JP5467320B2 - 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発 - Google Patents
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Description
(項目1)
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
(項目2)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目1に記載の一枚膜リポソーム。
(項目3)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目1に記載の一枚膜リポソーム。
(項目4)
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
(項目5)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目4に記載のライブラリー。
(項目6)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目4に記載のライブラリー。
(項目7)
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
(項目8)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目7に記載の一枚膜リポソーム。
(項目9)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目7に記載の一枚膜リポソーム。
(項目10)
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
(項目11)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目10に記載のライブラリー。
(項目12)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目10に記載のライブラリー。
(項目13)
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
(項目14)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目13に記載の方法。
(項目16)
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
(項目17)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、項目16に記載の方法。
(項目19)
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)項目4に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるDNAを増幅する工程;および、
(iv)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
(項目20)
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)項目10に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるRNAに逆転写酵素を作用させて、DNAを生成する工程;
(iv)該生成したDNAを増幅する工程;および、
(v)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
本明細書において使用する場合、用語「微小区画」とは、脂質層、および、その内部の水層から構成される閉じられた微小な空間をいう。「微小区画」としては、例えば、リポソームが挙げられるがこれに限定されない。
本発明において使用する一枚膜リポソームは、実施例に記載する遠心沈降法を用いて調製することができるが、調製法は、これに限定されない。例えば、遠心沈降法の他にも、静置水和法(P.Mueller and T.F.Chien,Biophys.J.,1983,44,375−381)、および、エレクトロフォーメーション法(Miglena I.Angelove and Dimiter S.Dimitrov,Faraday Discuss.Chem.Soc.,1986,81,303−311)を利用することが可能である。
本発明において使用する核酸分解酵素としては、例えば、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素が挙げられるがこれらに限定されない。使用する核酸分解酵素の供給源は、特に限定されることはない。核酸分解酵素としてDNaseを使用する場合、使用する酵素活性は、100μLのリポソーム溶液あたり、1U〜20U、より好ましくは、5U〜15U、もっとも好ましくは、約12.5Uである。核酸分解酵素としてRNaseを使用する場合、使用する酵素活性は、100μLのリポソーム溶液あたり、1μg〜20μg、より好ましくは、5μg〜15μg、もっとも好ましくは、約10μgである。当業者は、使用する酵素量を容易に決定することができる。
例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がDNAである場合、そのDNAに、タンパク質のコード配列、ならびに、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列、および、このコード配列に作動可能に連結された転写翻訳調節配列を含ませる。
本発明のリポソームを分子進化工学に利用することができる。
以下に記載の遠心沈降法により、一枚膜リポソームを調製した。
・10mgの脂質(ホスファチジルコリン:コレステロール=9:1)を100μlクロロホルムに溶解し、2mlの流動パラフィンと混合した。
・80℃で30分インキュベーションした。
・リポソーム外液(333mM グルコース、無細胞蛋白質合成系から翻訳タンパク質群とtRNAを除いたもの)、内液(330mM スクロース、1μM Transferrin Alexa 647、無細胞蛋白質合成系、40U/μl RNaseインヒビター(Promega)、0.4μM リボソームS1サブユニット、50μM 5−クロロメチルフルオレセイン ジ−β−D−ガラクロピラノシド(CMFDG)、50pM
鋳型DNA(pUCMDV(+)(−NH)−β(+)Gal(−)とpUCMDV(+)(−NH)−dS−β(+)Gal(−)の1:1混合物)を調製した。
・脂質を溶解した流動パラフィン400μlにリポソーム内液20μlを入れ、氷上に1分置いた。
・ボルテックスミキサーの最大強度で40秒攪拌しエマルションを調整後、氷上で10分置いた。
・新しいチューブにリポソーム外液150μlをいれ、その上に調製したエマルションを積層し、氷上で10分置いた。
・14k×g、4℃で30分遠心した。
・チューブの底に穴を開け、底に溜まったリポソーム懸濁液80μlを回収した。
・リポソーム懸濁液に2μlの5U/μl DNase、または、4mg/ml RNaseを添加した。
・リポソーム懸濁液を37℃で3時間インキュベーションした。
・希釈液(50mM Hepes−KOH(pH 7.6)、13mM 酢酸マグネシウム、100mM グルタミン酸カリウム)で20倍に希釈し、セルソーター(FACS Aria)にかけた。
・セルソーターにより、より強い蛍光を持つリポソームを選択した。
・選択されたリポソームから反応中に生じたRNAをRNeasy(QIGEN)により精製した。
・得られたRNAを0.2μM プライマー1(配列番号1:GCAAGTGACTCAGGATTCGTACATAATATCGTCTCCGTAAACAGTG)、各1mM
dNTPと混合し、65℃で5分熱処理後直ちに氷冷した。
・10U/μl PrimeScript Reverse Transcriptase(TAKARA)、PrimeScript buffer、1U/μl RNaseインヒビター(Promega)を加え、50℃で60分、70℃で15分インキュベーションした。
・反応液を水で5倍希釈した。
・pUCMDV(+)(−NH)−β(+)Gal(−)を測定する場合には0.4μMのプライマー2(配列番号2:GGTAGTGTTGTTACCTACGAGAAG)およびプライマー3(配列番号3:GCAAGTGACTCAGGATTCGTAC)を用いた。pUCMDV(+)(−NH)−dS−β(+)Gal(−)を測定する場合には0.4μMのプライマー3(配列番号3:GCAAGTGACTCAGGATTCGTAC)とプライマー4(配列番号4:CCCTCTGTGAGCTCGAGTC)を加え、SYBR Premis Ex TaqIIと混合した。・SYBR蛍光を指標に定量PCRを行ない、回収されたRNA量を測定した。PCRのサイクルは以下のとおり。95℃10秒の後、(95℃5秒、63℃10秒、72℃15秒)を50サイクル。
各0.3mM アミノ酸(アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン)、3.6μg/μl tRNA、2mM ATP、2mM GTP、1mM CTP、1mM UTP、14mM 酢酸マグネシウム、50mM Hepes−KOH (pH7.8)、100mM グルタミン酸カリウム、2mM スペルミジン、20mM クレアチンリン酸、2mM ジチオスレイトール、10ng/μl 10−ホルミル−5.6.7.8.−テトラヒドロ葉酸、翻訳タンパク質群(2500nM IF1、411nM IF2、728nM IF3、247nM RF1、484nM RF2、168nM RF3、485nM RRF、727nM AlaRS、99nM ArgRS、420nM AsnRS、121nM AspRS、100nM CysRS、101nM GlnRS、232nM GluRS、86nM GlyRS、85nM HisRS、365nM IleRS、99nM LeuRS、115nM LysRS、109nM MetRS、134nM PheRS、166nM ProRS、99nM SerRS、84nM ThrRS、102nM TrpRS、101nM TyrRS、100nM ValRS、588nM MTF、926nM MK、465nM CK、1307nM NDK、621nM Ppiase2、1290nM EF−G、2315nM EF−Tu、3300nM EF−Ts、529nM Tig、22nM HrpA、1440nM TrxC)。
活性のある野生型のガラクトシダーゼ遺伝子と活性のない変異型のガラクトシダーゼ遺伝子とを1:1で混合し、実施例1に記載の方法で作製したリポソームに封入した。蛍光を発したリポソームを回収し、リポソーム内のDNAの種類(野生型か変異型か)を決定した。その結果を、図1に示す。
配列番号2:プライマー2(PCR用プライマー)
配列番号3:プライマー3(PCR用プライマー)
配列番号4:プライマー4(PCR用プライマー)
Claims (20)
- 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。
- 核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項4に記載のライブラリー。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項4に記載のライブラリー。
- 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。
- 核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項10に記載のライブラリー。
- 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項13に記載の方法。
- 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。 - 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項16に記載の方法。
- 一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項4に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるDNAを増幅する工程;および、
(iv)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。 - 一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項10に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるRNAに逆転写酵素を作用させて、DNAを生成する工程;
(iv)該生成したDNAを増幅する工程;および、
(v)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
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