JP5495790B2 - 三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で2006年12月21日に出願された米国仮特許出願第60/871,366号ならびに「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で2007年3月27日に出願された米国仮特許出願第60/908,307号(いずれも参照によりその全体が本明細書に援用されるものとする)に基づく優先権を主張する。本出願はまた、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称の米国特許出願第11/961,601号(その全体が参照により本明細書に援用されるものとする)に基づく優先権を主張するものでありかつその継続出願である。
本発明は、一般的には、干渉顕微鏡観察、たとえば、光活性蛍光タンパク質分子から光を内部放射するサンプルのように、空間分解可能な点光源で構成されたもしくは標識されたサンプルの干渉顕微鏡観察、および/または第3の次元(たとえばz座標)で位置情報を決定すると同時に2つの他の次元(たとえばx座標およびy座標)で位置情報を測定するために位相差が測定される干渉顕微鏡観察に関する。
一実施形態では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第1の次元と第1の次元に実質的に直交する第2の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。画像の各画像は、光源からの第1の方向の発光と、光源からの第1の方向とは異なる第2の方向の発光と、の干渉に基づく。プロセッサーは、画像に基づいて第3の次元で位置を計算するように構成される。第3の次元は、第1の次元と第2の次元とに実質的に直交する。
広義には、本明細書に記載の1つ以上の実施形態により、公知の光学顕微鏡観察よりも良好な解像度を有する三次元レンダリングを生成することが可能である。いくつかの実施形態では、干渉顕微鏡で位相差を測定することにより、第3の次元(たとえばz座標)で位置情報を決定すると同時に2つの他の次元(たとえばx座標およびy座標)で位置情報を測定することが可能である。いくつかの実施形態では、一群の点光源を含有するサンプル、たとえば、光活性蛍光標識から光を内部放射するサンプルを干渉顕微鏡で測定することが可能である。
E1=A×exp(−ikδ+ikL1+ikL2+iπ/2)、
式中、k=2π/λ。
E2=A×exp(ikδ+ikL1+ikL2)。
E12=1/20.5×(E1±E2)=
1/20.5×(A×exp(−ikδ+ikL1+ikL2+iπ/2)±A×exp(ikδ+ikL1+ikL2))。
I1=1/2×(E1+E2)2=A2×(1+sin(2kδ))。
I2=1/20.5×(E1−E2)2=A2×(1+sin(2kδ+π))。
(I1−I2)/(I1+I2)=sin(4πδ/λ)またはδ=λarcsin((I1−I2)/(I1+I2))/4π
Iij=Gj×(AUi 2+ALi 2+2×βj×AUi×ALi×cos(φi+φj)+Ofsj)
式中、j=0、1、2、…は、多位相干渉計のレッグを表す、
Ij=点光源のjレッグの強度、オフセット補正なし、
βj=j番目のレッグの干渉補正係数、
Gj=j番目のレッグのゲイン、
Ofsj=j番目のレッグのオフセット、
AUi=i番目の点光源の振幅、上側対物レンズ、
ALi=i番目の点光源の振幅、下側対物レンズ、
φj=j番目のレッグの位相シフト、および
φi=点光源(すなわち蛍光分子)の位相。
Ioj=Gj×Ofsj
Iij=Gj×(AUi 2+ALi 2+2×βj×AUi×ALi×cos(φi+φj)+Ofsj) 全振幅:ATi 2=AUi 2+ALi 2
Xi=2×AUi×ALi/ATi 2
Iij=Ioj+Gj×ATi 2(1+βj×Xi×cos(φi+φj))
Ifj(z)=Ioj+Gj×If(1+βj×Xf×cos(φj(z)+φj))。
If=1かつXf=1かつαi=ATi 2/If
Iij=Ioj+Gj×ATi 2(1+βj×Xi×cos(φi+φj))
Dij=(Iij−Ioj)/(Gj×If) 再スケール調整された強度データ
Dij=αi×(1+βj×Xi×cos(φi+φj))
Dij=αi×(1+βj×Xi×cos(φi(z)+φj))
を用いて軸方向に沿った発光体の位置を決定することが可能である。したがって、i番目の分子の強度に関する3つ以上のデータ値Di0、Di1、Di2、…から、3つの未知の値:αi、Xi、および(最も興味深い)φi(z)を決定するための3つ以上の式が得られる。3つの位相だけが存在する場合、3つの式からこれらの3つの未知量の一意解が得られるであろう。この値、特にφiの値は、たとえば、ニュートン法により解くことが可能である。
χi=Σj[Dij−αi(1+βjcos(φi+φj))]2
tan(φi)≒−ΣjDijsin(φj)/ΣjDijcos(φj)
δi≒λ×φi/(4πn)=λ/(4πn)×atan(ΣjDijsin(φj)/ΣjDijcos(φj))
φi≒4πδ/(nλ)+atan(δ/zR)。
[CA1(z)−PA1]2+[CA2(z)−PA2]2+[CA3(z)−PA3]2+...+[CAN(z)−PAN]2
式中、N=システム中のディテクターの数であり、
CAi(z)=z平面内の特定のサンプル位置に対して校正時に決定されたディテクターiにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅であり、
PAi=現在のPALM画像フレームから決定されたディテクターiにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅である。
δ=2π(Δinner−Δouter)/λ=Δz×(1−cos(θ))×2πn/(λ)。
Δz=δλ/(n(1−cos(θ))。
Claims (12)
- サンプルにおいてスイッチャブル光源を活性化させるよう構成された活性化源と、
活性化された前記スイッチャブル光源から光エネルギーが複数の方向に放出されるように、活性化された前記スイッチャブル光源を励起化するよう構成された励起化源と、
ビームスプリッターデバイスおよび少なくとも3つのディテクターを有する光学システムであって、
前記ビームスプリッターデバイスは、第1の位相を有する、前記光源からの前記第1の方向の発光と、第2の位相を有する、前記光源からの第2の方向の発光とを干渉させて、少なくとも3本の出力ビームを生成し、前記第1の方向は前記第2の方向と異なり、
前記光学システムは、前記干渉に基づいて、第1の次元および第1の次元に実質的に直交する第2の次元で、前記光源の複数の画像を生成するように構成され、
前記少なくとも3つのディテクターは、ある時間点で前記複数の画像の画像に一意的に関連付けられた、前記少なくとも3つのディテクターの各ディテクターによって、前記少なくとも3本の出力ビームを検出するよう構成された、
光学システムと、
前記複数の画像に基づいて第3の次元で前記光源の位置を計算するように構成されたプロセッサーであって、前記第3の次元は、前記第1の次元および前記第2の次元に実質的に直交するプロセッサーと、
を含み、
前記プロセッサーが、前記光源に対応する少なくとも2つの画像の一部分間の振幅差に基づいて前記第3の次元で位置を計算するように構成される、
装置。 - 前記複数の画像が第1の画像および第2の画像を含み、前記第1の画像が、前記光源からの前記第1の方向の発光の第1の部分および前記光源からの前記第2の方向の発光の第1の部分に関連付けられ、前記第2の画像が、前記光源からの前記第1の方向の発光の第2の部分および前記光源からの前記第2の方向の発光の第2の部分に関連付けられ、
前記第1の方向の発光の前記第1の部分が、前記第1の方向の発光の前記第2の部分とは異なり、前記第2の方向の発光の前記第1の部分が、前記第2の方向の発光の前記第2の部分とは異なる、請求項1に記載の装置。 - 前記光学システムが、前記少なくとも3つのディテクターの第1のディテクターに対して前記第1の方向の発光の前記第1の部分および前記第2の方向の発光の前記第2の部分をアライメントするように構成され、かつ
前記光学システムが、前記少なくとも3つのディテクターの第2のディテクターに対して前記第1の方向の発光の前記第2の部分および前記第2の方向の発光の前記第1の部分をアライメントするように構成される、請求項2に記載の装置。 - 前記光学システムが、ビームスプリッターを含み、かつ前記複数の画像を生成するように構成され、前記複数の画像の各画像は、前記ビームスプリッターにおける前記第1の方向の発光の位相と、前記第1の方向の発光の前記位相に依存しない、前記ビームスプリッターにおける前記第2の方向の発光の位相と、に基づくものとする、請求項1に記載の装置。
- 前記光学システムが、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第1の光路を画定するように構成された第1の光学素子と、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第2の光路を画定するように構成された第2の光学素子と、
前記ビームスプリッターデバイスの少なくとも3本の出力ビームから光エネルギーを検出するように構成された少なくとも2つの光ディテクターと、
を含む、請求項1に記載の装置。 - 前記光学システムが、前記光源と前記少なくとも2つの光ディテクターとの間の光路に沿って配設された少なくとも1つの分光フィルターを含み、前記少なくとも1つの分光フィルターが、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルターである、請求項1に記載の装置。
- 前記光学システムが、
前記ビームスプリッターデバイス、前記第1の光学素子、前記第2の光学素子、または少なくとも2つの光ディテクターのうちの少なくとも1つに結合された多軸ポジショナー、
を含む、請求項1に記載の装置。 - 前記少なくとも3つのディテクターが第1のディテクターのセットであり、前記複数の画像が第1の複数の画像であり、前記光源が、ある波長を有する第1の光源であり、
前記光学システムが、少なくとも3つのディテクターを含む第2のディテクターのセットと複数のダイクロイックフィルターとをさらに含み、前記第2のディテクターのセットが、前記第1の光源の波長と異なる波長を有する第2の複数の画像を生成するよう構成され、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、前記第1の複数のディテクターのディテクターおよび前記第2の複数のディテクターのディテクターに一意的に関連付けられ、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、第1の光源からの発光と第2の光源からの発光とを分離するように構成される、請求項1に記載の装置。 - 前記プロセッサーは、前記光学システムにより画定される回折限界未満の確度まで前記光源の位置を計算する、請求項1に記載の装置。
- サンプルにおいてスイッチャブル光源を活性化することと、
活性化された前記スイッチャブル光源から光エネルギーが複数の方向に放出されるように、活性化された前記スイッチャブル光源を励起化することと、
前記ビームスプリッターデバイスは、第1の位相を有する、前記光源からの前記第1の方向の発光と、第2の位相を有する、前記光源からの第2の方向の発光とを干渉させて、少なくとも3本の出力ビームを生成することであって、前記第1の方向は前記第2の方向と異なる、生成することと、
前記干渉に基づいて、第1の次元および第1の次元に実質的に直交する第2の次元で、前記光源の複数の画像を少なくとも3つの検出位置で生成することと、
ある時間点で前記複数の画像からの画像を検出位置に一意的に関連付けることと、
前記複数の画像に基づいて第3の次元で前記光源の位置を計算することであって、前記第3の次元は、前記第1の次元および前記第2の次元に実質的に直交することと
を含み、
前記光源の位置を計算することは、前記光源に対応する少なくとも2つの画像の一部分間の振幅差に基づいて前記第3の次元で位置を計算する、方法。 - 第1の方向の前記発光の第1の部分および第2の方向の前記発光の第2の部分を、第1の検出位置に対してアライメントすることと、
第1の方向の前記発光の第2の部分および第2の方向の前記発光の第1の部分を、第2の検出位置に対してアライメントすることと
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 前記光源と前記干渉との間に第1の光路を画定することと、
前記光源と前記干渉との間に第2の光路を画定することと、
前記少なくとも3本の出力ビームから光エネルギーを検出することと
をさらに含む、請求項10に記載の方法。
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