NO334230B1 - Peptid eller peptidmimetukum og anvendelse derav - Google Patents

Peptid eller peptidmimetukum og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO334230B1
NO334230B1 NO20024218A NO20024218A NO334230B1 NO 334230 B1 NO334230 B1 NO 334230B1 NO 20024218 A NO20024218 A NO 20024218A NO 20024218 A NO20024218 A NO 20024218A NO 334230 B1 NO334230 B1 NO 334230B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
peptide
group
lipophilic
groups
hydrogen atoms
Prior art date
Application number
NO20024218A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20024218D0 (no
NO20024218L (no
Inventor
John Sigurd Svendsen
Bengt Erik Haug
Istvan Marko
Oeystein Rekdal
Merete Linchausen Skar
Wenche Stensen
Morten Boehmer Stroem
Original Assignee
Lytix Biopharma As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lytix Biopharma As filed Critical Lytix Biopharma As
Publication of NO20024218D0 publication Critical patent/NO20024218D0/no
Publication of NO20024218L publication Critical patent/NO20024218L/no
Publication of NO334230B1 publication Critical patent/NO334230B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår bioaktive molekyler, spesielt små molekyler som har antimikrobiell og antitumoral aktivitet.
Peptider og deres derivater har lenge vært ansett som terapeutisk interessante molekyler. Mange forskjellige organismer anvender peptider som en del av sin vertsforsvarsmekanisme. Antimikrobielle peptider er blitt isolert fra arter så forskjellige som bakterier og pattedyr [R.l. Lehrer, A.K. Lichtenstein og T. Ganz
(1993) Ann. Rev. Immunol. 11, 105-128]. Generelt har disse peptider en positiv nettoladning og en tendens til å danne amfifile a-heliks- eller fJ-plate-strukturer ved interaksjon med det ytre fosfolipid-dobbeltlag i bakteriecellemembraner [R. Besalle, A. Gorea, J. Shalit, J.W. Metger, C. Dass, D.M. Desiderio og M. Fridkin (1993) J. Med. Chem. 36 1203-1209]. I de fleste tilfeller er den detaljerte molekylmekanisme for den antibiotiske virkning ukjent, skjønt en del peptid-kategorier så som klasse L-(lytiske) peptider antas å interagere med bakterie-cellemembraner, sannsynligvis under dannelse av ionekanaler eller porer [S.J. Ludtke, K. He, W.T. Heller, T.A. Harroun, L. Yang og H.W. Huang (1996) Biochemistry 35 13723-13728], noe som fører til permeabilitetsforandringer og derav følgende cellelyse.
Magaininer er antibakterielle peptider fra huden hos frosken Xenopus laevis, og er klassifisert som klasse L-antibiotika på grunn av at de spesifikt lyserer bakterier; andre peptider så som mastroparaner, en bigift, mangler denne spesifisitet siden de lyserer eukaryote samt prokaryote celler og kalles klasse L-gifter [E.M. Tytler, G.M. Anantharamaiah, D.E. Walker, V.K. Mishra, M.N. Palgunachari og J.P. Segrest (1995) Biochemistry 34 4393-4401].
I likhet med magaininer og mastroparaner er vertsforsvarspeptider blitt isolert fra møll og fluer (cecropiner) og fra hesteskokrabbe. Den direkte virkning av disse vertsforsvarspeptider til frastøtning av rovdyr, f.eks. som gifter, er klar. Leting etter peptider som har antibiotikavirkninger, har ført til identifisering av andre proteiner/peptider som ikke ville være ventet å ha cytotoksiske egenskaper. Ett av disse er laktoferrin, en jerntransportør som også viser svak antibakteriell effekt.
Størstedelen av kjente antibakterielle peptider omfatter 10 eller flere, typisk 20 eller flere aminosyrer, og dette antall aminosyrer er nødvendig for tilveiebringelse av tilstrekkelig lengde for at peptidet, vanligvis i a-heliks-form, skal kunne spenne om bakteriecellemembranen og danne en pore. En slik mekanisme er den vanlig aksepterte måte på hvilken størstedelen av slike peptider utøver sin cytotoksiske aktivitet.
Syntetisering av de antibakterielle peptider ifølge teknikkens stand kan være vanskelig og fordrer typisk at peptidene syntetiseres av bakterier eller andre organismer som kan dyrkes og høstes under oppnåelse av det aktuelle peptid, og ytterligere bearbeidelsestrinn etter isolering av det direkte translasjonsprodukt er vanligvis nødvendig. Hvis det kunne identifiseres aktive peptider som var kortere, ville dette muliggjøre økonomisk svarende fremstilling ved syntetisering ut fra aminosyre-byggeklossene eller tilgjengelige di- eller tripeptider. Dessuten ville korte peptider gi fordeler med hensyn til bioavgivelse. Det er et voksende behov for antibiotika som kan administreres uten behov for injeksjon, så som ved inhalasjon eller absorpsjon gjennom blodkapillærene i nesegangene. Følgelig er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe bioaktive, spesielt antimikrobielle, f.eks. antibakterielle, molekyler som er små nok til å syntetiseres uten behov for å transfektere organismer med nukleinsyre som koder for det aktuelle peptid, og som gir mulighet for mange forskjellige administreringsmåter.
Leting etter nye antibiotika er blitt spesielt presserende på grunn av det økende antall bakteriestammer som viser resistens overfor kjente legemidler som anvendes i stor utstrekning. Personer som opererer innenfor feltene medisin og landbruk, miljøbeskyttelse og matvaresikkerhet, trenger stadig nye antibakterielle midler og vil kunne måtte behandle en gitt populasjon eller sted med flere forskjellige antibakterielle midler for effektiv bekjempelse av de uønskede bakterier.
Alle peptider, og dette gjelder desto mer korte peptider, er utsatt for enzymatisk nedbrytning i menneske- eller dyrekroppen. Derfor vil peptid-derivater eller peptidmimetika som bibeholder eller til og med forøker den biologiske aktivitet hos basispeptidet, men som har lengre sirkulasjons-halveringstid, være spesielt fordelaktige, og tilveiebringelse av slike forbindelser utgjør et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse. Peptidmimetika og andre organiske molekyler kan lett syntetiseres i store mengder ved hjelp av ikke-fermenteringsmetoder.
Kombinasjonsbiblioteker er blitt anvendt til identifisering av aktive peptider (S.E. Blondelle et al. [1994] American Society for Microbiology vol. 38 nr. 10, 2280-2286). Skjønt et stort antall peptider kan screenes på denne måte, er logikken bak aktiviteten av ett peptid sammenliknet med et annet kanskje ikke klar. Et anomalt resultat som tyder på aktivitet for en spesiell sekvens kan oppmuntre til forskning med hensyn til en klasse molekyler som, som helhet, ikke representerer de beste terapeutiske kandidater. Dessuten er det med kombinasjonskjemi ofte vanskelig å være sikker på omtrent nøyaktig hvilke forbindelser som faktisk er blitt laget, og arbeidskrevende testing og analysering er nødvendig for å bekrefte identiteten av fremstilte forbindelser. Hvis man vil prøve å identifisere et kjerneaktivt mønster som kanskje ikke er sekvens- eller størrelsesavhengig, er kombinasjonsteknikker uegnet. Dessuten må kjemien som anvendes til oppbygging av molekylet, typisk fra monomerer, være ganske enkel, noe som begrenser variasjonene i molekyler som kan lages.
I nærværende tilfelle har oppfinnerne forsøkt å undersøke hvilke strukturkomponenter som trenges for tilveiebringelse av den ønskede terapeutiske og generelle antimikrobielle aktivitet, mens toksisitet begrenses og det muliggjøres relativt enkel fremstilling og fleksibilitet med hensyn til administreringsmåtene for de aktive molekyler. De anvendte teknikker har, i stedet for en ikke-styrt fremstilling og analyse av tusenvis, og til og med millioner av molekyler, analogt med å se etter en nål i en høystakk, vært basert på rasjonell utførelse. Oppfinnerne har forsøkt å identifisere viktige mønstre og de komponenter som både er nødvendige og tilstrekkelige for tilveiebringelse av molekyler med de ønskelige karakteregenskaper omtalt ovenfor. En slik fremgangsmåte har vist seg effektiv og er spesielt verdifull når det gjelder å muliggjøre identifikasjon av de mulige minste, enkleste molekyler som kan syntetiseres og som fortrinnsvis er motstandsdyktige overfor enzymatisk nedbrytning, dvs. som ikke er ikke-derivatiserte peptider.
Det er, overraskende nok, funnet at små molekyler, ekvivalent til 4 aminosyrer eller mindre, viser god bioaktivitet under forutsetning av at de har tilstrekkelig voluminøse og lipofile og kationiske grupper. Tidligere antok man at bare større molekyler, typisk lengre peptider, kunne ha den ønskede terapeutiske virkning, som resultat av måten slike molekyler ble antatt å utøve sin virkning på cellemembraner på. Det er spesielt overraskende at disse små molekyler viser god selektivitet, dvs. at de er cytotoksiske overfor mikrober, men har meget liten, hvis noen, toksisk aktivitet overfor eukaryote vertsceller.
Følgelig er det i henhold til ett aspekt ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt et peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter minst tre lipofile grupper av minst 5 ikke-hydrogenatomer hvori én av peptidets eller peptidmimetikumets lipofile grupper innbefatter 6 eller flere ikke-hydrogenatomer og en andre lipofil gruppe innbefatter 10 eller flere ikke-hydrogenatomer og hvori minst én lipofil gruppe innbefatter en lukket ring av minst 6 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst én mer kationisk enn anionisk del, og hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe) og minst én av de lipofile gruppene er en aminosyresidekjede (R gruppe), for anvendelse i behandling av infeksjoner i mennesker eller dyr gjennom destabilisering av mikrobecellemembraner, eller for anvendelse som et anti-tumormiddel.
Denne definisjon kan omfatte korte umodifiserte peptider, men slike peptider som bare inneholder aminosyrer valgt blant de 20 genetisk kodede aminosyrer, og som heller ikke har noen voluminøse eller lipofile N- eller C-terminale modifikasjoner, er ikke medtatt innenfor rammen for dette aspekt ved foreliggende oppfinnelse. Formålet med foreliggende oppfinnelse er ikke å identifisere aktive peptidfragmenter perse, men å tilveiebringe stabile aktive molekyler som kan fremstilles ved kjemisk syntese.
Slike antimikrobielle molekyler har også ikke-terapeutiske anvendelser, for eksempel i landbruket eller i husholdnings- eller industri-situasjoner som steriliseringsmidler for materialer som er utsatt for mikrobiell forurensning. Følgelig tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse ved et ytterligere aspekt en ikke-terapeutisk ex vivo anvendelse som et membran-virkende antimikrobielt middel av et peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter minst tre lipofile grupper av minst 5 ikke-hydrogenatomer hvori én av peptidets eller peptidmimetikumets lipofile grupper innbefatter 6 eller flere ikke-hydrogenatomer og en andre lipofil gruppe innbefatter 10 eller flere ikke-hydrogenatomer, og hvori minst én lipofil gruppe innbefatter en lukket ring av minst 6 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst én mer kationisk enn anionisk del, og hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe) og minst en av de lipofile gruppene er en aminosyresidekjede (R gruppe).
Molekylene oppviser antimikrobiell aktivitet, og spesielt utøver de en cytotoksisk virkning via en direkte membranpåvirkende mekanisme, og kan betegnes membranvirkende antimikrobielle midler. Disse molekyler er lytiske, destabiliserende, eller de perforerer til og med cellemembranen. Dette giren tydelig terapeutisk fordel fremfor midler som virker på eller interagerer med protein holdige komponenter i målcellene, f.eks. celleoverflatereseptorer. Skjønt mutasjoner kan resultere i nye former for målproteinene som fører til antibiotikaresistens, er det mye mindre sannsynlig at radikale forandringer av lipidmembranene kan finne sted under forhindring av den cytotoksiske effekt. Den lytiske virkning gir meget hurtig celledød og har følgelig den fordel at den dreper bakterier før de har sjanse til å formeres. Dessuten kan molekylene ha andre nyttige egenskaper som dreper eller skader målmikrobene, f.eks. evne til å inhibere proteinsyntese, og følgelig kan de ha multimål-aktivitet.
En membran-virkningsmåte vil si at skjønt molekylene kan administreres sammen med andre aktive antimikrobielle midler som en del av en kombinert terapi, kan de også administreres alene, dvs. som det eneste antimikrobielle middel ved en terapeutisk kur. Dette kan for eksempel oppsettes som en motsetning til molekyler som virker som utstrømningspumpe-inhibitorer som ko-administreres med et primært antimikrobielt middel, idet de ofte ikke har noen egen antimikrobiell aktivitet.
Molekylene er tilveiebrakt for anvendelse ved destabilisering av mikrobecellemembraner. Med "destabilisering" menes en forstyrrelse av den normale tredimensjonale lipid-dobbeltlag-form innbefattende, men ikke begrenset til, membran-tynngjøring, øket membranpermeabilitet (typisk ikke innbefattende kanaler) av vann, ioner eller metabolitter osv. som også svekker bakterienes respirasjonssystemer. Mekanismene for bakterie-lyse forårsaket av antimikrobielle peptider er grundig beskrevet av Sitaram og Nagaraj (N. Sitaram og R. Nagaraj, Biochim. Biophys. Acta vol 1462 1999 s. 29-54) og Shai (Y. Shai, Biochim. Biophys. Acta vol. 1462 1999 s. 55-70). Destabilisering dreper eller svekker cellen, noe som gjør det mindre sannsynlig at den vokser eller reproduseres.
Som omtalt ovenfor, har oppfinnerne i dette tilfelle prøvd å identifisere de funksjonelle og strukturelle mønstre som tilsammen gir molekylene de ønskede egenskaper omfattende terapeutisk (antimikrobiell) aktivitet, men lav toksisitet. Ved en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en tredje type gruppe også funnet i molekylene, idet de første to er positivt ladede grupper og voluminøse og lipofile grupper. Denne tredje gruppe er en karbonylgruppe eller liknende polar gruppe så som en sulfon-, tiokarbonyl- eller imingruppe. En slik gruppe er en hydrogenbindings-akseptordel og kan passende finnes som en del av molekylets skjelett, for eksempel amidbindingene som finnes i peptid- eller andre skjeletter, andre skjeletter kan omfatte ester- eller tioesterbindinger som gir molekylet den ønskede polaritet.
Peptidene innlemmer minst tre lipofile grupper, også omtalt her som "voluminøse og lipofile" grupper. Disse er uladede grupper med minst 5, mer foretrukket minst 6 ikke-hydrogen-atomer, og innbefatter typisk minst ett lukket ringsystem. For lettvinthets skyld omtales slike grupper noen ganger i det foreliggende ganske enkelt som "voluminøse" grupper. Én eller flere av de voluminøse og lipofile grupper som finnes i molekylet, kan ha 2 eller flere lukkede ringer på 5 eller 6 atomer, og det er hensiktsmessig at 2 eller flere av disse ringer er kondenserte eller knyttet sammen ved hjelp av broforbindelser. Fortrinnsvis er minst én av de voluminøse og lipofile grupper ikke tilveiebrakt ved den umodifiserte R-gruppe i én av de 20 genetisk kodede aminosyrer. Aromatiske voluminøse og lipofile grupper er foretrukket, og likeså grupper som har tredimensjonal karakter. Hvis gruppen ikke inneholder én eller flere ringer, vil den fortrinnsvis være forgrenet.
Det viser seg at plasseringen av de funksjonelle grupper (f.eks. ladede eller voluminøse grupper) ikke er av stor betydning. De voluminøse og lipofile grupper har en kombinert påvirkning på aktiviteten av molekylet som helhet. Følgelig kan en forholdsvis liten gruppe sammen med en ganske stor gruppe gi en liknende aktivitet til 2 voluminøse grupper med moderat størrelse.
Et hierarki av voluminøse grupper kan eksemplifiseres ved følgende liste av aminosyrer, idet man starter med den minst voluminøse og aktive: fenylalanin, cykloheksylalanin, tryptofan, tert.-butylfenylalanin, bifenylalanin, og den mest voluminøse og aktive, tri-tert.-butyltryptofan. En faglært leser vil forstå at slike grupper er gitt som eksempler på forskjellige størrelser, og andre grupper med liknende volum kan anvendes som erstatning uten at det i noen betydelig grad påvirker molekylets aktivitet.
Det må erindres at det nødvendige antall og beskaffenheten av molekylets voluminøse grupper vil variere fra én mikroorganisme-type til en annen, idet et gitt molekyl generelt er mye mer aktivt overfor gram-positive enn gram-negative bakterier.
Med en "kationisk del" menes en del som har en positiv nettoladning ved pH 7,0, eller en forløper for en slik del som ved fysiologiske betingelser kan tilveiebringe en del som har en positiv nettoladning ved pH 7,0. Slike forløperdeler er kjent på området. Likeledes er en "anionisk del" en del som har en negativ nettoladning ved pH 7,0, eller en forløper til denne. Positive ladninger er viktige for tiltrekking til og interaksjon med de negativt ladede fosfolipider som utgjør cellemembraner. Egnede kjemiske grupper som tilveiebringer denne kationiske funksjonalitet, innbefatter slike som omfatter en ammonium-, guanidin-, imidazolium-, sulfonium- eller fosfoniumdel eller en tetrazol.
En kationisk del kan innlemmes som en del av en voluminøs og lipofil gruppe, f.eks. en modifisert tryptofanrest så som 5'-aminoetyltryptofan (tilgjengelig som sidekjede-Boc- og N-alfa-FMOC-derivat fra RSP Amino Acids Analogues Inc, Boston, MA, USA). Atomet som faktisk bærer den positive ladning når molekylet er ved pH 7,0, kan være anbrakt i en avstand fra skjelettet. Hvis man for eksempel ser på R-gruppen i arginin, anses hele R-gruppen her for å være den kationiske del, og atomene som knytter guanidingruppen til a-karbonatomet, anses følgelig for å være en del av den kationiske del og ikke en del av skjelettet.
Som eksempel har molekylet Arg-Trp OBz, et dipeptid hvis C-terminale ende er blitt modifisert ved dannelse av en benzoylester, én kationisk del som er tilført ved R-gruppen i arginin, og én i den frie N-terminale ende. Den anioniske C-terminale ende er blitt modifisert, og følgelig har molekylet to flere kationiske enn anioniske deler, dvs. 2 ytterligere kationiske deler. Hvis den N-terminale ende likeledes var blitt modifisert, for eksempel med en cykloheksylkarboksylatgruppe, ville en kationisk del ha blitt "tapt".
En gruppe som er ansvarlig for øking av molekylets kationisitet ved modifikasjon av den C-terminale ende, kan også tilveiebringe én av den voluminøse eller lipofile grupper, som i ovenstående eksempel.
Et nitrogenatom, for eksempel ett som utgjør en del av en kationisk ammoniumgruppe i den N-terminale ende av et peptid, kan være ett av skjelettatomene. Følgelig kan de kationiske deler utgjøre en del av skjelettet eller være knyttet til dette.
Molekylene for anvendelse ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis ha 2 eller flere, kationiske deler, men det er viktig å ta i betraktning antallet av både kationiske og anioniske deler som er til stede. For eksempel har tripeptidet Trp-Arg-Trp to kationiske deler, én tilført ved R-gruppen i arginin, og den N-terminale gruppe. Imidlertid er den anioniske C-terminale ende ikke modifisert, slik at molekylet som helhet bare har én mer kationisk enn anionisk del.
I hele teksten er de velkjente 3-bokstav- og 1 -bokstav-koder for de genetisk kodede aminosyrer brukt.
De bioaktive molekyler ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis omfatte to eller flere ytterligere kationiske deler ("ytterligere" anvendes for å angi antallet ekstra kationiske deler som er til stede i molekylet sammenliknet med anioniske deler).
Molekyler som innbefatter minst tre voluminøse og lipofile grupper og minst én ytterligere kationisk del, f.eks. tre voluminøse og lipofile grupper og én ytterligere kationisk del, er blitt vist å ha god aktivitet. Kationisitet eller volum alene gir ikke den ønskede aktivitet. Likeledes tilveiebringer tre ytterligere kationiske deler i et molekyl med bare én voluminøs og lipofil gruppe ikke det ønskede bioaktivitetsnivå, dersom ikke den voluminøse og lipofile rest er "super"-voluminøs og -lipofil.
Uten at man ønsker å være bundet av noen teori, ser det ut til at den "super-voluminøse og -lipofile gruppe" utøver den samme virkning på molekylet som to vanlige voluminøse og lipofile grupper. Med "super-voluminøs og -lipofil gruppe" menes en gruppe med minst 13, mer foretrukket minst 15 eller 18 ikke-hydrogen-atomer som omfatter 1 eller flere, fortrinnsvis 2 eller flere, lukkede ringsystemer med 4 eller flere ikke-hydrogenatomer i hvert, f.eks. R-gruppen i tri-tertbutyltryptofan, di-tertbutyltryptofan eller PMC (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl)-modifisert tryptofan eller adamantylalanin. Foretrukket er grupper omfattende to kondenserte eller mer spesielt ikke-kondenserte 5- eller 6-leddede ringer, f.eks. naftyl-, difenylmetyl-, bifenyl- eller større grupper.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse ved et ytterligere aspekt et peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter en lipofil gruppe som omfatter minst 13 ikke-hydrogenatomer og én eller flere lukkede ringer av 4 eller flere ikke-hydrogenatomer, hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe), og minst én av aminosyresidekjedene (R grupper) er en lipofil gruppe av minst 4 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst to flere kationiske enn anioniske deler, for anvendelse i behandling av mikrobielle infeksjoner i mennesker eller dyr gjennom destabilisering av mikrobecellemembraner, eller for anvendelse som et anti-tumormiddel.
Ytterligere aspekter ved oppfinnelsen innbefatter anvendelse av disse molekyler som ikke-terapeutiske midler; egnede ikke-terapeutiske anvendelser som anvender den generelle antimikrobielle aktivitet hos disse molekyler, er omtalt i det foreliggende.
Disse molekyler kan også omfatte én eller flere vanlige voluminøse og lipofile grupper som beskrevet ovenfor, kovalent knyttet til skjelettet.
Blant de bioaktive molekyler beskrevet ovenfor, er peptider som innbefatter 2-4 aminosyrer, fortrinnsvis 2 eller 3 aminosyrer, men også hensiktsmessig 4 aminosyrer, foretrukket. Aminosyrene kan være genetisk kodede aminosyrer, genetisk kodede aminosyrer som er blitt modifisert, eller modifiserte eller ikke-modifiserte ikke genetisk kodede aminosyrer som kan være naturlig forekommende eller ikke. (5- og y-aminosyrer samt oc-aminosyrer er innbefattet i betegnelsen "aminosyrer". Peptider kan være av cyklisk type. Betegnelsen "peptid" innbefatter depsi-peptider.
Disse peptid- eller peptid-avledede molekyler vil typisk innbefatte N- og/eller C-terminale modifiserende grupper. De voluminøse og lipofile grupper kan være tilveiebrakt av R-gruppene i aminosyrerestene og/eller være en del av den N- eller C-terminale modifiserende gruppe. De kationiske deler kan være frie N-terminale grupper, aminosyre-R-grupper eller en del av de N- eller C-terminale modifiserende grupper. Den C-terminale ende er fortrinnsvis modifisert, f.eks. amidert eller mer foretrukket forestret. Anvendelse av betegnelsen aminosyre-"R-gruppe" er godt kjent på området og anvendes konsekvent i hele teksten til å angi den variable gruppe knyttet til a-karbonatomet, f.eks. for alanin en metylgruppe.
Peptidiske skjeletter er
kjennetegnet ved
en peptid- eller amidbinding. Peptid-skjeletter
innbefatter minst én slik peptidbinding. Skjeletter som slutter i en peptidbinding, f.eks. en amidert karboksygruppe, anses ikke som peptidisk bare på basis av denne gruppe. For å bli klassifisert som peptidisk, må skjelettet følgelig ha én eller flere indre peptidbindinger.
Skjønt et peptidskjelett er kjennetegnet ved én eller flere indre peptidbindinger, vil et peptid ha peptidbindinger som binder hver aminosyrerest.
Følgelig vil en forbindelser hvor én eller flere amidbindinger er blitt erstattet med en alternativ linker, men hvor minst én amidbinding er tilbake, ha et peptidskjelett som definert i det foreliggende, men forbindelsen som helhet vil ikke være et peptid, men et peptidmimetikum.
Peptidliknende (peptidmimetiske) skjeletter er en ytterligere klasse egnede skjeletter, og kan for eksempel foretrekkes på grunn av at de kan gi molekylet som helhet resistens overfor hydrolytiske enzymer. Peptidmimetiske skjeletter vil vanligvis være lineære eller lineære strenger av kondenserte cykliske grupper som etterlikner peptidskjelettet.
Et peptidmimetikum er typisk kjennetegnet ved at det bibeholder polariteten, den tredimensjonale størrelse og funksjonaliteten (bioaktiviteten) hos sin peptid-ekvivalent, men hvor peptidbindingene er blitt erstattet, ofte med mer stabile bindinger. Med "stabil" menes mer bestandig overfor enzymatisk nedbrytning ved hydrolytiske enzymer. Vanligvis konserverer bindingen som erstatter amidbindingen (amidbindings-surrogat) mange av egenskapene hos amidbindingen, f.eks. form, sterisk volum, elektrostatisk karakter, mulighet for hydrogenbinding osv. Kapittel 14 i "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors og Madsen (red.) 1996, Horwood Acad. Pub gir en generell omtale av teknikker ifølge teknikkens stand for utforming og syntetisering av peptidmimetika. I det nærværende tilfelle, hvor molekylet reagerer med en membran heller enn med det spesifikke aktive sete på et enzym, er en del av problemene beskrevet for nøyaktig etterliknende affinitet og effektivitet eller substratfunksjon ikke relevante, og et peptidmimetikum kan lett fremstilles basert på en gitt peptidstruktur eller et mønster av nødvendige funksjonelle grupper. Egnede amidbindingssurrogater innbefatter følgende grupper: N-alkylering (R. Schmidt et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47), retro-inverst amid (M. Chorevog M. Goodman, Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), tioamid (D.B. Sherman og A.F. Spatola, J. Am. Chem. Soc, 1990, 112,433), tioester, fosfonat, ketometylen (R.V. Hoffman og H.O. Kim, J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), hydroksymetylen, fluorvinyl (T. Allmendinger et al., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 7297), vinyl, metylenamino (Y. Sasaki og J. Abe, Chem. Pharm. Bull. 1997, 45, 13), metylentio (A.F. Spatola, Methods Neurosci, 1993, 13, 19), alkan (S. Lavielle et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) og sulfonamid (G. Luisi et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).
De peptidmimetiske forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha én eller flere, fortrinnsvis 2 eller 3 identifiserbare subenheter som har omtrent ekvivalent størrelse og funksjon som aminosyrer. Betegnelsen "aminosyre" kan følgelig passende anvendes i det foreliggende for å angi de ekvivalente subenheter i en peptidmimetisk forbindelse. Videre kan peptidmimetika ha grupper ekvivalente med R-gruppene i aminosyrer, og omtale i det foreliggende av egnede R-grupper, innbefattende modifiserte R-grupper, og av N- og C-terminale modifiserende grupper gjelder, med de nødvendige endringer, peptidmimetiske forbindelser.
Som omtalt i læreboken henvist til ovenfor, kan peptidmimetika, i tillegg til erstatning av amidbindinger, innbefatte erstatning av større strukturelle deler med di-eller tripeptidmimetiske strukturer, og i dette tilfelle kan mimetiske deler som innbefatter peptidbindingen, så som azol-avledede mimetika, anvendes som dipeptiderstatninger. Peptidmimetika og følgelig peptidmimetka-skjeletter hvor amidbindingene er blitt erstattet som omtalt ovenfor, er imidlertid foretrukket.
Egnede peptidmimetika innbefatter reduserte peptider hvor amidbindingen er blitt redusert til et metylenamin ved behandling med et reduksjonsmiddel, f.eks. boran eller et hydridreagens så som litiumaluminiumhydrid. En slik reduksjon har den ytterligere fordel at den øker molekylets totale kationisitet.
Andre peptidmimetika innbefatter peptoider dannet for eksempel ved trinnvis syntetisering av amid-funksjonaliserte polyglyciner. En del peptidmimetika-skjeletter vil lett kunne fås ut fra sine peptidforløpere, så som peptider som er blitt permetylert; egnede metoder er beskrevet av J.M. Ostresh et al. i Proe. Nati. Acad. Sei. USA
(1994) 91, 11138-11142. Sterkt basiske betingelser vil begunstige N-metylering fremfor O-metylering og resulterer i metylering av en del av eller alle nitrogenatomene i peptidbindingene og det N-terminale nitrogen.
Foretrukne peptidmimetika-skjeletter innbefatter polyestere, polyaminer og derivater derav samt substituerte alkaner og alkener. Peptidmimetikaene vil fortrinnsvis ha N- og C-terminale ender som kan være modifisert som omtalt i det foreliggende.
Peptider og peptidmimetika vil vanligvis ha et skjelett med en lengde på 7-16 atomer. Molekyler med skjeletter i den øvre ende av disse områder vil vanligvis omfatte (5- og y-aminosyrer eller deres ekvivalenter.
Peptidene for anvendelse som antimikrobielle midler ifølge oppfinnelsen vil typisk innbefatte 2 eller 3 aminosyrer, hvorav minst én har en kationisk R-gruppe. Egnede genetisk kodede aminosyrer som gir denne kationiske funksjonalitet, vil derfor være lysin, arginin og histidin; ikke genetisk kodede aminosyrer og modifiserte aminosyrer som også gir en kationisk R-gruppe, innbefatter analoger til lysin, arginin og histidin så som homolysin, ornitin, diaminosmørsyre, diaminopimelinsyre, diaminopropionsyre og homoarginin samt trimetyl-lysin og trimetylornitin. Én eller flere av aminosyrerestene har en R-gruppe som tilveiebringer én av de fordrede voluminøse og lipofile grupper. Blant de genetisk kodede aminosyrer er tryptofan, fenylalanin og tyrosin egnet. Tryptofan er på grunn av sin to-kondensert- ring-struktur og ekstra volum spesielt foretrukket, skjønt tyrosins polaritet også kan være nyttig. Ikke-genetiske aminosyrer, som kan være naturlig forekommende, og tryptofan-, fenylalanin- og tyrosin-analoger og aminosyrer som er blitt modifisert til å innbefatte en voluminøs og lipofil R-gruppe, kan også anvendes. Alle slike modifiserte og umodifiserte aminosyrer kan passende omtales som "voluminøse og lipofile aminosyrer".
De lukkede ringsystemer er typisk dannet av karbonatomer, eventuelt også innbefattende nitrogen-, oksygen- eller svovelatomer. Spesielt foretrukne aminosyrer omfatter en substitutert eller usubstituert indol. R-gruppen kan fortrinnsvis være tredimensjonal. Foretrukne aminosyrer som innbefatter en voluminøs og lipofil R-gruppe, innbefatter adamantylalanin, 3-benzotienylalanin, 4,4'-bifenylalanin, 3,3-difenylalanin, homofenylalanin, 2,6-diklorbenzyltyrosin, cykloheksyltyrosin, 7-benzyloksytryptofan, tri-tert.-butyltryptofan, homotryptofan, 3-(-antracenyl)-L-alanin, L-p-isopropylfenylalanin, L-tyroksin, 3,3',5-trijod-L-tyronin, trijodtyrosin.
Et lipofilt molekyl er et molekyl som knyttes sammen med sin egen type i vandig oppløsning, ikke nødvendigvis på grunn av at interaksjonene mellom de lipofile molekyler er sterkere enn mellom det lipofile molekyl og vann, men på grunn av at interaksjoner mellom et lipofilt molekyl og vann vil ødelegge de mye sterkere interaksjoner vannmolekylene seg imellom. Det er derfor foretrukket at den voluminøse og lipofile R-gruppe ikke bør inneholde mange polare funksjonelle grupper, f.eks. ikke mer enn 4, fortrinnsvis 2 eller færre. Slike grupper vil øke bindings-interaksjonen med de vandige omgivelser og følgelig redusere molekylets lipofilisitet. For eksempel kan en fenylgruppe som komponent i en voluminøs og lipofil gruppe være foretrukket fremfor en pyridylgruppe, selv om de har det samme antall ikkehydrogen-atomer og har liknende total størrelse. Imidlertid er tilstedeværelsen av en hydroksylgruppe i en voluminøs og lipofil gruppe blitt vist å øke aktiviteten, og spesielt i lengre peptid- og peptidmimetika-forbindelser vil én eller flere av de voluminøse og lipofile grupper fortrinnsvis inneholde én eller to polare grupper, spesielt hydroksygrupper. Følgelig kan amfipatiske grupper så som fenolgrupper være spesielt effektive voluminøse og lipofile grupper, spesielt i lengre molekyler.
Ikke-genetiske voluminøse og lipofile aminosyrer innbefatter modifiserte tryptofan-, tyrosin- og fenylalaninrester, spesielt tryptofanrester som er blitt substituert i 1-, 2-, 5- og/eller 7-stillingen i indolringen, idet stillinger 1 eller 2 er foretrukket, f.eks.
5'-hydroksytryptofan. Mange forskjellige andre aminosyre-derivater med voluminøs og lipofil beskaffenhet er kjent for en fagperson på området.
Egnede aminosyrer innbefatter tyrosin samt følgende kommersielt tilgjengelige aminosyrer og deres derivater: L-3-benzotienylalanin, CAS = 72120-71-9 (Synthetech), D-3-benzotienylalanin, CAS = 111139-55-0 (Synthetech), L-4,4'-bifenylalanin (Synthetech), D-4,4'-bifenylalanin (Synthetech), L-4-bromfenylalanin, CAS = 24250-84-8 (Synthetech), D-4-bromfenylalanin, CAS = 62561-74-4 (Synthetech), L-2-klorfenylalanin, CAS = 103616-89-3 (Synthetech), D-2-klorfenylalanin, CAS = 80126-50-7 (Synthetech), L-3-klorfenylalanin, CAS = 80126-51-8 (Synthetech), D-3-klorfenylalanin, CAS = 80126-52-9 (Synthetech), L-4-klorfenylalanin, CAS = 14173-39-8 (Synthetech), D-4-klorfenylalanin, CAS = 14091-08-8 (Synthetech), L-3-cyanofenylalanin, CAS = 57213-48-6 (Synthetech), D-3-cyanofenylalanin (Synthetech), L-4-cyanofenylalanin (Synthetech), D-4-cyanofenylalanin (Synthetech), L-3,4-diklorfenylalanin, CAS = 52794-99-7 (Synthetech), D-3,4-diklorfenylalanin, CAS = 52794-98-6 (Synthetech), L-3,3-difenylalanin (Synthetech), D-3,3-difenylalanin (Synthetech), L-homofenylalanin, CAS = 943-73-7 (Synthetech), D-homofenyl-alanin, CAS = 82795-51-5 (Synthetech), L-2-indanylglycin (Synthetech), D-2-indanylglycin (Synthetech), L-4-jodfenylalanin, CAS = 24250-85-9 (Synthetech), D-4-jodfenylalanin, CAS = 62561-75-5 (Synthetech), L-1-naftylalanin, CAS = 55516-54-6 (Synthetech), D-1-naftylalanin, CAS = 78306-92-0 (Synthetech), L-2-naftylalanin, CAS = 58438-03-2 (Synthetech), D-2-naftylalanin, CAS = 76985-09-6 (Synthetech), L-3-trifluormetylfenylalanin, CAS = 14464-68-7 (Synthetech), D-3-trifluormetylfenylalanin (Synthetech), L-4-trifluormetylfenylalanin, CAS = 114926-38-4 (Synthetech), D-4-trifluormetylfenylalanin, CAS = 114872-99-0 (Synthetech), Boc-D-homofenylalanin (Neosystem Laboratoire), Boc-L-homofenylalanin (Neosystem Laboratoire), Fmoc-4-metyl-D-fenylalanin (Neosystem Laboratoire), Fmoc-4-metyl-L-fenylalanin (Neosystem Laboratoire), 2,6-diklorbenzyltyrosin, CAS = 40298-71-3 (Senn Chemicals), benzyltyrosin-Fmoc (Senn Chemicals), cykloheksyltyrosin-Fmoc (Senn Chemicals), L-3,5-dijodtyrosin, CAS = 300-39-0 (Senn Chemicals), D-3,5-dijodtyrosin (Senn Chemicals), L-3,5-dibromtyrosin (Senn Chemicals), D-3,5-dibromtyrosin (Senn Chemicals), L-t-butyltyrosin (Senn Chemicals), N-acetyl-homotryptofan (Toronto Research), 7-benzyloksytryptofan (Toronto Research), homotryptofan (Toronto Research), 3-(antracenyl)-L-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 3-(3,5-dibrom-4-klorfenyl)-L-alanin (Peninsula Laboratories), 3-(3,5-dibrom-4-klorfenyl)-D-alanin (Peninsula Laboratories), 3-(2-kinoyl)-L-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 3-(2-kinoyl)-D-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 2-indanyl-L-glycin-Boc (Peninsula Laboratories), 2-indanyl-D-glycin-Boc (Peninsula Laboratories), L-p-t-butoksyfenylglycin-Fmoc (RSP), L-2-t-butoksyfenylalanin-Fmoc (RSP), L-3-t-butoksyfenylalanin-Fmoc (RSP), L-homotyrosin, O-t-butyleter-Fmoc (RSP), L-p-t-butoksymetylfenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-metylfenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-etylfenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-iso-propylfenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-metoksyfenylalanin-Fmoc (RSP), P-p-(tBu-tio)fenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-(Trt-tiometyl)fenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-hydroksymetylfenylalanin, O-t-butyl (RSP), L-p-benzoylfenylalanin (Advanced ChemTech), D-p-benzoylfenylalanin (Advanced ChemTech), O-benzyl-L-homoserin-Boc (Advanced ChemTech), O-benzyl-D-homoserin-Boc (Advanced ChemTech), L-fM-naftylalanin (Advanced ChemTech), D-p-1-naftylalanin (Advanced ChemTech), L-penta-fluorfenylalanin-Boc (Advanced ChemTech), D-pentafluorfenylalanin-Boc (Advanced ChemTech), D-penta-fluorfenylalanin-Fmoc (Advanced ChemTech), 3,5-dijod-L-tyrosin-Fmoc (-Boe)
(Advanced ChemTech), L-tyroksin-Na, CAS = 6106-07-6 (Novabiochem), 3,3',5-trijod-L-tyronin-Na, CAS = 55-06-1 (Novabiochem).
Det er, overraskende nok, funnet at kjemiske standard-beskyttelsesgrupper ved tilknytning til en aminosyre-R-gruppe kan gi egnede voluminøse og lipofile grupper. Slike modifiserte R-grupper utgjør foretrukne voluminøse og lipofile grupper. Egnede aminosyre-beskyttende grupper er velkjente på området og innbefatter Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl), Mtr (4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl) og Pbf (2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofuransulfonyl), som passende kan øke volumet og lipofilisiteten hos aromatiske aminosyrer, f.eks. Phe, Trp og Tyr. Dessuten er tert.-butylgruppen en vanlig beskyttende gruppe for et stort område av aminosyrer og kan tilveiebringe voluminøse og lipofile grupper som beskrevet i det foreliggende, spesielt ved modifisering av aromatiske rester. Z-gruppen (karboksybenzyl) er en ytterligere beskyttende gruppe som kan anvendes til tilveiebringelse av en voluminøs og lipofil gruppe.
En voluminøs og lipofil gruppe som definert ovenfor kan også tilveiebringes av en N-terminal-modifiserende gruppe. Slike voluminøse og lipofile N-terminale modifikasjoner vil fortrinnsvis omfatte en 5- eller 6-leddet ring som kan være alkyl eller aryl, f.eks. cykloheksylkarboksylat eller benzylkarboksylat. Den voluminøse og lipofile N-terminal-modifiserende gruppe kan omfatte 2 eller flere kondenserte ringer hvorav én eller flere kan være en 5-leddet ring, f.eks. adamantyl eller indol. Dessuten er Fmoc, på grunn av sin tendens til å forårsake uakseptable toksisitets-nivåer (dvs. hemolytisk aktivitet) og til å gi peptider som er bakteriostatiske heller enn baktericide, utelukket fra eventuelle voluminøse og lipofile N-terminale modifikasjoner. N-terminale acetylgrupper er ikke foretrukket av liknende grunner.
Egnede molekyler som kan anvendes til modifisering av den N-terminale ende og gi en voluminøs og lipofil gruppe, innbefatter: cis-Bicyklo[3.3.0]oktan-2-karboksylsyre, [18209-43-3] (Aldrich); Abietinsyre, [514-10-3] (Aldrich); Ursolinsyre, [77-52-1] (Aldrich); (1,2-Metanfulleren-C60)-61-karboksylsyre, [155116-19-1] (Fluka); Dimetylkuban-1,4-dikarboksylat, [29412-62-2]
(Fluka); 2-Norbornaneddiksyre, [1007-01-8] (Aldrich); 4-Pentylbicyklo[2.2.2]-oktan-1-karboksylsyre, [73152-70-2] (Aldrich); Adamantyleddiksyre; 3-Noradamantan-karboksylsyre, [16200-53-6] (Aldrich); 9-Fluoreneddiksyre, [6284-80-6] (Aldrich); cis-Dekahydro-1-naftol, [36159-47-4] (Aldrich); 9-Etyl-bicyklo[3.3.1]nonan-9-ol, [21915-33-3] (Aldrich); 3-Kinuklidinol, [1619-34-7] (Aldrich); [[(1S)-endo]-(-)-Borneol, [464-45-9] (Aldrich); (1R,2R,3R,5S)-(-)-lsopinokamfeol, [25465-65-0] (Aldrich); Dehydro-abietylamin [1446-61-3] (Aldrich); (+)-3-Aminokinuklidin [6530-09-2] (Aldrich); R-(+)-Bornylamin, [32511-34-5] (Aldrich); 1,3,3-Trimetyl-6-aza-bicyklo[3.2.1]oktan [53460-46-1] (Aldrich); 1-Adamantylamin, [768-94-5] (Aldrich); 9-Aminofluoren, [5978-75-6]
(Aldrich); (1 R)-(-)-10-kamfersulfonsyre, [35963-20-3] (Aldrich); 5-lsokinolinsulfonsyre, [27655-40-9] (Aldrich); 2-Kinolinetiol, [2637-37-8] (Aldrich); 8-Merkaptomenton, [38462-22-5] (Aldrich).
N-terminale modifikasjoner som gir voluminøse og lipofile grupper, kan omfatte en voluminøs og lipofil gruppe "R" som kan være direkte knyttet til det N-terminale amin under dannelse av et mono-, di- og eventuelt kationisk tri-alkylert N-terminalt amin. Alternativt kan R-gruppen være tilknyttet via en sammenknyttende del, f.eks. en karbonylgruppe (RCO), f.eks. adamantyl eller benzyl, karbamat (ROCO) eller en linker som danner urea (RNHCO) eller (R2NCO) eller med en linker som danner et sulfonamid, boramid eller fosfonamid. Sulfonamid-dannende linkere kan være spesielt nyttige når det fordres et mer stabilt peptid. Den voluminøse og lipofile gruppe R omfatter en fortrinnsvis mettet cyklisk gruppe, mer foretrukket en polycyklisk gruppe hvor de cykliske grupper er kondenserte eller bro-sammen-knyttede.
En voluminøs og lipofil gruppe som definert ovenfor kan også tilveiebringes ved en C-terminal-modifiserende gruppe. Egnede C-terminale modifikasjoner innbefatter dannelse av estere, innbefattende tioestere eller substituerte primære og sekundære amider under dannelse av f.eks. en benzyl- eller cykloheksylester eller - amid. Vanligvis foretrekkes estere. Andre voluminøse og lipofile C-terminale grupper innbefatter naftylamin og substituerte aromatiske aminer så som fenyletylamin. C-terminale beskyttende standardgrupper kan også tilveiebringe en voluminøs og lipofil gruppe. C-terminale modifikasjoner vil derfor typisk omfatte en voluminøs og lipofil gruppe "R" som kan være knyttet direkte til den C-terminale karboksygruppe under dannelse av et keton. Altrnativt kan R-gruppen være tilknyttet via en sammenknyttende del, f.eks. (OR) som danner en ester i den C-terminale ende, (NH-R) eller (NR2, hvor de to R-grupper ikke behøver være de samme) som danner henholdsvis primære og sekundære amidgrupper i den C-terminale ende, eller grupper (B-(OR)2) som danner borestere eller fosforanaloger. Dae (diaminoetyl) er en ytterligere sammenknyttende del som kan anvendes til å tilknytte en voluminøs og lipofil gruppe, f.eks. karbobenzoksy (Z) til den C-terminale ende. C-terminale modifikasjoner har den fordel at de "fjerner" en anionisk gruppe og følgelig øker den kationiske beskaffenhet av molekylet som helhet. Mens derfor den kationiske N-terminale ende vanligvis ikke vil være modifisert med unntak av med en voluminøs og lipofil gruppe, vil den C-terminale ende typisk være modifisert enten ved innlemming av en voluminøs og lipofil gruppe eller på annen måte for opphevelse av den negative ladning, f.eks. ved amidering eller dannelse av en ikke-voluminøs og lipofil ester, f.eks. en alkylester så som en metylester. På denne måte kan peptidet Tbt-Arg-Trp-NH2ha de ønskelige 2 voluminøse og lipofile grupper (tilført ved Tbt og Trp) og 2 kationiske grupper, i den N-terminale ende og R-gruppen i arginin, hvorav ingen er "opphevet" av en anionisk C-terminal ende.
En moderat voluminøs C-terminal gruppe, så som en gruppe omfattende en enkelt, fortrinnsvis 6-leddet ring, så som en gruppe som danner en benzylester, er vist å gi peptider med spesielt gode terapeutiske egenskaper, og peptider omfattende en slik gruppe utgjør følgelig en foretrukket gruppe molekyler i henhold til foreliggende oppfinnelse.
Peptidene innbefatter fortrinnsvis minst 3 voluminøse og lipofile grupper (eller minst 1 super-voluminøs og -lipofil gruppe) og minst to flere kationiske enn anioniske deler. Molekylene for anvendelse i henhold til oppfinnelsen er peptider, innbefattende peptid-derivater eller peptidmimetika, og de er fortrinnsvis ikke-cykliske.
Anvendelsen av peptidmimetiske ekvivalenter til ovennevnte peptider utgjør et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse. Et slikt peptidmimetisk molekyl kan inneholde én eller flere indre amidbindinger, og skjelettet i et slikt molekyl vil, som omtalt ovenfor, følgelig anses som peptidisk, skjønt molekylet, som resultat av andre amidbindinger eller andre modifikasjoner, ikke er "et peptid".
Betegnelsene "voluminøs og lipofil", "super-voluminøs og -lipofil" samt definisjonene av kationiske og anioniske grupper er som beskrevet tidligere. Disse korte peptider vil fortrinnsvis være modifisert i den N- og/eller C-terminale ende. Peptidene omtales som "kunstige peptider" for å angi at peptider som bare innbefatter aminosyrer valgt blant de 20 genetisk kodede aminosyrer, og ingen voluminøs og lipofil N- eller C-terminal modifikasjon, ikke er påtenkt å være medtatt innenfor rammen for dette aspekt ved oppfinnelsen. Dessuten er, som omtalt ovenfor, Fmoc, på grunn av sin tendens til å gi uakseptable nivåer av toksisitet (dvs. hemolytisk aktivitet) holdt utenfor eventuelle voluminøse og lipofile N-terminale modifikasjoner.
Der vil være praktiske øvre grenser for hvor voluminøs og lipofil en gruppe kan være, spesielt på bakgrunn av økende toksisitet hos molekylet til uakseptable nivåer. Dette kan være avhengig av molekylets totale størrelse samt faktorer så som tredimensjonalitet hos gruppen og det totale antall ikkehydrogen-atomer i gruppen samt dens stilling i molekylet som helhet, dvs. av om hvorvidt det er en terminal eller indre gruppe.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for legemiddel-identifikasjon og - produksjon basert på de funksjonelle mønstre identifisert i det foreliggende. Det er, overraskende nok, funnet at meget små molekyler, så som små peptider, kan ha utmerket terapeutisk, f.eks. antimikrobiell aktivitet, men at slik aktivitet er avhengig av tilstedeværelse av et visst antall voluminøse og lipofile og kationiske deler; egnede mønstre for disse funksjonelle grupper er definert i det foreliggende. Identifikasjon av disse mønstre gir en meget nyttig strategi for slike som prøver å fremstille antimikrobielle molekyler, og muliggjør spesielt fremstilling av molekyler som er mindre enn vanlige terapeutiske antimikrobielle midler. Potensielle "lead"-kandidat- legemiddelforbindelser kan identifiseres og eventuelt modifiseres ytterligere for økning av aktiviteten.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for fremstilling av et membranvirkende antimikrobielt middel, som omfatter identifisering av et peptid med en lengde på 2-4 aminosyrer, med minst én mer kationisk enn anionisk del, og som har minst tre voluminøse og lipofile grupper eller grupper som kan modifiseres til å gi voluminøse og lipofile grupper, og syntetisering av et derivat eller et peptidmimetikum for dette peptid, og eventuelt utforming av nevnte peptid, peptid-derivat eller peptidmimetikum med en fysiologisk akseptabel bærer eller eksipiens.
Det innledningsvis identifiserte molekyl kan være et peptid så som et fragment av et kjent peptid eller et fragment syntetisert de novo. Dette peptid kan testes med henblikk på sin biologiske aktivitet, og deretter utføres syntetiseringstrinnet før testing av peptidet, derivatet eller peptidmimetikumet ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis vil det innledningsvis identifiserte peptid ikke bli syntetisert og testet, men vil ganske enkelt tilveiebringe basis for syntetisering av et molekyl. Dette molekyl kan i seg selv testes og deretter ytterligere modifiseres i henhold til læren i det foreliggende. Før syntetisering vil det være en utformingsprosess hvor den nøyaktige beskaffenhet og posisjon for de funksjonelle grupper og de nødvendige syntesetrinn bestemmes.
Det er også observert at innlemming av én eller flere enantiomere aminosyrer i betydelig grad kan øke peptidenes bioaktivitet, og slike peptider vil også ha redusert ømfintlighet overfor enzymatisk hydrolyse. Følgelig kan én eller flere av aminosyrene som finnes i molekylet, være i D-formen, f.eks. kan alle aminosyrer være i D-formen, alternerende rester kan være i D-formen, eller det kan være blokker av D- og L-rester.
Egnede forbindelser som har de strukturelle og funksjonelle karakteregenskaper som de bioaktive molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, men som ikke er peptider eller peptidmimetika, kan lett fremstilles av en fagperson på området. I dette tilfelle tilveiebringer "skjelettet" typisk et stillas til hvilket de kationiske og voluminøse og lipofile grupper, dvs. de funksjonelle grupper som er ansvarlige for molekylets aktivitet, tilknyttes.
De bioaktive molekyler for anvendelse i henhold til oppfinnelsen vil fortrinnsvis kombinere god aktivitet overfor patogene mål-organismer, f.eks. målt ved MBC-verdier, og forholdsvis lav toksisitet, målt ved hemolytisk aktivitet. Følgelig vil molekylene fortrinnsvis ha en MBC overfor S. aureus på 50 ug/ml eller mindre, mer foretrukket 20 ug/ml eller mindre, og en hemolytisk aktivitet på EC50> 500 ug/ml, fortrinnsvis > 1000 ^ig/ml.
Det må være klart at i eksemplene 1 og 4 anvendes arginin som et eksempel på en genetisk kodet kationisk aminosyre, og tryptofan eller tyrosin som eksempel på en genetisk kodet voluminøs og lipofil aminosyre. De andre genetisk kodede voluminøse og lipofile og kationiske aminosyrer er beskrevet tidligere. Ekvivalenter til peptidene ifølge eksempler 1 og 4 som innbefatter andre genetisk kodede voluminøse og lipofile aminosyrer i stedet for tryptofan og/eller arginin er overveiet. Den C-terminale ende av disse peptider er umodifisert eller amidert eller forestret med en liten ikke-voluminøs og -lipofil gruppe.
Molekylene ifølge oppfinnelsen har typisk antimikrobiell, f.eks. antibakteriell, antiviral eller antifungal aktivitet. Dessuten oppviser molekylene antitumor-aktivitet, idet molekylene selektivt lyserer kreftceller heller enn friske eukaryote celler. Molekylene kan være lytiske og/eller forårsake en destabilisering av cellemembranen som kan påvirke permeabiliteten og cellenes levedyktighet. Molekylene er aktive overfor gramnegative og grampositive bakterier, men er blitt vist å være spesielt effektive overfor grampositive bakterier. Følgelig er anvendelsene, terapiene og medikamentene fortrinnsvis for behandling av en gram-positiv infeksjon.
Molekylene kan være baktericide eller bakteriostatiske, skjønt baktericide molekyler vanligvis er foretrukket. En høy MBC-verdi men lav MIC-verdi tyder på et bakteriostatisk molekyl; dipeptidet TbtR-OMe er for eksempel bakteriostatisk med hensyn til E. coli. Tripeptidet RTbtR-OME, som innbefatter en ytterligere kationisk gruppe, er baktericid. Øking av et molekyls kationisitet er et verktøy som kan anvendes for å tilveiebringe et baktericid molekyl, og følgelig er det også beskrevet en fremgangsmåte for å øke et peptids baktericide aktivitet sammenliknet med dets bakteriostatiske aktivitet, idet peptidet har 2-4 aminosyrer, minst én mer kationisk enn anionisk del og minst én super-voluminøs og -lipofil gruppe, eller minst to voluminøse og lipofile grupper, ved øking av antallet kationiske deler som finnes i peptidet, med minst én. Vanligvis ser det ut til at tilstedeværelsen av minst to, f.eks. 3 eller 4 ytterligere kationiske grupper gir aktive molekyler, men kationisiteten kan reduseres hvis antallet voluminøse og lipofile grupper økes for å kompensere.
Også omtalt her er metoder for behandling av mikrobeinfeksjoner ved administrering av de forskjellige molekyler beskrevet i det foreliggende. Spesielt er det tilveiebrakt metoder for destabilisering av mikrobecellemembraner. Den administrerte mengde bør være effektiv til å drepe alle eller en del av mål-mikrobene, eller til å forhindre eller redusere deres reproduksjonshastighet eller på annen måte redusere deres skadelige virkning på kroppen. Legen eller pasienten bør merke forbedring i én eller flere av parameterne eller symptomene som er forbundet med infeksjonen. Administreringen kan også være profylaktisk.
Peptidene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres på hvilken som helst passende måte. Vanligvis vil de tilstedeværende reaktive grupper (for eksempel amino, tiol og/eller karboksyl) være beskyttet under den generelle syntese. Slutt-trinnet ved syntesen vil følgelig være avbeskyttelse av et beskyttet derivat ifølge oppfinnelsen. Som omtalt ovenfor, vil visse peptider ifølge oppfinnelsen bære en "beskyttende gruppe", siden denne er ansvarlig for øket cytotoksisitet.
Ved oppbygging av peptidet kan man i prinsippet starte enten i den C-terminale eller N-terminale ende, skjønt C-terminal-startmetoden er foretrukket.
Metoder for peptidsyntetisering er velkjente på området, men når det gjelder foreliggende oppfinnelse, kan det være spesielt hensiktsmessig å utføre syntesen på en fast-fase bærer; slike bærere er velkjente på området.
Det er kjent et stort utvalg av beskyttende grupper for aminosyrer, og egnede aminbeskyttende grupper kan innbefatte karbobenzoksy-(også betegnet Z), t-butoksykarbonyl (også betegnet Boe), 4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (også betegnet Fmoc). Det vil være klart at når peptidet bygges opp fra den C-terminale ende, vil en aminbeskyttende gruppe være til stede på a-aminogruppen i hver ny tilføyd rest, og denne vil måtte fjernes selektivt før neste koplingstrinn.
Karboksylbeskyttende grupper som for eksempel kan anvendes, innbefatter lett spaltede estergrupper så som benzyl (Bzl)-, p-nitrobenzyl (ONb)-, pentaklor-fenyl (OPCIP)-, pentafluorfenyl (OPfp)- eller t-butyl-(OtBu)-grupper samt koplings-gruppene på faste bærere, for eksempel metylgrupper bundet til polystyren.
Tiolbeskyttende grupper innbefatter p-metoksybenzyl (Mob), trityl (Trt) og acetamidometyl (Acm).
Det finnes et stort område av metoder for fjerning av amin- og karboksylbeskyttende grupper. Disse må imidlertid være i overensstemmelse med den anvendte syntesestrategi. De sidekjede-beskyttende grupper må være stabile overfor betingelsene som anvendes til fjerning av den midlertidige a-amino-beskyttende gruppe før neste koplingstrinn.
Aminbeskyttende grupper så som Boe, og karboksylbeskyttende grupper så som t£u, kan fjernes samtidig ved syrebehandling, for eksempel med trifluoreddiksyre. Tiolbeskyttende grupper så som Trt kan fjernes selektivt under anvendelse av et oksidasjonsmiddel så som jod.
Peptider ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved ufullstendig fjerning av beskytttende grupper, idet det blir tilbake grupper som øker peptidenes cytotoksiske aktivitet. Alternativt kan modifiserte R- og N- og C-terminale grupper fremstilles etter syntetisering av peptidet og tilknyttet fjerning av beskyttende grupper.
En spesielt foretrukket metode innbefatter syntetisering ved anvendelse av aminosyrederivater med følgende formel: Fmoc-aminosyre-Opfp.
Referanser og teknikker for syntetisering av peptidmimetiske forbindelser og de andre bioaktive molekyler ifølge oppfinnelsen er beskrevet i det foreliggende og er følgelig velkjente på området.
Formuleringer omfattende ett eller flere små bioaktive molekyler som definert i det foreliggende, i blanding med et egnet fortynningsmiddel, bærer eller eksipiens er beskrevet. Slike formuleringer kan blant annet være for farmasøytiske formål (innbefattende veterinærmedisinske) eller landbruksformål eller for anvendelse som steriliseringsmidler for materialer som er utsatt for mikrobiell forurensning, f.eks. i matvareindustrien. Egnede fortynningsmidler, eksipienser eller bærere er kjent for en fagperson.
Peptidene og andre molekyler definert i det foreliggende oppviser vid antimikrobiell aktivitet og er således også egnet som antivirus- og antisoppmidler, som vil ha farmasøytiske og landbruksanvendelser, og som promotere for sårheling, eller spermicider. Alle disse anvendelser utgjør utførelsesformer av oppfinnelsen.
Metoder for behandling eller forebygging av bakterie-, virus- eller soppinfeksjoner eller for behandling av tumorer, som omfatter administrering til en pasient som er et menneske eller dyr, av ett eller flere av peptidene eller peptidmimetikaene som definert i det foreliggende er muliggjort ved den foreliggende oppfinnelse.
Preparatene kan for eksempel presenteres i en form egnet for oral, nasal, parenteral, intravenøs, intratumoral eller rektal administrering.
Anvendt i det foreliggende innbefatter betegnelsen "farmasøytisk" veterinærmedisinske anvendelser av oppfinnelsen.
De aktive forbindelser definert i det foreliggende kan presenteres i de vanlige farmakologiske former for administrering, så som tabletter, belagte tabletter, nesesprayer, oppløsninger, emulsjoner, liposomer, pulver, kapsler eller langvarig frigjørings-former. Peptidene er spesielt egnet for topisk administrering, f.eks. ved behandling av diabetiske ulcera. Vanlige farmasøytiske eksipienser samt de vanlige produksjonsmetoder kan anvendes for fremstilling av disse former. Tabletter kan for eksempel fremstilles ved blanding av den aktive bestanddel eller bestanddeler med kjente eksipienser, så som for eksempel med fortynningsmidler, så som kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller laktose, disintegrerende midler så som maisstivelse eller algininsyre, bindemidler så som stivelse eller gelatin, smøremidler så som magnesiumstearat eller talkum, og/eller midler for oppnåelse av langvarig frigjøring, så som karboksypolymetylen, karboksymetylcellulose, celluloseacetat-ftalat eller polyvinylacetat.
Tablettene kan, hvis ønskelig, bestå av flere lag. Belagte tabletter kan fremstilles ved belegging av kjerner, oppnådd på liknende måte som for tablettene, med midler som vanligvis anvendes til tablettbelegg, for eksempel polyvinylpyrrolidon eller skjellakk, gummi arabicum, talkum, titandioksid eller sukker. For oppnåelse av langvarig frigjøring eller for å unngå inkompatibiliteter kan kjernen også bestå av flere lag. Tablettbelegget kan også bestå av flere lag for oppnåelse av langvarig frigjøring,
i hvilket tilfelle eksipiensene nevnt ovenfor for tabletter kan anvendes.
Organspesifikke bærersystemer kan også anvendes.
Injeksjonsoppløsninger kan for eksempel fremstilles på den vanlige måte, så som ved tilsetting av konserveringsmidler, så som p-hydroksybenzoater, eller stabilisatorer, så som EDTA. Oppløsningene blir så fylt i injeksjonsglass eller ampuller.
Nesespray som er en foretrukket administreringsmetode, kan utformes på liknende måte i vandig oppløsning og pakkes i spraybeholdere enten med et aerosol-drivmiddel eller forsynt med hjelpemidler for manuell kompresjon. Kapsler inneholdende én eller flere aktive bestanddeler kan for eksempel fremstilles ved blanding av de aktive bestanddeler med inerte bærere, så som laktose eller sorbitol, og fylling av blandingen i gelatinkapsler.
Egnede stikkpiller kan for eksempel fremstilles ved blanding av den aktive bestanddel eller kombinasjoner av aktive bestanddeler med de vanlige bærere som er påtenkt for dette formål, så som naturlige fett-typer eller polyetylenglykol eller derivater derav.
Doseringsenheter inneholdende de aktive molekyler inneholder fortrinnsvis 0,1-10 mg, for eksempel 1-5 mg av det antimikrobielle middel. De farmasøytiske preparater kan i tillegg omfatte ytterligere aktive bestanddeler, innbefattende andre cytotoksiske midler så som andre antimikrobielle peptider. Andre aktive bestanddeler kan innbefatte forskjellige typer antibiotika, cytokiner f.eks. IFN-y, TNF, CSF og vekstfaktorer, immunmodulatorer, kjemoterapeutiske midler, f.eks. cisplatin eller antistoffer.
De bioaktive molekyler er, når de anvendes i topiske preparater, vanligvis til stede i en mengde på minst 0,1 vekt%. i de fleste tilfeller er det ikke nødvendig å anvende peptidet i større mengde enn 1,0 vekt%.
Ved anvendelse av slike preparater systemisk (intramuskulært, intravenøst, intraperitonealt) er det aktive molekyl til stede i en slik mengde at det oppnås et serumnivå av det bioaktive molekyl på minst ca. 5 ug/ml. Vanligvis behøver ikke serumnivået overstige 500ug/ml. Et foretrukket serumnivå er ca. 100ug/ml. Slike serumnivåer kan oppnås ved innlemming av det bioaktive molekyl i et preparat for systemisk administrering i en dose på fra 1 til ca. 10 mg pr. kg. Vanligvis behøver ikke molekylet (molekylene) administreres i en dose som overstiger 100 mg pr. kg.
Metoder for behandling av omgivelses- eller landbrukssteder eller
-produkter, samt matvarer og steder for matvareproduksjon, med ett eller flere av de bioaktive molekyler som definert i det foreliggende for reduksjon av antallene levedyktige bakterier som er til stede, eller begrensing av bakterievekst eller -reproduksjon, utgjør ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse.
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ytterligere med henvisning til følgende ikke-begrensende eksempler og figurene, hvor:
Fig. 1 er et elektronmikroskopibilde av normal (ubehandlet) E. coli, og
Fig. 2 er et elektronmikroskopibilde av E. coli behandlet med ett av peptidene beskrevet i det foreliggende, WRWRWR. De behandlede bakterier mangler cytoplasmamateriale, og deres cellemembraner (samt celleveggkomponenter) er ødelagt, noe som tydelig viser en lytisk mekanisme.
Noen av molekylene som beskrevet i eksemplene er ikke i overensstemmelse med oppfinnelsen, men er innlemmet for sammenlikningsformål og for illustrerende formål.
Eksempler
Følgende forsøk eksemplifiserer prinsippene omtalt ovenfor. For lettvinthets skyld er kationiske aminosyrer representert ved arginin, og voluminøse og lipofile aminosyrer ved tryptofan, tyrosin og tri-tert.-butyltryptofan (super-voluminøs og -lipofil). Det er klart at andre rester med liknende ladning eller volum og lipofilisitet kan anvendes i stedet for disse aminosyrer. N- og C-terminale modifiserende grupper gir ytterligere voluminøse og lipofile grupper.
Den antimikrobielle effektivitet ble bestemt som den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) og minimale baktericide konsentrasjon (MBC) både i ug/ml for E. coli og S. aureus, representative gramnegative og grampositive bakterier. Celletoksisiteten ble betemt som EC50 (mengde av peptid nødvendig for 50% lyse av erytrocytter).
MIC (minimal inhiberende konsentrasjon)-tester
De anvendte bakteriestammer var: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, MRSA ATCC 33591 og MRSE ATCC 27626. Alle stammer ble oppbevart ved -70°C. Bakteriene ble dyrket i 2% Bacto-pepton-vann (Difco 1807-17-4). Alle tester ble utført med bakterier i midt-logaritmisk vekstfase. Bestemmelse av den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av peptidene for bakteriestammer ble utført i 1% Bacto-pepton-vann. En standard-mikrofortynningsteknikk med et inokulum på 2 x 10<6>CFU/ml ble anvendt. Alle analyser ble utført in duplo. Siden peptidene er positivt ladd og derfor kan henge fast i plastbrønnene, kontrollerte vi den virkelige konsentrasjon av peptidene i oppløsningen ved hjelp av HPLC. Det var ingen forskjell mellom konsentrasjonen av peptidene før og etter tilsetting av oppløsningen i plastbrønnene. MBC-tester ble utført på analog måte.
Hemolvtisk analyse
Peptidenes hemolytiske aktiviteter ble bestemt ved anvendelse av friske humane røde blodlegemer. 8 ml blod ble tatt fra en frisk person. 4 ml blod ble overført til et polykarbonat-rør inneholdende heparin til en sluttkonsentrasjon på 10 E/ml, og de gjenværende 4 ml blod ble overført til et glassrør inneholdende EDTA med sluttkonsentrasjon på 15% EDTA. Erytrocyttene ble isolert fra heparin-behandlet blod ved sentrifugering ved 1500 omdr. pr. min. i 10 minutter og vasket tre ganger med fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for fjerning av plasma og "buffy coat". Cellepelleten ble gjenoppslemmet i PBS slik at sluttvolumet ble 4 ml. Peptidet ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 mg/ml og 0,1 mg/ml. Peptidet ble ytterligere fortynnet til konsentrasjonene som angitt i tabell 15. For hvert rør ble PBS tilsatt først, og deretter de røde blodlegemer og peptidoppløsningene. Hematokriten i blodet behandlet med EDTA ble bestemt etter 30 minutter med Sysmex K-1000, og de gjenoppslemmede RBC ble fortynnet til 10% hematokrit. RBCer i PBS (1%) med og uten peptider (tabell 15) ble inkubert i en risteinnretning ved 37°C i 1 time og deretter sentrifugert ved 4000 omdr.pr. min. i 5 min. Supernatanten ble omhyggelig overført til nye polykarbonatrør, og supernatantens absorbans ble målt ved 540 nm. Basislinje-hemolyse var hemoglobin frigjort i nærvær av PBS, og 100% hemolyse var hemoglobin frigjort i nærvær av 0,1% Triton X-100.
Eksempel 1
En serie peptider ble fremstilt på et fastfast-multippel-peptidsyntetiseringsapparat MBS 396 fra Advance Chemtech med Arg-Trp-kombinasjoner med C-terminal amidering for unngåelse av negativ ladning fra karboksylatet. Disse peptiders antibakterielle aktivitet er vist i tabell 1 nedenfor.
Verdiene i parentes angir peptider hvor én eller flere av tryptofan reste ne er blitt modifisert ved PMC-gruppen.
Eksempel 2
En andre serie peptider ble fremstilt manuelt ved syntetisering i oppløsning innbefattende et Art/Trp (Tbt)- eller Trp (Tbt)/Arg-mønster med C-terminal forestring og/eller N-terminal acylering. Det annet sett peptider ble utformet på basis av fremstilling av et lite antall byggeklosser (dvs. Boe RW OBz, Boe WE OMe og Boe TbtR OMe) og modifisering av disse med ytterligere aminosyrer (i den N-terminale ende), N-terminal acylering og/eller C-terminal modifisering (frembringelse av et kationisk sete i den C-terminale ende ved fremstilling av et diaminoetan-derivat).
Generell metode for fjerning av Boe
Det Boc-beskyttede peptid ble oppløst i reagens K1 og omrørt ved romtemperatur i 60-90 minutter.<1>Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt en oppløsning av p-toluensulfonsyre (2,0-2,5 ekv) oppløst i en minimal mengde dietyleter<1>, og den melkeaktige hvite blanding ble avkjølt i kjøleren over natten slik at produktet skulle få utfelles fullstendig. Eterfasen ble tappet av og residuet findelt med dietyleter før inndamping i vakuum til et pulver. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC før biologisk testing eller anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.
Boc- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 2- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-D-Arg-OH-hydroklorid (855 mg, 2,75 mmol), H-D-Trp-OBzl-hydroklorid (832 mg, 2,5 mmol), HOBt (1378 mg, 9 mmol) og DIPEA (2,05 ml, 12 mmol) i DMF (5 ml) og diklormetan (1 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (1138 mg, 3 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 1 time, 40 ml diklormetan ble tilsatt og den organiske fase vasket suksessivt med 3 x 40 ml mettet NaHC03, 2 x 30 ml 5% citronsyre, 50 ml vann og 2 x 30 ml saltoppløsning. Inndamping ga et hvitt faststoff.
H- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 2- 2- 1)
Boc-D-Arg-D-Trp-OBzl (1,29 g, 2,2 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,85 g av et gulaktig faststoff.
Boc- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 1- 2)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Arg-OH (792 mg, 2,75 mmol), H-L-Trp-OBzl-hydroklorid (832 mg, 2,5 mmol), HOBt (1378 mg, 9 mmol) og DIPEA (2,05 ml, 12 mmol) i DMF (6 ml) og diklormetan (3 ml) avkjølt på is ble det tilsastt HBTU (1138 mg, 3 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 45 minutter og ved romtemperatur i 45 minutter. Opparbeiding ble utført som beskrevet for KP-2-1. Inndamping ga 1,7 g av et gulaktig faststoff.
H- L- Arq- L- Trp- OBzl ( KP- 4- 1)
Boc-L-Arg-L-Trp-OBzl (1,0 g, 1,5 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 1,07 g av et beige faststoff.
Boc- L- Trp- L- Arq- OMe ( KP- 3- 2)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Trp-OH (761 mg, 2,5 mmol), H-L-Arg-OMe-dihydroklorid (718 mg, 2,75 mmol), HOBt (1378 mg, 9 mmol) og DIPEA (2,05 ml, 12 mmol) i DMF (5 ml) og diklormetan (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (1138 mg, 3 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 1 time, 40 ml etylacetat ble tilsatt, og den organiske fase ble vasket suksessivt med 3 x 40 ml mettet NaHC03, 2 x 30 ml 5% citronsyre, 50 ml vann og 2 x 30 ml saltoppløsning. Inndamping ga 1,1 g av et hvitt faststoff.
H- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 5- 1)
Boc-L-Trp-L-Arg-OMe (1,1 g, 2,15 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 1,23 g av et gulaktig faststoff.
Boc- L- Trp- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 6- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Trp-OH (87 mg, 0,29 mmol), H-L-Trp-L-Arg-OMe-di-p-toluensulfonsyre (226 mg, 0,3 mmol), HOBt (158 mg, 1,03 mmol) og DIPEA (235 jil, 1,37 mmol) i DMF (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (130 mg, 0,34 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 80 minutter, 5 ml diklormetan ble tilsatt og den organiske fase ble vasket suksessivt med 3 x 5 ml mettet NaHC03, 2 x 5 ml 5% citronsyre, 5 ml vann og 5 ml saltoppløsning. Inndamping ga 0,05 g av en gul olje som, ifølge bedømmelse ved hjelp av Tic, inneholdt bare mindre mengder produkt. De blandede vannfaser ble ekstrahert med 3 x 15 ml etylacetat, tørket over MgS04og inndampet, hvorved man fikk 0,17 g av en gul olje. Denne olje ble anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.
H- L- Trp- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 8- 1)
Boc-L-Trp-L-Trp-L-Arg-OMe (0,14 g, ca. 0,2 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Produktet ble utfelt ved tilsetting av dietyleter uten tilsatt p-toluensulfonsyre.
Boc- L- Arg- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 11- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Arg-OH (64 mg, 0,22 mmol), H-L-Trp-L-Arg-OMe-di-p-toluensulfonsyre (175 mg, 0,23 mmol), HOBt (128 mg, 0,83 mmol) og DIPEA (181 ul, 1,1 mmol) i DMF (1 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (106 mg, 0,28 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 2 timer og ved romtemperatur i 30 minutter, 10 ml etylacetat ble tilsatt og den organiske fase ble vasket som beskrevet for KP-3-2. Etter opparbeiding inneholdt den organiske fase intet av det ønskede produkt ifølge bedømmelse ved analytisk RP-HPLC. De blandede vannfaser ble ekstrahert med 3 x 15 ml etylacetat og inndampet, hvorved man fikk 0,1 g av en gul olje. Denne olje ble anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.
H- L- Arg- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 13- 1)
Boc-L-Trp-L-Trp-L-Arg-OMe (0,14 g, ca. 0,2 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Produktet ble utfelt ved tilsetting av dietyleter uten tilsatt p-toluensulfonsyre. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,1 g av et hvitt faststoff.
Boc- L- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 12- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Trp-OH (88 mg, 0,29 mmol), H-L-Arg-L-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyre (255 mg, 0,3 mmol), HOBt (158 mg, 1,03 mmol) og DIPEA (235 ul, 1,37 mmol) i DMF (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (130 mg, 0,34 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 2 timer og ved romtemperatur i 30 minutter, 10 ml etylacetat ble tilsatt og den organiske fase ble vasket som beskrevet for KP-3-2. Inndamping ga 0,23 g av en gul olje.
H- L- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 14- 1)
Boc-L-Trp-L-Arg-L-Trp-OBzl (0,23 g, ca. 0,3 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for KP-8-1. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,2 g av et hvitt faststoff.
Boc- D- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 15- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-D-Trp-OH (90 mg, 0,29 mmol), H-L-Arg-L-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyre (251 mg, 0,3 mmol), HOBt (158 mg, 1,03 mmol) og DIPEA (235 ul, 1,37 mmol) i DMF (5 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (130 mg, 0,34 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 40 minutter og opparbeidelse utført som beskrevet for KP-2-1. Inndamping ga 0,24 g av et hvitt faststoff.
H- D- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 16- 1)
Boc-Trp-Arg-Trp-OBzl (0,24 g, ca. 0,3 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,17 g av et beige faststoff.
Boc- D- Trp- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 2- 1 - 2)
Til en omrørt oppløsning av Boc-D-Trp-OH (162 mg, 0,53 mmol), H-D-Arg-D-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyre (464 mg, 0,56 mmol), HOBt (292 mg, 1,9 mmol) og DIPEA (4,4 ml, 25 mmol) i DMF (5 ml) og diklormetan (1 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (241 mg, 0,64 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 70 minutter, 10 ml diklormetan ble tilsatt og den organiske fase ble vasket suksessivt med 3 x 10 ml mettet NaHC03, 4 x 10 ml 5% citronsyre (inntil sur vannfase på grunn av for mye tilsatt DIPEA), 2 x 10 ml vann og 2 x 10 ml saltoppløsning. Inndamping ga 0,42 g råprodukt.
H- D- Trp- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 2- 1 - 3)
Boc-D-Trp-D-Arg-D-Trp-OBzl (0,38 g, ca. 0,4 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,3 g av et beige faststoff.
Boc- L- Arg- L- Trp- OH ( KP- 10- 2)
Til en oppløsning av Boc-L-Arg-L-Trp-OH (300 mg, 0,5 mmol) i 5 ml metanol/vann (19:1) ble det tilsatt Pd-10% på trekull (53 mg, 0,05 mmol). Blandingen ble omrørt under hydrogenatmosfære (1 atm) over natten, filtrert gjennom et tynt lag Celite 545 og inndampet, hvorved man fikk en rød olje. Oljen ble oppløst i vann under forsiktig oppvarming, og lyofilisert, hvorved man fikk 383 mg av et lyserødt pulver.
Boc- L- Arg- L- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 17- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Arg-L-Trp-OH-hydroklorid (100 mg, 0,20 mmol), H-L-Arg-L-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyre (175 mg, 0,21 mmol), HOBt (110 mg, 0,72 mmol) og DIPEA (164 jxl, 0,96 mmol) i DMF (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (91 mg, 0,24 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 3 timer og opparbeiding utført som beskrevet for KP-3-2.
H- L- Arg- L- Trp- L- Arg- L- Trp- OBzl ( KP- 19- 1)
Boc-L-Arg-L-Trp-L-Arg-L-Trp-OBzl (ca. 0,2 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for KP-8-1. Fullstendig fjerning av eterfasen var vanskelig å utføre uten tap av materiale, og det lyserøde råprodukt inneholdt derfor sannsynligvis betydelige mengder TFA.
Boc- L- Arg- L- Trp- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 18- 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Arg-L-Trp-OH-hydroklorid (100 mg, 0,20 mmol), H-D-Arg-D-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyre (175 mg, 0,21 mmol), HOBt (110 mg, 0,72 mmol) og DIPEA (164 jxl, 0,96 mmol) i DMF (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (91 mg, 0,24 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 3 timer og opparbeiding utført som beskrevet for KP-3-2. Etter opparbeiding inneholdt den organiske fase bare mindre mengder av det ønskede produkt, ifølge bedømmelse ved analytisk RP-HPLC. De blandede vannfaser ble ekstrahert med 3 x 15 ml etylacetat og inndampet, hvorved man fikk råproduktet.
H- L- Arg- L- Trp- D- Arg- D- Trp- OBzl ( KP- 20- 1)
Boc-L-Arg-L-Trp-D-Arg-D-Trp-OBzl (ca. 0,2 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for KP-8-1. Fullstendig fjerning av eterfasen var vanskelig å utføre uten tap av materiale, og råproduktet inneholdt derfor sannsynligvis betydelige mengder TFA.
Boc- L- Arg- L- Trp- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 21 - 1)
Til en omrørt oppløsning av Boc-L-Arg-L-Trp-OH-hydroklorid (100 mg, 0,20 mmol), H-L-Trp-L-Arg-OMe-di-p-toluensulfonsyre (171 mg, 0,23 mmol), HOBt (110 mg, 0,72 mmol) og DIPEA (164 jxl, 0,96 mmol) i DMF (2 ml) avkjølt på is ble det tilsatt HBTU (91 mg, 0,24 mmol) i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt på is i 3 timer og opparbeiding utført som beskrevet for KP-3-2. Etter opparbeiding inneholdt den organiske fase bare mindre mengder av det ønskede produkt, ifølge bedømmelse ved analytisk RP-HPLC. De blandede vannfaser ble ekstrahert med 3 x 15 ml etylacetat og inndampet, hvorved man fikk 0,16 g av en gul olje.
H- L- Arg- L- Trp- L- Trp- L- Arg- OMe ( KP- 22- 1)
Boc-L-Arg-L-Trp-L-Trp-L-Arg-OMe (0,16 g, ca. 0,18 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for KP-8-1. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,12 g av et lyserødt faststoff.
Ind- Trp- Arg- OMe
3-lndolyleddiksyre (0,289 mmol) ble behandlet med H-Trp-Arg-OMe (1,06 ekv), trietylamin (2,01 ekv) og HBTU (1,10 ekv) som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Metanol ble anvendt som løsningsmiddel. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetting av 9 ml mettet natriumklorid. Vannfasen ble ekstrahert med 3 x 7 ml etylacetat og den organiske fase vasket med 4 ml 2 M saltsyre, 4 ml vann og 4 ml 5% natriumhydrogenkarbonat. Vaskeprosessen ble gjentatt én gang før den organiske fase ble tørket med 5 ml mettet natriumklorid og deretter inndampet, hvorved man fikk 0,11 g av et hvitt faststoff. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC.
<1>H-NMR (acetonitril-d3): 8 = 1,34 (2H, m), 1,52 (1H, m), 1,71 (1H, m), 2,89 (5H, m), 3,05 (1H, m), 3,15 (1H, m), 4,34 (1H, m), 4,48 (1H, m), 6,01 (4H, bs), 6,42 (1H, bs), 6,88-7,50 (12H, ms), 9,10 (1H, s), 9,22 (1H, s).
Chx- Trp- Arg- OMe
Cykloheksan-karboksylsyre (0,297 mmol) ble behandlet med H-Trp-Arg-OMe (1,03 ekv), trietylamin (1,96 ekv) og HBTU (1,05 ekv) som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Metanol ble anvendt som løsningsmiddel. Reaksjonsavbryting og opparbeiding ble utført som for Ind-Trp-Arg-OMe, hvorved man fikk 0,10 g av et hvitt faststoff. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC.
Boc- Tbt- Arg- OMe
En omrørt oppløsning av Boc-Tbt-OH (0,4735 g, 1,0 mmol), H-Arg-OMe-hydroklorid (0,2741 g, 1,05 mmol), HOBt (0,4872 g, 3,61 mmol) og DIPEA (0,820 ml, 4,79 mmol) i DMF/diklormetan (14 ml) avkjøles i is/vann-bad. HBTU (0,4560 g, 1,2 mmol) tilsettes i små porsjoner i løpet av 10 min. Blandingen omrøres i 30 min og kjølebadet fjernes. Reaksjonsblandingen får omrøres ved romtemperatur til det ikke er tilbake noen karboksylsyrekomponent (Tlc-system A). Blandingen inndampes til en olje, 20 ml diklormetan tilsettes og den organiske fase vaskes med 3 x 20 ml mettet natriumhydrogenkarbonat, 2 x 15 ml 5% citronsyre, 25 ml vann og 2 x 15 ml mettet natriumklorid suksessivt, og inndampes, hvorved det fås 0,80 g av et hvitt faststoff.
H- Tbt- Arg- OMe
Boc-Tbt-Arg-OMe (0,90 mmol) ble behandlet med reagens K som beskrevet for den generelle metode. Inndamping etter fjerning av eterfasen ga 0,24 g av et hvitt faststoff. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC.
Boc- Arg- Tbt- Arg- OMe
Di-p-toluensulfonsyresaltet av H-Tbt-Arg-OMe (0,24 g, 0,270 mmol), Boc-Arg-OH (0,0933 g, 0,335 mmol), HOBt (0,0442 g, 0,327 mmol), trietylamin (0,113 ml, 0,811 mmol) og HBTU (0,1231 g, 0,325 mmol) ble oppløst i acetonitril (2,2 ml, HPLC-kvalitet) og omrørt ved romtemperatur. Etter 1 time var det fremdeles igjen utgangsmateriale (Tlc-system A). Tre ekvivalenter av trietylamin ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt i ytterligere 1 time. Avbryting og opparbeiding ble utført som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Råoljen ble inndampet sammen med diklormetan, hvorved man fikk 0,23 g av et hvitt pulver. Råproduktet ble anvendt uten ytterligere rensinger.
H- Arg- Tbt- Arg- OMe
Det ubearbeidede Boc-Arg-Tbt-Arg-OMe ble oppløst i 4,05 ml av reagens K og spaltingen utført som beskrevet for den generelle metode. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC før biologisk testing.
Boc- Arg- Trp- OBzl
Boc-Arg-OH og H-Trp-OBzl koplet som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. N-metylmorfolin anvendt som base. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC.
H- Arg- Trp- OBzl
Det ubearbeidede Boc-Arg-Trp-OBzl (1,23 mmol) ble oppløst i 18,3 ml av reagens K og spaltningen utført som beskrevet for den generelle metode. Råproduktet ble anvendt uten ytterligere rensing.
Ind- Arg- Trp- OBzl
3-lndolyleddiksyre (0,0450 g, 0,257 mmol) ble behandlet med H-Arg-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyresalt, HBTU og trietylamin (6 ekv) som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Acetonitril ble anvendt som løsningsmiddel. Råproduktet ble isolert som 0,19 g av et hvitt faststoff.
Chx- Arg- Trp- OBzl
Cykloheksan-karboksylsyre (0,0031 ml, 0,266 mmol) ble behandlet med H-Arg-Trp-OBzl-di-p-toluensulfonsyresalt, HBTU og trietylamin (6 ekv) som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Acetonitril ble anvendt som løsningsmiddel. Råproduktet ble isolert som 0,17 g av et hvitt faststoff.
Ind- Arq- Trp- OH
Det ubearbeidede Ind-Arg-Trp-OBzl ble hydrogenert som beskrevet for den generelle metode, hvorved man fikk en gul olje.
Chx- Arg- Trp- OH
Det ubearbeidede Chx-Arg-Trp-OBzl ble hydrogenert som beskrevet for den generelle metode, hvorved man fikk en gul olje.
Boc- Arq- Trp- OH ( B87)
Det ubearbeidede Boc-Arg-Trp-OBzl ble hydrogenert som beskrevet for den generelle metode, hvorved man fikk 0,72 g av en gul olje.
Boc- Arq- Trp- Dae- Z
Til en omrørt oppløsning av Boc-Arg-Trp-OH (1,265 mmol) i DMF/diklormetan (12 ml, 1:1) ble det tilsatt HOBt (0,6202 g, 4,590 mmol), DIPEA (1,040 ml, 6,075 mmol) og N-Z-diaminoetan-hydroklorid (0,3088 g, 1,339 mmol). HBTU (0,5772 g, 1,522 mmol) ble tilsatt i små porsjoner i løpet av 5 min. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer og 45 minutter og inndampet til en mørkegul olje. Oljen ble oppløst i 20 ml etylacetat og vasket suksessivt med 3 ml 2 M saltsyre, 5 ml vann, 5 ml 5% natriumhydrogenkarbonat og 5 ml vann. Den resulterende mørkegule oppløsning ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til en olje. Findeling i heptan lyktes ikke, og oljen ble inndampet, hvorved man fikk 0,86 g av et brunaktig faststoff.
H- Arg- Trp- Dae- Z
Boc-Arg-Trp-Dae-Z (0,544 mmol) ble oppløst i reagens K (6,8 ml TFA) og omrørt ved romtemperatur i 1 time og 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble inndampet til et lite volum, og en oppløsning av p-toluensulfonsyre (0,32 g) i dietyleter (20 ml) ble tilsatt. Den melkeaktige hvite blanding ble avkjølt i kjøleren over natten for at produktet skulle få utfelles fullstendig. Eterfasen ble ledet bort og residuet inndampet i vakuum, hvorved man fikk et hvitt pulver. Råproduktet ble renset ved hjelp av RP-HPLC.
Ind- Arg- Trp- Dae- Z
3-lndolyleddiksyre (0,0265 g, 0,153 mmol) ble behandlet med H-Arg-Trp-Dae-Z-di-p-toluensulfonsyresalt, HBTU (1,2 ekv) og trietylamin (5 ekv) som beskrevet for Boc-Trp-Arg-OMe. Acetonitril (1,4 ml) og DMF (0,6 ml) ble anvendt som løsningsmidler, på grunn av dårlig løselighet av dipeptidanalogen i acetonitril. Råproduktet ble isolert som 0,12 g av et hvitt faststoff.
Forkortinger
Arg arginin
Boe t-butyloksykarbonyl
Chx cykloheksan-karboksylsyre
Dae diaminoetan
DIPEA diisopropyletylamin
DMF N.N-dimetylformamid
ES MS Elektrospray-massesprektrometri
HBTU 0-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluronium-heksafluorfosfat
HOBt 1-hydroksybenzotriazol
Ind 3-indolyleddiksyre
MBC Minimal baktericid konsentrasjon
MIC Minimal inhiberende konsentrasjon
RP-HPLC Reversert fase-høyprestasjons-væskekromatografi
Tbt 2,5,7-tri-t-butyltryptofan
TFA frifluoreddiksyre
Trp tryptofan
Z benzyloksykarbonyl
Referanser
1) CA. Guy; G.B. Fields, Methods in Enzymology 1997,
289, 67-83.
2) R.S. Lott; V.S. Chauhan; C.H. Stammer,
Journal of the Chemical Society Chemical
Communications 1979, 495-496.
Anmerkninger
Reagens K består av fenol (5 vekt/volum%), vann (5 volum%), tioanisol (5
volum%), etanditiol (2,0 volum%) og trifluoreddiksyre (82,5 volum%). 1,5 ml av reagenset pr. mol av peptidet anvendes for spaltning av Boc-gruppen.
Tilsettingen av p-toluensulfonsyre i dietyleter resulterer i dannelse av p-toluensulfonsyresaltene av peptidene. Peptider inneholdende én fri aminofunksjon eller en guanidinfunksjon antas å danne mono-p-toluensulfonsyresaltet osv.
Identifikasjon av produktene ble utført ved anvendelse av ESMS, og resultatene er vist i tabell 2.
Det kjemiske utbytte av koplings- og beskyttelsesfjerningsreaksjonene er ikke målt. Identifisering av produktene er utført ved anvendelse av ESMS. Rensing er utført med RP-HPLC på en semipreparativ C18-kolonne med vann og acetonitril (begge tilsatt 0,01 % TFA) som mobil fase. Peptidinnholdet i de rensede prøver er blitt påvist med RP-HPLC på en analytisk C18-kolonne.
Disse peptiders antibakterielle aktivitet er vist i tabellene 3-5 nedenfor.
Konsentrasjonsserie: 300,100, 50, 37,5 og 25 ug/ml.
Store bokstaver representerer L-aminosyrer, små bokstaver representerer D-aminosyrer.
Titerserie: 200, 100, 75, 50, 25,10, 5, 2,5 ug/ml
Med unntak av de to peptider inneholdende Tbt, viste ingen av peptidene ifølge eksempler 1 eller 2 målbar hemolyse (dvs. EC50 > 1000 ug/ml). Dipeptidet Tbt-Arg-OMe hadde en EC50 på 360 ug/ml, men overraskende nok var tripeptidet Arg-Tbr-Arg-OMe mindre toksisk, med en EC50 på 720 ug/ml, til tross for sin høyere aktivitet både overfor E. coli og S. aureus.
Skjønt arginin er foretrukket, kan lysin anvendes uten betydelig tap av antibakteriell aktivitet. Fenylalanin er på grunn av sin mindre størrelse mindre aktivt enn tryptofan.
Eksempel 3
Peptidet Arg-(2-Nal)-Arg-Tyr-Arg-(2-Nal)NH2hvor (2-Nal) er 2-naftylalanin ble fremstilt og testet mot en rekke klinisk viktige patogene organismer som vist i tabell 6 nedenfor.
Peptidet ble syntetisert på et automatisk peptidsyntetiseringsapparat av typen 9050 Millipore under anvendelse av Fmoc-beskyttelse og aktivering med pentafluorfenyl-(Pfp)-estere eller in situ-aktivering med koplingsreagenset HATU (O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat). Når det gjaldt kopling med pentafluorfenylestere, ble 1-HOBt (1-hydroksybenzotriazol) tilsatt for katalysering av reaksjonen, og ved anvendelse av koplingsreagenset HATU ble reaksjonen basekatalyset med DIPEA (diisopropyletylamin). Alle aminosyrer med reaktive sidekjeder ble beskyttet med syrelabile beskyttelsesgrupper og spaltet ved behandling med TFA (trifluoreddiksyre)-holdige fjerningsmidler. (Se nedenfor for fjerningsmiddelblanding). På samme tid ble peptidet spaltet fra den faste bærer ved behandling med TFA-oppløsning.
A) Tilknytting av den første aminosyre til den faste bærer
Den faste bærer PAC-PEG-PS (peptidsyre - polyetylenglykol - polystyren-harpiks) (1 ekv) ble blandet sammen med Fmoc-(2-Nal)-OPfp (5 ekv) og DMAP (dimetylaminopyridin) (1 ekv) i et lite volum DMF (dimetylformamid) og fikk stå og svelle i 30 minutter. Oppløsningen ble så omrørt langsomt i 4% time. Ac20 (eddiksyreanhydrid) (2,5 ekv) og DMAP (0,1 ekv) ble deretter tilsatt til oppløsningen for acetylering av eventuelle gjenværende hydroksylgrupper på den faste bærer. Oppløsningen ble så omrørt i ytterligere 1 time. Den faste bærer med den C-terminale aminosyre tilknyttet ble isolert ved filtrering og vasket flere ganger på filteret med DMF. Den faste bærer ble deretter anvendt ved syntetiseringen av målpeptidet på det automatiske peptidsyntetiseringsapparat av typen 9050 Millipore.
B) Ninhydrintest/Kaisers test
Mindre enn 1 mg av peptid-harpiks-komplekset ble behandlet med små like volumer av en 5% ninhydrinoppløsning i etanol, en oppløsning av 80 g fenyl i 20 ml etanol og en oppløsning av tørket, destillert pyridin. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i to minutter ved 110°C og undersøkt under mikroskop. (I denne test viser en gul reaksjonsblanding vellykket acetylering, mens en blå oppløsning viser fremdeles frie aminogrupper).
C) Avspalting av syrelabile beskyttende grupper
Avspalting av syrelabile beskyttelsesgrupper og avspalting av peptidene fra den faste bærer ble oppnådd ved anvendelse av en blanding av 2% anisol, 2% etanditiol (EDT), 2% vann og 2% fenol i TFA, og med spaltingstider på ikke mer enn fire timer. Den faste bærer ble så fjernet ved filtrering og peptidet utfelt i dietyleter. Eteroppløsningen inneholdende TFA ble fjernet under anvendelse av pasteurpipette, og peptidet ble vasket flere ganger med dietyleter og tørket under høyvakuum.
D) Rensing
Peptidet ble renset ved hjelp av HPLC under anvendelse av en C18 reversert fase-kolonne (<*>) og en blanding av vann og acetonitril (begge tilsatt 0,1% TFA) som mobil fase. Valgt bølgelengde for påvisning av peptidfraksjoner var 254 nm. ;(<*>) PrePak®-patron 25 x 100 mm. DeltaPak™ C18 15 nm 100 A. (Waters Corporation).
E) Analyse
Peptidet ble analysert med henblikk på forurensninger på en analytisk HPLC C18 reversert fase-kolonne under anvendelse av en blanding av vann og acetonitril (begge tilsatt 0,1% TFA) som mobil fase. Peptidenes molekylvekt ble bestemt ved positivt ion-elektrospray-ioniserings-massespektrometri (VG Quattro Quadrupole).
Aminosvrederivater anvendt ved syntese valgt blant følgende
Fmoc-AlaPEG-PS (fast bærer)
Fmoc-Arg (Pbf)-OH
Fmoc-Arg (Pmc)-OH
Fmoc-Asn (Trt)-OPfp
Fmoc-Cys (Acm)-OPfp
Fmoc-Gln-OPfp
Fmoc-Glu (OtBu)-OPfp
Fmoc-Gly-OPfpFmoc-Tyr(tBu)-OPfp
Fmoc-(2-Nal)-OPfp
Aminosyrederivatene ble anskaffet enten fra Bachem, MilliGen/Biosearch (Avdeling av Millipore) eller fra PerSeptive Biosystems.
MRSA = Methicillin-resistent S. aureus
MRSE = Methicillin-resistent S. epidermidis
Eksempel 4
En ytterligere serie av peptider ble utformet og laget for å undersøke virkningen av voluminøse og lipofile grupper med forskjellige størrelser og deres relative stilling i molekylet.
Størstedelen av følgende peptider ble laget ut fra samme utgangsmateriale, ROBzl. Det ble utviklet en metode for fremstilling av ROBzl ut fra BocR ved følgende totrinnsmetode: Ut fra ROBzl-utgangsmaterialet ble peptidene laget ved anvendelse av standard-totrinnsprotokollen med amidbindingsdannelse og fjerning av beskyttende grupper fra den N-terminale ende.
For testing av den "super-voluminøse" gruppe, dvs. peptider med bare én meget stor voluminøs og lipofil gruppe, ble det fremstilt dipeptidmetylestere (XROMe). Som eksempel er syntetiseringen av TbtR OMe beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Analoge metoder ble anvendt ved fremstilling av de andre metylestere.
Den antibakterielle aktivitet hos de forskjellige peptider målt som MIC i ug/ml er vist i tabell 7 nedenfor.
Titerserie: 500, 300, 200, 150, 100, 50, 50, 37,5, 30, 25, 12,5, 5, 4, 2 og 1.
Ingen av disse peptider hadde målbar toksisitet overfor røde blodlegemer.
Eksempel 5
En ytterligere gruppe heksapeptider og tetrapeptider ble fremstilt på et fast-fase-multippelpeptidsyntetiseringsapparat MBS 396 som beskrevet i tidligere eksempler. Disse ble testet overfor E. coli og S. aureus, og deres minimale inhiberende konsentrasjoner (MIC) er oppført i tabell 8 nedenfor. Den første kolonne er verdien i ug/ml og den andre i^iM/ml. Alaninrester inngår som "mellomstykker" og for å undersøke virkningen av lengden på aktiviteten.
Disse data viser utmerket aktivitet, spesielt for de peptider som har den super-voluminøse Pmc-gruppe, overfor de grampositive bakterier. Dataene viser også at den faktiske sekvens ikke er meget signifikant. Noe som er overraskende og fordelaktig, er at de mindre peptider er mer aktive, cf. WBRR og WBRRAA.
Eksempel 6
Nedenfor er det beskrevet generelle metoder for peptidkopling, fjerning av beskyttende grupper og rensing som anvendt, eller egnet for anvendelse, til fremstilling av peptidene beskrevet i det foreliggende.
Peptidkopling Generell metode
Syntetisering
Det N-Boc-beskyttede aminosyrederivat (1,05 ekv) og C-terminale beskyttede
(enten som metylester, benzylester, bifenylmetylester eller beta-naftylamid)
aminosyrederivat (1,00 ekv) og 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) (1,2 ekv) ble tilsatt i reaksjonsbeholderen. Diisopropyletylamin (DIPEA) (2,4 ekv) og dimetylformamid (DMF) (5 ml/mmol N-Boc-beskyttet aminosyre) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt til alle komponenter var oppløst. 0-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HBTU) (1,2 ekv) ble tilsatt porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble ristet i 1 time.
Ekstrahering og opparbeiding
Reaksjonsblandingen fra en 1 mmol sats ble fortynnet med etylacetat (16 ml) og vasket to ganger med en blanding av 12 ml 5% citronsyre og 5 ml saltoppløsning. Den etterfølgende organiske fase ble vasket to ganger med en blanding av 6 ml mettet natriumbikarbonat og 2 ml saltoppløsning.
Spaltning av det N- Boc- beskvttede peptid
En egnet metode er beskrevet tidligere i disse eksempler.
Rensing og analysering av peptidene
Peptidene ble renset på en RP-HPLC C18-kolonne (Delta-Pak C18,100Å, 15H,m, 25 x 100 mm, Waters Corporation, Milford, MA, USA) under anvendelse av en blanding av vann og acetonitril (inneholdende 0,1% TFA) som mobil fase, og med anvendelse av UV-påvisning ved 254 nm. Alle peptider ble analysert med henblikk på forurensninger på en analytisk RP-HPLC C18-kolonne (Delta-Pak C18, 100Å, 5 nm, 3,9 x 150 mm, Waters Corporation) med en blanding av vann og acetonitril (inneholdende 0,1% TFA) som mobil fase. Renheten av alle peptider ble funnet å være over 96%. Peptidenes fullstendighet ble kontrollert ved hjelp av positivt ion-elektrospray-ioniserings-massespektrometri på et VG Quattro Quadrupole massespektrometer (VG Instruments Inc., Storbritannia).
Eksempel 7
Fremstilling av H- Arg- OBzl (etter M. Bodanszky og A. Bodanszky, "The practice of peptide synthesis" (1994), Springer Verlag, s. 30-31)
Vann (2 ml) ble tilsatt til en oppløsning av Boc-Arg-OH (2,5 mmol) i metanol (20 ml). Oppløsningen ble nøytralisert med en 20% oppløsning av CS2CO3i vann og deretter inndampet i vakuum til tørrhet. Restvann ble fjernet ved gjentatt tilsetting og inndamping avtoluen. Det faste cesiumsalt av Boc-arginin ble behandlet med DMF (25 ml) og benzylbromid (3 mmol) og omrørt ved romtemperatur i 6 timer. DMF ble fjernet i vakuum, og produktet ble oppløst i aceton og filtrert. Filtratet ble inndampet i vakuum, og produktt ble behandlet med 95% trifluoreddiksyre (TFA) (4 ml). Det resulterende produkt H-Arg-OBzl ble isolert ved findeling med dietyleter. Saltet av H-Arg-OBzl ble isolert ved behandling av produktet med para-toluensulfonsyre (5 mmol) i eter.
Fremstilling av H- Arg- OBip (etter M. Bodanszky og A. Bodanszky, "The practice of peptide synthesis" (1994), Springer Verlag, s. 30-31)
Vann (2 ml) ble tilsatt til en oppløsning av Boc-Arg-OH (2,5 mmol) i metanol (20 ml). Oppløsningen ble nøytralisert med en 20% oppløsning av CS2CO3i vann og deretter inndampet i vakuum til tørrhet. Restvann ble fjernet ved gjentatt tilsetting og inndamping avtoluen. Det faste cesiumsalt av Boc-arginin ble behandlet med DMF (25 ml), bifenylmetylklorid (3 mmol) og kaliumjodid (1 mmol) og omrørt ved romtemperatur i 6 timer. DMF ble fjernet i vakuum, og produktet ble oppløst i aceton og filtrert. Filtratet ble inndampet i vakuum, og produktet ble behandlet med 95% trifluoreddiksyre (TFA) (4 ml). Det resulterende produkt H-Arg-OBip ble isolert ved findeling med dietyleter. Saltet av H-Arg-OBip ble isolert ved behandling av produktet med para-toluensulfonsyre (5 mmol) i eter.
Eksempel 8
Følgende C-terminalt modifiserte dipeptider ble også laget og testet. For enkelhets skyld er deres kjemiske strukturer oppført nedenfor
Eksempel 9
Peptidmimetika basert på KWOBzl er blitt fremstilt og testet for å vise at en peptidstruktur ikke er nødvendig for aktivitet, under forutsetning av at de ønskede strukturmønstre er til stede.
Den første forbindelse ble anskaffet fra Neosystems i Frankrike. Den andre forbindelse ble fremstilt ut fra indoleddiksyre under anvendelse av standardteknikker (Cs-salt-mediert forestring av syren med benzylbromid) og kopling til diBoc-lysin under anvendelse av en standard-koplingsprotokoll.
Små bokstaver angir D-enantiomerer
Disse resultater viser at esterderivatene er minst like aktive som sine peptid-ekvivalenter, og illustrerer fordelene ved en karbonylgruppe.
Eksempel 10
Følgende difenyletylendiaminer tilgjengelige fra Aldrich-katalogen ble også testet, og alle hadde en MIC-verdi overfor S. aureus på 250 ug/ml.
Eksempel 11
Følgende molekyler bestående av en modifisert enkelt super-voluminøs aminosyre ble laget og testet med henblikk på sin antimikrobielle aktivitet.
Boc-Tbt-Dab-Z:
En blanding av Boc-Tbt-OH (0,7510 g, 1,6 mmol), N-Z-1,4-diaminobutan-monohydroklorid (0,4323 g, 1,7 mmol), HOBt (0,8715 g, 5,7 mmol), DIPEA (1,63 ml, 9,5 mmol) i 12 ml DMF/CH2CI2(1:1) omrøres i et is/vann-bad, og HBTU (0,7220 g, 1,9 mmol) tilsettes i små porsjoner i løpet av 10 minutter. Blandingen omrøres i ytterligere 30 minutter, kjølebadet fjernes og omrøring fortsettes i 2 timer og 30 minutter. Reaksjonsblandingen inndampes i vakuum. Den resulterende flytende olje oppløses i diklormetan og ekstraheres deretter med 3 x 5 ml mettet NaHC03, 2x5 ml 10% citronsyre, 10 ml vann og 5 ml mettet NaCI før den tørkes over MgS04og inndampes til en lysegul olje. Oljen findeles med vann og tørkes i vakuum. Rensing av råproduktet ved hjelp av hurtigkromatografi (6% MeOH-CHCI3) ga 0,96 g (89%) av tittelforbindelsen.
Boc-Tbt-Dae-Z og Boc-Tbt-Dah-Z ble fremstilt ved hjelp av samme metode som beskrevet for Boc-Tbt-Dab-Z. Råprodukter ble oppnådd i nesten kvantitativt utbytte, og rensing ved hjelp av hurtigkromatografi var ikke nødvendig.
Fjerning av den beskyttende Z-gruppe ble utført ved hydrogenering natten over (1 atm) over 10% Pd på trekull i metanol/vann (19:1). Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom Celite. Inndamping av løsningsmidlet i vakuum ga det frie amin som en gul olje. Den beskyttende Boc-gruppe ble fjernet ved behandling med reagens K. Diaminet som hadde fått fjernet beskyttende Boc-grupper, ble isolert som et hvitt faststoff ved behandling av det oljeaktige residuum etter inndamping av reaksjonsblandingen i vakuum med p-toluensulfonsyre i dietyleter. Råproduktene ble renset ved hjelp av RP-HPLC og lyofilisert til hvitt pulver.
Forkortinger:
Tbt: p-(2,5,7-tri-tert.-butylindol-3-yl)alanin
Dae: 1,2-diaminoetan
Dab: 1,4-diaminobutan
Dah: 1,6-diaminoheksan
Eksempel 12
Flere opprinnelige strukturer som utgjør kombinasjonen av en voluminøs lipofil gruppe og en polar rest, kan lett fås ut fra billig råmateriale så som cyklopentadien. To slike forbindelser er vist på fig. A, som allerede viser mangesidigheten hos det cyklopentanbaserte stillas. Faktisk fører en enkel forandring i tilsettingsrekkefølgen for de voluminøse eller de polare grupper til to forskjellige produkter 1 og 2.
Synteseveier! som følges for fremstillingen av forbindelse 1, og som er anvendbar for fremstillingen av 2, er vist på fig. B.
Cyklopentadien 3 ble omsatt med singlett-oksygen, dannet in situ ved fotolyse av oksygen i nærvær av Rose Bengal som fotosensibiliseringsmiddel, hvorved man fikk det tilsvarende endoperoksid. Dette peroksid ble ikke isolert, men redusert direkte av tiourea som var til stede i reaksjonsblandingen, til den ønskede cis-diol 4 i et totalt utbytte på 48%. Forestring av cis-diol 4 under anvendelse av et overskudd av bromacetylbromid i nærvær av pyridin og DMAP ga den ønskede diester 5 i 40% utbytte. Den påfølgende omdannelse av diester 5 til det avanserte mellomprodukt 6 ble lett utført ved nukleofil substitusjon under anvendelse av kalium-anionet av ftalimid. Alken 6 ble så dihydroksylert fra a-overflaten under klassiske osmiumkatalyserte betingelser, noe som førte til den ønskede diol 7 i praktisk talt kvantitativt utbytte. Omdannelsen av diol 7 til sluttproduktet 1 ble utført ved DCC-mediert kopling av 7 med indolkarboksylsyre fulgt av fjerning av den beskyttende ftalimidgruppe ved hjelp av hydrazinhydrat i varm etanol. Den omvendte sekvens ble fulgt for fremstilling av 2.
Denne mangesidige sekvens kan forandres til fremstilling av mange forskjellige analoger ved modifisering av tilsettingsrekkefølgende for de voluminøse og polare funksjoner, ved forandring av den relative stereokjemi for de fire hydroksylfunksjoner, ved substituering av cyklopentanskjelettet og ved forandring av størrelsen og beskaffenheten av de voluminøse og polare grupper. Denne strategi er illustrert ved en del strukturer vist på fig. 3, men dette er ikke på noen måte en utfyllende liste.
Forsøksmetoder 1,3-dihydroksy-4-cyklopenten-fremstilling
Til en oppløsning av tiourea (5,03 g; 0,68 ekv) og Rose Bengal (197 mg; 0,002 ekv) i destillert metanol (1,81) ble det tilsatt 8 ml nydestillert cyklopentadien (1 ekv) ved 0°C. Oksygen ble ledet gjennom oppløsningen. Etter 2 timer ble den bestrålt med en 450 W kvikksølvlampe, og strømmen av oksygen ble opprettholdt i 2 timer. Deretter ble oppløsningen holdt i mørke, og oksygenet ble avslått over natten. Blandingen ble konsentrert til 200 ml og filtrert gjennom trekull og Celite® flere ganger til den var fargeløs. Deretter ble den tørket på Na2S04, og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk uten oppvarming. Råproduktet ble renset ved hjelp av horisontal destillasjon (115°C, 10"<4>mbar) under oppnåelse av 3,525 g (36% utbytte) av et gult faststoff med lavt smeltepunkt.
NMR H<1>DMSO 300 MHz 8 i ppm (multiplisitet): 1,53 (dt); 2,82 (dt); 4,67 (d); 5,16 (s); 6,03 (s)
Dibrom-diester-fremstilling
Til en oppløsning av 7,05 g (1 ekv) diol og 46,62 g (3 ekv) bromeddiksyre-bromid i 250 ml diklormetan ble det tilsatt 17,04 ml (3 ekv) pyridin og 700 mg (0,08 ekv) DMAP ved 0°C. Oppløsningen fikk oppvarmes til romtemperatur og ble holdt under agitasjon over natten. Deretter ble det tilsatt 700 ml DCM, og den organiske fase ble vasket med 70 ml 3 M HCI, 140 ml av en mettet oppløsning av NaHC03og 140 ml vann. Den organiske fase ble tørket på Na2S04og filtrert, og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av hurtigkromatografi (AcOEt/EP 35:75) under oppnåelse av 9,76 g (40,6% utbytte) av en fargeløs væske.
NMR H<1>CDCI3300 MHz 8 i ppm (multiplisitet): 1,8 (dt); 2,89 (dt); 3,91 (s); 5,58 (dd); 6,13 (s)
Diftalimido-diester-fremstilling
En oppløsning av 1,311 g (1 ekv) av dibromforbindelsen og 1,78 g (2,5 ekv) kaliumftalamid i 30 ml DMSO ble holdt under tilbakeløp over natten. Blandingen ble fortynnet med 250 ml dietyleter og vasket 3 ganger med 150 ml saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket på Na2S04og filtrert, og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av hurtigkromatografi (AcOEt/EP 80:20), hvorved man fikk 1,24 g (68,8% utbytte) av et hvitt faststoff.
NMR H<1>CDCI3300 MHz 8 i ppm (multiplisitet): 1,85 (dt); 2,87 (dt); 4,42 (s); 5,61 (dd); 6,11 (s); 7,85 (m).

Claims (10)

1. Peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter minst tre lipofile grupper av minst 5 ikke-hydrogenatomer hvori én av peptidets eller peptidmimetikumets lipofile grupper innbefatter 6 eller flere ikke-hydrogenatomer og en andre lipofil gruppe innbefatter 10 eller flere ikke-hydrogenatomer og hvori minst én lipofil gruppe innbefatter en lukket ring av minst 6 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst én mer kationisk enn anionisk del, og hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe) og minst én av de lipofile gruppene er en aminosyresidekjede (R gruppe), for anvendelse i behandling av infeksjoner i mennesker eller dyr gjennom destabilisering av mikrobecellemembraner, eller for anvendelse som et anti-tumormiddel.
2. Ikke-terapeutisk ex vivo anvendelse som et membran-virkende antimikrobielt middel av et peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter minst tre lipofile grupper av minst 5 ikke-hydrogenatomer hvori én av peptidets eller peptidmimetikumets lipofile grupper innbefatter 6 eller flere ikke-hydrogenatomer og en andre lipofil gruppe innbefatter 10 eller flere ikke-hydrogenatomer, og hvori minst én lipofil gruppe innbefatter en lukket ring av minst 6 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst én mer kationisk enn anionisk del, og hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe) og minst en av de lipofile gruppene er en aminosyresidekjede (R gruppe).
3. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, hvori peptidet eller peptidmimetikumet har minst to flere kationiske enn anioniske deler.
4. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, hvori minst én av de lipofile grupper ikke er tilveiebrakt ved den umodifiserte R gruppen av én av de 20 genetisk kodede aminosyrene.
5. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, hvori peptidet eller peptidmimetikumet har to lipofile grupper som hver innbefatter en lukket ring av minst 6 ikke-hydogenatomer.
6. Peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter en lipofil gruppe som omfatter minst 13 ikke-hydrogenatomer og én eller flere lukkede ringer av 4 eller flere ikke-hydrogenatomer, hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe), og minst én av aminosyresidekjedene (R grupper) er en lipofil gruppe av minst 4 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst to flere kationiske enn anioniske deler, for anvendelse i behandling av mikrobielle infeksjoner i mennesker eller dyr gjennom destabilisering av mikrobecellemembraner, eller for anvendelse som et anti-tumormiddel.
7. Ikke-terapeutisk ex vivo anvendelse som et membran-virkende antimikrobielt middel av et peptid eller peptidmimetikum som består av 2-4 aminosyrer som omfatter en lipofil gruppe som omfatter minst 13 ikke-hydrogenatomer og en eller flere lukkede ringer av 4 eller flere ikke-hydrogenatomer, hvori minst én av aminosyrene har en kationisk sidekjede (R gruppe) og minst én av aminosyresidekjedene (R grupper) er en lipofil gruppe av minst 4 ikke-hydrogenatomer, hvori nevnte peptid eller peptidmimetikum har minst to flere kationiske enn anioniske deler.
8. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i krav 6 eller 7, hvori den lipofile gruppen innbefatter 2 lukkede ringer av 5 eller flere ikke-hydrogenatomer,
9. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori peptidet eller peptidmimetikumet er modifisert i C terminusen slik at det ikke lenger bærer en negativ ladning.
10. Peptid eller peptidmimetikum eller anvendelse som angitt i krav 9, hvori C terminusen er amidert eller forestret.
NO20024218A 2000-03-09 2002-09-04 Peptid eller peptidmimetukum og anvendelse derav NO334230B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0005703.4A GB0005703D0 (en) 2000-03-09 2000-03-09 Compounds
PCT/GB2001/001035 WO2001066147A2 (en) 2000-03-09 2001-03-09 Antimicrobial compounds and formulations

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20024218D0 NO20024218D0 (no) 2002-09-04
NO20024218L NO20024218L (no) 2002-11-05
NO334230B1 true NO334230B1 (no) 2014-01-13

Family

ID=9887297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20024218A NO334230B1 (no) 2000-03-09 2002-09-04 Peptid eller peptidmimetukum og anvendelse derav

Country Status (10)

Country Link
US (3) US7232803B2 (no)
EP (2) EP1263471B1 (no)
JP (3) JP2004514644A (no)
AT (1) ATE528017T1 (no)
AU (2) AU3761601A (no)
CA (1) CA2400410C (no)
DK (1) DK1263471T3 (no)
GB (1) GB0005703D0 (no)
NO (1) NO334230B1 (no)
WO (1) WO2001066147A2 (no)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8283315B2 (en) 1998-08-28 2012-10-09 Lytix Biopharma As Inhibition of tumour growth
GB0005703D0 (en) 2000-03-09 2000-05-03 Alpharma As Compounds
CA2412513A1 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 San Diego State University Foundation Modulators of recombination and methods for producing and using the same
NO20031818D0 (no) * 2003-04-23 2003-04-23 Uni I Tromsoe Fremgangsmåte av bioaktiv peptid forberedelse
EP3381515B1 (en) 2003-05-01 2020-07-08 Cornell Research Foundation, Inc. Carrier complexes for delivering molecules to cells
WO2005074968A2 (en) * 2004-02-10 2005-08-18 Universiteit Maastricht Medical use of basic peptides
US8536120B2 (en) * 2006-04-28 2013-09-17 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Ghrelin/growth hormone releasing peptide/growth hormone secretatogue receptor antagonists and uses thereof
AU2007272272B2 (en) * 2006-07-10 2012-04-12 Pba3 Biomed Gmbh Antimicrobial peptides
GB0724951D0 (en) 2007-12-20 2008-01-30 Lytix Biopharma As Compounds
GB0724953D0 (en) 2007-12-20 2008-01-30 Lytix Biopharma As Methods of peptide modification
US9139355B2 (en) * 2008-04-18 2015-09-22 Medline Industries, Inc. Glove packaging having antimicrobial barrier
EP2303914B1 (en) 2008-06-17 2018-04-11 Corden Pharma Brussels Peptide manufacturing process
GB0818074D0 (en) * 2008-10-02 2008-11-05 Lytix Biopharma As Treatment of biofilms
GB0821616D0 (en) 2008-11-26 2008-12-31 Lytix Biopharma As Compounds
US9724381B2 (en) 2009-05-12 2017-08-08 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Methods of inhibiting the ghrelin/growth hormone secretatogue receptor pathway and uses thereof
US9969617B2 (en) * 2009-07-21 2018-05-15 Udo Bogner Material system containing endoperoxide with adaption of decomposition, and applications
WO2012072088A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Bionor Immuno As Peptide scaffold design
CA2821995C (en) 2011-01-06 2019-02-12 Bionor Immuno As Monomeric and multimeric peptides immunogenic against hiv
US9320698B2 (en) * 2011-05-11 2016-04-26 Escape Therapeutics, Inc. Peptide tyrosinase inhibitors and uses thereof
EP2802593A1 (en) * 2012-01-09 2014-11-19 The University of Tromsoe Therapeutic boron-containing compounds
WO2013157871A1 (ko) * 2012-04-18 2013-10-24 대한민국(관리부서:농촌진흥청장) 다이펩타이드 유도체를 활성 성분으로 함유하는 농업용 작물 보호제
CA2874923C (en) 2012-06-06 2021-08-31 Bionor Immuno As Peptides derived from viral proteins for use as immunogens and dosage reactants
TWI577697B (zh) * 2013-11-28 2017-04-11 國立清華大學 耐高鹽及抗蛋白之抗菌胜肽及其製造方法
JP6516758B2 (ja) * 2014-01-22 2019-05-22 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 抗菌ペプチド模倣物
EP3497965B1 (en) 2016-08-11 2022-04-13 Kyocera Corporation Ran-assisted rate adaptation
WO2018160791A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Massachusetts Institute Of Technology Antimicrobial constructs and uses thereof
CN110938112A (zh) * 2019-12-10 2020-03-31 倪京满 脂肪酸修饰的超短序列抗菌肽类似物及其应用
CN110950932B (zh) * 2020-01-09 2023-04-18 福州大学 一种修饰肽的制备及其应用
EP4103587A1 (en) 2020-02-14 2022-12-21 Immunor AS Corona virus vaccine
CN113248572B (zh) * 2021-04-30 2023-04-11 重庆理工大学 一种抗多重耐药菌环肽及其应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5668254A (en) * 1990-05-11 1997-09-16 Romano Deghenghi D-2-alkyl-tryptophan and peptides containing same
JP3009718B2 (ja) * 1990-10-01 2000-02-14 日本合成化学工業株式会社 新規ペプチド、その製造法及び用途
EP0503939B1 (en) * 1991-03-13 1997-06-18 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Antimicrobial peptide and antimicrobial agent
JP2771068B2 (ja) * 1991-03-13 1998-07-02 森永乳業株式会社 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤
JP3173857B2 (ja) * 1991-04-24 2001-06-04 森永乳業株式会社 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤
DK0510912T3 (da) * 1991-04-24 1998-02-09 Morinaga Milk Industry Co Ltd Antimikrobielt peptid og antimikrobielt middel
JP3173858B2 (ja) * 1991-04-24 2001-06-04 森永乳業株式会社 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤
US5547939A (en) * 1991-06-14 1996-08-20 The Regents Of The University Of California Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use
US5885782A (en) * 1994-09-13 1999-03-23 Nce Pharmaceuticals, Inc. Synthetic antibiotics
US6127339A (en) * 1995-06-21 2000-10-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Peptide for binding thereto a low density lipoprotein
IL117223A0 (en) 1996-02-22 1996-06-18 Yeda Res & Dev Antipathogenic polypeptides and compositions comprising them
IL118003A0 (en) * 1996-04-23 1996-08-04 Yeda Res & Dev Novel vip fragments and pharmaceutical compositions comprising them
US5948889A (en) 1996-05-21 1999-09-07 Case Western Reserve University Compositions and methods for screening antimicrobials
DE19818802A1 (de) * 1998-04-27 1999-10-28 Dresden Arzneimittel Stabile Mitoxantron-Lösungen
KR20010043695A (ko) * 1998-05-18 2001-05-25 로렌스 티. 마이젠헬더 아르기닌 유도체를 사용한 옥사졸리디논 항균제 활성의증진 방법
GB9818938D0 (en) * 1998-08-28 1998-10-21 Alpharma As Bioactive peptides
GB0005702D0 (en) 2000-03-09 2000-05-03 Alpharma As Method
GB0005703D0 (en) * 2000-03-09 2000-05-03 Alpharma As Compounds
US20030059827A1 (en) * 2001-03-13 2003-03-27 Cayetano Gonzalez Engineered protein binding domains and methods and systems for their design and use
US7291698B2 (en) * 2001-09-04 2007-11-06 Stephen Eliot Zweig Synthetic substrate for high specificity enzymatic assays

Also Published As

Publication number Publication date
US20030195144A1 (en) 2003-10-16
AU2001237616B2 (en) 2005-08-11
JP2012229254A (ja) 2012-11-22
JP5554810B2 (ja) 2014-07-23
US9115169B2 (en) 2015-08-25
CA2400410A1 (en) 2001-09-13
US20120108520A1 (en) 2012-05-03
EP1263471B1 (en) 2011-10-12
JP5747100B2 (ja) 2015-07-08
JP2004514644A (ja) 2004-05-20
US8048852B2 (en) 2011-11-01
US7232803B2 (en) 2007-06-19
WO2001066147A3 (en) 2002-04-11
CA2400410C (en) 2013-06-11
US20100267621A1 (en) 2010-10-21
EP1263471A2 (en) 2002-12-11
ATE528017T1 (de) 2011-10-15
NO20024218D0 (no) 2002-09-04
DK1263471T3 (da) 2012-02-06
AU3761601A (en) 2001-09-17
NO20024218L (no) 2002-11-05
JP2014196302A (ja) 2014-10-16
GB0005703D0 (en) 2000-05-03
WO2001066147A2 (en) 2001-09-13
EP2338522A1 (en) 2011-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5747100B2 (ja) 抗菌化合物および処方物
AU2001237616A1 (en) Antimicrobial compounds and formulations
US6890902B2 (en) Cytotoxic modified lactoferrin peptides
AU781243B2 (en) Methods of peptide preparation
US9109048B2 (en) Inhibition of tumor growth
US20200071357A1 (en) Antimicrobial peptides
WO2004094462A2 (en) Methods of peptide preparation

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees