닌을 환원형으로 되돌려 산화를 방지함으로써 색소 자체의 색을 엷게 만드는 방법뿐만 아니라 멜라닌이 케라티노사이트로 전이를 억제하거나 표피의 턴오버를 빠르게 진행시키는 방법 등이 있다.

한편, 아토피 피부염은 심한 가려움증(소양감)을 수반하는 재발성의 만성 피부염으로 현재 전세계 인구의 10 ~ 20%가 아토피 피부염으로 고통 받는 것으로 추정되고 있다. 아토피 피부염의 원인은 현재까지 명확하게 밝혀져 있지 않지만 유전적인 소인, 면역계 이상 등 서로 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 추정되고 있다. 아토피 피부염은 특히 심한 가려움증이 특징적인데 자꾸 긁다 보면 상처가 나게 되고 이로 인해 세균감염 및 외부 알러젠에 의한 2차 감염이 발생하여 T-세포 및 대식세포와 같은 면역세포들이 활성화되어 TNF-α를 비롯한 여러 싸이토카인과 가려움증을 유발하는 히스타민, 뉴로펩타이드 등이 분비되어 염증 및 가려움증을 일으켜 다시 긁게 되어 아토피 피부염 증상이 증폭되는 현상이 반복되어 더욱 심각한 상태로 발전된다. 이에 인체에 부작용이 없으며 가려움증 완화 효과가 있는 원료 개발이 필요하다.

한편, PAR-2(Protease activated receptor-2)는 N-말단측의 특정 부위의 아미노산 배열이 세린 프로테아제(Serin protease)일종인 트립신(Trypsin)에 의해 절단되어지고, 이때 생긴 N-말단 부위 서열이 수용체 자체의 결합부위에 결합하여 활성화가 일어난다. 또한, N-말단에 해당하는 리간드 서열과 동일한 합성 펩타이드도 PAR-2를 비효소적으로 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 PAR-2는 멜라노사이트 내에서 생성된 멜라노좀을 케라티노사이트로 전달하는 기능을 한다는 보고도 있어(Pigment Cell Res. 2001, 14(4), 236~242), PAR-2 억제제는 멜라닌이 각질형성세포로의 이동을 막아 미백 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.

현재 상용되는 미백원료의 대부분이 티로시나아제의 활성을 직, 간접적으로 조절하여 멜라노사이트의 멜라닌 생합성을 억제시키는데, 이러한 기전들은 오직 멜라노사이트의 멜라닌 생성세포에만 초점을 맞춘 것이기 때문에 여러 세포들이 상호 작용을 하여 생체 반응을 일으키는 피부에서는 그 효과가 제한적일 수 있다. 이에 비해, PAR-2(Protease activated receptor-2) 활성을 억제하면 멜라노사이트와 케라티노사이트 상호 관련 기전인 멜라노좀 트랜스퍼를 억제할 수 있으므로, 이미 생성된 멜라닌의 세포 침착을 막을 수 있어 피부에 더욱 효과적일 수 있다.

또한, PAR-2는 케라티노사이트, 비만세포 및 신경세포 등에 존재하고, NO와 TNF-α의 분비를 유도하여 염증을 유발하며, 히스타민, 물질 P(Substance P)와 같은 염증유발 물질 분비를 촉진함으로써 가려움증을 일으킨다고 알려져 있다(J. Invest. Dermatol 2006(126) 746)). 이와 같이 PAR-2는 피부 미백뿐만 아니라 아토피 피부염의 가려움 및 접촉성 피부염에 의한 가려움증에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명자는 피부의 색소침착 과정 및 염증 형성 과정에서 중요한 역할을 하는 PAR-2의 작용에 초점을 맞추어 PAR-2 저해 활성을 갖는 길항제를 탐색하던 중, PAR-2 저해 활성이 뛰어난 신규의 펩타이드 화합물을 합성하고, 이들 펩타이드 화합물이 미백 작용 및 아토피 개선 등에 효과가 우수함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성 및 트립신 저해 활성을 갖는 신규의 펩타이드 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 개선, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 펩타이드 화합물에 관한 것이다.

[일반식 1]

AA1-AA2-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-z

여기서, AA1 및 AA2는 각각 Arg, Lys 또는 His이며,

z는 OH 또는 NH₂이다.

본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 상기 일반식 1에서 AA1 및 AA2가 각각 양전하를 띄는 아미노산인 Arg(아르기닌), Lys(라이신) 및 His(히스티딘)일 수 있으며, 바람직하게는 AA1 및 AA2가 모두 각각 Arg 이며, z는 NH₂이다. 즉, Arg-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-NH₂(아르기닐-아르기닐-페닐알라닐-세릴-루실-루실-아르기닐-티로실 아미드, 서열번호 1)구조를 갖는다. 본 발명에서 이용가능한 펩타이드 화합물의 아미노산 서열(상기 일반식 1에서 z를 제외한 아미노산 서열)을 서열번호1~9에 나타내었다.

서열번호 1 : Arg-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 2 : Arg-Lys-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 3 : Arg-His-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 4 : Lys-Lys-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 5 : Lys-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 6 : Lys-His-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 7 : His-His-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 8 : His-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

서열번호 9 : His-Lys-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-

본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 당업계에 공지된 펩타이드 합성법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 9-플루오로에닐메톡시카보닐(9-fluorenylmethoxy carbonyl, Fmoc)을 아미노산 보호기로 사용하는 고체상 펩타이드 합성법을 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 높은 PAR-2 저해 활성을 가짐을 특징으로 한다.

본 발명에서 "PAR-2"은 프로테아제 활성 수용체-2(Protease activated receptor-2)로서, 케라티노사이트(keratinocyte) 및 섬유아세포(fibroblast)를 포함하여 다수의 조직에서 발현되는 세린-프로테아제 활성 수용체를 의미한다. 상기 PAR-2는 세포 내에서 트립신과 같은 세린-프로테아제에 의해 활성화되고, NO와 TNF-α, 히스타민, Substance-P 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(Calcitonin Gene-Related Peptide; CGRP)의 분비를 유도하여 염증과 가려움증을 유발시키는 물질이며, 멜라노사이트(Melanocyte)에서 만들어진 멜라닌을 주위의 케라티노사이트(Keratinocyte)에 전달을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 "PAR-2 저해"란 PAR-2 단백질 활성을 억제하는 작용, 즉, 단백질의 합성을 저해하거나 단백질에 직접적으로 작용하여 단백질의 정상적인 기작을 방해함으로써 그 촉매반응이 저해되는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 PAR-2에 직,간접적으로 작용하여 PAR-2 활성을 저해할 수 있으며, 예를 들면, PAR-2 수용체에 대한 길항제 작용을 하여 PAR-2의 활성을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 PAR-2 저해 활성을 통해, 멜라닌의 케라티노사이트로의 전달을 막을 수 있어 피부 색소 침착을 방지할 수 있으며, PAR-2에 의해 유도되는 염증 형성 경로를 차단함으로써 PAR-2 매개성 염증 질환을 개선시킬 수 있게 된다.

또한, 본 발명의 펩타이드 화합물은 트립신 저해 활성을 갖는다. 트립신은 세린 프로테아제의 일종으로 PAR-2의 N-말단쪽 특정 부위를 절단시켜 PAR-2을 활성화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 화합물은 트립신 저해 활성을 통해 높은 효율로 PAR-2 활성화를 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 높은 PAR-2 저해 활성 및 트립신 저해 활성을 가지므로, PAR-2 억제제로 이용될 수 있으며, PAR-2 매개성 질환, 예를 들면, 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선을 위한 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강기능식품의 용도로 이용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 과색소침착 질환은 기미, 주근깨, 염증 후 색소침착 및 포이츠제거스증후군 등을 포함하며, 상기 염증성 피부질환은 건선, 습진, 여드름, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 가려움증, 만성단순태선 및 박탈 피부염 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 화장료 조성물에 포함되는 펩타이드 화합물의 함량은 세포독성을 나타내지 않으면서, 충분한 PAR-2 저해 활성을 나타낼 정도의 양이면, 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 20중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량%이다. 이때, 펩타이드 화합물의 총 함량이 0.00001% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 20% 이상일 때에는 피부에 자극을 유발하거나, 제형의 안정화에도 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기한 펩타이드 화합물 외에 피부에 자극을 주지 않으면서, 미백 및 항염작용을 갖는 공지의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기한 펩타이드 화합물 이외에 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제형화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 개선, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 약학적 조성물에 포함되는 펩타이드 화합물의 함량은 세포독성을 나타내지 않으면서, 충분한 PAR-2 저해 활성을 나타낼 정도의 양이면, 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대해 0.00001~10중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량%이다. 이때, 펩타이드 화합물의 총 함량이 0.00001% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 10% 이상일 때에는 피부 자극을 유발하거나, 제형의 안정화에도 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 펩타이드 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 피부외용제의 제형으로 제공될 수 있는데, 이러한 경우, 상기 조성물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 펩타이드 화합물의 양을 기준으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎎/㎏이며, 필요에 의해 1~5회에 나누어 투여할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다.

상기 펩타이드 화합물의 유효한 첨가량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 바람직하게는 총 원료에 대하여 10 중량% 이하, 바람직하게는 1 중량% 이하의 양으로 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다. 특히, 본 발명의 화합물은 식품학적으로 허용가능한 식품첨가제를 추가로 포함하여 제제화함으로써 제제 형태의 건강기능식품으로 제조할 수 있으며, 제제의 형태로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등이 가능하다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 다양한 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 데스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 펩타이드 화합물을 포함하는 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강기능식품은 공지의 트립신 저해활성을 갖는 펩타이드, 예를 들면, 하기 서열번호 10 내지 12로 표시되는 선형(linear)의 펩타이드를 추가로 포함하여 제공될 수 있다.

[서열번호 10] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Gln-Arg-Cys

[서열번호 11] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Cys

[서열번호 12] Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys

상기 서열번호 10 내지 12의 펩타이드는 세포내에서 트립신 저해 활성을 나타내, 본 발명의 펩타이드 화합물과 병용하는 경우, 증진된 트립신 저해 활성 및 PAR-2 저해 활성을 나타낼 수 있으며, 이를 통해, 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 염증성 피부질환 개선 정도를 향상시킬 수 있게 된다.

본 발명의 상기 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되는 상기 서열번호 10~12로 표시되는 펩타이드의 함량은 세포독성을 나타내지 않으면서, 본 발명 펩타이드의 PAR-2 저해 활성을 향상시킬 수 있을 정도의 양이면, 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대해 0.00001 내지 10중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량%이다.

본 발명에 따른 신규의 펩타이드 화합물은 향상된 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성 및 트립신 저해 활성을 가져 뛰어난 피부 미백, 과색소침착 질환 및 염증성 피부질환 개선 효능을 나타내며, 인체안정성이 높은 장점이 있다.

따라서, 본 발명의 상기 펩타이드 화합물은 PAR-2 매개성 질환으로 대표되는 피부 미백, 과색소침착 질환 및 염증성 피부질환 개선을 위한 화장료, 약학적 제제 및 건강기능식품 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1. 펩타이드 화합물 제조

9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl: Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였으며, N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole: HOBt)와 N,N‘-디시클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide: DCC)을 활성제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌: Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford)\].

하기 표 1 번호의 서열을 갖는 펩타이드를 상기 합성법으로 아미드 레진 상에서 제조하였다. Fmoc제거는 20% 피페리딘(piperidine)을 사용하여 20분, 15분 2회 처리하여 실시하였으며, 아미노산은 HOBt(N-Hydroxybenzotriazole)와 DIC(Diisopropyl carbodiimide)를 커플링 시약으로 2시간의 커플링 시간으로 하여 8개의 아미노산을 도입하였다. 그 다음 펩타이드가 결합된 아미드 레진을 TFA-Phenol-H2O-Thioanisole-Ethanedithiol의 혼합액으로 처리하여 떼어낸 다음 그 용액을 차가운 에테르(Ether)로 처리하여 흰색의 펩타이드 침전물을 얻었다. 이 펩타이드 침전물을 RP-HPLC를 이용하여 정제한 용액을 동결 건조하여 깨끗한 펩타이드를 얻었다.

실험예 1. PAR-2 저해 활성 및 트립신 저해 활성 측정

멜라노좀 전달 및 염증, 가려움을 유발하는 PAR-2의 안타고니스트(antagonist)를 스크리닝하기 위해, Calcium modulation assay를 수행하였다. PAR-2가 활성화 되면 세포내부의 칼슘 수준이 증가 한다. 칼슘 indicator인 Fluo-4를 이용하여 세포 내 칼슘 수준을 형광 검출함으로써 PAR-2 antagonist로의 작용여부를 확인할 수 있다.

실험 내 필요한 재료의 기능은 다음과 같다. HaCat cells(각질형성세포주)을 10% FBS와 1% 항생제를 포함한 RPMI-1640 배지, 5% CO₂ 배양기, 37 ℃에서 유지하였다. Fluo-4 working solution을 제조하였다. 2.5 mM probenecid 포함된 RPMI 배지 제조하였다. Black 96 well에 seeding (2.5 x 10⁴ cells/ well) confluent 할 때 실험 한다. 2.5 mM probenecid 가 포함된 RPMI 배지에 Fluo-4 working solution 20 ㎕를 잘 섞은 후 well 에 loading 하였다. 37 ℃ 15분 후 상온 30분 배양하였다. Serum free 배지로 2회 세포를 세척(cell washing)하였다. 2.5 mM probenecid가 포함된 RPMI 배지(대조군) 혹은 펩타이드 화합물(표 1, 번호1~14)이 섞인 2.5 mM probenecid가 포함된 RPMI 배지(실험군)를 각각 로딩한 후 30 분 동안 상온 배양하였다. PAR-2 activator(SLIGKV) 혹은 트립신을 넣어 바로 상온에서 검출하였다(Excitation: 494 nm. Emission: 516 nm).

PAR-2 저해력 비교를 위해, PAR-2 저해제로 알려진 합성물질 ENMD-1068을 처리하여 실험하였다.

번호	샘플명	PAR-2 저해력 IC₅₀ (mM)	트립신 저해력 IC₅₀ (mM)
1	ENMD-1068	3.845	3.038
2	FSLLRY	1.602	1.321
3	FSLLKY(acid form)	-	-
4	LSIGRL	8.953	6.493
5	FSLLKY	-	5mM 이상
6	FSLLRR	5mM 이상	3.907
7	FRLLRY	5mM 이상	3.448
8	FSLLRA	-	5mM 이상
9	FRLLRD	-	-
10	DSLLRY	-	5mM 이상
11	RSLLRY	-	2.076
12	KKFSLLRY(acid form)	-	-
13	KKFSLLRY	1.324	5mM 이상
14	RRFSLLRY	0.697	0.760
* 번호 2,4,5,6,7,8,9,10,11,13,14는 펩타이드 말단이 아미드(NH₂) 형태임

그 결과, ENMD-1068은 펩타이드 FSLLRY보다 효과가 우수하지는 않았다. FSLLRY 중간의 라이신을 제외한 아미노산 부분을 치환한 결과 더 우수한 효과를 나타내지 않아서 F, S, R, Y 모두 중요한 아미노산임을 밝혀졌고 앞부분에 polar basic 한 K나 R을 2개 붙이면 효능이 올라가며 특히, RRFSLLRY는 트립신 저해력이나 PAR-2 저해력을 모두 높은 것으로 나타나 FSLLRY보다 약 2배정도 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 2. 트립신 저해 활성 확인(공지의 펩타이드 )

공지된 식물 또는 동물 유래의 트립신 저해 활성을 갖는 펩타이드를 합성하여 트립신 저해 활성을 측정하였으며, PAR-2 저해 활성을 함께 측정하였다.

HaCat cells(각질형성세포주)을 10% FBS와 1% 항생제를 포함한 RPMI-1640 배지, 5% CO₂ 배양기, 37 ℃에서 유지하였다. Fluo-4 working solution 제조하였다. 2.5 mM probenecid 포함된 RPMI 배지를 제조하였다. Black 96 well에 seeding (2.5 x 10⁴ cells/ well) confluent 할 때 실험하였다. 2.5 mM probenecid 가 포함된 RPMI 배지에 Fluo-4 working solution 20 ㎕를 잘 섞은 후 well 에 loading 하였다. 37 ℃ 15분 후 상온 30분 배양하였다. Serum free 배지로 2회 cell washing 한다. 2.5 mM probenecid가 포함된 RPMI 배지(대조군) 혹은 펩타이드(표 2, 번호1~6)가 섞인 2.5 mM probenecid가 포함된 RPMI 배지(실험군)를 로딩한 후 30 분 동안 상온 배양하였다. 트립신을 넣어주자마자 상온에서 검출하였다.(Excitation: 494 nm. Emission: 516 nm)

번호	샘플명	PAR-2 저해력 IC₅₀ (mM)	트립신 저해력 IC₅₀ (mM)
1	CPKILQRC (S-S)	-	5mM 이상
2	CPKILQRC (linear)	-	1.300
3	CPKILKKC (S-S)	-	2.420
4	CPKILKKC (linear)	-	2.023
5	CWTKSIPPKPC (S-S)	-	0.437
6	CWTKSIPPKPC (linear)	-	0.481

공지된 트립신 저해제는 선형(linear) 형태로 합성한 경우, 트립신 저해력이 높아지는 경향을 나타냈으며, 상기 표 2의 번호 1~6의 펩타이드 모두 PAR-2 저해 활성은 거의 없는 것으로 나타났다.

실험예 3. 피부 안정성 테스트

몇 가지 펩타이드(하기 표 3, 번호1~6)의 고농도에 대한 피부자극성 평가는 피부 첩포시험(Closed Patch-test)을 통하여 실시하였으며, 그 대상은 20 ~ 40대의 건강한 성인 20명을 대상으로 하였으며 시험 방법은 다음과 같다. 각각의 시료를 25㎕씩 취하여 IQ 챔버에 담아 등에 부착시키고 24 시간 경과 후 제거한 다음, 30분 경과 후, 그리고 48시간 후에 피부의 부작용, 가려움과 홍반, 부종 등을 수치화하여 평균 자극성 판정 범위를 하기 수학식 3 에 의거 계산하였다. 판정자는 해당 실험 10년 이상인 전문 연구원이 실시하였다. 그 결과를 정리하여 표 3에 나타내었다.

No.		Results of evaluation					average skin	자극성
	SAMPLE	(No.of subjects)					irritation	판정	농도
		+++	++	+	+-	-	range(%)	등급
1	FSLLRY(분산)			3	4	13	12.5	2	1.0%/DW
2	RRFSLLRY			2	7	11	13.8	2	1.0%/DW
3	KKFSLLRY			2	5	13	11.3	2	1.0%/DW
4	CWTKSIPPKPC			5	5	10	18.8	2	1.0%/DW
5	CPKILQRC (linear)			3	4	13	12.5	2	1.0%/DW
6	식염수				6	14	7.5	1	0.9% NaCl

상기 표 3에서 보는 바와 같이 1% 농도에서 서로 비슷한 자극을 나타냈으며 식염수와 비교하여 유의성을 갖지 않을 정도의 피부 일차 자극 반응이 나타나 피부 외용제로서 안전한 물질임을 확인하였다.

제조예. 화장품 제조

하기 표 4의 조성으로 가용화제형의 화장품을 제조하였다. 구체적으로 표 4에 기재된 1 ~ 5항의 수상 파트와 6 ~ 10항의 알코올 파트를 각각 실온에서 충분히 아지믹서로 용해한 후 알코올 파트를 서서히 수상 파트에 투입하면서 가용화 시셨다. 그 후 중화제 11을 투입하여 겔을 만든 후 미용제 12, 13, 14, 15를 투입하여 10 ~ 20 분 정도 더 혼합하여 준 다음 화장품의 제조를 완성하였다.

구분	원료명	용도	제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5
수 상 파 트	1.정제수	용제	To100	To100	To100	To100	To100
	2.글리세린	보습제	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	3.부틸렌글리콜	보습제	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	4.카보머	점증제	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
	5.디소듐이디티에이	금속이온봉쇄제	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
알코올 파트	6.에탄올	용제	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
	7.하이드록시캐스터오일 POE(60)	가용화제	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
	8. 향	착향제	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
	9. 메칠파라벤	방부제	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
	10.디메친콘오일	유연제	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
중화	11.트리에탄올아민	중화제	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
미용제	12.제조예1 RRFSLLRY	미용제	0.05	-	-	-	-
	13.제조예2 KKFSLLRY	미용제	-	0.05	-	-	-
	14.제조예3 CPKILQRC(linear)	미용제	-	-	0.05	-	-
	15.제조예4 FSLLRY	미용제	-	-	-	0.05	-
	16.제조예5 대조군	-	-	-	-	-	-

실험예 4. 미백효과 시험

건강한 10명의 성인을 대상으로 미백 효과에 대한 인체시험을 시행하였다. 각 피험자에게 자외선 조사기로 0.7MED 광량으로 3회에 걸쳐 자외선을 조사하여 인위적으로 색소침착을 유발한 후 피험자에게 상기 제조예1 ~ 5의 조성으로 제조된 화장품을 매일 2회(아침,저녁) 지속적으로 도포하게 하고 8주 경과 후에 기기적 평가(Mexameter MX16)에 의한 Melanin index(MI)를 측정하였다.

결과는 ΔMI 값으로 나타내었는데 ΔMI는 UV에 의한 피부 흑화 유도 직후의 MI 값에서 샘플 도포 8주 후에 측정한 MI 값을 뺀 값이다. 즉 ΔMI 값이 클수록 미백효과가 크다는 것을 의미한다. 하기 표 5에 피험자들의 결과를 평균값을 나타내었다.

샘플	ΔMelanin Index
제조예1	15.4
제조예2	11.5
제조예3	14.2
제조예4	13.2
제조예5(대조군)	8.8

상기 표 5에서 보는 바와 같이 제조예5 보다 제조예1~4의 화장품을 도포한 경우의 ΔMI 값이 더 큰 것을 알 수 있다. 이는 펩타이드를 함유한 화장품이 미백효과가 더욱 뛰어나다는 것을 의미하는 결과이다.

실험예 5. 아토피 임상시험

아토피 피부염으로 진단된 환자 중 가려움을 호소하는 10명을 선정하여 제조예1의 조성으로 제조된 화장품을 양팔 환부에 4주 동안 1일 2회씩 사용하도록 하였다. 그리고 가려움증 정도와 아토피 피부염 정도를 문진 및 육안으로 판정하고 뚜렷한 효과, 효과 있음, 차이 없음의 3단계로 평가를 하기 표 6에 나타내었다.

실험물질	항목	뚜렷한 효과(명)	효과 있음(명)	차이 없음(명)
제조예1	가려움증 개선	5	3	2
제조예1	아토피피부염 개선	4	3	2

상기 표 6에서 보듯이 제조예1의 화장품을 도포한 경우 가려움증 및 아토피피부염에 효과가 있는 것으로 나타났다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 일반식 1로 표시되는 펩타이드 화합물:
[일반식 1]
AA1-AA2-Phe-Ser-Leu-Leu-Arg-Tyr-z
여기서, AA1 및 AA2는 각각 Arg이고,
z는 NH₂이다.
삭제
제1항에 있어서,
상기 펩타이드 화합물은 PAR-2(Protease activated receptor-2) 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드 화합물.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드 화합물은 트립신 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드 화합물.
제1항의 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 과색소침착 질환 또는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 과색소침착 질환은 기미, 주근깨, 염증 후 색소침착 및 포이츠제거스증후군으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 화장료 조성물.
삭제
제5항에 있어서,
상기 펩타이드 화합물은 조성물 총 중량에 대해 0.0001~20중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 하기 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 선형(linear)의 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물:
[서열번호 10] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Gln-Arg-Cys
[서열번호 11] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Cys
[서열번호 12] Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys.
제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항의 펩타이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
삭제
제11항에 있어서,
상기 조성물은 하기 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 선형(linear)의 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
[서열번호 10] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Gln-Arg-Cys
[서열번호 11] Cys-Pro-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Cys
[서열번호 12] Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys.
제11항에 있어서,
상기 펩타이드 화합물은 조성물 총 중량에 대해 0.00001~10중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 피부외용제 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
삭제
제1항의 펩타이드 화합물을 포함하는 PAR-2(Protease activated receptor-2) 억제제.