JP5502373B2 - 平滑筋細胞の増殖抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、平滑筋細胞の増殖抑制材料に関し、特に平滑筋細胞の増殖が問題となる医療器具等に用いることができる平滑筋細胞の増殖抑制材料に関する。

医療の発達と共に、血管内に留置するステントや、埋め込み式の人工心臓等の生体内で使用する医療器具の使用が増加している。しかし、医療器具を生体内に埋め込むと、生体が異物として認識するため、血栓形成をはじめとする種々の生体反応が惹起されるという問題がある。

例えば、医療器具に生じる血栓形成を低減する方法を考えた場合、ヘパリン又はウロキナーゼ等の抗血栓性薬剤により医療器具をコーティングする方法が知られている。しかし、薬剤のコーティングは剥がれやすく効果が持続しないという問題がある。また、薬剤による副作用の問題も知られている。

そこで、薬剤にたよるのではなく、医療器具自体を抗血栓性の材料により形成したり、医療器具の表面に抗血栓性に優れた強固な皮膜を形成したりする方法が検討されている。中でも、ダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）膜により医療器具を覆う方法は、耐久性に優れているため特に注目されている。

さらに、ＤＣＬ膜の抗血栓性を向上させるために、ＤＬＣ膜の表面に親水性の官能基を導入したり、抗血栓性の薬剤を固定したりすることも検討されている（例えば、特許文献１を参照。）。

特開２００７−１９５８８３号公報

しかしながら、短時間の使用が前提である透析器及び人工心肺等においては血栓形成の防止の観点から材料の設計をすれば十分であるが、ステント及び人工血管等の埋め込み医療器具を目指す場合には、血液適合性だけでなく組織適合性をも考慮する必要がある。例えば、血管内留置ステントを考えた場合、血管を構成する平滑筋細胞とＤＬＣ膜等の材料との相互作用を調べることは重要である。ＤＬＣ膜を医療器具の材料として考えた場合、抗血栓性についてはこれまで検討されているが、平滑筋細胞等の組織細胞との相互作用についてはほとんど検討されていない。

平滑筋細胞は血管の収縮及び弛緩を制御する細胞である。平滑筋細胞は何らかの刺激を受けると増殖する性質を有していることが知られている。血管内にステント等を留置した場合に、平滑筋細胞が刺激を受けると平滑筋細胞が異常に増殖し、血管が狭窄してしまう。このため、血管内に留置する医療器具は平滑筋細胞に刺激を与えにくく、平滑筋細胞の増殖を抑制する機能を有している必要がある。また、内皮細胞に速やかに覆われる特性を有していれば、血栓形成のリスクを大幅に低減することができる。

本発明は、本願発明者らによって得られた平滑筋細胞の増殖とＤＬＣ膜の表面状態との相間に基づいてなされたものであり、医療器具等に適した平滑筋細胞の増殖を抑制する材料を実現できるようにすることを目的とする。

前記の目的を達成するため、本発明は平滑筋細胞の増殖抑制材料を、カルボキシル基導入量が少ないダイヤモンド様炭素膜とする。

具体的に、本発明に係る平滑筋細胞の増殖抑制材料は、基材の表面に形成されたダイヤモンド様炭素膜と、ダイヤモンド様炭素膜の表面に導入されたカルボキシル基とを備え、カルボキシル基の導入率は、３．５％以下であることを特徴とする。

本発明の平滑筋細胞の増殖抑制材料は、カルボキシル基の導入率（ＣＯＯ／Ｃ）が３．５％以下のダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）膜を備えている。平滑筋細胞の増殖率は、ＤＬＣ膜表面のカルボキシル基の量が少ないほど低くなる。ＣＯＯ／Ｃが３．５％以下の場合には、通常の細胞培養プレートよりも増殖率が低くなる。従って、平滑筋細胞の増殖率が抑制された生体適合性に優れた材料となる。

本発明の平滑筋細胞の増殖抑制材料は、ダイヤモンド様炭素膜の表面に導入されたアミノ基をさらに備えていてもよい。アミノ基の導入率は平滑筋細胞の増殖率には影響しないが、内皮細胞の増殖率を向上させることができる。

本発明に係るステントは、本発明の平滑筋細胞の増殖抑制材料を備えていることを特徴とする。

本発明に係る平滑筋細胞の増殖抑制材料によれば、医療器具等に適した平滑筋細胞の増殖を抑制する材料を実現できる。

カルボキシル基導入率と、平滑筋細胞の増殖率との関係を示すグラフである。 窒素導入率と、平滑筋細胞の増殖率との関係を示すグラフである。

（一実施例）
本発明の一実施例に係る平滑筋細胞の増殖抑制材料は、ダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）膜等の炭素質膜であり、カルボキシル基を有している。以下に、その構成及び製造方法について詳細に説明する。

−炭素質膜の形成−
基材の表面にダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）膜を形成した。細胞培養の際には基材として直径１５ｍｍのカバーガラスを用いた。ＤＬＣ膜は化学気相堆積（ＣＶＤ）法を用いて形成した。具体的には、基材を載置したチャンバ内にＣ₂Ｈ₂を流量が１５０ｓｃｃｍ（ｃｍ³／分、但し１気圧、０℃）で、圧力が３Ｐａ（２２ｍＴｏｒｒ）となるように導入し、ＲＦ電極に１００Ｗの高周波電力を印加した。これにより、カルボキシル基導入率が０％で膜厚が０．１３μｍのＤＬＣ膜を得た。なお、ＤＬＣ膜とは、ｓｐ²炭素−炭素結合（グラファイト結合）及びｓｐ³炭素−炭素結合（ダイヤモンド結合）を含むアモルファス膜である。

ＤＬＣ膜の形成には他の方法を用いてもよい。例えば、スパッタ法、ＤＣマグネトロンスパッタ法、ＲＦマグネトロンスパッタ法、プラズマイオン注入法、重畳型ＲＦプラズマイオン注入法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、イオンビーム蒸着法又はレーザーアブレーション法等を用いることができる。

また、基材とＤＬＣ膜との間にアモルファスシリコン等からなる中間層を形成してもよい。また、ＤＬＣ膜の膜厚は、特に限定されるものではないが、０．００５μｍ〜３μｍの範囲が好ましく、より好ましくは０．０１μｍ〜１μｍの範囲である。

−カルボキシル基導入率の調整−
得られたＤＬＣ膜にプラズマを照射することにより、官能基導入率が異なるＤＬＣ膜を形成した。プラズマ照射は平行平板型のプラズマ照射装置により行った。ターボ分子ポンプを使用し、高真空条件下でプラズマ処理を行える装置と、ロータリーポンプのみを使用し、低真空条件下でプラズマ処理を行える装置とを用いた。プラズマ照射装置のチャンバ内にＤＬＣ膜を形成した基材をセットした後、チャンバ内の圧力を１×１０^-3Ｐａ以下又は２Ｐａ以下まで排気する。次に、チャンバ内にガスを所定の流量で導入し、平行平板電極の間に高周波電力を印加することによりプラズマを発生させた。高周波電力は、高真空条件の場合には１００Ｗとし、低真空条件の場合には３０Ｗとした。ガス流量の調整はマスフローコントローラにより行い、プラズマ照射時のチャンバ内圧力は高真空条件の場合には１Ｐａとし、低真空条件の場合には１３０Ｐａとした。高周波電力は、マッチングボックスを介して接続された高周波電源を用いて印加した。プラズマの生成に用いたガスは、アルゴン（Ａｒ）、アセチレン（Ｃ₂Ｈ₂）、アンモニア（ＮＨ₃）及び酸素（Ｏ₂）である。これにより、カルボキシル基導入率が１．５％〜３．９％までの９種類のサンプルを形成した。

−官能基導入率の測定−
ＤＬＣ膜の表面におけるカルボキシル基の導入率及び窒素の導入率はＸ線光電子分光（ＸＰＳ）測定により評価した。ＸＰＳ測定には、日本電子株式会社製の光電子分光装置ＪＰＳ−９０１０ＭＣを用いた。Ｘ線源にはアルミニウムＫα線を用い、加速電圧が１２．５ｋＶで、エミッション電流が１０ｍＡの条件でＸ線を発生させた。試料中から任意に選択した直径５ｍｍのエリアについて測定を行った。また、Ｘ線を試料に対して４５度の角度で入射させ、検出角度を試料面に対して９０度とすることにより、５ｎｍ程度の深さまでの組成を測定した。

結合エネルギーの測定領域は、２７４ｅＶ〜２９４ｅＶ、３８９ｅＶ〜４０９ｅＶ及び５２２ｅＶ〜５４２ｅＶとし、それぞれ炭素１ｓ（Ｃ１ｓ）、窒素１ｓ（Ｎ１ｓ）及び酸素１ｓ（Ｏ１ｓ）のピークを得た。Ｃ１ｓのナローピークをピークフィッティングすることにより全炭素に対するカルボキシル基量（ＣＯＯ／Ｃ）を求めた。また、Ｎ１ｓピークの面積とＮ１ｓピーク、Ｃ１ｓピーク及びＯ１ｓピークの面積の和との比率から窒素の導入量（Ｎ／Ｃ＋Ｎ＋Ｏ）を求めた。

−平滑筋細胞の増殖性の測定−
細胞の増殖率は次の様にして求めた。ＣＯＯ／Ｃの値が異なる種々のＤＬＣ膜がコートされた直径１５ｍｍのカバーグラスを７０％エタノールにより滅菌した後、２４穴の細胞培養用マルチプレート（Costar 3516、コーニング社）の底に置き、超純水により３回洗浄した。カバーグラスの表面に人冠動脈由来の平滑筋細胞（Cell Applications社：ＨＣＡＳＭＣ）を１×１０⁴cell/well（５００μＬ）の密度で播種した。播種の後、温度を３７℃とし、５％炭酸ガス雰囲気で４日間継続して培養を行った。培地には、Cell Applications社より販売されている各細胞専用の培地を使用し、培地交換は毎日行った。４日間培養した後の細胞増殖率をCell-Counting-Kit8（同仁化学製）を用いて求めた。測定法はキットに添付のマニュアルに従い行った。各ＤＬＣ膜における増殖率の比較は、増殖した細胞数に対応する細胞内のミトコンドリアの活性により生じるWST-8 frmazanの濃度（吸光度）をマイクロプレートリーダーを用いて求め、市販の細胞培養プレート（ＴＣＰ）上で培養を行った場合の吸光度を１００％とし、これに対する各サンプルの％増殖率を算出すことにより増殖性を比較検討した。

−平滑筋細胞の増殖性の評価−
図１は、ＣＯＯ／Ｃの値と平滑筋細胞の増殖率との関係を示している。図１に示すようにＣＯＯ／Ｃの値が大きくなると増殖率の値が大きくなった。ＣＯＯ／Ｃの値が３．５％以下の場合には、平滑筋細胞の増殖率が１００％未満となったが、ＣＯＯ／Ｃの値が３．５％を越えると平滑筋細胞の増殖率が１００％を越え、ＴＣＰよりも平滑筋細胞が増殖しやすくなった。ＴＣＰは優れた細胞増殖性を示すように処理がなされているが、カルボキシル基導入率が低いＤＬＣ膜は、ＴＣＰよりも優れた平滑筋細胞の増殖抑制材料となることが示された。

平滑筋細胞の増殖性は、カルボキシル基を含まない場合に最も小さくなると推測される。しかし、カルボキシル基を含まない未処理のＤＬＣ膜の場合、内皮細胞の増殖性も低くなってしまう。このため、平滑筋細胞の増殖性を抑え且つ内皮細胞の増殖性を高く保つためには、カルボキシル基が導入されたＤＬＣ膜であることが必要である。

図２は、窒素含有率（Ｎ／Ｃ＋Ｎ＋Ｏ）に対して平滑筋細胞の増殖率をプロットしている。窒素含有率の値と平滑筋細胞の増殖率との間にはほとんど相間が認められなかった。窒素含有量の値と平滑筋細胞の増殖率との間には相関が認められなかったが、内皮細胞の増殖率はＤＬＣ膜の表面に導入されたアミノ基の量によって変化することが知られている。従って、アンモニアプラズマを照射してカルボキシル基とアミノ基を含むＤＬＣ膜を形成すれば、平滑筋細胞の増殖抑制できると共に、内皮細胞の増殖を促進できる材料とすることが可能となる。

また、アミノ基を導入する場合にはアンモニアに代えて他の塩基性窒素含有化合物を用いることも可能である。塩基性窒素含有化合物としては、一般式がＮＲ₁Ｒ₂Ｒ₃により示される有機アミン類（但し、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅、−Ｃ₃Ｈ₇又は−Ｃ₄Ｈ₈であり、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は互いに同一であっても、異なっていてもよい。）又はベンジルアミン及びその２級、３級アミン等が挙げられる。但し、アンモニアがコスト、取り扱いの容易さから好ましい。

基材は、どのような材質であってもよい。具体的には、特に限定されるものではないが例えば、鉄、ニッケル、クロム、銅、チタン、白金、タングステン又はタンタル等の金属を基材として用いることができる。また、これらの合金である、ＳＵＳ３１６Ｌ等のステンレス鋼、Ｔｉ−Ｎｉ合金若しくはＣｕ−Ａｌ−Ｍｎ合金等の形状記憶合金、Ｃｕ−Ｚｎ合金、Ｎｉ−Ａｌ合金、チタン合金、タンタル合金、プラチナ合金又はタングステン合金等の合金を用いることもできる。また、アルミニウム、シリコン若しくはジルコン等の酸化物、窒化物若しくは炭化物等の生体不活性なセラミックス又はアパタイト若しくは生体ガラス等の生体活性を有するセラミックスでもよい。さらに、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、高密度ポリエチレン、ポリアセタール、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル、ポリカーボネート樹脂若しくはポリスルホン等の高分子樹脂又はポリジメチルシロキサン等のシリコンポリマー若しくはポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系ポリマー等であってもよい。

また、形状もどのような形状であってもよく、医療器具等の状態に成形されたものであっても、板材、棒材又は線材等の成形前の材料の状態であってもよい。特に、平滑筋細胞の増殖抑制材料によりステント等の血管内に留置する医療器具の表面を被覆すれば、再狭窄が生じにくい医療器具を実現することが可能となる。

本発明に係る平滑筋細胞の増殖抑制材料は、平滑筋細胞の増殖を抑制する材料を実現でき、平滑筋細胞の増殖が問題となる医療器具等に用いることができる平滑筋細胞の増殖抑制材料等として有用である。

Claims (1)

1. 表面にカルボキシル基が導入され、且つ前記カルボキシル基の全炭素に対する導入率が３．５％以下であるダイヤモンド様炭素膜を用いる、人体内を除く平滑筋細胞の増殖抑制方法。

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