JP5554810B2 - 抗菌化合物および処方物 - Google Patents
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Description
理論に拘束されることは望まないが、「超嵩高で親油性の基」は、2個の通常の嵩高な親 油性基と同様の影響を分子に及ぼしていると思われる。「超嵩高で親油性の基」とは、それぞれ4個またはそれ以上の非水素原子を有する1個または複数の閉環系、好ましくは2個またはそれ以上の閉環系を含む少なくとも9個、典型的には少なくとも10個もしくは11個、好ましくは少なくとも12個もしくは13個、さらに好ましくは15個もしくは18個の非水素原子を有する基を意味する。例えばトリ−t−ブチルトリプトファン、ジ−t−ブチルトリプトファンまたはPMC(2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル)修飾されたトリプトファンまたはアダマンチルアラニンのR基である。超嵩高な基は好ましくは少なくとも、t−ブチル基に結合している1個の6員環、例えばt−ブチルフェニル基の同等基を含む。2個の縮合している、または特には非縮合の5または6員環、例えばナフチル、ジフェニルメチル、ビフェニルまたはより大きな基を含む基がさらに好ましい。
L−3−ベンゾチエニルアラニン、CAS=72120−71−9(Synthetech)、D−3−ベンゾチエニルアラニン、CAS=111139−55−0(Synthetech)、L−4,4'−ビフェニルアラニン(Synthetech)、D−4,4'−ビフェニルアラニン(Synthetech)、L−4−ブロモフェニルアラニン、CAS=24250−84−8(Synthetech)、D−4−ブロモフェニルアラニン、CAS=62561−74−4(Synthetech)、L−2−クロロフェニルアラニン、CAS=103616−89−3(Synthetech)、D−2−クロロフェニルアラニン、CAS=80126−50−7(Synthetech)、L−3−クロロフェニルアラニン、CAS=80126−51−8(Synthetech)、D−3−クロロフェニルアラニン、CAS=80126−52−9(Synthetech)、L−4−クロロフェニルアラニン、CAS=14173−39−8(Synthetech)、D−4−クロロフェニルアラニン、CAS=14091−08−8(Synthetech)、L−3−シアノフェニルアラニン、CAS=57213−48−6(Synthetech)、D−3−シアノフェニルアラニン(Synthetech)、L−4−シアノフェニルアラニン(Synthetech)、D−4−シアノフェニルアラニン(Synthetech)、L−3,4−ジクロロフェニルアラニン、CAS=52794−99−7(Synthetech)、D−3,4−ジクロロフェニルアラニン、CAS=52794−98−6(Synthetech)、L−3,3−ジフェニルアラニン(Synthetech)、D−3,3−ジフェニルアラニン(Synthetech)、L−ホモフェニルアラニン、CAS=943−73−7(Synthetech)、D−ホモフェニルアラニン、CAS=82795−51−5(Synthetech)、L−2−インダニルグリシン(Synthetech)、D−2−インダニルグリシン(Synthetech)、L−4−ヨードフェニルアラニン、CAS=24250−85−9(Synthetech)、D−4−ヨードフェニルアラニン、CAS=62561−75−5(Synthetech)、L−1−ナフチルアラニン、CAS=55516−54−6(Synthetech)、D−1−ナフチルアラニン、CAS=78306−92−0(Synthetech)、L−2−ナフチルアラニン、CAS=58438−03−2(Synthetech)、D−2−ナフチルアラニン、CAS=76985−09−6(Synthetech)、L−3−トリフルオロメチルフェニルアラニン、CAS=14464−68−7(Synthetech)、D−3−トリフルオロメチルフェニルアラニン(Synthetech)、L−4−トリフルオロメチルフェニルアラニン、CAS=114926−38−4(Synthetech)、D−4−トリフルオロメチルフェニルアラニン、CAS=114872−99−0(Synthetech)、Boc−D−ホモフェニルアラニン(Neosystem Laboratoire)、Boc−L−ホモフェニルアラニン(Neosystem Laboratoire)、Fmoc−4−メチル−D−フェニルアラニン(Neosystem Laboratoire)、Fmoc−4−メチル−L−フェニルアラニン(Neosystem Laboratoire)、2,6−ジクロロベンジルチロシン、CAS=40298−71−3(Senn Chemicals)、ベンジルチロシンFmoc(Senn Chemicals)、シクロヘキシルチロシンFmoc(Senn Chemicals)、L−3,5−ジヨードチロシン、CAS=300−39−0(Senn Chemicals)、D−3,5−ジヨードチロシン(Senn Chemicals)、L−3,5−ジブロモチロシン(Senn Chemicals)、D−3,5−ジブロモチロシン(Senn Chemicals)、L−t−ブチルチロシン(Senn Chemicals)、L−t−ブチルチロシン(Senn Chemicals)、N−アセチルホモトリプトファン(Toronto Research)、7−ベンジルオキシトリプトファン(Toronto Research)、ホモトリプトファン(Toronto Research)、3−(−アントラセニル)−L−アラニンBoc(またはFmoc)(Peninsula Laboratories)、3−(3,5−ジブロモ−4−クロロフェニル)−L−アラニン(Peninsula Laboratories)、3−(3,5−ジブロモ−4−クロロフェニル)−D−アラニン(Peninsula Laboratories)、3−(2−キノイル)−L−アラニンBoc(またはFmoc)(Peninsula Laboratories)、3−(2−キノイル)−D−アラニンBoc(またはFmoc)(Peninsula Laboratories)、2−インダニル−L−グリシンBoc(Peninsula Laboratories)、2−インダニル−D−グリシンBoc(Peninsula Laboratories)、L−p−t−ブトキシフェニルグリシンFmoc(RSP)、L−2−t−ブトキシフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−3−t−ブトキシフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−ホモチロシン、O−t−ブチルエーテルFmoc(RSP)、L−p−t−ブトキシメチルフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−メチルフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−エチルフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−イソ−プロピルフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−メトキシフェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p(tBu−チオ)フェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−(Trt−チオメチル)フェニルアラニンFmoc(RSP)、L−p−ヒドロキシメチル−フェニルアラニン、O−t−ブチル(RSP)、L−p−ベンゾイルフェニルアラニン(Advanced ChemTech)、D−p−ベンゾイルフェニルアラニン(Advanced ChemTech)、O−ベンジル−L−ホモセリンBoc(Advanced ChemTech)、O−ベンジル−D−ホモセリンBoc(Advanced ChemTech)、L−β−1−ナフチル−アラニン(Advanced ChemTech)、D−β−1−ナフチル−アラニン(Advanced ChemTech)、L−ペンタ−フルオロフェニルアラニンBoc(Advanced ChemTech)、D−ペンタ−フルオロフェニルアラニンBoc(Advanced ChemTech)、D−ペンタ−フルオロフェニルアラニンFmoc(Advanced ChemTech)、3,5−ジヨード−L−チロシンFmoc(Boc)(Advanced ChemTech)、L−チロキシンNa、CAS=6106−07−6(Novabiochem)、3,3',5−トリヨード−L−チロシンNa、CAS=55−06−1(Novabiochem)。
シス−ビシクロ[3.3.0]オクタン−2−カルボン酸、[18209−43−3](Aldrich);アビエチン酸[514−10−3](Aldrich);ウルソール酸、[77−52−1](Aldrich);(1,2−メタノフラーレンC60)−61−カルボン酸[155116−19−1](Fluka);キュバン−1,4−ジカルボン酸ジメチル、[29412−62−2](Fluka);2−ノルボルナン酢酸、[1007−01−8](Aldrich);4−ペンチルビシクロ[2.2.2]オクタン−1−カルボン酸、[73152−70−2](Aldrich);アダマンチル酢酸;3−ノルアダマンタンカルボン酸[16200−53−6](Aldrich);9−フルオレン酢酸、[6284−80−6](Aldrich);シス−デカヒドロ−1−ナフトール、[36159−47−4](Aldrich);9−エチル−ビシクロ[3.3.1]ノナン−9−オール、[21915−33−3](Aldrich);3−キヌクリジノール、[1619−34−7](Aldrich);[[(1S)−エンド]−(−)−ボルネオール、[464−45−9](Aldrich);(1R,2R,3R,5S)−(−)−イソピノカンフェオール、[25465−65−0](Aldrich);デヒドロアビエチルアミン[1446−61−3](Aldrich);(±)−3−アミノキヌクリジン[6530−09−2](Aldrich);(R)−(+)−ボルニルアミン、[32511−34−5](Aldrich);1,3,3−トリメチル−6−アザ−ビシクロ[3.2.1]オクタン[53460−46−1](Aldrich);1−アダマンチルアミン、[768−94−5](Aldrich);9−アミノフルオレン、[5978−75−6](Aldrich);(1R)−(−)−10−カンフルスルホン酸、[35963−20−3](Aldrich);5−イソキノリンスルホン酸、[27655−40−9](Aldrich);2−キノリンチオール、[2637−37−8](Aldrich);8−メルカプトメントン、[38462−22−5](Aldrich)が含まれる。
MIC(最小発育阻止濃度)試験
使用された細菌株は:Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, MRSA ATCC 33591およびMRSE ATCC 27626であった。すべての株は、−70℃で貯蔵された。細菌は、2%バクト ペプトン水(Difco1807−17−4)中で成長させた。すべてのテストは、対数成長期中期にある細菌を用いて行った。細菌株に対するペプチドの最小発育阻止濃度(MIC)の決定は、1%バクト ペプトン水中で行われた。2×106CFU/mlの接種を用いる標準微量希釈技術を使用した。すべてのアッセイは、二連で行った。ペプチドはプラスに帯電しており、このためプラスチック製ウェルに付着できるため、我々はHPLCによって溶液中のペプチドの実際の濃度を制御した。プラスチックウェルに該溶液を添加する前後で、ペプチド濃度に差は何らなかった。MBCテストは、同様の方法で行った。
溶血性アッセイ
ペプチドの溶血性の活性は、新鮮なヒトの赤血球を用いて決定した。8mlの血液を健康なヒトから採取した。4mlの血液は、ヘパリンを最終濃度が10U/mlになるように含むポリカーボネート管に移され、残り4mlの血液は、最終濃度が15%EDTAとなるようにEDTAを含むガラス管に移された。赤血球は、1500rpmで10分間の遠心分離によって、ヘパリン処理された血液から分離され、血漿およびバッフィコートを除去するためリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。細胞ペレットを、PBSに再懸濁し、4mlの最終容量とした。ペプチドは、2mg/mlおよび0.1mg/mlの濃度に希釈された。ペプチドは、さらに、表15に記載されている濃度に希釈した。おのおの試験管に、PBSが最初に添加され、ついでRBCおよびペプチド溶液が添加された。EDTAで処理された血液におけるヘマトクリットは、30分後にSysmex K−1000で決定され、また再懸濁されたRBCは10%ヘマトクリットに希釈された。PBS中のRBC(1%)は、ペプチドと一緒におよびペプチドなしで(表15)、37°で1時間、振盪機でインキュベートし、次いで、4000rpmで5分間、遠心分離した。上清は慎重に新たなポリカーボネート管に移し、上清の吸光度を540nmで測定した。ベースラインの溶血は、PBSの存在のもとに放出されるヘモグロビンであり、100%溶血は、0.1% Triton X−100の存在下に放出されるヘモグロビンであった。
一連のペプチドは、Advance Chemtech社製の固相多重ペプチド合成装置MBS 396上で、カルボキシレートのマイナス電荷を避けるためのC末端アミド化を伴うArg−Trpのコンビネーションを用いて調製される。これらのペプチドの抗菌活性を以下の表1に示す。
ペプチドの2番目のシリーズは、C末端のエステル化および/またはN末端のアシル化を伴い、溶液においてArg/Trp(Tbt)またはTrp(Tbt)/Argモチーフを組み込む手動の合成により調製した。ペプチドの2番目のセットは、少数の構成ブロック(すなわち、Boc RW OBz, Boc WE OMeおよびBoc TbtR OMe)の調製ならびにこれらのブロックを、(N末端で)アミノ酸追加、N末端アシル化および/またはC末端の修飾(ジアミノエタン誘導体を作ることによるC末端におけるカチオン部位の調製)で修飾することに基づきデザインされた。
Bocで保護されたペプチドは、試薬Ki中に溶解され、かつ室温で60−90分間撹拌された。反応混合物に、最少量のジエチルエーテル1に溶解したp−トルエンスルホン酸(2.0−2.5当量)の溶液が添加され、乳白色混合物は、生成物を完全に析出させるため、冷蔵庫内で一晩冷却した。エーテル層を抜き去り、残留物をジエチルエーテル1で粉末まで粉砕し、次いで真空中で蒸発させた。粗生成物は、生物的試験に先立ちPR−HRLCで精製するか、あるいはさらに精製を行うことなく次段階で使用した。
Boc−D−Arg−OH 塩酸(855mg, 2.75mmol)、H−D−Trp−OBzl 塩酸 (832mg, 2.5mmol), HOBt(1378mg, 9mmol)およびDIPEA(2.05ml, 12mmol)のDMF(5ml)およびジクロロメタン(1ml)溶液に、氷上で冷却し攪拌しながらHBTU(1138mg,3mmol)が10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で1時間撹拌され、40mlジクロロメタンを添加し、次いで有機相を、3×40ml飽和NaHCO3、2×30ml 5%クエン酸、50ml水および2×30ml塩水で次々と洗浄した。蒸発させて白色固体を得た。
Boc−D−Arg−D−Trp−OBzl(1.29g, 2.2mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理した。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.85gの黄色みがかった固体を得た。
Boc−L−Arg−OH(792mg, 2.75mmol)、H−L−Trp−OBzl 塩酸 (832mg, 2.5mmol), HOBt(1378mg, 9mmol)およびDIPEA(2.05ml, 12mmol)のDMF(6ml)およびジクロロメタン(3ml)溶液に、HBTU(1138mg,3mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で45分間、さらに室温45分間撹拌された。KP−2−1に記載されたように、ワークアップ(workup)を実施した。蒸発して1.7gの黄色みがかった固体を得た。
Boc−L−Arg−L−Trp−OBzl(1.0g, 1.5mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発して1.07gのベージュ色固体を得た。
Boc−L−Trp−OH(761mg, 2.5mmol)、H−L−Arg−OMe 二塩酸 (718mg, 2.75mmol), HOBt(1378mg, 9mmol)およびDIPEA(2.05ml, 12mmol)のDMF(5ml)およびジクロロメタン(2ml)溶液に、HBTU(1138mg,3mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で1時間撹拌され、40mlの酢酸エチルが添加され、次いで有機相は、3×40ml飽和NaHCO3、2×30ml 5%クエン酸、50ml水および2×30ml塩水で次々と洗浄された。蒸発して白色固体、1.1gを得た。
Boc−L−Trp−L−Arg−OMe(1.1g, 2.15mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発して1.23gの黄色みがかった固体を得た。
Boc−L−Trp−OH(87mg, 0.29mmol)、H−L−Trp−L−Arg−OMe ジ−p−トルエンスルホン酸(226mg, 0.3mmol), HOBt(158mg, 1.03mmol)およびDIPEA(235μl, 1.37mmol)のDMF(2ml)溶液に、HBTU(130mg,0.34mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で80分間撹拌され、5mlのジクロロメタンが添加され、次いで有機相は、3×5ml飽和NaHCO3、2×5ml 5%クエン酸、5ml水および5ml塩水で次々と洗浄された。蒸発させて、0.05gの黄色油状物を得たが、このものは微量の生成物を含むことがTlcにより判定された。プールされた水相は3×15ml酢酸エチルで抽出し、MgSO4上で乾燥して、蒸発させ0.17gの黄色油状物を得た。この油状物はさらに精製することなく次の段階で使用された。
Boc−L−Trp−L−Trp−L−Arg−OMe(0.14g, 約0.2mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。生成物はp−トルエンスルホン酸を添加されることなくジエチルエーテルの添加により析出した。
Boc−L−Arg−OH(64mg, 0.22mmol)、H−L−Trp−L−Arg−OMe ジ−p−トルエンスルホン酸(175mg, 0.23mmol)、HOBt(128mg, 0.83mmol)およびDIPEA(181μl, 1.1mmol)のDMF(1ml)溶液に、HBTU(106mg, 0.28mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で2時間、室温で30分間撹拌され、10mlの酢酸エチルが添加され、次いで有機相はKP−3−2に記載されたように洗浄された。ワークアップ後、分析RP−HPLCによって判定したところ有機層には所望の生成物は全く含まれていなかった。プールされた水相は3×15mlの酢酸エチルで抽出され、蒸発させて0.1gの黄色油状物を得た。この油状物はさらに精製することなく次の段階で使用した。
Boc−L−Trp−L−Trp−L−Arg−OMe(0.14g, 約0.2mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。生成物はp−トルエンスルホン酸を添加されることなくジエチルエーテルの添加により析出した。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.1gの白色固体を得た。
Boc−L−Trp−OH(88mg, 0.29mmol)、H−L−Arg−L−Trp−OBzl ジ−p−トルエンスルホン酸(255mg, 0.3mmol)、HOBt(158mg, 1.03mmol)およびDIPEA(235μl, 1.37mmol)のDMF(2ml)溶液に、HBTU(130mg, 0.34mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で2時間、室温で30分間撹拌され、10mlの酢酸エチルが添加され、次いで有機相はKP−3−2に記載されたように洗浄した。蒸発して0.23gの黄色油状物を得た。
Boc−L−Trp−L−Arg−L−Trp−OBzl(0.23g, 約0.3mmol)は、KP−8−1に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.2gの白色固体を得た。
Boc−D−Trp−OH(90mg, 0.29mmol)、H−L−Arg−L−Trp−OBzl ジ−p−トルエンスルホン酸(251mg, 0.3mmol)、HOBt(158mg, 1.03mmol)およびDIPEA(235μl, 1.37mmol)のDMF(5ml)溶液に、HBTU(130mg, 0.34mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で40分間撹拌され、ワークアップがKP−2−1に記載されているように実施された。蒸発させて0.24gの黄色固体を得た。
Boc−Trp−Arg−Trp−OBzl(0.24g, 約0.3mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.17gのベージュ色固体を得た。
Boc−D−Trp−OH(162mg, 0.53mmol)、H−D−Arg−D−Trp−OBzl ジ−p−トルエンスルホン酸(464mg, 0.56mmol), HOBt(292mg, 1.9mmol)およびDIPEA(4.4ml, 25mmol)のDMF(5ml)およびジクロロメタン(1ml)溶液に、HBTU(241mg, 0.64mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で70分間撹拌され、10mlジクロロメタンが添加され、次いで有機相は、3×10ml飽和NaHCO3、4×10ml 5%クエン酸(過量のDIPEAが添加されているため酸性水相まで)、2×10ml水および2×10ml塩水で次々と洗浄した。蒸発させて0.42gの粗生成物を得た。
Boc−D−Trp−D−Arg−D−Trp−OBzl (0.38g, 約0.4mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.3gのベージュ色固体を得た。
Boc−L−Arg−L−Trp−OH(300mg, 0.5mmol)の5mlメタノール/水(19:1)溶液に、Pd−10%活性炭(53mg, 0.05mmol)が添加された。混合物は、水素雰囲気(1atm)で一晩撹拌され、セライト545の薄層を通して濾過され、そして蒸発させて赤い油状物を得た。油状物はとろ火で水に溶解し、凍結乾燥して383mgのピンク色粉末を得た。
Boc−L−Arg−L−Trp−OH 塩酸(100mg, 0.20mmol)、H−L−Arg−L−Trp−OBzlジ−p−トルエンスルホン酸(175mg, 0.21mmol)、HOBt(110mg, 0.72mmol)、およびDIPEA(164μl, 0.96mmol)のDMF(2ml)溶液に、HBTU(91mg, 0.24mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で3時間撹拌され、さらにKP−3−2に記載されたようなワークアップが実施された。
Boc−L−Arg−L−Trp−L−Arg−L−Trp−OBzl (約0.2mmol)は、KP−8−1に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層の完全な除去は、物質の損失なしに実施することが困難であり、このため、おそらくピンク色の粗生成物はかなりの量のTFAを含んでいた。
Boc−L−Arg−L−Trp−OH 塩酸(100mg, 0.20mmol)、H−D−Arg−D−Trp−OBzlジ−p−トルエンスルホン酸(175mg, 0.21mmol)、HOBt(110mg, 0.72mmol)およびDIPEA(164μl, 0.96mmol)のDMF(2ml)溶液に、HBTU(91mg, 0.24mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で3時間撹拌され、さらにKP−3−2に記載されたようなワークアップが実施された。ワークアップ後、分析RP−HPLCによって判定したところ有機層は所望の生成物を少量のみ含んでいた。プールされた水相は3×15ml酢酸エチルで抽出され、蒸発させて粗生成物を得た。
Boc−L−Arg−L−Trp−D−Arg−D−Trp−OBzl(約0.2mmol)は、KP−8−1に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層の完全な除去は、物質の損失なしに実施することが困難であり、このため、おそらく粗生成物はかなりの量のTFAを含んでいた。
Boc−L−Arg−L−Trp−OH 塩酸(100mg, 0.20mmol)、H−L−Trp−L−Arg−OMeジ−p−トルエンスルホン酸(171mg, 0.23mmol)、HOBt(110mg, 0.72mmol)およびDIPEA(164μl, 0.96mmol)のDMF(2ml)溶液に、HBTU(91mg, 0.24mmol)が氷上で冷却し攪拌しながら10分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で3時間撹拌され、さらにKP−3−2に記載されたようなワークアップが実施された。ワークアップ後、分析RP−HPLCによって判定したところ有機層は所望の生成物を少量しか含んでいなかった。プールされた水相は3×15ml酢酸エチルで抽出され、蒸発させて0.16gの黄色油状物を得た。
Boc−L−Arg−L−Trp−L−Trp−L−Arg−OMe(0.16g、約0.18mmol)は、KP−8−1に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.12gのピンク色固体を得た。
3−インドリル酢酸(0.289mmol)は、Boc−Trp−Arg−OMeについて記載されているように、H−Trp−Arg−OMe(1.06当量)、トリエチルアミン(2.01当量)およびHBTU(1.10当量)で処理された。メタノールを溶媒として使用した。反応は、9mlの飽和塩化ナトリウムを添加することにより失活された。水相は3×7ml酢酸エチルで抽出され、次いで有機相は4mlの2M塩酸、4mlの水および4mlの5%炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機相は、前記の洗浄工程を1回繰り返したのち、5mlの飽和塩化ナトリウムで乾燥して、次いで蒸発させて0.11gの白色固体を得た。粗生成物はRP−HPLCで精製された。
1H NMR(アセトニトリル−d3):δ=1.34(2H,m)、1.52(1H,m)、1.71(1H,m)、2.89(5H,m)、3.05(1H,m)、3.15(1H,m)、4.34(1H,m)、4.48(1H,m)、6.01(4H,bs)、6.42(1H,bs)、6.88−7.50(12H,ms)、9.10(1H,s)、9.22(1H,s)。
シクロヘキサンカルボン酸(0.297mmol)が、H−Trp−Arg−OMe(1.03当量)、トリエチルアミン(1.96当量)およびHBTU(1.05当量)で、Boc−Trp−Arg−OMeについて記載されているように処理された。メタノールを溶媒として使用した。失活およびワークアップは、Ind−Trp−Arg−OMeに記載されたように実施して、0.10gの白色固体を得た。粗生成物はRP−HPLCで精製された。
Boc−Tbt−OH(0.4735g, 1.0mmol)、H−Arg−OMe 二塩酸(0.2741g, 1.05mmol)、HOBt(0.4872g, 3.61mmol)およびDIPEA(0.820ml, 4.79mmol)のDMF/ジクロロメタン(14ml)の溶液が、攪拌しながら氷/水浴中で冷却される。HBTU(0.4560g, 1.2mmol)が少しずつ10分かけて添加される。混合物は30分間撹拌され、次いで冷却浴は除去される。反応混合物は、カルボン酸成分が少しも残らなくなるまで、室温で撹拌される(TlcシステムA)。混合物は油状になるまで蒸発させて、20mlジクロロメタンを添加し、次いで有機相は、3×20mlの飽和炭酸水素ナトリウム、2×15mlの5%クエン酸、25mlの水、2×15mlの飽和塩化ナトリウムで次々と洗浄され、蒸発させて0.80gの白色固体を得る。
Boc−Tbt−Arg−OMe(0.90mmol)は、基本手順に記載されたように試薬Kで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて0.24gの白色固体を得た。粗生成物は、RP−HPLCで精製した。
H−Tbt−Arg−OMe のジ−p−トルエンスルホン酸塩(0.24g, 0.270mmol)、Boc−Arg−OH(0.0933g, 0.335mmol)、HOBt(0.0442g, 0.327mmol)、トリエチルアミン(0.113ml,0.811mmol)およびHBTU(0.1231g, 0.325mmol)がアセトニトリル(2.2ml,HPLC等級)中に溶解され、室温で撹拌された。1時間後、出発物質は未だ残っていた(TlcシステムA)。3当量のトリエチルアミンが添加され、反応混合物は、もう1時間撹拌された。失活およびワークアップは、Boc−Trp−Arg−OMeに記載されたように実施された。粗油状物は、ジクロロメタンと共蒸発させて、0.23gの白色固体を得た。粗生成物は、さらに精製することなく使用された。
粗Boc−Arg−Tbt−Arg−OMeは試薬Kの4.05mlに溶解して、基本手順に記載されたように開裂を行った。粗生成物は生物学試験に先立ちRP−HRLCによって精製された。
Boc−Arg−OHとH−Trp−OBzlとを、Boc−Trp−Arg−OMeに記載されているように結合させた。N−メチルモルフォリンを塩基として使用した。粗生成物はRP−HPLCで精製した。
粗Boc−Arg−Trp−OBzl(1.23mmol)を試薬Kの18.3mlに溶解して、基本手順に記載されたように開裂を行った。粗生成物はさらに精製することなく使用された。
3−インドリル酢酸(0.0450g、0.257mmol)が、Boc−Trp−Arg−OMeに記載されているように、H−Arg−Trp−OBzlジ−p−トルエンスルホン酸塩、HBTUおよびトリエチルアミン(6当量)で処理された。アセトニトリルを溶媒として使用した。粗生成物は、0.19gの白色固体として分離された。
シクロヘキサンカルボン酸(0.0031ml, 0.266mmol)が、Boc−Trp−Arg−OMeに記載されているように、H−Arg−Trp−OBzl、ジ−p−トルエンスルホン酸塩、HBTUおよびトリエチルアミン(6当量)で処理された。アセトニトリルを溶媒として使用した。粗生成物は、0.17gの白色固体として分離された。
粗Ind−Arg−Trp−OBzlは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、黄色油状物が得られた。
粗Chx−Arg−Trp−OBzlは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、黄色油状物が得られた。
粗Boc−Arg−Trp−OBzlは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、0.72gの黄色油状物が得られた。
Boc−Arg−Trp−OH(1.265mmol)のDMF/ジクロロメタン(12ml、1:1)溶液に、攪拌しながらHOBt(0.6202g, 4.590mmol)、DIPEA(1.040ml, 6.075mmol)およびN−Z−ジアミノエタン塩酸(0.3088g、1.339mmol)が添加された。HBTU(0.5772g, 1.522mmol)が少しずつ5分かけて添加された。反応混合物は室温で3時間45分撹拌され、蒸発させて暗黄色油状物となった。油状物は20mlの酢酸エチルに溶解し、3mlの2M塩酸、5mlの水、5mlの5%炭酸水素ナトリウム、5mlの水で次々と洗浄された。得られた暗黄色溶液は、硫酸マグネシウム上で乾燥され、蒸発させると油状物になった。ヘプタン中では粉砕できず、油状物は蒸発させて0.86gの茶色がかった固体を得た。
Boc−Arg−Trp−Dae−Z(0.544mmol)は試薬K(6.8mlTFA)に溶解され、室温で1時間10分撹拌された。反応混合物は少容量まで蒸発させて、p−トルエンスルホン酸(0.32g)のジエチルエーテル(20ml)溶液が添加された。乳白色混合物は冷蔵庫内で一晩冷却され、生成物を完全に析出させた。エーテル層を抜き去り、残存物は、真空下で蒸発させて白色粉末を得た。粗生成物は、RP−HPLCで精製した。
3−インドリル酢酸(0.0265g、0.153mmol)が、Boc−Trp−Arg−OMeについて記載されているように、H−Arg−Trp−Dae−Zジ−p−トルエンスルホン酸塩、HBTU(1.2当量)およびトリエチルアミン(5当量)で処理された。アセトニトリル(1.4ml)およびDMF(0.6ml)は、アセトニトリル中でジペプチドアナログが溶解しにくいことから、溶媒として使用された。粗生成物は、0.12gの白色固体として分離された。
Arg アルギニン
Boc t−ブチロキシカルボニル
Chx シクロヘキサンカルボン酸
Dae ジアミノエタン
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N'−ジメチルホルムアミド
ESMS エレクトロスプレー(Electrospray)質量分析法
HBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)N,N,N',N'−テトラ
メチルウロニウムヘキサフルオロリン酸
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ind 3−インドリル酢酸
MBC 最小殺菌濃度
MIC 最小発育阻止濃度
RP−HPLC 逆相高性能液体クロマトグラフィー
Tbt 2,5,7−トリ−t−ブチルトリプトファン
TFA トリフルオロ酢酸
Trp トリプトファン
Z ベンジロキシカルボニル
文献
1) Guy, C. A..; Fields, G. B. Method in enzymology 1997, 289, 67−83
2) Lott, R. S.; Chauhan, V. S.; Stammer, C. H. Journal of the Chemical Society Chemical Communications 1979, 495−496
備考
i 試薬Kはフェノール(5%, w/v)、水(5% v/v)、チオアニソール(5% v/v)、エタンジチオール(2.% v/v)およびトリフルオロ酢酸(82.5% v/v)からなる。ペプチド 1 mmole当たり1.5mlの試薬が、Boc基の開裂に使用される。
ii ジエチルエーテルにあるp−トルエンスルホン酸の添加は、結果として、ペプチドのトルエンスルホン酸塩の形成をもたらす。1個の遊離アミノ官能基あるいはグアニジン官能基を含むペプチドは、モノp−トルエンスルホン酸塩などを形成すると信じられている。
ペプチドArg−(2−Nal)−Arg−Tyr−Arg−(2−Nal)NH2(ここで(2−Nal)は2−ナフチルアラニンである)が調製され、下記の表6に示されるように、ある範囲の臨床的に重要な病原体に対して試験された。
A)固体担体への1番目のアミノ酸の付着
固体担体PAC−PEG−PS(ペプチド酸−ポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂)(1当量)は、Fmoc−(2−Nal)−OPfp(5当量)およびDMAP(ジメチルアミノピリジン)(1当量)とともに、小容量のDMF(ジメチルホルムアミド)中で混合し、30分間膨潤させるために放置した。次いで、溶液をゆっくりと4時間半撹拌した。その後固体担体上に残存する水酸基すべてをアセチル化するために、Ac2O(無水酢酸)(2.5当量)およびDMAP(0.1当量)が溶液に添加された。該溶液は、次いでもう1時間撹拌された。C末端アミノ酸が付着する固体担体は、濾過によって分離され、さらにフィルター上でDMFで数回洗浄された。その後、該固体担体は、9050 Millipore Automatic Peptide Synthesizerを用いるターゲットペプチドの合成に使用された。
B)ニンヒドリンテスト/カイザー(Kaiser's)テスト
1mg未満のペプチド−樹脂複合体は、5%ニンヒドリンのエタノール溶液、エタノール(20ml)中のフェノール(80g)溶液、および乾燥、蒸留したピリジン溶液の同じ小容量で処理された。反応混合物を2分間、110℃で加熱し、顕微鏡で観察した。(このテストでは、黄色の反応混合物は、充分にアセチル化したことを示し、一方、青い溶液は未だ遊離アミノ基があることを示す。)
C)酸不安定性保護基の開裂
酸不安定な保護基の開裂および固体担体からのペプチドの切断は、2%アニソール、2%エタンジチオール(EDT)、2%水および2%フェノールのTFA混合物を用いて、僅か4時間の開裂時間で行なわれた。固体担体は、その後、濾過により除去され、ペプチドはジエチルエーテル中で析出した。TFAを含むエーテル溶液は、パスツールピペットを用いて除去され、ペプチドはジエチレンエーテルで数回洗浄され、高真空下で乾燥された。
D)精製
前記ペプチドは、C18逆層カラム(*)、および移動相として水およびアセトニトリル(ともに0.1%TFAが添加される)を使用するHPLCで精製された。ペプチドのフラクションの検出に選択された波長は254nmであった。
(*)PrePakR カートリッジ 25×100mm。DeltaPakTM C18 15μm 100Å(Waters Corporation)
E)分析
ペプチドは、分析用HPLC C−18逆層カラム上で移動相として水およびアセトニトリル(ともに0.1%TFA添加される)を使用して、不純物の分析をおこなった。ペプチドの分子量は、陽イオンエレクトロスプレー質量分析法(VG Quattro Quadrupole)で決定された。
下記から選択される、合成に使用されたアミノ酸誘導体
MRSE=メチシリン耐性表皮ブドウ球菌
さらなる一連のペプチドが、嵩高な親油性基の異なるサイズおよび分子におけるそれらの相対的な位置の影響を調べるために、設計されて作製された。
以下のほとんどのペプチドは、同じ出発原料、ROBzlから製造された。1つの方法が、次の2段階法によってBocRからROBzlを製造するために開発された。
これらのペプチドはいずれも赤血球に対して測定可能な毒性を有していなかった。
ヘキサペプチドおよびテトラペプチドのもう一つのグループが、前記実施例で記載されたように、固相多重ペプチド合成装置MBS 396で調製された。これらはE. coliおよびS. aureusに対してテストされ、これらの最小発育阻止濃度(MIC)を下記の表8に示す。最初のカラムはμg/mlでの数値であり、二番目のカラムはμM/mlである。アラニン残基が、「スペーサー」として含められ、活性に対する長さの影響を調べられた。
本明細書で記載されたペプチドを調製する際に使用される、あるいは使用に好適なペプチドカップリング、脱保護および精製のための基本手順が以下に記載される。
ペプチドカップリング 基本手順
合成
N−Boc保護アミノ酸誘導体(1.05当量)およびC末端保護(メチルエステル、ベンジルエステル、ビフェニルメチルエステルかまたはβ−ナフチルアミドとして、そのいずれかで)されたアミノ酸誘導体(1.00当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(1.2当量)が、反応容器に添加された。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(2.4当量)およびジメチルホルムアミド(DMF)(5ml/mmol N−Boc保護アミノ酸)を添加して、すべての成分が溶解するまで反応混合物を撹拌した。O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)(1.2当量)が少量ずつ添加され、反応混合物は1時間振盪された。
1mmolバッチからの反応混合物は酢酸エチル(16ml)で希釈し、12mlの5%クエン酸と5ml塩水との混合物で2回洗浄した。得られた有機相は6mlの飽和炭酸水素ナトリウムと2ml塩水との混合液で2回洗浄した。
好適な手順は、これらの先の実施例に記載されている。
ペプチドは、移動相として水およびアセトニトリルの混合液(0.1%TFAを含む)を使用し、RP−HPLC C18カラム(Delta−Pak C18, 100Å, 15μm, 25×100mm, Waters Corporation, Milford, MA, USA)で、254nmでのUV検出を行い、精製された。すべてのペプチドは、移動相として水およびアセトニトリルの混合物(0.1%TFAを含む)を使用して、分析用RP−HPLC C18カラム(Delta−Pak C18, 100Å, 5μm, 3.9×150mm, Waters Corporation)で、不純物について分析された。すべてのペプチドの純度は、96%より上であることがわかった。ペプチドの完全な状態は、VG Quattro 4重極質量スペクトロメーター(VG Instruments Ins., UK)を用いる陽イオンエレクトロスプレーイオン化質量分析法でチェックされた。
H−Arg−OBzlの調製(Bodanszky,MおよびBodanszky,A、「The practice of peptide synthesis」(1994) Springer Verlag, p. 30−31に倣った。)
Boc−Arg−OH(2.5mmol)のメタノール(20ml)溶液に、水(2ml)を添加した。該溶液はCs2CO3の20%水溶液で中和され、その後、乾燥するまで真空中で蒸発させた。残存する水は、トルエンの添加と蒸発を繰り返されることによって除去された。Boc−アルギニンのセシウム塩(固体)は、DMF(25ml)および臭化ベンジル(3mmol)で処理され、室温で6時間撹拌された。DMFは減圧下、除去され、生成物はアセトン中に溶解され、濾過された。濾液は真空中で蒸発させ、生成物は95%トリフルオロ酢酸(TFA)(4ml)で処理された。結果として得られる生成物、H−Arg−OBzlは、ジエチルエーテルを用いてピペット吸引して(by tituration)分離された。H−Arg−OBzlの塩は、パラ−トルエンスルホン酸(5mmol)のエーテル溶液で生成物を処理することにより分離された。
H−Arg−OBipの調製(Bodanszky,MおよびBodanszky,A「The practice of peptide synthesis」(1994) Springer Verlag, p. 30−31に倣った。)
Boc−Arg−OH(2.5mmol)のメタノール(20ml)溶液に水(2ml)を添加した。該溶液はCs2CO3の20%水溶液で中和され、その後、乾燥するまで真空中で蒸発させた。残存する水は、トルエンの添加と蒸発を繰り返されることによって除去された。Boc−アルギニンのセシウム塩(固体)は、DMF(25ml)、ビフェニルメチルクロリド(3mmol)およびヨウ化カリウム(1mmol)で処理され、そして室温で6時間撹拌された。DMFは真空中で除去され、生成物はアセトン中に溶解され、濾過された。濾液は真空中で蒸発され、生成物は95%トリフルオロ酢酸(TFA)(4ml)で処理された。結果として得られる生成物、H−Arg−OBipはジエチルエーテルを用いて、ピペット吸引して分離された。H−Arg−OBip塩は、パラ−トルエンスルホン酸(5mmol)のエーテル溶液で生成物を処理することにより分離された。
C末端が修飾された下記ジペプチドもまた作製し、評価した。便宜のため、これらの化学的構造を以下に示す。
KWOBzlに基づくペプチド様物質が製造され、望ましい構造モチーフが存在すればペプチド構造が活性には要求されないことを証明するため、試験された。
また、アルドリッチ(Aldrich)カタログから入手できる下記ジフェニルエチレンジアミンもテストされ、そしてすべてがS. aureusに対する250μg/mlのMICを有していた。
修飾された単一の超嵩高なアミノ酸からなる下記分子を作製し、これらの抗菌活性をテストした。
12mlのDMF/CH2Cl2(1:1)にあるBoc−Tbt−OH(0.7510g, 1.6mmol)、N−Z−1,4−ジアミノブタン一塩酸(0.4323g、1.7mmol)、HOBt(0.8715g, 5.7mmol)、DIPEA(1.63ml, 9.5mmol)の混合物は、氷/水浴中で撹拌され、HBTU(0.7220g, 1.9mmol)が少量ずつ10分かけて添加された。混合物は、さらに30分間撹拌され、次いで冷却浴が取り除かれ、撹拌を2時間半続けた。反応混合物は、真空中で蒸発された。得られる液状油状物は、ジクロロメタンに溶解され、続いて3×5ml飽和NaHCO3、2×5ml 10%クエン酸,10ml水および5ml飽和NaClで抽出され、次にMgSO4上で乾燥され、明るい黄色油状物に蒸発された。油状物は、水で粉砕され、真空下で乾燥された。フラッシュクロマトグラフィー(6% MeOH−CHCl3)による粗生成物の精製により、0.96g(89%)の表題化合物を生じた。
Tbt: β−(2,5,7−トリ−tert−ブチルインドール−3−イル)アラニン
Dae: 1,2−ジアミノエタン
Dab: 1,4−ジアミノブタン
Dah: 1,6−ジアミノヘキサン
嵩高な親油基と極性残基との組合せを具体化する、いくつかのオリジナル構造は、シクロペンタジエンといった安価な原料から、たやすく入手可能である。このような化合物の2つは、図Aに示され、すでに、シクロヘキサンベースを基礎とする土台の汎用性が証明されている。実際、嵩高なまたは極性基の添加順序の単純な変化が、2つの異なる生成物1および2を導く。
1,3−ジヒドロキシ−4−シクロペンテンの調製
ジブロモ−ジエステル調製
ジフタルイミド−ジエステルの調製
Claims (12)
- 2〜4個のアミノ酸からなるペプチドまたはペプチド様物質であって、
当該ペプチドまたはペプチド様物質が、5個またはそれ以上の非水素原子を包含する、少なくとも3個の親油性基を有し、
前記ペプチドまたはペプチド様物質の親油性基の1つが、6個またはそれ以上の非水素原子を包含し、
第2の親油性基が10個またはそれ以上の非水素原子を包含し、
少なくとも1個の親油性基が、少なくとも6個の非水素原子からなる閉環を包含し、
当該ペプチドまたはペプチド様物質が、アニオン基よりも少なくとも1個多いカチオン基を有し、
前記アミノ酸の少なくとも1つが、カチオン性の側鎖(R基)を有し、前記親油性基の1つがアミノ酸の側鎖(R基)であるものである、
ペプチドまたはペプチド様物質を含む、ヒトまたは動物体の微生物感染治療剤。 - 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、アニオン基よりも少なくとも2個多いカチオン基を有するものである、請求項1に記載の微生物感染治療剤。
- 前記少なくとも1個の親油性基が、遺伝的にコードされるアミノ酸20種のいずれかのアミノ酸の未修飾R基に由来しないものである、請求項1に記載の微生物感染治療剤。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、2個の親油性基を有し、そのそれぞれが、少なくとも6個の非水素原子からなる閉環を包含するものである、請求項1に記載の微生物感染治療剤。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、負の電荷を有しないように、C末端で修飾されたものである、請求項1〜4の何れか一項に記載の微生物感染治療剤。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、C末端で、アミド化またはエステル化されたものである、請求項5に記載の微生物感染治療剤。
- 2〜4個のアミノ酸からなるペプチドまたはペプチド様物質であって、
当該ペプチドまたはペプチド様物質が、5個またはそれ以上の非水素原子を包含する、少なくとも3個の親油性基を有し、
前記ペプチドまたはペプチド様物質の親油性基の1つが、6個またはそれ以上の非水素原子を包含し、
第2の親油性基が10個またはそれ以上の非水素原子を包含し、
少なくとも1個の親油性基が、少なくとも6個の非水素原子からなる閉環を包含し、
当該ペプチドまたはペプチド様物質が、アニオン基よりも少なくとも1個多いカチオン基を有し、
前記アミノ酸の少なくとも1つが、カチオン性の側鎖(R基)を有し、前記親油性基の1つがアミノ酸の側鎖(R基)であるものである、
ペプチドまたはペプチド様物質の、膜作用性抗菌剤としての、ex vivoでの非治療的使用。 - 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、アニオン基よりも少なくとも2個多いカチオン基を有するものである、請求項7に記載の使用。
- 前記少なくとも1個の親油性基が、遺伝的にコードされるアミノ酸20種のいずれかのアミノ酸の未修飾R基に由来しないものである、請求項7に記載の使用。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、2個の親油性基を有し、そのそれぞれが、少なくとも6個の非水素原子からなる閉環を包含するものである、請求項7に記載の使用。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、負の電荷を有しないように、C末端で修飾されたものである、請求項7〜10の何れか一項に記載の使用。
- 前記ペプチドまたはペプチド様物質が、C末端で、アミド化またはエステル化されたものである、請求項11に記載の使用。
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