JP2023514584A - 遺伝暗号の再プログラミングのため、長鎖炭素と環状アミノ酸が包含されるよう化学的基質を拡張する - Google Patents

遺伝暗号の再プログラミングのため、長鎖炭素と環状アミノ酸が包含されるよう化学的基質を拡張する Download PDF

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Abstract

配列特定ポリマーを合成するための方法、系、成分、および組成物が開示されている。これらの方法、系、成分、および組成物を利用し、非標準的なアミノ酸単量体と非アミノ酸単量体を含む新規な基質を配列特定ポリマーの中に組み込むことができる。本明細書に開示されているように、その新規な基質を利用し、フレキシザイムを触媒とする反応を通じてtRNAをアシル化することができる。その新規な基質でこのようにアシル化されたtRNAを合成プラットフォームにおいて利用し、その新規な基質を配列特定ポリマーの中に組み込むことができる。【選択図】図１Ａ

Description

連邦が資金援助した研究または開発に関する宣言
本発明は政府のサポートを得て、Army Research Officeによって資金援助されたW911NF-16-1-0372のもとでなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。
関連する特許出願の相互参照
本出願は、U.S.C. § 119(e)のもとで、2020年2月14日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/976,672号と2020年3月27日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第63/001,165号の優先権の恩恵を主張するものであり、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
背景
本発明の分野は、配列特定ポリマーを調製するための成分と方法に関する。特に、本発明の分野は、遺伝暗号再プログラミングにおいてと、フレキシザイムを触媒とするアシル化反応において利用するための成分と方法に関する。
遺伝暗号再プログラミングを通じてポリペプチドに非カノニカルなアミノ酸を部位特異的に組み込むことは、自然の限界を超えるバイオベースの製品を製造するための強力なアプローチである。リボソームを媒介とする重合ではさまざまなレパートリーの化学的基質を使用できるが、フレキシザイム（Fx）を媒介としてtRNAにチャージすることと、配列に基づくポリマーに遺伝暗号再プログラミングのアプローチを利用して長い炭素鎖と環状構造を持つアミノ酸類似体を組み込むことは、実現できないまま残されている。
ここでは、野生型リボソームと操作されたリボソームを用いた新規なベータ-アミノ酸基質の調製と、配列に基づくポリマーへのインビトロでの部位特異的組み込みを実証する。この目的を達成するため、アシル化されてtRNAに結合できる新たなベータ-アミノ基質を最適化された反応条件下で合成したところ、これらのアシル化された基質は、インビトロでの翻訳を利用してリボソームペプチドに組み込むことができた。われわれの仕事は化学的基質の範囲を拡張するものであり、操作された翻訳装置をインビトロで用いてそのような基質をペプチドに組み込めることを実証している。
配列特定ポリマーを合成するための方法、系、成分、および組成物が開示される。これらの方法、系、成分、および組成物は、非標準的なアミノ酸単量体と非アミノ酸単量体を包含する新規な基質を配列特定ポリマーに組み込むために利用することができる。本明細書に開示されているように、新規な基質は、フレキシザイムを触媒とする反応を通じてtRNAのアシル化に利用することができる。したがって新規な基質を用いてアシル化されるそのtRNAは、新規な基質を配列特定ポリマーに組み込むための合成プラットフォームで利用することができる。
本明細書に開示されている成分は、アシル化tRNA分子と、アシル化tRNA分子を調製するためのドナー分子を包含し、そのアシル化tRNA分子とドナー分子は、配列特定ポリマーに組み込むことのできる単量体を含む。開示されているアシル化tRNA分子は、ドナー分子の中に存在していて本明細書では「R」と呼ぶことのできる部分を用いてアシル化されている。
開示されているアシル化tRNA分子は、式：
Figure 2023514584000002
 を持つと定義することができる（ただしこの式において、
tRNAはトランスファーRNAであり（すなわちこのtRNAはC3ヒドロキシル基の位置がR-C(O)-でアシル化されている）；
Rは、アミノ酸部分を含む（例えばその非限定的な例は、アルファ-アミノ酸部分、ベータ-アミノ酸部分、ガンマ-アミノ酸部分、デルタ-アミノ酸部分、イプシロン-アミノ酸部分、またはより長い鎖アミノ酸部分である）。Rは、例えばベータ位にアミノ酸を含むアミノ酸部分も含む（例えばその非限定的な例は環状アミノ酸部分である）。
いくつかの実施形態では、Rは、場合によりアミノで置換されたアルキル；シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル；(ヘテロシクロアルキル)アルキル；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール；ヘテロアリール；(アリール)アルキル；(ヘテロアリール)アルキル；または(アリール)アルケニルから選択され；その中のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(アリール)アルキル、(ヘテロアリール)アルキル、または(アリール)アルケニルは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、ホルミル、オキソ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている。
他の実施形態では、Rは、式：
Figure 2023514584000003
 を持つ（ただしこの式において、
nは0～6であり；
R1またはR2は、水素、場合によりアミノで置換されたアルキル；シクロアルキル；ヘテロシクロアルキル；(ヘテロシクロアルキル)アルキル；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール；ヘテロアリール；(アリール)アルキル；ヘテロアリール(アルキル)；または(アリール)アルケニルから選択され；その中のアリールまたはヘテロアリールは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、ホルミル、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されるか；
R1とR2は合わさって、場合により、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換された炭素環、場合により3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、開示されているアシル化tRNA分子は、式：
Figure 2023514584000004
 を持つことができる。
いくつかの実施形態では、開示されているアシル化tRNA分子は、式：
Figure 2023514584000005
を持つことができる。
いくつかの実施形態では、開示されているアシル化tRNA分子は、式：
Figure 2023514584000006
 を持つことができる（ただしこの式においてXは(CH2)mであり、mは例えば1～6である、すなわちここではR1とR2が合わさって、3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成している）
開示されているアシル化tRNA分子は、tRNA分子とドナー分子をフレキシザイム（Fx）の存在下で反応させることによって調製することができる。これらの方法は、（i）フレキシザイム（Fx）：（ii）tRNA分子；および（ii）式：
Figure 2023514584000007
 を持つドナー分子（ただしこの式において、
Rは上に定義された部分であり；
LGは離脱基であり；
XはOまたはSである）という反応混合物の中で反応させることを含むことができる。
この調製法では、FxがtRNA分子とドナー分子の間のアシル化反応の触媒となってアシル化tRNA分子が調製される。
式：
Figure 2023514584000008
 を持つドナー分子（ただしこの式において、
Rは上に定義された部分であり；
LGは離脱基であり；
XはOまたはSである）も本明細書に開示されている。
ドナー分子に適した離脱基（LG）には、離脱基（LG）（式：
Figure 2023514584000009
 を持つジニトロベンジルと4-((2-アミノエチル)カルボモイル)ベンジルなど）を包含することができるが、それに限定されない。
開示されている方法、系、成分、および組成物を利用して配列特定ポリマーをインビトロおよび／または生体内で調製することができる。いくつかの実施形態では、開示されている方法を実施して配列特定ポリマーを無細胞合成系の中で調製することができ、そのときその配列特定ポリマーは、アシル化tRNA分子のアンチコドンに対応するコドンを含むmRNAを翻訳することによって調製される。開示されている方法では、アシル化tRNA分子のR基は、mRNAの翻訳中に配列特定ポリマーに組み込まれる。開示されている方法を実施して、ポリオレフィンポリマー、アラミドポリマー、ポリウレタンポリマー、ポリケチドポリマー、共役ポリマー、D-アミノ酸ポリマー、β-アミノ酸ポリマー、γ-アミノ酸ポリマー、およびポリカーボネートポリマーから選択されるポリマーを調製することができるが、ポリマーはこれらに限定されない。
フレキシザイム（配列番号22）の結晶構造。（Xiao, H., Murakami, H., Suga, H. & Ferre-D'Amare, A.R. Structural basis of specific tRNA aminoacylation by a small in vitro selected ribozyme. Nature 454, 358-361 (2008)より）。 フレキシザイムによるtRNAのアシル化と、活性化されたエステル基質の調製に一般に用いられる離脱基。 化学的基質の調製。Bocで保護されたa-アミノ酸とBocで保護されたb-アミノ酸をアシル化のためのエステル化された基質に変換した。 フレキシザイム（Fx）を触媒とするアミノアシル化の最適化。 遺伝暗号の再プログラミング。Sub1、Sub2、およびSub3は再プログラムされたtRNAに対応するコドンを示す。 アミノ酸をポリペプチドに組み込むための方法の模式図。 組み込まれたアミノ酸を含有する合成ポリペプチドの特徴づけ。 エステル単量体、チオエステル単量体、またはABC単量体をチャージされたtRNAを用いて形成することのできる可能なポリマー骨格。 遺伝暗号再プログラミングのためフレキシザイムの化学的基質の範囲を拡張する。a）フレキシザイム（Fx）はtRNAの3’-CCA配列を認識し59、酸性基質を用いたtRNAのアシル化の触媒となる。Fxはこれまで、最も一般的なアミノ酸とヒドロキシ酸の限定されたセットを組み込むのに使用されてきた。この仕事では、側鎖または離脱基のどちらかに芳香族基を含有する追加の非カノニカルな酸性基質に対するFxの基質特異性を探索する（紫色の図）。b）精製した野生型翻訳機械（PURExpress（商標））から再構成した大腸菌無細胞タンパク質合成系を用い、そのような非カノニカルな酸性基質を含有するペプチドを生成させた60。非カノニカルな単量体をペプチドのN末端に組み込むこのアプローチはよく確立されている。c）広範な官能基を含む32種類の非カノニカルな酸性基質がペプチドのN末端に組み込まれた。 最適化された反応条件は、新規な基質を用いたFxを触媒とするアシル化を容易にする。Phe（A）と多彩な構造のPhe類似体（B～G）を用いたFxを触媒とするマイクロヘリックスtRNA（22 nt）のアシル化に関するさまざまな条件での酸変性PAGE分析。アシル化反応はeFx（45 nt）またはaFx（47 nt）を用いて実施し、2つの異なるpH（7.5対8.8）で120時間にわたってモニタした。 Fx基質の範囲をさまざまな足場を持つ類似体へと拡張する。Fxに適合した非カノニカルな基質の範囲を4つの異なる単量体構造（Phe類似体、安息香酸誘導体、複素芳香族、および脂肪族基質）についてさらに拡張した。eFxとaFxは基質のアリール基を認識することによって基質をチャージする。アシル化反応はマイクロヘリックスRNA（22 nt）をコグネイトFx（eFx：45 nt、aFx：47 nt）とともに用いて実施し、2つの異なるpH（7.5対8.8）で120時間にわたってモニタした。反応条件；50 mMのHEPES（pH 7.5）またはビシン（pH 8.8）、60 mMのMgCl2、1 μMのマイクロヘリックス、5 μMのFx、および5 mMの基質を含む20％(v/v) DMSO溶液。すべてのアシル化ヒートマップが、マイクロヘリックスの変換率ごとに影を付けられている。アシル化の数値に関しては図15を参照されたい。 選択された基質とeFxの結合ポケットの間の分子相互作用のシミュレーション。CMEエステルの四面体中間体モデルを最適化し、Rosettaによってモンテカルロ・エネルギー最適化を実施した。a）Phe（A）、b）ヒドロ桂皮酸（B）、c）桂皮酸（C）、d）安息香酸（D）、e）フェニル酢酸（E）；暗い黄色。f）ピロール-2-カルボン酸（25）とg）2-チオフェンカルボン酸（26）ではグアニン残基との強い相互作用が観察されない。 非カノニカルな基質を用いたN末端機能化ペプチドのリボソーム合成。a）ペプチドの合成と特徴づけの全体模式図。N末端機能化ペプチドを、PURExpress（商標）系において、FxによりチャージされたtRNAfMetを用いることによって調製し、Strepタグによって精製し、SDSで変性させ、MALDI質量分析によって特徴づけた。b）全20種類の天然アミノ酸の存在下かつFxによりチャージされたtRNAの不在下でのペプチドの質量スペクトル。c）メチオニンと、FxによりチャージされたtRNAの不在下でのペプチドの質量スペクトル。d～i）非カノニカルな基質が組み込まれたN末端を持つペプチドの質量スペクトル。*：N末端にフェニルアラニンを含有する微少量のペプチドがホルミル化されていないことが見いだされた。NH2-FWSHPQFEKST-OH（配列番号14）；[M+Na]+＝1415、A：フェニルアラニン、B：ヒドロ桂皮酸、C：桂皮酸、D：安息香酸、E：フェニル酢酸、G：プロパン酸。 種基質を用いたマイクロヘリックスのアシル化。6つの代表的な基質（Phe-CME（A）、hcinA-CME（B）、cinA-CME（C）、benA-CME（D）、PhAACME（E）、penA-CME（F）、penA-ABT（G）を用いたFxを触媒とするアシル化反応を2つの異なるpH（7.5と8.8）で120時間にわたってモニタした。一般に、高いpH（pH 8.8）と長いインキュベーション時間（120時間）は高い反応収率を与える。図8a（レーンA～C）、8b（レーンA～C）、および8d（レーンC～G）の一部を用いて図9を作成した。LG：離脱基。Fx：フレキシザイム、CME：シアノメチルエステル、ABT：(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステル。 アシル化されたマイクロヘリックスの望ましくない加水分解。PhPA（B）をチャージされたマイクロヘリックスは16時間の時点で100％の収率でアシル化されたが、アシル化収率は144時間の時点で低下すること（76％）が見いだされた。それはおそらく、エステル結合上の水による望ましくない加水分解による。レーン1：マイクロヘリックス；レーン2と3：それぞれ16時間と144時間の時点で観察された粗アシル化生成物。この観察結果に基づいて反応時間を120時間に制限した。 拡張された基質を用いて得られたマイクロヘリックスのアシル化収率の数値。32種類の非カノニカルな化学的基質を有するマイクロヘリックスのアシル化反応収率を、20％ポリアクリルアミドゲル（pH 5.2、50 mMのNaOAc、図16～18）上のバンド強度を定量することによって求めた。 1～6を用いたアシル化の分析。50 mMのNaOAc（pH 5.2）を含有する20％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によってアシル化の収率を分析した。化学的基質（1～6）を含有する粗生成物をゲルにロードし、冷えた部屋の中における135 mVでの電気泳動による移動によって2～3時間かけて分離した。反応を120時間にわたってモニタし、デンシトメトリー分析（ソフトウエア：ImageJ）を利用して収率を定量化した。 7～21を用いたアシル化の分析。基質（7～21）をチャージされた粗アシル化反応混合物を、図16に記載されているのと同じ方法を用いて分析した。 22～32を用いたアシル化の分析。化学的基質（22～32）をチャージされた粗生成物を分析した。ゲルをGelRed（Biotium）で染色し、Gel Doc XR+（Bio-Rad）の630 nmのフィルタ上で20秒間露出することによって可視化した。オレンジ色の箱の中のクマリン（24）をチャージされたmihxを含有するバンドは、ゲルをより短い波長（560 nm）に曝露すると他の核酸バンドよりも相対的に大きな強度を示す。収率は、それぞれCMEとABTという離脱基を含有する基質との反応から得られたことに注意されたい。（クマリン励起／放出波長：380 nm／410～470 nm）。 ピロール-ABTとチオフェン-ABTのアシル化試験。小さな芳香族環をeFxが認識しなかった場合に備え、ピロール基質とチオフェン基質（ABTを持つ25aと26a）のための追加の基質を試験した。しかし基質をチャージされたマイクロヘリックスに関する新たなバンドをゲル中に見いだすことはできなかった。eFxとaFxをそれぞれレーン1、3および2、4で使用した。（NMR分光データが得られたが、ここには提示しない）。 直線状第1級アミン部分を含む代表的な化合物。 環状第1級アミン部分を含む代表的な化合物。 環状第2級アミン部分を含む代表的な化合物。 直線状炭素鎖を持つベータ-アミノ酸がWTリボソームによってペプチドに組み込まれている。 環状炭素鎖を持つベータ-アミノ酸はWTリボソームによる組み込みにとって非効率的な基質である。 野生型リボソームは、ベータアミノ酸をペプチドのC末端に組み込む能力を幾分か示す。 追加の翻訳因子（EF-P）はペプチドのC末端への環状ベータアミノ酸の組み込みを助ける。 代表的なベータ-アミノ酸。 長鎖炭素と環状アミノ酸が包含されるよう翻訳装置の化学的基質の範囲を拡張する。（a）フレキシザイム（Fx）および無細胞タンパク質合成（CFPS）プラットフォームに適合した翻訳のための基質。ペプチドへの長鎖炭素（lcc）アミノ酸の組み込みは困難であることが証明されている。（b）骨格長、単量体機能、および／または単量体配列に基づき顕著に異なる特性（引張強度（TS）など）を持つ主要なポリアミドポリマーの実例。（c）Fx系によるlccアミノ酸のtRNAチャージングは、その結果として分子内ラクタムが形成されるため困難なままである。（d）Fxとインビトロでの翻訳により長鎖炭素アミノ酸を組み込むための戦略。 長鎖炭素と環状アミノ酸の系統的な設計。（a）直線状炭素鎖を持つアミノ酸の範囲をγ-、δ-、ε-、およびζ-アミノ酸へと拡張した。Fxによるより大きなアシル化収率が、アミノ酸鎖の長さが増加するときに観察された。これはおそらく、ラクタム化によるより大きな（＞5員）環形成が5員環形成よりも動力学的により不利だからであろう。（b）基質への環状かつ堅固な結合の導入はFxアシル化収率の増加を助ける。（c）増加したアシル化収率（7での約6％から12での約95％まで）は、堅固な結合（7）または環状構造（11～15）を持つγ-アミノ酸で得られた。これらのデータは、堅固な炭素足場が分子内5員ラクタム形成反応を効率的に阻害していることを示唆する。各基質のアシル化収率は、24時間／120時間の時点で観察されたマイクロヘリックスtRNAの収率を表わす。データは3つの独立な実験を表わす。 Fxを媒介とするγ-アミノ酸のアシル化におけるラクタムの観察。Fxを媒介とする基質2iiのアシル化において生成したラクタムを観察する。氷の上で24時間インキュベートしたFx反応の混合物に関して抽出されたイオンのクロマトグラムaは、ラクタムbの理論的質量に対応する新たなピークを示した。データは3つの独立な実験を表わす。 骨格伸長型単量体を用いたN末端機能化ペプチドのリボソーム合成。（a）すべての骨格伸長型アミノ酸（3～15）がFxによってチャージされたtRNAfMet(CAU)を、PURExpress（商標）系において、リボソームを媒介とする重合によってペプチドのN末端に組み込んだ。このペプチドをストレプトアビジンタグ（WSHPQFEK）によって精製し、MALDI質量分析によって特徴づけた。各ペプチドで観測された質量は理論的質量に対応しており、それは、（b）[M+H]+＝1345；[M+Na]+＝1367、（c）[M+H]+＝1359；[M+Na]+＝1381、（d）[M+H]+＝1373；[M+Na]+＝1395、（e）[M+H]+＝1369；[M+Na]+＝1391、（f）[M+Na]+＝1351、（g）[M+H]+＝1379；[M+Na]+＝1401、（h）[M+H]+＝1371；[M+Na]+＝1393、（i）[M+H]+＝1372；[M+Na]+＝1394、（j）[M+H]+＝1343；[M+Na]+＝1365、（k）[M+Na]+＝1365、（l）[M+H]+＝1357；[M+Na]+＝1379、（m）[M+H]+＝1371；[M+Na]+＝1393、（n）[M+H]+＝1371；[M+Na]+＝1393である。星印の付いたピークはN末端に標的基質を持たない切断型ペプチドである（[M+H]+＝1246；[M+Na]+＝1268）。データは3つの独立な実験を表わす。 アミノシクロブタン-カルボン酸（ACB）を用いたペプチドのリボソーム合成。（a）PURExpress（商標）系においてFxを媒介とするtRNAPro1E2(GGU)を用いてペプチドを合成し、ストレプトアビジンタグによって精製し、MALDI質量分析によって特徴づけた。（b）と（c）シス-ACBとトランス-ACBは野生型リボソームによってペプチドのC末端に組み込まれない。（d）操作されたリボソームは、ペプチドのC末端と鎖中央部へのシス／トランス-ACBの組み込みを容易にする。（e）と（f）シス-ACBとトランス-ACB。Mainiら24, 58によって開発された操作されたリボソームをインビトロでタンパク質翻訳反応物に添加したとき、C末端にシス／トランス-ACBを含有するペプチドが観察された。（g）と（h）シス-ACBとトランス-ACB。シス／トランス-ACBを組み込んだ後に追加アミノ酸残基（IleとAla）が伸長した。これは、操作されたリボソームがACBの部位特異的組み込みを可能にしたことを実証している。データは3つの独立な実験を表わす。全スペクトルについては図34を参照されたい。 基質1～15と2i～2vを用いたマイクロヘリックスのアシル化。（a～d）その20種類の基質を用いたFxを触媒とするアシル化反応を、3つの異なるフレキシザイム（eFx、dFx、およびaFx）について2つの異なるpH（7.5と8.8）で120時間にわたってモニタした。Fx：フレキシザイム（43～45 nt）、mihx：マイクロヘリックス（22 nt）。各反応の収率は、ゲル上のアシル化されていないマイクロヘリックス（赤色の矢印）とアシル化されたマイクロヘリックス（青色の矢印）の相対的バンド強度を、ImageJソフトウエアを用いて定量することによって求めた。1～15と2i～2vの基質構造は上記の特徴づけデータの中に示されている。データは多数（n＝1～3）の独立な実験を表わす。 シス-ACBとトランス-ACB（11～12）を有するC末端機能化ペプチドの特徴づけ。（a）標的ペプチドと、PURExpress（商標）翻訳反応で生成する副生成物である切断型ペプチドの構造と分子量。（b）野生型リボソームを用いてシス-ACB（11）を組み込む試みからのMALDI-TOF質量分析データ。（c）bで実施したのと同じPURExpress（商標）反応条件下でHechtリボソーム（040329）を添加することにより、C末端にシス-ACBを含有する標的ペプチドの理論的質量に対応するピークが生じた。（d）11を組み込んだ後に追加のアミノ酸IleとAlaを伸長させることができる。これは、操作されたリボソームが部位特異的組み込みを可能にしたことを示唆する。（e）野生型リボソームを用いてトランス-ACB (12)を組み込む試みからのMALDI-TOFデータ。（f）eで実施したのと同じ条件下でHechtリボソームを添加することにより、C末端に12を含有する標的ペプチドの理論的質量に対応するピークが生じた。（g）同じ追加アミノ酸残基（IleとAla）が12を組み込んだ後に伸長する。 切断型ペプチドの理論的質量は、p1については[M+H]+＝1089；[M+Na]+＝1111（緑色の矢印）、p2については[M+H]+＝1217、[M+Na]+＝1239（青色の矢印）、p3については[M+H]+＝1304；[M+Na]+＝1326（オレンジ色の矢印）である。星印の付いた16個のピーク（[M+H]+＝1334；[M+Na]+＝1356、黒色の矢印）は同定されなかった。強調されている（紫色）領域を用いて図32b、cとe～hを作成した。標的ペプチドの収率は、切断型ポリペプチドと標的ポリペプチドの総量に対する標的ポリペプチドの相対的ピーク面積（PA）に基づいて求めた（すなわち相対的収率（％）＝Σ PA（標的ペプチド）／ΣPA（P1＋P2＋P3＋標的ペプチド）×100）。データは3つの独立な実験を表わす。 リボソームを媒介とする重合の化学的基質の範囲を環状β-アミノ酸基質へと拡張する。環状β-アミノ酸（cβAA）基質に対する天然翻訳機械の基質特異性を、フレキシザイムを触媒とするアシル化と、リボソームを媒介とする組み込みを利用して探索する。多彩なかさばる環状構造を含む10種類の非カノニカルなcβAAを調べる。 α-アミノ酸とβ-アミノ酸のリボソーム組み込み。ペプチドを、PURExpress（商標）系においてFxを媒介とするtRNAPro1E2(GGU)を用いて調製し、Strepタグ（WSHPQFEK）によって精製し、MALDIによって特徴づけた。α-Puとβ-Puをチャージされた同量のtRNAPro1E2(GGU)をPURE反応に添加したとき、α-Puを含有するペプチドは、C末端にβ-Puを持つペプチドよりも14倍多いことが見いだされた。それはおそらく、天然翻訳機械がL-α-アミノ酸のほうを好むからであろう。観察された質量は、それぞれ、C末端にα-Puが組み込まれたペプチドでは1481 [M+H]+、1503 [M+Na]+、1525 [M-H+2Na]+、1547 [M-2H+3Na]+ Daであり、β-Puを持つペプチドでは1496 [M+H]+、1518 [M+Na]+ Daである。 10種類のcβAAに関するフレキシザイムを媒介とするアシル化の収率（％）。アシル化反応を6つの異なる条件（2つの異なるpH（7.5と8.8）と3つの異なるFx（e、d、aFx））を用いて実施し、最適化された反応条件を見いだした。4-cβAA（1～2）は、おそらくそれが環状生成物であるラクタムを形成する傾向を持つという理由で非効率的にチャージされたのに対し、5-cβAA（3～6）と6-cβAA（7～10）は高収率でチャージされた（40～60％、n＝3；平均値、ただしnは実験の数を表わす。図39参照）。 EF-Pの存在下でのかさばるcβAAの組み込み。インビトロのタンパク質翻訳系における10 μM（最終）のEF-Pが、C末端に5-cβAAと6-cβAAを含有するペプチドの強度をより強くする。a）、b）。円は、C末端に5-cβAAを含有するペプチドの質量を表わしており、[M+H]+＝1415、[M+Na]+＝1437、および[M-H+2Na]+＝1459にそれぞれ対応する。c）、d）。円は、6-cβAAを含有するペプチドを表わしており、質量はそれぞれ[M+H]+＝1429、[M+Na]+＝1451、[M-H+2Na]+＝1473である。全スペクトルに関してはSIを参照されたい。棒はfMWSHPQFEKSTの配列を持つペプチドを表わしており、その中のfMはホルミル化されたMetである。 基質1～12を用いたマイクロヘリックスのアシル化。20種類の基質を用いたFxを触媒とするアシル化反応を、3つの異なるフレキシザイム（eFx、dFx、およびaFx）について2つの異なるpH（7.5または8.8）で24時間にわたってモニタした。各反応の収率は、ゲル上のアシル化されていないマイクロヘリックスとアシル化されたマイクロヘリックスの相対的バンド強度を、ImageJソフトウエアを用いて定量することによって求めた。 5-cβAA（3～6）を有するN末端機能化ペプチドの特徴づけ。緑色のペプチドの配列はWSHPQFEKSTであり、N末端に基質を持たないペプチドの理論的質量に対応する、[M+H]+＝1246；[M+Na]+＝1268。すべての5-cβAA（3～6）が天然翻訳機械によりN末端に組み込まれていることがわかる。[M+H]+＝1357；[M+Na]+＝1279。 6-cβAA（7～10）を有するN末端機能化ペプチドの特徴づけ。すべての6-cβAA（7～10）が天然翻訳機械によりN末端に組み込まれていることがわかる。[M+H]+＝1371；[M+Na]+＝1393。 EF-Pの添加は、標的ポリペプチドへの5-cβAA（3～6）のC末端組み込みを増強する。PURExpress（商標）において同じ反応条件下でEF-P（c、e、g、およびi）を添加すると、C末端に5-cβAA基質を含有するペプチドの理論的質量に対応する増強された強度を持つピークが生じた。ペプチドの理論的質量は、[M+H]+＝1415；[M+Na]+＝1437；[MH+ 2Na]+＝1459である。青色のペプチドの配列はfMWSHPQFEKSであり、N末端に基質を持たないペプチドの理論的質量に対応する、[M+H]+＝1304；[M+Na]+＝1326。星印を付けたピーク（[M+H]+＝1334；[M+Na]+＝1356）は同定されなかった。強調されている（黄色）領域を利用して図38a～bを作成した。 EF-Pの添加は、標的ポリペプチド（7～10）への6-cβAAのC末端組み込みを増加させる。PURExpress（商標）において同じ反応条件下でEF-P（c、e、g、およびi）を添加すると、C末端に6-cβAA基質を含有するペプチドの理論的質量に対応する増強されたピークが生じた。ペプチドの理論的質量は、[M+H]+＝1429；[M+Na]+＝1451；[M-H+2Na]+＝1473である。青色のペプチドの配列はfMWSHPQFEKSTであり、これはN末端に基質を持たないペプチドの理論的質量に対応する、[M+H]+＝1304；[M+Na]+＝1326。強調されている（黄色）領域を利用して図38c～dを作成した。 cβAAのC末端組み込みの分析。a）PURExpress（商標）において同じ反応条件下でEF-Pを添加することにより、C末端にcβAA（2a～2dと3a～3d）を含有するペプチドの理論的質量に対応するすべてのピークの増強されたシグナルが生じた。これは、サンプル中の標的ペプチドの量が増加していることを示唆する。信号対雑音比（S/N）を、全スペクトルに内部基準として存在する1353の位置のピークのS/Nを用いて規格化した後、任意の数（1,000）を掛け、図38のピークシグナルと定量的に比較した。b）C末端組み込み効率（CIE、％）を、切断型ポリペプチドと標的ポリペプチドの総量に対する標的ポリペプチドの相対的ピーク面積（PA）に基づいて求めた。cβAAの組み込み効率は、EF-Pの添加後、単量体に応じてほぼ0.6～70.6％増加する。信号対雑音（S/N）比とピーク面積はCompass DataAnalysis 4.2ソフトウエア（Bruker）で処理した。
本開示の主題は、以下と本出願の全体を通じて示されているいくつかの定義を用いて本明細書に記載されている。
定義
特に断わらない限り、本明細書で用いられているあらゆる科学技術用語は、本発明が関係する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されているのと似ているか同等な任意の方法と材料を本発明の実践または試験で用いることができるが、好ましい方法と材料が本明細書に記載されている。
文脈によって異なる記載または指摘がある場合は別だが、「1つの」、「1つの」、および「その」という用語は、「1つ以上の」を意味する。例えば「1つの成分」は「1つ以上の成分」を意味すると解釈すべきである。
本明細書では、「約」、「ほぼ」、「実質的に」、および「顕著に」は当業者に理解されるであろうし、これらが使用される文脈に応じてある程度異なるであろう。これらの用語が当業者にとって明確でない使われ方をしている場合には、これらの用語が使われる文脈が与えられるとき、「約」と「ほぼ」はその用語のプラスマイナス10％以下を意味し、「実質的に」と「顕著に」はその用語のプラスマイナス10％超を意味するであろう。
本明細書では、「包含する」と「包含している」という用語は、「含む」と「含んでいる」という用語と同じ意味を持ち、後者の用語は、請求項をこれらつなぎ語の後に続けて記載されている要素に限定しない「開かれた」つなぎ語である。「からなる」という用語は「含んでいる」という用語に包含されるが「閉じられた」つなぎ語と理解すべきであり、請求項をこのつなぎ語の後に続けて記載されている要素だけに限定する。「本質的に～からなる」という表現は「含んでいる」という用語に包含されるが「部分的に閉じられた」つなぎ語と理解すべきであり、このつなぎ語の後に続く追加要素を許容するが、それはこれら追加要素が請求項の基本的な特徴と新規な特徴に実質的に影響を与えない場合だけである。
本明細書に記載されている範囲には、規定されている境界値のほか、記載されているその範囲内にある記載されていない任意の数値を包含する下位範囲が包含される。例えば約0.01 mM～約10.0 mMの範囲は、0.01 mMと10.0 mMの両方を包含する。やはり考慮される例示したこの範囲内の記載されていない数値は、例えば0.05 mM、0.10 mM、0.20 mM、0.51 mM、1.0 mM、1.75 mM、2.5 mM 5.0 mM、6.0 mM、7.5 mM、8.0 mM、9.0 mM、および9.9 mMなどを包含する。例示したこの範囲内の代表的な下位範囲は、約0.01 mM～約5.0 mM；約0.1 mM～約2.5 mM；約2.0 mM～約6.0 mMなどを包含する。
化学物質
新たな化学物質と、化学物質の利用が、本明細書に開示されている。化学物質は本分野で知られている用語を用いて記述することができ、下でさらに議論する。
本明細書では、星印「*」またはプラス記号「+」は任意の基または置換基（例えば本明細書で論じられている「R」）の付着点を指すのに用いることができる。
「アルキル」という用語は、本明細書では、直鎖アルキル基または分岐アルキル基をそのあらゆる異性体形態を含めて包含する（例えば炭素原子が1～12、1～10、または1～6個の直線状の基または分岐した基であり、本明細書ではそれぞれC1-C12アルキル、C1-C10-アルキル、およびC1-C6-アルキルと呼ぶ）。
「アルキレン」という用語は、直鎖アルキル基または分岐アルキル基のジラジカル（すなわち直鎖の、または分岐したC1-C6アルキル基のジラジカル）を意味する。代表的なアルキレン基の非限定的な例に包含されるのは、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH(CH2CH3)CH2-などである。
「ハロアルキル」という用語は、少なくとも1個のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。例えば-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CF2CF3など。
「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書では、少なくとも1個の炭素原子がヘテロ原子（例えばO、N、またはS原子）で置換された「アルキル」基を意味する。1つのタイプのヘテロアルキル基は「アルコキシ」基である。
「アルケニル」という用語は、本明細書では、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を持つ不飽和の直線状炭化水素または分岐炭化水素を意味する（例えば炭素原子が2～12、2～10、または2～6個の直線状の基または分岐した基であり、本明細書ではそれぞれC2-C12-アルケニル、C2-C10-アルケニル、およびC2-C6-アルケニルと呼ぶ）。
「アルキニル」という用語は、本明細書では、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を持つ不飽和の直線状炭化水素または分岐炭化水素を意味する（例えば炭素原子が2～12、2～10、または2～6個の直線状の基または分岐した基であり、本明細書ではそれぞれC2-C12-アルキニル、C2-C10-アルキニル、およびC2-C6-アルキニルと呼ぶ）。
「シクロアルキル」という用語は、炭素が3～12、3～8、4～8、または4～6個の1価の飽和した環式、二環式、または架橋環式（例えばアダマンチル）炭化水素基を意味し、本明細書では例えばシクロアルカンに由来するものを「C4-8-シクロアルキル」と呼ぶ。特に断わらない限り、シクロアルキル基は場合により1つ以上の環位置において例えばアルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミドまたはカルボキシアミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバミン酸、炭酸塩、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロ、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、硫酸塩、硫化物、スルホンアミド、スルホニル、またはチオカルボニルによって置換されている。ある実施形態では、シクロアルキル基は置換されていない、すなわち非置換である。
「シクロヘテロアルキル」という用語は、炭素が3～12、3～8、4～8、または4～6個の1価の飽和した環式、二環式、または架橋環式炭化水素基で、その中のシクロアルカンの少なくとも1個の炭素がヘテロ原子（例えばN、O、および／またはSなど）で置換されているものを意味する。
「シクロアルキレン」という用語は、1つ以上の環結合の位置が不飽和であるシクロアルキル基を意味する。
「部分的に不飽和の炭素環」という用語は、環原子の間に少なくとも1つの二重結合を含有する1価の環式炭化水素で、炭素環の少なくとも1つの環が芳香族でないものを意味する。部分的に不飽和の炭素環は、数オーリング炭素原子に従って特徴づけることができる。例えば部分的に不飽和の炭素環は、5～14、5～12、5～8、または5～6個の環炭素原子を含有することができ、したがってそれぞれ5～14、5～12、5～8、または5～6員の部分的に不飽和の炭素環と呼ばれる。部分的に不飽和の炭素環は、単環式炭素環、二環式炭素環、三環式炭素環、架橋した炭素環、スピロ環式炭素環、または他の炭素環系の形態が可能である。代表的な部分的に不飽和の炭素環基に包含されるのは、部分的に不飽和のシクロアルケニル基と二環式炭素環基である。特に断わらない限り、部分的に不飽和の炭素環基は、場合により1つ以上の環位置で、例えばアルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミドまたはカルボキシアミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバミン酸、炭素塩、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、硫酸塩、硫化物、スルホンアミド、スルホニル、またはチオカルボニルで置換されている。ある実施形態では、部分的に不飽和の炭素環は置換されていない、すなわち非置換である。
「アリール」という用語は本分野で知られており、炭素環芳香族基を意味する。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル、アントラセニルなどが包含される。「アリール」という用語には、2つ以上の炭素環を持っていて2個以上の炭素が2つの隣接した環（環は「縮合環」である）に共通しているポリ環式環系が包含され、その中の環の少なくとも1つは芳香族であり、他の環としては例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、および／またはアリールが可能である。特に断わらない限り、芳香族環は、1つ以上の環位置において、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミドまたはカルボキシアミド、カルボン酸、-C(O)アルキル、-CO2アルキル、カルボニル、カルボキシル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール部分、-CF3、-CNなどで置換することができる。ある実施形態では、芳香族環は1つ以上の環位置において、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、またはアルコキシルで置換されている。ある別の実施形態では、芳香族環は置換されていない、すなわち非置換である。ある実施形態では、アリール基は6～10員の環構造である。
「ヘテロシクリル」と「複素環基」という用語は本分野で知られており、飽和した、部分的に不飽和の、または芳香族の3員～10員環構造または3～7員環で、その環構造に1～4個のヘテロ原子（窒素、酸素、および硫黄など）を包含しているものを意味する。ヘテロシクリル基の中の環原子の数は、5 Cx-Cxという命名法（ただしxは環原子の数を特定する整数である）を用いて特定することができる。例えばC3-C7ヘテロシクリル基は、1～4個のヘテロ原子（窒素、酸素、および硫黄など）を含有する飽和した、または部分的に不飽和の3～7員環構造を意味する。「C3-C7」という指定は、環原子位置を占める任意のヘテロ原子を含めて複素環が合計で3～7個の環原子を含有することを示す。
「アミン」と「アミノ」という用語は本分野で知られており、置換されていないアミンと置換されたアミンの両方（例えば一置換されたアミン、または二置換されたアミン）を意味し、置換基には、例えばアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルケニル、およびアリールを包含することができる。
「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語は本分野で知られており、上に定義したアルキル基で、それに酸素基が結合したものを意味する。代表的なアルコキシ基に包含されるのは、メトキシ、エトキシ、t-ブトキシなどである。
「エーテル」は、酸素によって共有結合した2つの炭化水素である。したがってアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシル（-O-アルキル、-O-アルケニル、-O-アルキニルなどの1つによって表わせるものなど）であるか、アルコキシルに似ている。
「カルボニル」という用語は、本明細書では、基-C(O)を意味する-。
「オキソ」という用語は、2価の酸素原子-O-を意味する。
「カルボキサミド」という用語は、本明細書では基-C(O)NRR'を意味し、その中のRとR'は同じでも異なっていてもよい。RおよびR'として、例えば独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルが可能である。
「カルボキシ」という用語は、本明細書では、基-COOHまたはその対応する塩（例えば-COONaなど）を意味する。
「アミド」または「アミド」または「アミジル」という用語は、本明細書では、-R1C(O)N(R2)-、-R1C(O)N(R2)R3-、-C(O)NR2R3、または-C(O)NH2の形の基を意味する（その中のR1、R2、およびR3は、例えば互いに独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、アリール、アリールアルキル、カルバミン酸、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、水素、ヒドロキシル、ケトン、またはニトロである）。
本開示の化合物は1つ以上のキラル中心および／または二重結合を含有することができ、したがって立体異性体（幾何異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーなど）として存在することができる。「立体異性体」という用語は、本明細書で用いられるときには、あらゆる幾何異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーからなる。これら化合物は、不斉な炭素原子の周囲の置換基の立体配座およびまたは観察される光学回転に応じて記号「R」または「S」か、「+」または「-」によって指定することができる。本発明には、これら化合物のさまざまな立体異性体とその混合物が包含される。立体異性体には鏡像異性体とジアステレオマーが包含される。鏡像異性体またはジアステレオマーの混合物は命名法において(±)"で示すことができるが、当業者は、ある構造がキラル中心を黙示的に示している可能性を認識しているであろう。化学構造（例えば一般的な化学構造）の図解表示には、指定された化合物のあらゆる立体異性体形態が包含されると理解するが、異なる指示がある場合は別である。本明細書でやはり考慮されるのは、高光学純度の化合物を含む、本質的にその化合物からなる、またはその化合物からなる組成物であり、その組成物は、所与の化合物の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の単一の鏡像異性体（例えば所与の化合物の少なくとも約99％のR鏡像異性体）を含む、から本質的になる、またはからなることができる。
核酸と反応
「核酸」と「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では、（2-デオキシ-D-リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、（D-リボースを含有する）ポリヌクレオチド、およびプリン塩基またはピリミジン塩基のNグリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチドを意味する。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド』という用語の間に長さの違いは想定されておらず、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造だけを意味する。したがってこれらの用語は、二本鎖DNAと一本鎖DNAのほか、二本鎖RNAと一本鎖RNAを包含する。本発明で使用するため、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖、またはリン酸骨格が修飾されたヌクレオチド類似体のほか、非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド類似体も含むことができる。
オリゴヌクレオチドは適切な任意の方法によって調製することができ、方法には、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法；Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法；Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters 22:1859-1862のホスホジエステル法；およびアメリカ合衆国特許第4,458,066号の固体支持法などの方法による直接的化学合成が包含される（そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれている）。オリゴヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドの複合体の合成法の概説はGoodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187に提示されており、それが参照によって本明細書に組み込まれている。
「増幅反応」という用語は、結果として鋳型核酸配列のコピーが増加したり、鋳型核酸が転写されたりする任意の化学反応（酵素反応が包含される）を意味する。増幅反応には、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（リアルタイムPCR（アメリカ合衆国特許第4,683,195号と第4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990）を参照されたい）が包含される）、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）（Barany et al.、アメリカ合衆国特許第5,494,810号を参照されたい）が包含される。代表的な「増幅反応条件」または「増幅条件」は、典型的には、2工程サイクルまたは3工程サイクルのいずれかを含む。2工程サイクルは高温変性工程の後にハイブリダイゼーション／伸長（または連結）工程を持つ。3工程サイクルは、変性工程、その後にハイブリダイゼーション工程、その後に別の伸長工程を含む。
「標的、「標的配列」、「標的領域」、および「標的核酸」という用語は本明細書では同義語であり、核酸のうちの増幅、シークエンシング、または検出すべき領域または配列を意味する。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書では、2つの一本鎖核酸により相補的な塩基対が形成されることで二本鎖構造が形成されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間で、またはミスマッチがある小さな領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖の間で起こることができる。完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションであることが非常に好ましい条件は、「厳しいハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定な二本鎖は、より厳しくないハイブリダイゼーション条件下で実現することができる；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件を適切に調節することによって制御することができる。核酸技術の当業者は、本分野で提供されているガイダンス（例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4):227-259；およびOwczarzy et al., 2008, Biochemistry, 47: 5336-5353を参照されたい。これらは参照によって本明細書に組み込まれている）に従い、多数の変数（例えばオリゴヌクレオチドの長さと塩基対組成、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生が包含される）を経験的に考慮して二本鎖安定性を決定することができる。
「プライマー」という用語は、本明細書では、適切な条件下でDNA合成の開始点として機能できるオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件に包含されるのは、適切なバッファの中で4つの異なるヌクレオシド三リン酸と1つの伸長剤（例えばDNAポリメラーゼまたは逆転車酵素）の存在下にて適切な温度で核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件である。
プライマーは一本鎖DNAであることが好ましい。プライマーの適切な長さはプライマーの想定される用途に依存するが、典型的には約6～約225ヌクレオチドの範囲であり、そこには中間範囲（15～35ヌクレオチド、18～75ヌクレオチド、および25～150ヌクレオチドなど）が包含される。一般に短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映している必要はないが、鋳型にハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅に適したプライマーの設計は本分野では周知であり、本明細書に引用されている文献に記載されている。
プライマーは、プライマーの検出または固定化を可能にするがプライマーの基本的特性（DNA合成の開始点として機能する特性）は変えない追加の特徴を含むことができる。例えばプライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが増幅された生成物のクローニングまたは検出を容易にする追加核酸配列、または（例えばプロモータを包含することにより）RNAの転写を可能にしたり、（例えば5’-UTR（内部リボソーム侵入部位（IRES）または3’-UTRエレメント（ポリ(A)n配列（ただしnは約20～約200の範囲である）など）を包含することにより）タンパク質の翻訳を可能にしたりする追加核酸配列を5’末端に含有することができる。プライマーで鋳型がハイブリダイズするのに十分に相補的な領域は、本明細書ではハイブリダイジング領域と呼ばれる。
本明細書では、プライマーは、十分に厳しい条件下での増幅反応で用いられるとき主に標的核酸にハイブリダイズするのであれば、標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマーは、プライマー-標的二本鎖安定性がそのプライマーとサンプル中に見られる他の任意の配列の間に形成される二本鎖の安定性よりも大きい場合に、標的配列に対して特異的である。当業者は、さまざまな因子（塩条件のほか、プライマーの塩基組成やミスマッチの位置など）がプライマーの特異性に影響を与えることと、定型的な実験によるプライマー特異性の確認が多くの場合に必要とされることを認識しているであろう。プライマーが標的配列とだけ安定な二本鎖を形成することのできるハイブリダイゼーション条件を選択することができる。したがって適度に厳しい増幅条件下で標的特異的プライマーを用いると、標的プライマー結合部位を含有する標的配列を選択的に増幅することができる。
本明細書では、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合の触媒となる酵素を意味する。「DNAポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合の触媒となる。既知のDNAポリメラーゼに包含されるのは、例えばピュロコックス・フリオスス（Pfu）DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ、およびサーマス・アクアティカス（Taq）DNAポリメラーゼなどである。「RNAポリメラーゼ」はリボヌクレオチドの重合の触媒となる。DNAポリメラーゼの上記の例はDNA依存性DNAポリメラーゼとしても知られる。RNA依存性DNAポリメラーゼもDNAポリメラーゼの範囲に入る。逆転写酵素（レトロウイルスによってコードされるウイルスポリメラーゼが包含される）はRNA依存性DNAポリメラーゼの一例である。RNAポリメラーゼ（「RNAP」）の既知の例に包含されるのは、例えばバクテリオファージポリメラーゼ（その非限定的な例は特に、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、および大腸菌RNAポリメラーゼなど）である。RNAポリメラーゼの上記の例はDNA依存性RNAポリメラーゼとしても知られる。上記の任意の酵素のポリメラーゼ活性は、先行技術で周知の手段によって測定することができる。
「プロモータ」という用語は、RNAポリメラーゼと他のトランス作用性転写因子に、シス作用性DNA配列を含むDNA鋳型からのRNA転写の開始を指示するシス作用性DNA配列を意味する。
本明細書では、「配列特定バイオポリマー」という表現は、特定の一次配列を持つバイオポリマーを意味する。配列特定バイオポリマーは、遺伝子が特定の一次配列を持つバイオポリマーをコードしている場合には、遺伝子によってコードされる規定されたバイオポリマーと同等である可能性がある。
本明細書では、「発現鋳型」は、少なくとも1つのRNAを転写して配列特定バイオポリマー（例えばポリペプチドまたはタンパク質）に翻訳するための基質として機能する核酸を意味する。発現鋳型には、DNAまたはRNAからなる核酸が包含される。発現鋳型のための核酸として利用するためのDNAの適切な供給源に包含されるのは、ゲノムDNA、cDNA、およびcDNAに変換することのできるRNAである。ゲノムDNA、cDNA、およびRNAは、任意の生物系供給源（特に組織サンプル、生検、スワブ、痰、血液サンプル、糞便サンプル、尿サンプル、スクレイピングなど）からのものが可能である。そのゲノムDNA、cDNA、およびRNAは、宿主細胞またはウイルスを起源とするものと、任意の種（現存の生物と絶滅した生物が包含される）からのものが可能である。本明細書では、「発現鋳型」と「転写鋳型」は同じ意味を持ち、交換可能に用いられる。
本明細書では、「翻訳鋳型」は、リボソームが利用してポリペプチドまたはタンパク質を合成することのできる発現鋳型から転写されるRNA生成物を意味する。
本明細書では、カップルした転写／翻訳（「Tx/Tl」）は、RNAと配列特定バイオポリマーの両方を同じ抽出液から新たに合成することを意味する。例えば所与の配列特定バイオポリマーのカップルした転写／翻訳は、発現鋳型と、その発現鋳型から翻訳鋳型を生成させることのできるポリメラーゼとを含有する抽出液の中で起こることができる。カップルした転写／翻訳は、コグネイト発現鋳型と、抽出液の調製に使用される生物からのポリメラーゼを用いて起こることができる。カップルした転写／翻訳は、外部から供給される発現鋳型と、抽出液の調製に使用される生物とは異なる直交宿主生物からのポリメラーゼを用いて起こることもできる。酵母から調製される抽出液の場合には、外部から供給される発現鋳型の一例に、バクテリオファージポリメラーゼ特異的プロモータに機能可能にカップルした翻訳オープンリーディングフレームが包含され、直交宿主生物からのポリメラーゼの一例に、対応するバクテリオファージポリメラーゼが包含される。
「反応混合物」という用語は、本明細書では、所与の反応の実施に必要な試薬を含有する溶液を意味する。「増幅反応混合物」は、増幅反応の実施に必要な試薬を含有する溶液を意味し、典型的にはオリゴヌクレオチドプライマーとDNAポリメラーゼを適切なバッファの中に含有する。「PCR反応混合物」は、典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼ（最も典型的には耐熱性DNAポリメラーゼ）、dNTP、および2価金属カチオンを適切なバッファの中に含有する。
無細胞タンパク質合成（CFPS）
開示されている主題は、一部が、無細胞タンパク質合成のための方法、系、成分、および組成物に関係する。無細胞タンパク質合成（CFPS）は既知であり、先行技術に記載されている。（例えばアメリカ合衆国特許第6,548,276号；アメリカ合衆国特許第7,186,525号；アメリカ合衆国特許第8,734,856号；アメリカ合衆国特許第7,235,382号；アメリカ合衆国特許第7,273,615号；アメリカ合衆国特許第7,008,651号；アメリカ合衆国特許第6,994,986号アメリカ合衆国特許第7,312,049号；アメリカ合衆国特許第7,776,535号；アメリカ合衆国特許第7,817,794号；アメリカ合衆国特許第8,298,759号；アメリカ合衆国特許第8,715,958号；アメリカ合衆国特許第9,005,920号；アメリカ合衆国公開第2014/0349353号、およびアメリカ合衆国公開第2016/0060301号を参照されたい。その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。「CFPS反応混合物」は、典型的には、粗の、または部分精製した酵母抽出液、RNA翻訳鋳型、およびRNA翻訳鋳型から無細胞タンパク質合成を促進するのに適した反応バッファを含有する。いくつかの側面では、CFPS反応混合物は外来性RNA翻訳鋳型を含むことができる。他の側面では、CFPS反応混合物は、DNA依存性RNAポリメラーゼのためのプロモータエレメントに機能可能に連結されたオープンリーディングフレームをコードするDNA発現鋳型を包含することができる。これら他の側面では、CFPS反応混合物は、オープンリーディングフレームをコードするRNA翻訳鋳型の転写を指示するDNA依存性RNAポリメラーゼも包含することができる。これら他の側面では、追加のNTPと2価カチオン補因子をCFPS反応混合物が包含することができる。反応混合物は、反応を可能にするのに必要な全試薬を含有している場合には完全であると言われ、必要な試薬の一部だけを含有する場合には不完全であると言われる。反応成分は、簡便さ、保管安定性を理由として、または用途に応じた成分の濃度の調整を可能にするため、通常はそれぞれが全成分の一部を含有する別々の溶液として保管することと、反応成分を反応の前に組み合わせて完全な反応混合物を作ることを当業者は理解しているであろう。さらに、市販するため反応成分を別々に包装することと、有用な市販のキットは本発明の反応成分の任意の一部を含有できることを当業者は理解しているであろう。
配列特定バイオポリマーを調製するためのプラットフォーム
本発明の1つの側面は、タンパク質の配列特定バイオポリマーをインビトロで調製するためのプラットフォームである。配列特定ポリマーまたはタンパク質をインビトロで調製するためのプラットフォームは、上記のようにGRO生物からの細胞抽出液を含む。CFPSは細胞の粗ライセートから調製された一群の触媒タンパク質を利用するため、細胞抽出液（その組成は増殖培地、溶解法、および処理条件に敏感である）は抽出液に基づくCFPS反応の最も重要な成分である。無細胞タンパク質合成のための抽出液成分を調製するための多彩な方法が存在しており、その中に包含されるのは、Michael C. Jewettらが「無細胞タンパク質合成の方法」という名称で2014年3月14日に出願したアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第14/213,390号（2014年10月2日にアメリカ合衆国特許出願公開第2014/0295492号として公開）と、Michael C. Jewettらが「非標準的なアミノ酸を含有するタンパク質を用いたインビトロでの改善されたタンパク質合成法」という名称で2015年8月31日に出願したアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第14/840,249号（2016年3月3日にアメリカ合衆国特許出願公開第2016/0060301号として公開）である（その内容は参照によって組み込まれている）。
プラットフォームは、発現鋳型、翻訳鋳型、または発現鋳型と翻訳鋳型の両方を含むことができる。発現鋳型は、少なくとも1つのRNAを転写して配列特定バイオポリマー（例えばポリペプチドまたはタンパク質）にすることのできる基質として機能する。翻訳鋳型は、配列特定バイオポリマーをリボソームが合成するのに使用できるRNA生成物である。ある実施形態では、プラットフォームは発現鋳型と翻訳鋳型の両方を含む。ある特別な実施形態では、プラットフォームとして、同じ細胞抽出液から翻訳鋳型と配列特定バイオポリマーが合成されるカップルした転写／翻訳（「Tx/Tl」）系が可能である。
プラットフォームは、発現鋳型から翻訳鋳型を生成させることのできる1つ以上のポリメラーゼを含むことができる。ポリメラーゼは、外部から供給すること、または抽出液の調製に用いられる生物から供給することができる。いくつかの特別な実施形態では、ポリメラーゼは、抽出液の調製に用いられる生物から、および／または抽出液の調製に用いられる生物のゲノムの中の組み込み部位に存在するプラスミドから発現させる。
プラットフォームは直交翻訳系を含むことができる。直交翻訳系は、生物の直交翻訳機械と並列および／または独立に作動する設計にされた1つ以上の直交成分を含むことができる。ある実施形態では、直交翻訳系および／または直交成分は非天然アミノ酸が組み込まれる構成にされている。直交成分として直交タンパク質または直交RNAが可能である。ある実施形態では、直交タンパク質として直交合成酵素が可能である。ある実施形態では、直交RNAとして直交tRNAまたは直交rRNAが可能である。直交rRNA成分の一例は、Michael C. Jewettらが「連結されたリボソームとそれを作製および利用する方法」という名称で2015年5月29日に出願した出願番号第PCT/US2015/033221号（現在はWO2015184283として公開）と、Michael C. Jewettらが「連結されたサブユニットを持つリボソーム」という名称で2016年11月29日に出願したアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第15/363,828号（2017年3月16日にアメリカ合衆国特許出願公開第2017/0073381号として公開）に記載されており、その内容は参照によって組み込まれている。ある実施形態では、生体内またはインビトロでオリゴヌクレオチド鋳型を発現させることによって1つ以上の直交成分を調製することができる。その1つ以上の直交成分は、遺伝子再組み換え生物の中に存在するプラスミドから発現させること、遺伝子再組み換え生物のゲノム内の組み込み部位から発現させること、遺伝子再組み換え生物の中に存在するプラスミドと、遺伝子再組み換え生物のゲノム内の組み込み部位の両方から同時発現させること、インビトロでの転写反応と翻訳反応で発現すること、または外部から因子（例えばプラットフォームまたは反応混合物に添加される直交tRNAまたは直交合成酵素）として添加することができる。
CFPS反応の生理化学的環境を変えて細胞質をよりよく模倣するようにすると、タンパク質合成活性を改善することができる。以下のパラメータを単独で、または1つ以上の他の成分と組み合わせて考慮し、粗細胞抽出液（例えばS12、S30およびS60の抽出液）に基づいてロバストなCFPS反応プラットフォームを改善することができる。
温度は、CFPSに適した任意の温度が可能である。温度は約10℃～約40℃という一般的な範囲にすることができ、その中にはこの一般的な範囲内の中間の特定の範囲である約15℃～約35℃、約15℃～約30℃、約15℃～約25℃が包含される。いくつかの側面では、反応温度として約15℃、約16℃、約17℃、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃が可能である。
CFPS反応物は、CFPSに適した任意の有機アニオンを含むことができる。ある側面では、有機アニオンとしてグルタミン酸塩、酢酸塩が特に可能である。ある側面では、有機アニオンの濃度は独立に約0 mM～約200 mMという一般的な範囲にあり、その中にはこの一般的な範囲内の中間の特定の値である約0 mM、約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約110 mM、約120 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、および約200 mMなどが特に包含される。
CFPS反応物は、CFPSに適した任意のハロゲン化物アニオンも含むことができる。ある側面では、ハロゲン化物アニオンとして、塩化物、臭化物、ヨウ化物が特に可能である。1つの好ましいハロゲン化物アニオンは塩化物である。一般に、ハロゲン化物アニオンの濃度は、反応物の中に存在する場合には約0 mM～約200 mMという一般的な範囲内であり、その中にはこの一般的な範囲内の中間の特定の値である有機アニオンに関して本明細書に一般に開示されている値などが包含される。
CFPS反応物は、CFPSに適した任意の有機カチオンも含むことができる。ある側面では、有機カチオンとしてポリアミン（特にスペルミジンまたはプトレシンなど）が可能である。ポリアミンがCFPS反応物の中に存在することが好ましい。ある側面では、反応物の中の有機カチオンの濃度は一般に約0 mM～約3 mM、約0.5 mM～約2.5 mM、約1 mM～約2 mMが可能である。ある側面では、2つ以上の有機カチオンが存在することできる。
CFPS反応物は、CFPSに適した任意の無機カチオンを含むことができる。例えば適切な無機カチオンに、1価カチオン（特にナトリウム、カリウム、リチウムなど）; 2価カチオン（特にマグネシウム、カルシウム、マンガンなど）を含めることができる。ある側面では、無機カチオンはマグネシウムである。そのような側面では、マグネシウムの濃度は約1 mM～約50 mMという一般的な範囲内にすることができ、その中にはこの一般的な範囲内の中間の特定の値である約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mMなどが特に包含される。好ましい側面では、無機カチオンの濃度は約4 mM～約9 mMという特定の範囲内が可能であり、より好ましくは約5 mM～約7 mMの範囲内である。
CFPS反応物はNTPを含む。ある側面では、この反応物はATP、GTP、CTP、およびUTPを使用する。ある側面では、個々のNTPの濃度は約0.1 mM～約2 mMの範囲内である。
CFPS 反応物は、CFPSに適した任意のアルコールも含むことができる。ある側面では、アルコールとしてポリオール、より具体的にはグリセロールが可能である。ある側面では、アルコールは一般的な範囲の約0％(v/v)～約25％(v/v)であり、その中には特定の中間値である約5％(v/v)、約10％(v/v)、および約15％(v/v)、および約20％(v/v)が特に包含される。
タンパク質と配列特定バイオポリマーを調製する方法
本発明の1つの側面は、インビトロでの配列特定バイオポリマーまたはタンパク質の無細胞タンパク質合成の方法である。この方法は、配列特定バイオポリマーをコードするRNA鋳型を、上記のGROからの細胞抽出液を含む反応混合物と接触させることを含む。配列特定バイオポリマーの無細胞タンパク質合成の方法は以前に記載されている［1、18、26］。
ある実施形態では、配列特定バイオポリマーまたはタンパク質は、アミノ酸を含む方法またはプラットフォームによって調製される生成物を含む。ある実施形態では、アミノ酸として天然アミノ酸が可能である。本明細書では、天然アミノ酸は、普遍遺伝暗号のコドンによって直接コードされるタンパク質生成アミノ酸である。ある実施形態では、アミノ酸として非天然アミノ酸が可能である。本明細書では、非天然アミノ酸は、タンパク質を生成しないアミノ酸である。非天然アミノ酸は、非標準的なアミノ酸（NSAA）または非カノニカルなアミノ酸と呼ぶこともできる。ある実施形態では、配列特定バイオポリマーまたはタンパク質は複数の非天然アミノ酸を含むことができる。ある特別な実施形態では、配列特定バイオポリマーまたはタンパク質は、複数の同じ非天然アミノ酸を含むことができる。配列特定バイオポリマーまたはタンパク質は、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、または少なくとも40個の、または同じか異なる非天然アミノ酸を含むことができる。
非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸の非限定的な例に包含されるのは、p-アセチル-L-フェニルアラニン、p-ヨード-L-フェニルアラニン、O-メチル-L-チロシン、p-プロパルギルオキシフェニルアラニン、p-プロパルギル-フェニルアラニン、L-3-(2-ナフチル)アラニン、3-メチル-フェニルアラニン、O-4-アリル-L-チロシン、4-プロピル-L-チロシン、トリ-O-アセチル-GlcNAcpβ-セリン、L-ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、p-アジド-L-フェニルアラニン、p-アシル-L-フェニルアラニン、p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン、L-ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p-ブロモフェニルアラニン、p-アミノ-L-フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；メチオニンアミノ酸の非天然類似体；ロイシンアミノ酸の非天然類似体；イソロイシンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロン酸塩、24ufa24hor、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノで置換されたアミノ酸、またはこれらの組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を持つアミノ酸；スピン標識されたアミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化および／または光異性化アミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体を含有するアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重い原子で置換されたアミノ酸；化学的に、または光で切断可能なアミノ酸；伸長した側鎖を持つアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換されたアミノ酸；炭素が結合した糖を含有するアミノ酸；レドックス活性なアミノ酸；a-ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α,α二置換されたアミノ酸；β-アミノ酸；γ-アミノ酸、プロリンまたはヒスチジン以外の環状アミノ酸、およびフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン以外の芳香族アミノ酸である。
本明細書に記載の方法により、配列特定バイオポリマーまたはタンパク質をRNA鋳型に非常に忠実に調製することが可能になる。言い換えると、本明細書に記載の方法により、RNA鋳型によってコードされる非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸の正確な組み込みが可能になる。ある実施形態では、RNA鋳型によってコードされる配列特定バイオポリマーは、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、または少なくとも40個の非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸を含み、この方法から調製される生成物は、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％のコードされた非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸を包含する。
本明細書に記載の方法により、この方法によって調製される複数の生成物の調製も可能になる。ある実施形態では、この方法によって調製される生成物の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％が完全長である。ある実施形態では、RNA鋳型によってコードされる配列特定バイオポリマーは、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、または少なくとも40個の非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸を含み、この方法によって調製される複数の生成物の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％は、コードされた非天然アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、および／または非標準的アミノ酸を100％包含する。
ある実施形態では、配列特定バイオポリマーまたはタンパク質は、治療製品、診断製品、生体材料製品、接着製品、バイオコンポジット製品、または農業製品をコードする。
雑
本明細書に記載されているあらゆる方法は、本明細書に異なる記載がない場合や、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、適切な任意の順番で実施することができる。本明細書に示されているあらゆる実施例、または例示の用語（例えば「など」）は、単に本発明をよりわかりやすくすることを意図しており、本発明の範囲に制約を課すことはないが、請求項に異なる記載がある場合は別である。明細書の中のどの記述も、請求項にない本発明の実践に不可欠な何らかの要素を示すと解釈されてはならない。
本発明の好ましい側面が本明細書に記載されており、その中には、本発明を実施する上で発明者らに知られている最良の様式が包含される。これら好ましい側面のバリエーションは、上記の記述を読んだ当業者に明らかになろう。発明者らは、当業者がそのようなバリエーションを適切であるとして利用することを期待しており、しかも発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外のやり方で実施されることを想定している。したがって本発明には、本明細書に添付の請求項に記載されている主題のあらゆる改変と等価物が、適用可能な法律によって許容される範囲で包含される。さらに、本明細書に異なる記載がない場合や、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、上記の要素の任意の組み合わせが、その可能なあらゆるバリエーションで本発明に包含される。
遺伝暗号再プログラミングのため化学的基質を拡張する
本明細書に開示されている主題は、配列特定ポリマーの合成に使用できる方法、系、成分、および組成物に関する。特に、これらの方法、系、成分、および組成物は、非標準的アミノ酸単量体と非アミノ酸単量体を含む新規な基質を配列特定ポリマーに組み込むのに使用できる。本明細書に開示されているように、その新規な基質は、フレキシザイムを触媒とする反応によるtRNAのアシル化に利用することができる。したがってその新規な基質でアシル化されたtRNAは、その新規な基質を配列特定ポリマーに組み込むための合成プラットフォームで利用することができる。
本明細書に開示されている成分は、アシル化tRNA分子と、アシル化tRNA分子を調製するためのドナー分子を含む。開示されているアシル化tRNA分子は、ドナー分子の中に存在していて本明細書で「R」と呼ぶことのできる部分を用いてアシル化されており、ポリマー（例えば配列特定ポリマー）に組み込むことができる。Rはアミノ酸部分（その非限定的な例は、アルファ-アミノ酸部分、ベータ-アミノ酸部分、またはガンマ-アミノ酸部分などである）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、アシル化tRNA分子は、
Figure 2023514584000010
 によって規定される式を持つ。ただしこの式において、
tRNAは3’末端リボヌクレオチド（例えば3’末端アデノシンのリボースとで形成されるエステル結合）を介して連結されたトランスファーRNAである。
いくつかの実施形態では、Rは、アルキル（例えばブチル）；場合によりアミノで置換されたシクロアルキル（例えばシクロブチル、シクロペンチル、またはシクロへキシル）；ヘテロシクロアルキル（例えば環状第2級アミン（ピペリジニルまたはピペラジニルなど））； (ヘテロシクロアルキル)アルキル（例えば環状第2級アミン（(ピペリジニル)メチルまたは(ピペラジニル)メチルなど））；アルケニル（例えば1-ブテン-4-イル）；シアノアルキル（例えばシアノメチルまたはシアノエチル）；アミノアルキル（例えばアミノプロピル、アミノブチル、アミノペンチル、1,1-ジメチル-3-アミノ-プロパニル、メチルアミノプロピル、またはアミノへキシル）；アミノアルケニル（例えば1-アミノ-2-プロペニル）；カルボキシルアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル（例えばメチルカルボキシエチルエステル）；ハロアルキル（例えば2-ブロモ-プロパン-2-イル）；ニトロアルキル（例えばニトロメチル）；アリール（例えばフェニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、ピリジニル、クマリニル）；(アリール)アルキル（例えばベンジル、(フェニル)エチル、または(ピロリル)エチル)）；または(アリール)アルケニル（例えば(フェニル)エテニル)）から選択することができ；これらの中のアリールまたはヘテロアリールは、場合により、ヒドロキシル（例えば3,4-ジヒドロキシルフェニル）、ヒドロキシルアルキル（例えばヒドロキシルメチル）、アミノ、アミノアルキル（例えばアミノメチル）、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル（例えばニトロメチル）、ハロ、アルコキシ（例えばメトキシ）、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている。
他の実施形態では、Rは、式：
Figure 2023514584000011
 を持つ（ただしこの式において、
nは0～6であり；
R1またはR2は、水素、場合によりアミノで置換されたアルキル（例えばへキシル）；シクロアルキル（例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロへキシル）；ヘテロシクロアルキル（例えばピペリジニル）；(ヘテロシクロアルキル)アルキル（例えば(ピペリジニル)メチル)）；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール（例えばフェニル）；ヘテロアリール（例えばピリジニル）；アリール(アルキル)（例えばベンジル）；ヘテロアリール(アルキル)（例えば(ピリジニル)メチル)）；(アリール)アルケニルから選択され；これらの中のアリールまたはヘテロアリールは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されるか；
R1とR2は合わさって、場合により、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換された炭素環、場合により3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成する。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は置換された(アリール)アルキルである。場合により、R、R1、またはR2は、(3,4-ジヒドロキシフェニル)メチル、(ピロル-2-イル)メチル、および(4-アミノ-フェニル)メチルから選択することができる。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は置換されたフェニルである。場合により、Rは、4-ニトロフェニル、4-シアノフェニル、4-アジドフェニル、3-アセチルフェニル、4-ニトロメチフェニル、2-フルオロフェニル、4-メトキシフェニル、3-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル、3-アミノ-4-ニトロフェニル、および3-ニトロ-4-アミノフェニルから選択することができる。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2はヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリールである。場合により、R、R1、またはR2は、ピリジニル（例えばピリジン-4-イル）、フルオロピリジニル（例えば3-フルオロ-ピリジン-3-イル）、クマリニル、ピロリル（例えばピロル-2-イル）、チオフェン-2-イル、および5-アミノメチル-フラン-3-イルから選択することができる。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は第1級アミン基または第2級アミン基を含む。場合により、R、R1、またはR2は、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノブチル、1,1-ジメチル-3-アミノプロパニル、3-メチルアミノ-プロパニル、6-アミノへキシル、3-アミノ-1-プロペニル、2-アミノシクロブチル（例えば2(R)-アミノシクロブチルまたは2(S)-アミノシクロブチル）、2-アミノシクロペンチル（例えば2(R)-アミノシクロペンチルまたは2(S)-アミノシクロペンチル）、2-アミノシクロへキシル（例えば2(R)-アミノシクロへキシルまたは2(S)-アミノシクロへキシル）から選択することができる。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は、場合によりアミノで置換されたシクロアルキル基を含む。場合により、R、R1、またはR2は、シクロブチルまたはアミノシクロブチル（2-アミノシクロブチル（例えば2(R)-アミノシクロブチルまたは2(S)-アミノシクロブチル）など）、シクロペンチル、またはアミノシクロペンチル（2-アミノシクロペンチル（例えば2(R)-アミノシクロペンチルまたは2(S)-アミノシクロペンチル）など）、およびシクロへキシルまたはアミノシクロへキシル（2-アミノシクロへキシル（例えば2(R)-アミノシクロへキシルまたは2(S)-アミノシクロへキシル）など）から選択することができる。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は環状第2級アミン（ピペリジニルまたはピペラジニルなど）を含む。場合により、R、R1、またはR2は、ピペリジン-4-イル、(ピペリジン-4-イル)メチル、ピペラジン-4-イル、および(ピペラジン-4-イル)メチルから選択される。
アシル化tRNA分子のいくつかの実施形態では、R、R1、またはR2は、アルキル（例えばブチル）、アルケニル（例えば3-ブテニル）、シアノアルキル（例えばシアノメチルまたはシアノエチル）、およびアルキルカルボキシルアルキルエステル（例えばメチルカルボキシルエチルエステル）から選択される。
適切なR部分の非限定的な例に包含できるのは、本出願の図15に開示されているR部分、R1部分、またはR2部分である。このように開示されているR部分、R1部分、またはR2部分はポリマー（例えば本明細書に開示されている配列特定ポリマー）に組み込むことができる。
開示されているアシル化tRNA分子は適切な任意のtRNA分子を含むことができる。適切なtRNA分子の非限定的な例に包含できるのは、任意の天然アミノ酸に対応するアンチコドンを含むtRNA分子である。
開示されているアシル化tRNA分子は、tRNA分子とドナー分子をフレキシザイム（Fx）の存在下で反応させることによって調製することができる。
いくつかの実施形態では、調製法は、（i）フレキシザイム（Fx）：（ii）tRNA分子；および（ii）式：
Figure 2023514584000012
 を持つドナー分子（この式において、
tRNAは3'末端リボヌクレオチドを介して（例えば3’末端アデノシンのリボースとで形成されるエステル結合によって）連結されたトランスファーRNAであり；
Rは上に定義されている通りであり；
XはOまたはSであり；
LGは離脱基である）という反応混合物の中で反応させることを含むことができる。
ドナー分子のための適切なR部分の非限定的な例に包含できるのは、本出願の図15に開示されているR部分である。適切なドナー分子の非限定的な例に包含されるのは、本出願の図20～22と27に開示されているドナー分子である。
この調製法において、FxはtRNAの3’末端リボヌクレオチドとドナー分子の間のアシル化反応の触媒となり、（例えばtRNA分子の3’末端アデノシンのリボースとR部分で形成されるエステル結合によって）アシル化tRNA分子が調製される。
適切な任意のFxを開示されている調製法で用いることができる。適切なFxの非限定的な例に含まれるのは、aFx、dFx、およびeFxである。
適切な任意のtRNAを調製法で用いることができる。調製法に適したtRNA分子の非限定的な例に包含できるのは、任意の天然アミノ酸に対応するアンチコドンを含むtRNA分子である。いくつかの実施形態では、tRNAはアンチコドンCAU（すなわちメチオニンのアンチコドン）を含む。他の実施形態では、tRNAは、アンチコドンGGU（すなわちトレオニンのアンチコドン）、アンチコドンGAU（すなわちイソロイシンのアンチコドン）、またはアンチコドンGGC（すなわちアラニンのアンチコドン）を含む。
調製法におけるR部分のためのドナー分子は、典型的には離脱基（LG）を含む。いくつかの実施形態では、LGはシアノメチル部分を含み、ドナー分子はシアノメチルエステル（CME）を含む。他の実施形態では、LGはジニトロベンジル部分を含み、ドナー分子はジニトロベンジルエステル（DNB）を含む。さらなる実施形態では、LGは(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジル部分を含み、ドナー分子は(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステル（ABT）を含む。
開示されている調製法は、アシル化tRNAの収率を最大にする条件下で実施される。いくつかの実施形態では、この調製法は、反応混合物を120時間反応させた後に反応混合物の中のtRNAの少なくとも約50％がアシル化される反応条件下で、好ましくは反応混合物を16時間反応させた後に反応混合物の中のtRNAの少なくとも約50％がアシル化される反応条件下で実施される。
開示されている方法、系、成分、および組成物を用いて配列特定ポリマーをインビトロおよび／または生体内で調製することができる。いくつかの実施形態では、開示されている方法を無細胞合成系で実施して配列特定ポリマーを調製することができ、そのときその配列特定ポリマーは、アシル化tRNA分子のアンチコドンに対応するコドンを含むmRNAを翻訳することによって調製される。
開示されている方法では、アシル化tRNA分子のR基が、mRNAの翻訳中に配列特定ポリマーに組み込まれる。開示されている方法のいくつかの実施形態では、アシル化tRNA分子のR基は、mRNAの翻訳中にmRNAの開始コドン（AUG）の位置で配列特定ポリマーに組み込まれる。開示されている方法の他の実施形態では、アシル化tRNA分子のR基は、mRNAの翻訳中にトレオニンのコドン（例えばACC）、イソロイシンのコドン（例えばAUC）、またはアラニンのコドン（例えばGCC）の位置で配列特定ポリマーに組み込まれる。
開示されている方法を実施し、非限定的な例としてポリオレフィンポリマー、アラミドポリマー、ポリウレタンポリマー、ポリケチドポリマー、共役ポリマー、D-アミノ酸ポリマー、β-アミノ酸ポリマー、γ-アミノ酸ポリマー、δ-アミノ酸ポリマー、ε-アミノ酸ポリマー、ζ-アミノ酸ポリマー、およびポリカーボネートポリマーから選択されるポリマーを調製することができる。
新規なドナー分子または単量体も本明細書に開示されている。その新規なドナー分子または単量体は本明細書に開示されているようにしてポリマー（例えば本明細書に開示されている配列特定ポリマー）に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、組み込まれた新規なドナー分子または単量体を含むポリマーは、式：
Figure 2023514584000013
 から選択される式を持つポリマー（ただしこの式において、
Rは上に定義された通りであり；
Yは、O、S、またはNである）として記述することができる。
「ポリマー」は、新規なドナー分子または単量体が例えば一端または両端、および／または内部に組み込まれたポリマーである。
説明用の実施形態
以下の実施形態は説明用であり、請求項の主題の範囲を制限する意図はない。
実施形態1。tRNAのアシル化、または合成tRNA（例えばマイクロヘリックスRNA）のアシル化のためのドナー分子としてのエステル基質またはチオエステル基質と、エステル基質とチオエステル基質を合成する方法（ただし前記エステル基質は、1）直線状（長い）炭素鎖（γ、δ、ε、およびζ-）アミノ酸、または2）シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘクスン、フラン、ピペリジン、またはピペラジン部分を含む環状アミノ酸に由来し、前記エステル基質は、シアノメチルエステル（CME）、ジニトロベンジルエステル（DNB）、または(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステル（ABT）の中に場合により存在する離脱基を含む）。
実施形態2。ドナー分子のドナー部分を用いてtRNAおよび／またはマイクロヘリックス分子をアシル化するための（例えばeFx、dFx、またはaFxを含む）フレキシザイム（Fx）系の利用（ただし前記ドナー部分は本明細書に開示されているように「R」と定義することができ、Rとして非カノニカルなアミノ酸基質または非アミノ酸基質が可能である。
実施形態3。非カノニカルなアミノ酸基質または非アミノ酸基質を用いたマイクロヘリックスまたはtRNAのアシル化。
実施形態4。あらかじめチャージされたtRNAをインビトロ（無細胞）タンパク質合成プラットフォームに添加することによる、配列特定ポリマーへの非カノニカルなアミノ酸基質または非アミノ酸基質の組み込み。
実施形態5。tRNAまたはマイクロヘリックスRNAのアシル化を実現するためのドナー分子とフレキシザイムの間の適合性に関する基準の同定。
実施形態6。非カノニカルな合成基質を用いてtRNA(fMet(CAU))を再定義するためのeFx、dFx、およびaFxの利用。
実施形態7。非カノニカルな合成基質を用いてtRNA(Pro1E2(GGU))を再定義するためのeFx、dFx、およびaFxの利用。
実施形態8。無細胞タンパク質合成系において転写されたmRNAの開始コドン（ATG）に非カノニカルな基質を組み込むための、再プログラムされたtRNAの利用。
実施形態9。無細胞タンパク質合成系において転写されたmRNAのThrコドン（ACC）に非カノニカルな基質を組み込むための、再プログラムされたtRNAの利用。
実施形態10。本明細書に開示されている非カノニカルな基質を含む配列特定ポリマーの精製と特徴づけ。
実施形態11。無細胞（インビトロ）タンパク質またはポリマー合成で利用するための新規な単量体としての本明細書に開示されている非カノニカルな基質またはそのバリアント（および／または非カノニカルな基質またはそのバリアントを用いてアシル化されたtRNA）（異なるタイプの長い炭素鎖と環状アミノ酸が包含される）。
実施形態12。生体内ポリマー合成で利用するための単量体としての本明細書に開示されている非カノニカルな基質またはそのバリアント（および／または非カノニカルな基質またはそのバリアントを用いてアシル化されたtRNA）（異なるタイプの長い炭素鎖と環状アミノ酸が包含される）。
実施形態13。非天然アミノ酸単量体および／または非アミノ酸単量体非α-アミノ酸単量体（NNA）を用いてポリマー（ポリオレフィンポリマー、ポリアラミドポリマー、ポリウレタンポリマー、ポリケチドポリマー、ポリカーボネートポリマー、共役ポリマー、ガンマ-アミノ酸ポリマー、デルタ-アミノ酸ポリマー、イプシロン-アミノ酸ポリマー、ゼータ-アミノ酸ポリマー、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリビニルポリマー、およびポリフランポリマーなど）を合成するための本明細書に開示されている非カノニカルな基質またはそのバリアント（および／または非カノニカルな基質またはそのバリアントを用いてアシル化されたtRNA）。
実施形態14。非天然アミノ酸単量体および／または非アミノ酸単量体非α-アミノ酸単量体（NNA）を用いてポリマー（ポリオレフィンポリマー、ポリアラミドポリマー、ポリウレタンポリマー、ポリケチドポリマー、ポリカーボネートポリマー、共役ポリマー、ガンマ-アミノ酸ポリマー、デルタ-アミノ酸ポリマー、イプシロン-アミノ酸ポリマー、ゼータ-アミノ酸ポリマー、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリビニルポリマー、およびポリフランポリマーなど）を合成するための本明細書に開示されている新規な単量体またはそのバリアント（および／または非カノニカルな基質またはそのバリアントを用いてアシル化されたtRNA）。
実施形態15。1）2-アミノシクロへキシルカルボン酸（2-ACHC）、2-アミノシクロペンチルカルボン酸（2-ACPC）、2-アミノシクロブチルカルボン酸（2-ACBC）、および2-アミノシクロプロプカルボン酸（2-ACPrC）から誘導体化された16種類のβ-アミノ酸エステル基質の合成。
実施形態16。2-ACHCと2-ACPCは4つの異なる立体化学特性を持つ。
実施形態17。2-ACBCと2-ACPrCは、異性体形態でだけ、すなわちラセミ混合物、シス-ACBC、トランス-ACBC、シス-ACPrC、ndトランス-ACPrCが市販される。
実施形態18。ジニトロベンジルエステル（DNB）の離脱基を用いた(1R,2R)-2-ACHC、(1R,2S)-2-ACHC、(1S,2R)-2-ACHC、および(1S,2S)-2-ACHCの合成。
実施形態19。ジニトロベンジルエステル（DNB）の離脱基を用いた(1R,2R)-2-ACPC、(1R,2S)-2-ACPC、(1S,2R)-2-ACPC、および(1S,2S)-2-ACPCの合成。
実施形態20。ジニトロベンジルエステル（DNB）と(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステルABTの離脱基を用いたシス-2-ACBCとトランス-2-ACBCの合成。
実施形態21。ジニトロベンジルエステル（DNB）と(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステルABTの離脱基を用いたシス-2-ACPrCとトランス-2-ACPrCの合成。
実施形態22。前記アミノ酸を用いてtRNA／マイクロヘリックスアシル化を最適化するためのFx系（eFx、dFx、およびaFx）の利用。
実施形態23。前記非カノニカルなアミノ酸基質を用いたマイクロヘリックスとtRNAのアシル化。
実施形態24。前記あらかじめチャージされたtRNAをインビトロ（無細胞）タンパク質合成プラットフォームに添加することによる、ペプチドへの前記非カノニカルな基質の組み込み。
実施形態25。前記26種類の非カノニカルな合成基質を用いてtRNA(fMet(CAU))を再定義するためのeFx、dFx、およびaFxの利用。
実施形態26。前記266種類の非カノニカルな合成基質を用いてtRNAPro1E2(GGU)を再定義するためのeFx、dFx、およびaFxの利用。
実施形態27。無細胞タンパク質合成系において転写されたmRNAの開始コドン（ATG）に前記14種類の非カノニカルな基質を組み込むための再プログラムされたtRNAの利用。
実施形態28。無細胞タンパク質合成系において転写されたmRNAのThrコドン（ACC）に前記14種類の非カノニカルな基質を組み込むための再プログラムされたtRNAの利用。
実施形態29。機能化されたペプチドの精製と特徴づけ。
実施形態30。無細胞（インビトロ）タンパク質またはポリマー合成で利用するための新規な単量体としての本明細書に開示されている非カノニカルな基質またはそのバリアント（2つの異なるタイプの長い炭素鎖と環状アミノ酸が包含される）。
実施形態31。利用生体内ポリマー合成のための新規な単量体としての本明細書に開示されている非カノニカルな基質またはそのバリアント（2つの異なるタイプ（長鎖炭素鎖と環状アミノ酸）が包含される。
実施形態32。環状ベータ-アミノ酸と環状ガンマ-アミノ酸の利用と、リボソームによるポリマーへのその組み込み。
実施形態33。配列が特定されたナイロン、スパイダーシルク、ポリオレフィン、ポリアラミド、ポリウレタン、ポリケチド、ポリカーボネート、共役ポリマー、ガンマ-アミノ酸ポリペプチド、デルタ-アミノ酸、イプシロン-アミノ酸ポリペプチド、ゼータ-アミノ酸ポリペプチド、オリゴ糖とオリゴヌクレオチド、ポリビニル、ポリフランを生合成するのに必要な非天然非α-アミノ酸単量体（NNA）を用いてポリマーを合成するための新規な単量体とそのバリアントの利用。
実施形態34。配列が特定されたナイロン、スパイダーシルク、ポリオレフィン、ポリアラミド、ポリウレタン、ポリケチド、ポリカーボネート、共役ポリマー、ガンマ-アミノ酸ポリペプチド、デルタ-アミノ酸、イプシロン-アミノ酸ポリペプチド、ゼータ-アミノ酸ポリペプチド、オリゴ糖とオリゴヌクレオチド、ポリビニル、ポリフランを生合成するのに必要な非天然非α-アミノ酸単量体（NNA）を用いてポリマーを合成するための新規な単量体とそのバリアントの利用。
以下の実施例は説明用であり、請求項の主題の範囲を制限する意図はない。
実施例1 - 遺伝暗号再プログラミングのため化学的基質を拡張する
要約
無差別に任意のアミノ酸単量体をtRNAにチャージするリボザイムであるフレキシザイムの開発を通じて伝統的なアミノ酸-tRNAの割り当てが拡張されて非標準的な化学的基質-tRNAのペアが包含されるようになっており、それがその後部位を指定するやり方でリボソームペプチドに組み込まれる。しかしフレキシザイムとともに用いられる大半の基質はこれまでアミノ酸とヒドロキシ酸に限られており、そのことが、遺伝暗号再プログラミングのアプローチを利用して合成できる配列特定ポリマーの範囲を基本的に制限している。この仕事では、フレキシザイムを触媒とするアシル化反応における多彩な非カノニカルな基質のための包括的な経験的データが提供される。われわれの結果に基づき、そのような基質の範囲を6つの異なるタイプ（フェニルアラニン類似体、電子吸引基または電子供与基を含有する安息香酸誘導体、ヘテロ原子環、および脂肪族鎖など）に拡張する。このデータから、フレキシザイムに適合した基質の拡張において本質的な役割を果たす可能性がある設計規則を仮定する。さらに、無細胞タンパク質合成系と再プログラムされたfMet-tRNAにおいて野生型翻訳機械を使用し、リボソームペプチドへの32種類の非カノニカルな基質の組み込みを実証する。操作された翻訳機械は追加の化合物の導入を可能にし、そのことにより、細胞の翻訳装置によって産生させることのできる機能化されたポリマーの範囲を顕著に拡張する。
応用
開示されている技術の応用の非限定的な例に含まれるのは、（i）Fxに適合した化学的基質の設計規則を構築すること；（ii）非カノニカルな化学的基質の範囲を拡張して新規な機能性ポリマーの作製を可能にすること；（iii）遺伝暗号再プログラミングのアプローチを利用し、非カノニカルな基質を用いてtRNAを再定義すること；（iv）新たな機能の組み込みにより、操作されたペプチドを作製すること；および（v）コンピュータモデリングを通じてFxの触媒部位内の最も重要な（と重要でない）分子相互作用を理解することである。
利点
開示されている技術の利点の非限定的な例に含まれるのは、（i）Fxに適合した基質が非カノニカルな化学的基質（i．フェニルアラニン類似体、ii．複素芳香族基質、iii．脂肪族基質、およびiv～v．電子吸引基と電子供与基を持つ安息香酸誘導体）へと拡張されたこと；（ii）Fxが基質を高アシル化収率でチャージするようにしたこと；（iii）非カノニカルな基質の設計規則を置換基効果（電子効果と立体効果）に基づいて決定したこと；（iv）無細胞プラットフォームで前記32種類の非カノニカルな基質がペプチドのN末端に組み込まれるのを実証したこと;その大半は以前には決して見いだされたことがなく研究されていなかった；（v）それら32種類のペプチドを無細胞タンパク質合成反応物から精製し、質量分析によってそれらペプチドを特徴づけたこと；（vi）Fxの活性部位における基質の相互作用を同定するためのコンピュータモデリングを実証したこと；（vii）この仕事はペプチドの中に入るエキゾチックな単量体を含有する新規な機能的ペプチドを作製する可能性を開き、そのことによって単量体の間に新規な共有結合（例えば炭素-炭素結合または炭素-窒素結合）を持つ配列特定ポリマーをリボソームの中で生成させることが可能になったこと；および（viii）それに加え、この仕事は、そのような新規ポリマーの合成を可能にするリボソームバリアントと他の関連する翻訳装置を設計する研究を拡張できることである。
技術の記述
Fxアプローチによって150超の非カノニカルな基質がtRNAにチャージされてペプチドに組み込まれることが現在の研究によって報告されるとともに、非カノニカルなアミノ酸をチャージされたtRNAを合成するため多くの戦略が考案されてきたが、基質の範囲には制限とギャップがまだ存在する。誤アシル化tRNAは、保護されたpdCpAを用いた後、酵素（例えばT4 RNAリガーゼ）で3’末端CAヌクレオチドを欠く切断型tRNAと連結させることによって合成することができる。しかしこの方法は合成が面倒であり、リボソームペプチド合成を阻害する環状tRNA副生成物が生成するため結果が乏しいことがしばしばある。誤アシル化tRNAのためのエステル結合は、操作された合成酵素／直交tRNAペアを用いて得ることもできる。しかしアミノ酸基質に対する合成酵素の高い特異性だけが、狭い範囲の基質プールをチャージすることを可能にし、それは新たな合成酵素を開発するための広範な作業（例えば指向性進化）をしばしば必要とする。
誤アシル化tRNAを形成する別の手段は、フレキシザイム（Fx）の使用である。Fxは任意のtRNAをアミノアシル化する能力を持つ人工的なリボザイムである。Fx系は最近の10年間にわたって広い成功が見られており、誤アシル化tRNAを通じて広い範囲（150超）の化学的基質（α-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、D-アミノ酸、非標準的アミノ酸、N保護された（アルキル化された）アミノ酸、およびヒドロキシ酸）がリボソームペプチド鎖に組み込まれている。
ここでは、FxとWT翻訳装置による受け入れが相変わらず可能な多彩な非カノニカルな基質（Phe類似体、安息香酸誘導体、ヘテロ原子分子、および脂肪族鎖）に対する基質の範囲を系統的に拡張し、さらに、精製した再構成系（PURExpress）を通じた大腸菌翻訳機械の使用により多数の機能化ペプチドの作製が可能になることを実証する。われわれの研究と比較すると、以前の研究は大抵、Fxに適合した基質としてのアミノ酸バリアントに焦点を絞っている。第2に、ヒドロキシ酸バリアントは非アミノ酸基質の可能な置換基として発見されただけであった。第3に、基質プールの境界を顕著に拡張することを可能にするFxに適合した化学的基質の設計に関する理論的根拠はこれまで開発されていない。そして最後に、Fx結合ポケットにおける分子相互作用を同定し、新規ポリマー合成のための単量体の効率的な設計を可能かつ容易にするコンピュータ研究は存在しない。
Fxを触媒とするアシル化のための基質を設計するためのわれわれの理論的根拠により、新たな機能を提供できる単量体の開発と試験のスケジュールを短縮できる可能性がある。さらに、Fxの結合ポケットに対する基質の分子相互作用に関する情報が現在は欠けているため、Fxを触媒とするアシル化反応の間に形成される中間体に関するわれわれのコンピュータモデリングの結果は、化学者、生化学者、および分子生物学者のほか、タンパク質工学者が適切な非カノニカルな基質を選択するための基本的なリソースとして利用される可能性がある。具体的には、われわれの結果はFxの活性部位内の効率的な変異の研究を助ける可能性があるため、そこから計算量に関して大きな利益を得られると考えられる。
それに加え、5つの異なるサブセットに関する32種類の非カノニカルな基質の発見は基質の多様性の概要を示すとともに、ペプチド合成に対するその影響を特徴づけているため、この知見を他の非カノニカルな化学的基質のプロトタイプとして使用できる可能性がある。最後に、われわれの基質バリアントセットは、さまざまなペプチドを合成するための化学的基質バリアント（治療薬と大環状材料の前駆体が包含される）にただちに適用できると考えられる。この新規かつ包括的な研究は、基礎生物学と合成／工学的生物学にとって利点を持つ。
関連する技術
関連する技術は以下の特許文献と非特許文献の1つ以上の中に記載されている可能性がある（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）：アメリカ合衆国特許第5,478,730号；第5,556,769号；第5,665,563号；第6,168,931号；第6,518,058号；第6,783,957号；第6,869,774号；第6,994,986号；第7,118,883号；第7,189,528号；第7,338,789号；第7,387,884号；第7,399,610号；第9,410,148号；第9,528,137号；第9,951,392号；第9,688,994号、および第9,783,800。アメリカ合衆国公開特許出願第2009/0281280号；第2012/0171720号；第2016/0060301号；第2016/0083688号；第2016/0209421号；第2016/0289668号；第2017/0073381号；第2017/0306320号；第2017/0349928号；および第2018/0016614。公開国際出願WO2008/059823；WO2011/049157；WO2012/026566；WO2012/074129；WO2012/074130；WO2013/100132；WO2014/119600；WO2016/199801；EP2141175；JP2013071904；JP2018509172；およびJP2017216961。非特許文献：PassiouraとSuga、「フレキシザイム、その進化史とさまざまな有用性」、Top Curr Chem. 2014:344-45。
実施例2 - 遺伝暗号再プログラミングにおける化学的基質の拡張
「遺伝暗号再プログラミングにおける化学的基質の拡張」というタイトルのプレゼンテーション（Joongoo Lee, Kenneth Schwieter, Do Soon Kim, Jeffrey Moore, and Michael Jewett、2018 Synthetic biology: Engineering, Evolution, & Design (SEED) conference、スコッツデール、アリゾナ州で2018年6月3～4日に発表の予定）を参照する（その内容は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
要約
翻訳装置はタンパク質を合成するための細胞の工場である。その合成では、翻訳を行なう生物機械がmRNA鋳型のコード配列に従ってα-アミノ酸をカップリングさせることによりペプチド骨格を持つポリマーを生成させる。多くの先駆的仕事によりタンパク質合成のための遺伝暗号が150超の非標準的なアミノ酸へと拡張されたが、リボソームによって合成されるポリマーの共有結合はポリペプチド結合（アミド）またはポリエステル結合に限定されていた。本明細書では、多彩な共有化学結合を持つ有機的配列特定ポリマー（SDP）の作製を可能にする新たな環境と単量体鋳型を探索した。フレキシザイム系を用いて個々のコドンを再定義し、非ペプチド骨格を有するSDPを、操作された無細胞翻訳系を用いて再プログラムされた遺伝暗号の制御下で作製する。
緒言
リボソームによるタンパク質合成は、アミノアシル化（すなわち「チャージすること」）を通じてトランスファーRNA（tRNA）に共有結合するアミノ酸の重合によって実現される。従ってアミノ酸でアミノアシル化されたtRNAは「チャージされたtRNA」と呼ばれる。リボソームは、チャージされたtRNAの表面に存在する対応するアンチコドンとのマッチングを通じ、mRNAの中に存在するコドンを翻訳する。そのためチャージされたtRNAのアミノ酸は、リボソームを通じ、翻訳されたmRNAに対応する新生ポリペプチドに組み込まれる。
現代の生物では、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）と呼ばれるタンパク質系酵素がtRNAのアミノアシル化の触媒となる。しかし活性化されたアミノ酸を用いてtRNAをアミノアシル化するリボザイムがインビトロで発見されており、それは「フレキシザイム」と名づけられている。フレキシザイムとそれを用いた遺伝子再プログラミングは本分野で知られている。（例えばOhuchi et al.、「フレキシザイム系：翻訳装置にとって非常に柔軟性のあるtRNAアミノアシル化ツール」、Curr Opin Chem Biol. 2007 Ocxt; 11(5):537-42；Xiao et al.、「インビトロで選択された小さなリボザイムによる特異的tRNAアミノアシル化の構造的基礎」、Nature 454, 358-361 (2008)；Passioura and Suga、「非カノニカルなペプチド合成と薬発見のためのツールとしてのフレキシザイムを媒介とする遺伝子再プログラミング」、Angewandte Chemie, Volume 19, Issue 21, pages 6530-6536, May 17, 2013；およびKatoh et al.、「2014～2017年のインビトロでの遺伝暗号再プログラミングの進展」、Synthetic Biology, Volume 3, Issue 1, May 31, 2018を参照されたい；その内容は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。フレキシザイムを進化させ、インビトロで選択して非標準的アミノ酸を用いたtRNAのアミノアシル化の触媒とし、非標準的アミノ酸をこのようにチャージされたtRNAを用いて非標準的アミノ酸を新生ポリペプチドに組み込むことができる。したがってフレキシザイム系は、一般に天然アミノ酸に割り当てられるコドンを再定義して非標準的アミノ酸または他の残基に割り当てることによって遺伝暗号の再プログラミングを可能にするため、mRNAが指示する非天然ポリペプチドの合成を実現することができる。
図1はフレキシザイム系を示す。図1.A）はフレキシザイムの結晶構造を示す。図1.B）は、フレキシザイムによるtRNAのアシル化と、活性化されたエステル基質の調製に一般に使用される離脱基を示す。この離脱基はフレキシザイムを通じてtRNAまたはマイクロヘリックスにロードすることができる。
結果
tRNAまたはマイクロヘリックスにロードするための化学的基質は、保護されたα-アミノ酸または保護されたβ-アミノ酸を対応するエステルに変換することによって調製することができる。（図2.Aと2.Bをそれぞれ参照されたい）。
フレキシザイム（Fx）を触媒とするアミノアシル化を、tRNA模倣体としてのマイクロヘリックス（22nt）を用いて最適化した。（図3参照）。最適化反応は、50 mMのHEPES-KOH（PH 7.5）の中、または0.3 MのMgCl2、1 μMのマイクロヘリックス、5 μMのFx、2.5 mMのアミノ酸基質（例えばエステル化されたアミノ酸基質）、および20％のDMSOを含有するビシン（pH 8.8）バッファの中で実施した。反応混合物を0℃でインキュベートし、72時間にわたってモニタした。アシル化された生成物の収率は、ソフトウエア（ImageJ）を用いてバンド強度を定量することによって求めた。Micxrohelixを市場で取得し（Integarated DNA Technologies (IDT））、受け取った状態で使用した。興味あるtRNAを、マイクロヘリックス実験で用いたのと同じ条件下でL-Ser、D-Ser、β-Gly、およびβ-Pheを用いてアシル化した後、再プログラムされたtRNAを無細胞合成プラットフォーム（PURExpress）に添加した。AUC、ACC、およびGCCに対応するtRNAを、Fx系を用いて非天然アミノ酸基質で再定義した。（図4参照）。無細胞タンパク質合成（CFPS）プラットフォーム（図5参照）と再定義されたtRNAを用いて非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込んだ。（図6a）～f）参照）。mRNAにはアミノ酸の連続的な組み込みに関して最適なコドンの順番が存在することが観察された。（図6e）とf）参照）。
結論
新生配列特定ポリマーの中でリボソームによって新たな共有化学結合を形成し、無細胞合成（CFPS）プラットフォームの中でそのような配列特定ポリマーを合成することを可能にする単量体を設計する。潜在的なポリマー骨格には、ポリエステル骨格、ポリチオエステル骨格、または一般的な「ポリABCer」骨格が含まれる。（図7参照）。概念実証として、われわれのFx系によってtRNAに9種類のアミノ酸をチャージすると、tRNAにチャージされたそれら9種類のアミノ酸がCFPSプラットフォームにおいてポリペプチドに組み込まれることが見いだされた。
実施例3 - 遺伝暗号再プログラミングにおける化学的基質の拡張
Leeらの「リボザイムを用いた第2の遺伝暗号の制限の拡張」、Nat. Commun. 2019, Nov 8;10(1):5097を参照する。その内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
要約
遺伝暗号再プログラミングを通じてポリペプチドに非カノニカルなアミノ酸を部位特異的に組み込むというのは、自然の制限を超えて広がるバイオベースの生成物を作製するための強力なアプローチである。さまざまなレパートリーの化学的基質を、リボソームを媒介とする重合で使用できるが、大抵はアミノ酸とヒドロキシ酸に限定されていた。ここでは、フレキシザイムを媒介として非カノニカルな単量体をtRNAにチャージするための設計規則で、リボソームを媒介とする重合のための基質の範囲を拡張すると考えられるものを同定することを試みる。この目標を達成するため、4つの足場（フェニルアラニン誘導体、安息香酸誘導体、複素芳香族単量体、および脂肪族単量体）に基づいて38種類の新たな基質を合成したところ、最適化された反応条件下で32種類がアシル化されてtRNAに結合できることが見いだされた。これら基質のすべてを、インビトロでの翻訳を利用してリボソームペプチドのN末端に組み込むことができた。われわれの仕事により、フレキシザイムを触媒とするアシル化の設計規則が提供され、翻訳装置を転用するための化学的基質の範囲が拡張される。
緒言
翻訳装置はタンパク質を合成するための細胞の工場であり、規定された遺伝子鋳型から配列特定ポリマー（タンパク質）にL-α-アミノ酸基質を組み込む。1秒当たりアミノ酸20個までのタンパク質伸長速度と顕著な精度（約99.99％の忠実度）1-3を持つ大腸菌タンパク質生合成系（リボソームと重合に必要な関連因子重合）は、信じられない触媒能力を有する。このことが、バイオテクノロジーの人工バージョンを理解して活用する努力を長期にわたって動機づけてきた。しかし自然界では、限定されたセットのタンパク質単量体だけが利用されるため、その結果として限定されたセットのバイオポリマー（すなわちタンパク質）になっている。リボソーム単量体の自然のレパートリー4-12を拡張すると、遺伝子がコードする多彩な化学を用いた新たな種類のバイオベースの生成物が生じる可能性があろう。これまで、天然リボソームは、特にインビトロで、制御と自由度がより大きい設計が可能な広い範囲の化学的基質を伸長中のポリマー鎖に選択的に組み込めることが示されている13。これら化学的基質に包含されるのは、α-14、β-15、γ-16、D-17,18、N-アルキル化された19, 20、非カノニカルなアミノ酸21、ヒドロキシ酸22,23、ペプチド24、オリゴマーフォルダマー-ペプチドハイブリッド25、および非アミノカルボン酸26, 27である。このように広くかつ多彩なセットの単量体の組み込みは、特にペプチドとタンパク質への非カノニカルなアミノ酸の部位特異的組み込みについて、新規な治療剤、酵素、および材料の製造に影響があった28-34。
リボソームによって伸長中の鎖に選択的に組み込まれるリボソーム単量体にとって、その単量体はトランスファーRNA（tRNA）に共有結合して（またはチャージされて）アミノアシル-tRNA基質にならねばならない。多くの戦略が、そのような非カノニカルなアミノアシル-tRNA、または「誤アシル化された」tRNAを合成するために考案されてきた。古典的戦略は化学的アミノアシル化であり、5'-ホスホ-2'-デオキシリボシチジリルリボアデノシン（pdCpA）ジヌクレオチドの合成、アミノ酸基質とのエステルカップリング、および酵素（例えばT4 RNAリガーゼ）による切断型tRNA35-39との連結を必要とする。残念なことに、化学的アミノアシル化は困難で技術的に難しいため、リボソームペプチド合成を阻害する環状tRNA副生成物の生成40が原因で翻訳が好ましくない結果になることがしばしばある。別の戦略は、アミノアシル-tRNA合成酵素（aaRS）と呼ばれるタンパク質酵素を操作することであり、指向性進化によってカノニカルなアミノ酸を自然にtRNAにチャージする41-50。しかしaaRSは非カノニカルな化学的基質の混交度が限定されているため、一般に天然アミノ酸に似た狭い範囲のアミノ酸類似体に限られる。
より最近になり、フレキシザイム（Fx）として知られるRNA酵素を用いて誤アシル化tRNAを生成させる1つの代替アプローチが開発された。Sugaと共同研究者が先駆者となったこの柔軟で強力なアプローチは、任意のtRNAの3’-OHを活性化されたエステル52-55で排他的にアミノアシル化することができる51（図8a）。指向性進化と配列最適化を通じ、3つの異なるフレキシザイム（eFx、dFx、およびaFx）5が、基質：活性化基の特別な組み合わせを認識するために開発されている。結晶学的研究56は、基質側鎖または離脱基いずれかのアリール基がFxの触媒性結合ポケットとの基質相互作用にとって極めて重要であることを明らかにした。例えばeFxはアリール基を含有していてシアノメチルエステル（CME）によって活性化される酸でtRNAをアシル化するのに対し、dFxはジニトロベンジルエステル（DNBE）によって活性化される非アリール酸を認識する57。アリール基を欠く基質、またはDNBEが存在するため溶解度が低い基質のため、(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステル（ABT）58離脱基を認識するaFxで、必要なアリール基とよりよい水溶性を提供するものが開発されている（図8a、最下部）。
フレキシザイムアプローチの独自の潜在力は、側鎖がアシル化反応の（または反応性側鎖の場合には適切に保護／脱保護される）条件に対して安定である限り、実質的にあらゆるアミノ酸を任意のtRNAにチャージでき、特定のコドンを新たなアミノ酸に再び割り当てることが可能になることである。そのためフレキシザイムが開発されたことで、遺伝暗号再プログラミングによって翻訳に用いられる単量体の既知の許容可能なスペースが顕著に拡張された。しかし組み込まれた単量体の範囲はこれまでは主にアミノ酸23とヒドロキシ酸33に限定されていた。フレキシザイムを媒介とするチャージングの設計規則は非カノニカルな単量体の探索をより効率的にガイドする可能性があるが、まだ同定の途上にある。リボソームによる鋳型にガイドされた重合のために利用可能な設計空間をポリペプチドまたはポリエステルを超えてポリマーへと拡張するため、フレキシザイムを媒介とするチャージングとリボソームによる翻訳の両方にとって許容可能な非カノニカルな単量体の多様性の範囲を制限している制約を探索する新たな努力が必要とされる。
ここでは、フレキシザイムを媒介とするチャージングのため化学的基質の範囲を系統的に拡張した後に天然リボソームを用いて翻訳することにより、知識のこのギャップを埋めることを試みる（図8）。具体的には、既知の適合性のある足場に基づいて設計した38種類のフェニルアラニン誘導体、安息香酸誘導体、複素芳香族単量体、および脂肪族単量体のレパートリーを合成した。天然リボソームで合成されたペプチドまたはその翻訳後修飾された誘導体がアクセスできない化学的部分を特徴とするか、（アミド結合およびエステル結合よりは）新規なA-Bポリ縮合反応をサポートする可能性がある潜在的な基質を意図的に選択する。活性化されたエステルを化学合成した後、pHと時間を変えることによってフレキシザイムがこれらの基質をtRNAにチャージする能力を評価し、最適化されたアシル化条件を創出した。38種類の基質のうちの32種類がtRNAにチャージされることが見いだされ、そこから、新規な単量体の探索をより効率的にガイドするのを助ける傾向が出現した。基質-フレキシザイムの適合性に関する見通しを得るため、高いアシル化収率または低いアシル化収率を示すフレキシザイムの結合ポケットの中の核酸残基と基質の分子相互作用を研究するコンピュータモデリングも利用した。最後に、市販のPURExpress（商標）無細胞翻訳系の中で野生型リボソームが新規なtRNA-単量体を利用できるかどうかを調べた。基質-tRNAfMet複合体からペプチドへの新規な単量体のN末端組み込みは32種類の基質には可能であった一方で、野生型リボソームによるペプチドのC末端への組み込みは可能でなかった。
結果と考察
フレキシザイム（Fx）を触媒とするRNAアシル化のため基質レパートリーを拡張する。Fxを触媒とするtRNA誤アシル化のための基質の範囲を拡張するため、最初に適合性のある基質足場を決めた。その目的で、eFxにとっての最適な基質としてCMEによって活性化されるフェニルアラニンの分子構造（Phe-CME、A、図9a、中央部）をベンチマークにし51, 56, 59, 61、一連の5つの基質に対するeFxの基質の柔軟性を、親構造Aからの改変の程度を大きくしながら調べた（B～F、図9a、中央部）。その中に包含されるのは、B（ヒドロ桂皮酸）：Aから除外されるアミン；C（桂皮酸）：Bの不飽和形態；DとE（それぞれ安息香酸とフェニル酢酸）：2個または1個の炭素がBから除かれている；およびF（プロパン酸）：Bにおいてアリールが脂肪族基で置換されている。
最初に、eFxによる小さなtRNA模倣体であるマイクロヘリックスtRNA（mihx、22 nt）へのAのアシル化効率を、以前に報告されている標準的なアシル化条件（pH 7.5、0℃）62を利用して求めた（図9a、上部）。変性性酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）による反応混合物の分析は、67％のmihxがAでアシル化されることを示した（図9b、レーン1）。このベンチマークが確立したことで、次に5つの基質の基質-eFx適合性をスクリーニングした。eFxはmihxをBでうまくアシル化し、収率77％であった。これは、アミン官能基がアミノアシル化に必要でないことを示す（図9b、レーン2）。α,β-不飽和基質Cは標準的な反応条件下ではフレキシザイムによるmihxアシル化に適合していないため、Phe構造からさらに離れるのは困難であることが証明された（図9b、レーン3）。しかし反応のpHを大きくし、時間を長くしていくと（pH 7.5～pH 8.8と16時間～120時間、十分な詳細に関しては図13と14を参照されたい）、Cを用いたmihxのアシル化が改善され、それぞれ16時間後と120時間後に44％と74％になった（図9b、レーン6、7）。注目すべきことに、新たに確立されたpH 8.8は、AとBに関する収率をそれぞれ82％と100％に増加させた（図9b、レーン4、5）。わずかな程度だが、DとEもmihxにそれぞれ16％と40％の収率でアシル化された（図9b、レーン8、9）。基質はeFxによる基質認識のためのアリール基を含有していないため、予想通り、脂肪族基質FはeFxによってmihxにチャージされなかった（図9b、レーン10）。しかし基質の離脱基をCMEからABTに変更し、eFxの代わりにaFxを用いると、120時間後に同じ脂肪族基質Gを収率55％でチャージすることが可能になった（図9b、レーン11）。したがって新たに確立されたアシル化条件を利用し、適切な離脱基とFxを用いると、5つの基質すべてがtRNA模倣体にうまくチャージされる。
次に、許容できる基質が教示されるよう、B、C、D、およびGの足場を構成することによって基質の範囲をさらに拡張することを試みた。Fx系が使用できるだけでなく、後にリボソームも使用できる基質（下記参照）。その目的で、4セットの足場類似体、すなわちアリール基を持つ飽和した脂肪族足場と不飽和の脂肪族足場が含まれるPhe類似体、多彩な官能基を持つ安息香酸誘導体、異なる電子的特性を持つ複素芳香族足場、およびさまざまな立体障害を持つ脂肪族足場を用いてeFxとaFxのmihx-アシル化効率を求めた（図10）。
アリール基を含有する飽和脂肪族足場と不飽和脂肪族足場を調べるため、Fx基質BとC に由来し多彩な機能を持つPhe類似体を探索した（1～6）。
最適な条件下で基質1～4をeFxによってmihxにチャージすると収率が16時間後に50～100％、120時間後に100％になった（図15と16）。α,β-不飽和足場を含有する基質5と6は、その親構造Cと似た収率を示した。両方とも、Fx結合ポケットとの相互作用を妨げる構造的な堅固さがおそらく増大したことが理由で、eFxにより、飽和した基質よりも低い効率（それぞれ30％と22％の収率）でチャージされた。
安息香酸（D）に対するeFxの基質適合性をさらに理解するため、電子的特徴のほか、置換基の位置（オルト、メタ、パラ）が変化する一連の誘導体を調製し（電子が少ない：7～14、電子が豊富：15～18）、Fxを触媒とするアシル化反応を実施し、酸変性PAGEとデンシオメトリー分析によってアシル化効率を求めた（図15、17、および18）。p-ニトロ置換された基質（7）については、eFxのアシル化収率が16時間後に30％の収率、120時間後に76％であり、置換されていない基質（D）については、16時間の時点で0％、120時間の時点で16％であることが明らかになった。
同様に、高い収率（16時間の時点で28～48％、120時間の時点で78～100％）が、それぞれp-ニトリル、p-アジド、m-ホルミル基、およびm-ニトロメチル基を持つ電子が少ない基質（8～11）で観察された。逆に、中程度の電子供与基（p-メトキシ（15）、p-エチニル（16）、およびp-ヒドロキシメチル（17）など）を持つ基質はより低い反応率を示し；16時間後にアシル化は観察されず、120時間後にほんの中程度の収率であった（19～63％）。電子が豊富なp-アミノ基質18では120時間後に変換がまったく観察されなかった。これらの結果は顕著な電子効果があることを示しており；反応率は一般に電子が少ない基質で増加し、電子が豊富な基質で低下した。
電子が少ないFx基質18のメタ位に電子吸引ニトロ基を設置することにより基質21にするというこの仮説を検証した。予想通り、120時間後に10％という収率のわずかな改善が観察された。置換基のパターンを交換すると基質20（p-ニトロとm-アミン）になって反応効率がさらに改善され、120時間後に収率55％になった。これは、電子的特徴に基づく反応性の傾向を支持している。それに加え、オルト置換基の許容は立体効果に支配されることが観察された。というのもo-フルオロ12では120時間後に82％の収率になったのに対し、より大きなオルト置換基（o-ヨード13、o-ホルミル14）を持つ基質はmihxにチャージされなかったからである。電子的特徴とFxを触媒とするアシル化の間の相関を、電子が少ない複素芳香族基質ピリジン22、フルオロ-ピリジン23、およびクマリン24を調べることによってさらに確認した。3つの基質すべてが高収率でチャージされ（16時間の時点で45～100％、120時間の時点で100％）、電子的傾向に従っている。逆に、電子が豊富な5員複素芳香族基質（ピロール25、25aと、チオフェン26、26a；25aと26aについては図19参照）は、Fxを触媒とするtRNAアシル化反応において反応性をまったく示さなかった。
最後に、aFxの基質適合性を、その基質Gに由来する脂肪族バリアントに対する触媒活性を探索することによって調べた。直鎖脂肪族酸が非常に好ましい基質であること；アルケニル（27）、シアノ（28）、およびエステル（29）の類似体が16時間後に100％の収率でチャージされることが見いだされた。ニトロアルカン（30）は適格な基質であったが、収率が低かった（25％、16時間と、30％、120時間）。逆に、立体障害のあるシクロへキシル（31）はよりゆっくりとチャージされた（収率30％、120時間）。さらに、ブロモプロパン（32）は120時間後に10％しかチャージされなかった。これは、立体的なかさばりの増大が、Fxを触媒とするアシル化をさらに減少させたことを示す。
まとめると、試験した38種類の類似体から、これまで知られていなかった32種類のFx基質が同定され、Fxを触媒とするアミノアシル化反応の範囲が顕著に拡張された。潜在的なFx基質に関する一般的な設計規則が、その分子的特徴と、Fxを触媒とするアシル化における効率に基づき、i）eFxでのPheとのより大きな構造類似性、ii）カルボニル領域から電子を減少させる特徴、およびiii）アシル化部位におけるより少ない立体障害に関して最大の成功で導出される。
非カノニカルな化学的基質をtRNAにチャージするのにフレキシザイムを用いることに関する可能な制約についてのさらなる見通しを得るため、次に、コンピュータモデリングを利用してわれわれのデータをよりよく理解した。以前の結晶学的研究56は、芳香族アミノ酸（Pheなど）がFxによってチャージされるとき、基質のフェニル環がFxの末端J1a/3塩基対に対して配置されることを示唆している。注目すべきことに、結晶化された構造（PDB：3CULと3CUN）はフェニルアラニル-エチルエステルリガンドに関する残留密度だけを含有しており、これは活性な部位における基質立体配座の可能な位置を示唆する。Rosetta63を利用してFxの結合ポケットにおける基質の分子相互作用を解明するため、5つの代表的な基質（A～E）のほか、ピロール-2-カルボン酸（25、25a）と、Fx触媒作用に関するアシル化収率を与えない2-チオフェンカルボン酸（26、26a）によるtRNAを用いて形成した四面体中間体のモデル（データは示さない）を作った（図11）。このモデル化は、Pheとヒドロ桂皮酸（B）に関するT型配置相互作用、または桂皮酸（C）、安息香酸（D）、およびフェニル酢酸（E）に関する平行配置相互作用のいずれかを支持する。逆に、ピロール基とチオフェン基は、末端J1a/3塩基対と特に有利な相互作用を形成することはできない。これら相互作用の不在が、電子が豊富な複素芳香族基を含有する25、25aと、26、26aが、eFxにとっては電子が少ない基質であるというわれわれの経験的観察結果を説明できる可能性がある。
新規なFx基質はtRNAにチャージされてペプチドに組み込まれる。次に、tRNAにチャージできる新たに見いだされたFx基質が天然のタンパク質翻訳機械に受け入れられるかどうかを調べた。われわれの最適化された条件に基づき、mihxの代わりにFxに最適化されたtRNA62を用いてFxを触媒とするアシル化反応を実施した。次いでtRNA-単量体を精製し、無細胞タンパク質合成反応物に添加して翻訳の進行が可能になるようにした後、MALDI-TOF質量分析によって小さなレポータペプチドへの新規な基質の組み込みを調べた（図12と、示されていないデータ）。
最初に、非カノニカルなアミノ酸の高レベルの組み込みを可能にする、よく確立された粗抽出液に基づく大腸菌無細胞タンパク質合成（CFPS）34, 64-67を利用することを試みた。しかしレポータペプチドを特徴づけることはできなかった。それはおそらく、抽出液の中の活性なペプチダーゼがペプチドを消化したためである。可能な望まない分解を回避するため、市販の（組み換えエレメントを用いたタンパク質合成）PURExpress（商標）系68に切り替えた。PURExpress（商標）系はタンパク質翻訳に必要とされる最少セットの成分を含有しており、そのことによってあらゆる望まないペプチド分解を最少にするとともに、特注セットのアミノ酸と興味あるtRNAの添加を可能にする。
特にSuga研究室からの以前の仕事は、このプラットフォームが、ペプチド合成を特に非カノニカルな単量体のN末端組み込み25, 60に関して評価するのに適していることを示した69。レポータペプチドとして、新規なFx基質をN末端に組み込むための翻訳開始コドンAUG、ストレプトアビジン（Strep）タグ、およびSerとThrのコドンをコードしていてT7 プロモータによって制御されるDNA鋳型（pJL1_StrepII）（XMWHSPQFEKST（配列番号15）（strepタグ；イタリック）を設計した（ただしXは新規なFx基質の位置を示す、詳細についてはSIを参照されたい）。開始コドンAUGと精製タグをデコードする9種類のアミノ酸だけを用いてペプチド合成を実施した（データは示さない）。対応する内在性tRNAがアミノアシル化されて翻訳に使用されるのを阻止するため他の11種類のアミノ酸を除外することにより、ペプチド合成中の内在性tRNAとFxによりチャージされたtRNAの間の競合を排除した。その目的で、PURExpress（商標）反応物を37℃で4時間インキュベートした。次いで合成されたペプチドを、Strep-Tactin（登録商標）で被覆された磁性ビーズ（IBA）を用いて精製し、SDSで変性させ、MALDI-TOF質量分析によって特徴づけた（図12a）。
陽性対照実験として、全20種類の天然アミノ酸の存在下かつFxによりチャージされたあらゆるtRNAの不在下でペプチドを調製し、レポータmRNAが標準的な遺伝暗号に従ってMWHSPQFEKST（配列番号16）に翻訳されるようにした。実際、ペプチドイオンの理論的質量に対応する2つの主要なピークが検出された。N末端のMet残基はPURE系に存在するホルミラーゼによってホルミル化されること（fM）が見いだされた（fMWHSPQFEKST、配列番号17）70；[M+H]+＝1405（観測値、obs）、1405 Da（計算値、cal）、[M+Na]+＝1427 (obs)、1427 Da (cal)（図12b）。
陰性対照実験として、開始コドンの下流の残基をコードする9種類のアミノ酸だけ（W、S、H、P、Q、F、E、K、およびT）の存在下でPURExpress（商標）反応を実施した；Metまたは誤アシル化されたtRNAfMetは反応混合物に添加しなかった。MALDIスペクトルは、1246 Da（[M+H]+）と1268 Da（[M+Na]+）の質量を与える合成ペプチドに関する単一種だけを示す（図12c）。観察されたピークは配列WHSPQFEKST（配列番号18）を持つペプチドの理論的質量に対応する。これは、開始コドンのためのアミノ酸がCFPS系の中に存在しない場合には続くmRNコドン上で翻訳開始が起こりうることを示しており、以前に報告されている現象である71。
開始コドンの位置に非カノニカルな基質（B～EとG）を組み込むため、tRNAfMetとして、mRNA上のAUGコドンに対応するCAUアンチコドンと、そのtRNAに別々にチャージされた全5つの基質を含有するものを使用した。基質がチャージされた／チャージされていないtRNAの混合物を含有する同量の沈降したtRNAをPURExpress（商標）反応物に添加した。PURE系で生成したMetをチャージされた内在性tRNAfMetによって開始コドンの位置にMetが組み込まれることを回避するため、メチオニンは反応物に添加しなかった。MALDIスペクトルに見られるすべてのピークはN末端に基質を含有するペプチドの理論的質量に対応することが発見された（図12d～i）。完全にホルミル化されていることが見いだされた図12bのN末端Metと比べてN末端Trpはホルミル化されていない（図12c）ことが見いだされたことは注目に値する。N末端Phe（図12d）はホルミル化（fF）ありとホルミル化（F）なしであることが見いだされた。これは、より大きな側鎖はホルミラーゼが残基を効率的にホルミル化するのを禁じる可能性があることを示唆する。
他の非カノニカルな基質（B～Gと1～32だが、アシル化を示さなかった6種類の基質；F、13、14、18、25、および26は除く）についてtRNAfMet上で同じアシル化反応を実施し、その後、N末端上の各基質を用いて32種類の異なるペプチドを合成した。これは、すべての非カノニカルな基質がペプチドに組み込まれたことを示す。精製したペプチドでMALDIスペクトルが生じた（データは示さない）。アシル化収率がより高い基質はより高い翻訳効率を示す傾向があり（データは示さない）、誤アシル化tRNAの濃度が翻訳の1つの制限因子であることを表わしている。N末端ペプチドをより厳密に特徴づけるため、追加してペプチド収率を定量した（データは示さない）。これらのデータは、この系が誤アシル化tRNAによって制限されるというわれわれの仮説を支持する。
リボソームを媒介として代わりのA-Bポリ縮合反応物（すなわち非エステル結合と非アミド結合）を重合させることで、新たなクラスの配列特定ポリマーが提供される可能性がある。mRNA上のACCコドン（Thr）を認識する誤アシル化tRNAGluE2（GGU）を用い、共有炭素-炭素結合の形成を必要とすると考えられるペプチドC末端でのいくつかの基質の組み込みを調べた。残念なことに、そのような結合を持つバイオポリマーを作製するわれわれの試みは成功しなかった。
結論
この仕事では、フレキシザイムを媒介として非カノニカルな単量体をtRNAにチャージするための設計規則の同定を通して、翻訳のための化学的基質の範囲を系統的に拡張することを試みた。一般に用いられているアミノ酸とヒドロキシ酸を超えて、フェニルアラニン、安息香酸、複素芳香族、および脂肪族の足場に基づいて構成することから構築した多彩なレパートリーの基質でtRNAをアシル化できることが示された。足場設計へのわれわれの合理的なアプローチにより、フレキシザイムを用いて新規な単量体をtRNAにチャージするための設計規則をよりよく同定することが可能になった。予想通り、フェニルアラニンにより似た基質が、Fxを触媒とするアシル化反応にとって好ましいことが見いだされた。例えば電子が少ない基質は電子が豊富な基質よりも好ましく、あるかさばる基は残念ながらアシル化活性部位の近くではよく許容されないという新たな指導原理も見いだされた。それに加え、フレキシザイムの結合ポケットにおける重要な基質の分子相互作用を、コンピュータモデリングを用いて調べることにより、T型配置相互作用または平行配置相互作用のいずれかがフレキシザイムによるチャージを可能にするという重要な特徴らしいことが見いだされた。これら設計規則を超えて、われわれの拡張された基質からのtRNA-単量体はPURExpress（商標）系において遺伝暗号再プログラミングを通じて多彩なN機能化ペプチドをうまく生じさせることも示された。これは重要である。なぜならわれわれのデータは、リボソームは広範囲の基質を特にN末端において重合させうることを示す、数が増加しつつある研究を合わせたものだからである。新規なN末端ペプチドそのものの作製はわれわれの興味の中心ではなかったが、それらを本分野の他の研究者が多くのやり方で使用することができよう。例えばN末端に4と27を含有するペプチドは、重合可能なユニットを用いて分子を化学的に結合させることによって合成ポリマーと配列特定ペプチドの利点を組み合わせた潜在力を持ち、それが新規なハイブリッド材料につながる可能性がある。将来を考え、われわれの仕事が翻訳で使用するための新たなクラスの非カノニカルな単量体の設計と選択を可能にすることを期待する。例えばわれわれが記述する単量体は、ポリエステルまたはポリアミドではない新しいクラスのシークエンシングされた規定のポリマーに向けた歩みも、おそらく炭素-炭素結合を持つポリマーにさえ向けて開始する。しかしリボソームとその活性部位の形、生理化学、および動的特性は、約20種類のカノニカルなアミノ酸でできたタンパク質で作用するのに進化的に最適化されてきたため、このような進展は翻訳装置の工学における追加の努力による支援が必要であろう72,73。
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材料と方法
あらゆる試薬と溶媒は市販グレードであり、必要なときには使用する前に精製した。ジクロロメタンは、Grubbs1が記載しているようにして活性化アルミナのカラムを通過させることによって乾燥させた。フェニルアラニンシアノメチルエステル（A）は最近記載されているようにして調製した2。(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（ABT）は標準的な手続きに従って調製した3。あらゆる有機溶液はMgSO4上で乾燥させた。薄層クロマトグラフィ（TLC）はガラス裏当てシリカゲル（250 μm）プレートを用いて実施した。フラッシュクロマトグラフィはBiotage Isolera One自動化精製系で実施した。UV光および／またはKMnO4の使用を用いて生成物を可視化した。核磁気共鳴スペクトル（NMR）はBruker Advance III-500（500 MHz）またはVarian Unity 500（500 MHz）装置で取得した。化学シフトは、内部標準としてδ 7.26とδ 77.0（CDCl3）、およびδ 2.50とδ 39.5（DMSO-d6）に設定した残留溶媒のピークに対して測定する。質量スペクトルは、 Bruker AmaZon SLまたはWaters Q-TOF Ultima（ESI）と、Impact-IIまたはWaters 70-VSE（EI）という分光器で、記載されているイオン化法を利用して記録した。
シアノメチルエステルを形成するための一般的な手続き。撹拌棒を備えたガラス製バイアルに、カルボン酸（1当量）、CH2Cl2（1.0 M）、トリメチルアミン（1.5当量）、およびクロロアセトニトリル（1.2当量）を添加した。25℃で16時間撹拌した後、反応混合物をEtOAcで希釈し、水またはブラインで洗浄した。有機相を乾燥させ、濃縮すると、粗生成物が得られた。必要であればこの生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製した。
Figure 2023514584000014
3-フェニルプロパン酸シアノメチル（B）。一般的な手続きに従い、3-フェニルプロパン酸（100 mg、0.66 mmol）、トリメチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が透明な油として得られた（95 mg、77％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H)、7.28-7.21 (m, 3H)、4.72 (s, 2H)、3.01 (t, J = 7.8 Hz, 2H)、2.76 (t, J = 7.8 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 171.2、139.5、128.6、128.2、126.6、114.3、48.2、35.1、30.5；HRMS (EI)：C11H11NO2に関する正確な質量計算値[M]+189.07898、実測値189.07881。
Figure 2023514584000015
トランス-桂皮酸シアノメチル（C）。一般的な手続きに従い、トランス-桂皮酸（98 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（78 mg、63％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, J = 16.0 Hz, 1H)、7.57-7.53 (m, 2H)、7.44-7.40 (m, 3H)、6.46 (d, J =16.1 Hz, 1H)、4.86 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 165.1、147.7、133.6、131.1、129.0、128.4、115.2、114.5、48.4；HRMS (EI)：C11H9NO2に関する正確な質量計算値[M]+187.0633、実測値187.0633。
Figure 2023514584000016
安息香酸シアノメチル（D）。一般的な手続きに従い、安息香酸（81 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が透明な油として得られた（87 mg、82％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.3, 1.4 Hz, 2H)、7.67-7.59 (m, 1H)、7.49 (t, J = 7.8 Hz, 2H)、4.97 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.9、134.1、130.0、128.7、127.8、114.4、48.8；HRMS (EI)：C9H7NO2に関する正確な質量計算値[M]+161.0477、実測値161.0475。
Figure 2023514584000017
2-フェニル酢酸シアノメチル（E）。一般的な手続きに従い、フェニル酢酸（90 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（79 mg、68％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.35-7.23 (m, 5H)、4.70 (s, 2H)、3.70 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 169.9、132.2、129.2、128.8、127.6、114.2、48.6、40.4；HRMS (EI)：C10H9NO2に関する正確な質量計算値[M]+175.0633、実測値175.0634。
Figure 2023514584000018
吉草酸シアノメチル（F）。一般的な手続きに従い、吉草酸（72 μL、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が透明な油として得られた（65 mg、70％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.71 (s, 2H)、2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H)、1.67-1.60 (m, 2H)、1.41-1.30 (m, 2H)、0.92 (t, J = 7.4 Hz, 3H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 172.1、114.5、48.1、33.1、26.6、22.1、13.6；HRMS (CI)：C7H12NO2に関する正確な質量計算値[M+H]+142.0868、実測値142.0867。
Figure 2023514584000019
3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパン酸シアノメチル（1）。一般的な手続きに従い、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパン酸（60 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）、およびジクロロメタン（0.2 mL）を用いて調製した。生成物が茶色の固体として得られた（40 mg、55％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 (s, 1H)、8.67 (s, 1H)、6.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H)、6.58 (d, J = 1.9 Hz, 1H)、6.46-6.44 (m, 1H)、4.94 (s, 2H)、2.69-2.68 (m, 2H)、2.66-2.64 (m, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.9、145.5、144.0、131.3、119.2、116.4、116.1、115.9、49.3、35.2、29.8；HRMS (EI)：C11H11NO4に関する正確な質量計算値：[M]+ 221.0688、実測値221.0690。
Figure 2023514584000020
3-(1H-ピロル-2-イル)プロパン酸シアノメチル（2）。一般的な手続きに従い、3-(1H-ピロル-2-イル)プロパン酸（46 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）、およびジクロロメタン（0.2 mL）を用いて調製した。生成物が茶色の固体として得られた（45 mg、77％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.54 (s, 1H)、6.58 (d, J = 2.0 Hz, 1H)、5.88 (q, J = 2.7, 3.0, 2.6 Hz, 1H)、5.74 (m, 1H)、4.96 (s, 2H)、2.81 (t, J = 8 Hz, 2H)、2.70 (t, J = 7 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.9、130.0、116.8、116.5、107.6、105.0、49.4、33.6、22.8；HRMS (EI)：C9H10N2O2に関する正確な質量計算値：[M]+178.0742、実測値178.0743。
Figure 2023514584000021
3-(4-アミノフェニル)プロパン酸シアノメチル（3）。一般的な手続きに従い、3-(4-アミノフェニル)プロパン酸（109 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（123 mg、55％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.98 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、6.63 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、4.68 (s, 2H)、3.48 (br s, 2H)、2.87 (t, J = 7.7 Hz, 2H)、2.67 (t, J = 7.7 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 171.4、144.8、129.5、129.0、115.3、114.4、48.1、35.5、29.8；HRMS (EI)：C11H12N2O2に関する正確な質量計算値[M]+204.0899、実測値204.0897。
Figure 2023514584000022
3-(4-アジドフェニル)プロパン酸シアノメチル（4）。一般的な手続きに従い、3-(4-アジドフェニル)プロパン酸（126 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が赤色の油として得られた（123 mg、81％）。1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H)、4.72 (s, 2H)、2.91 (t, J = 7.6 Hz, 2H)、2.70 (t, J = 7.6 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, CD3CN) ppm 172.4、139.0、138.1、130.8、119.9、116.2、49.6、35.4、30.3；HRMS (EI)：C11H10N4O2に関する正確な質量計算値[M]+230.0804、実測値230.0794。
Figure 2023514584000023
(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリル酸シアノメチル（5）。一般的な手続きに従い、(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリル酸（59 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）、およびジクロロメタン（0.2 mL）を用いて調製した。生成物がピンク色の固体として得られた（41 mg、57％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.71 (s, 1H)、9.20 (s, 1H)、7.61 (m, 1H)、7.10 (d, J = 1.8 Hz, 1H)、7.07 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 1H)、6.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H)、6.35 (d, J = 16.3 Hz, 1H)、5.06 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 165.9、149.5、147.9、146.1、125.6、122.5、116.7、116.2、115.6、112.0、49.3；HRMS (EI)：C11H9NO4に関する正確な質量計算値：[M]+ 219.0532、実測値219.0531。
Figure 2023514584000024
(E)-3-(1Hピロル-2-イル)アクリル酸シアノメチル（6）。一般的な手続きに従い、 (E)-3-(1H-ピロル-2-イル)アクリル酸（45 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）、およびジクロロメタン（0.2 mL）を用いて調製した。生成物が茶色の固体として得られた（24 mg、43％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.65 (s, 1H)、7.56 (d, J = 15.6 Hz, 1H)、7.11 (m, 1H)、6.67 (m, 1H)、6.24 (d, J = 15.8 Hz, 1H)、6.22-6.20 (m, 1H)、5.02 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 166.2、137.3、128.4、125.0、116.8、116.7、110.9、107.8、49.2；HRMS (EI)：C9H8N2O2に関する正確な質量計算値：[M]+ 176.0586、実測値176.0586。
Figure 2023514584000025
4-ニトロ安息香酸シアノメチル（7）。一般的な手続きに従い、4-ニトロ安息香酸（110 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物がベージュ色の固体として得られた（69 mg、51％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.34 (d, J = 8.9 Hz, 2H)、8.26 (d, J = 9.0 Hz, 2H)、5.03 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 163.2、151.2、133.1、131.2、123.9、113.8、49.5；HRMS (EI)：C9H6N2O4に関する正確な質量計算値[M]+ 206.03276、実測値206.03188。
Figure 2023514584000026
4-シアノ安息香酸シアノメチル（8）。一般的な手続きに従い、4-シアノ安息香酸（97 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（101 mg、82％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.18 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、7.80 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、5.01 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 163.4、132.5、131.6、130.5、124.8、117.6、113.9、49.4；HRMS (EI)：C10H6N2O2に関する正確な質量計算値[M]+ 186.0429、実測値186.0426。
Figure 2023514584000027
4-アジド安息香酸シアノメチル（9）。一般的な手続きに従い、4-アジド安息香酸（108 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が赤色の油として得られた（89 mg、67％）。1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ 8.02 (d, J = 8.7 Hz, 2H)、7.17 (d, J = 8.7 Hz, 2H)、4.97 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CD3CN) ppm 165.2、146.8、132.4、125.6、120.2、116.2、50.3；HRMS (EI)：C9H6N4Oに関する正確な質量計算値[M]+ 202.0491、実測値202.0487。
Figure 2023514584000028
3-ホルミル安息香酸シアノメチル（10）。一般的な手続きに従い、3-ホルミル安息香酸（99 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が透明な油として得られた（95 mg、69％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.09 (s, 1H)、8.55 (t, J = 1.7 Hz, 1H)、8.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H)、8.16 (d, J = 7.7 Hz, 1H)、7.69 (t, J = 7.7 Hz, 1H)、5.02 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 190.9、163.9、136.7、135.4、134.3、131.4、129.7、129.0、114.1、49.2；HRMS (EI)：C10H6NO3に関する正確な質量計算値[M]+ 189.0347、実測値189.0344。
Figure 2023514584000029
3-(ニトロメチル)安息香酸シアノメチル（11）。一般的な手続きに従い、3-ブロモ安息香酸（500 mg、2.49 mmol）、トリエチルアミン（520 μL、3.74 mmol）、クロロアセトニトリル（188 μL, 2.99 mmol）、およびジクロロメタン（2.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の油性固体として得られた（579 mg、97％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.20 (dd, J = 1.8, 1.8 Hz, 1H)、8.00 (ddd, J =7.8, 1.7, 1.1 Hz, 1H)、7.76 (ddd, J = 8.0, 2.0, 1.1 Hz, 1H)、7.38 (dd, J = 7.9, 7.9 Hz, 1H)、4.97 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 163.5、136.9、132.7、130.2、129.6、128.4、122.6、114.2、49.0；HRMS (EI)：C9H6NO2Br [M]+に関する正確な質量計算値238.95818、実測値238.95761。文献の手続きに従い、炎で乾燥させたガラス製バイアルにアルゴン雰囲気下で、3-ブロモ安息香酸シアノメチル（192 mg、0.80 mmol）、K3PO4（204 mg、0.96 mmol）、XPhos（23.9 mg、0.05 mmol）、Pd2dba3（18.3 mg、0.02 mmol）、ニトロメタン（430 μL、8.0 mmol）、およびジオキサン（3.6 mL）を添加した。この反応混合物を70℃で24時間撹拌した。室温まで冷やした後、この混合物をCH2Cl2で希釈し、1 MのHClで洗浄した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2、ヘキサンの中に10～35％の酢酸エチル）により生成物が黄色の油として得られた（120 mg、68％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.16 (s, 1H)、8.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H)、7.74 (d, J = 7.8 Hz, 1H)、7.59 (dd, J = 7.7, 7.7 Hz, 1H)、5.51 (s, 2H)、4.99 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.0、135.5、131.6、131.5、130.3、129.7、128.9、114.2、79.1、49.1；HRMS (CI)：C10H9N2O4に関する正確な質量計算値[M+H]+ 221.0562、実測値221.0558。
Figure 2023514584000030
2-フルオロ安息香酸シアノメチル（12）。一般的な手続きに従い、2-フルオロ安息香酸（92 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が赤色の油として得られた（66 mg、56％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.98 (td, J = 7.5, 1.8 Hz, 1H)、7.61 (tdd, J = 7.0, 5.9, 3.3 Hz, 1H)、7.26 (td, J = 7.7, 1.1 Hz, 1H)、7.19 (ddd, J = 10.7, 8.4, 1.1 Hz, 1H)、4.98 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 162.6 (d, 3JCF = 3.6 Hz)、162.2 (d, 1JCF = 262.4 Hz)、135.9 (d, 3JCF = 9.1 Hz)、132.3、124.2 (d, 3JCF = 4.0 Hz)、117.2 (d, 2JCF = 21.9 Hz)、116.3 (d, 2JCF = 9.3 Hz)、114.2、48.8；HRMS (EI)：C9H6FNO2に関する正確な質量計算値[M]+ 179.0383、実測値179.0383。
Figure 2023514584000031
2-ヨード安息香酸シアノメチル（13）。一般的な手続きに従い、2-ヨード安息香酸（164 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン (140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が赤色の油として得られた（129 mg、68％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H)、7.88 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H)、7.45 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H)、7.23 (td, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H)、4.97 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.4、141.9、133.8、132.2、131.6、128.1、114.1、94.7、49.1；HRMS (EI)：C9H6INO2に関する正確な質量計算値[M]+ 286.9443、実測値286.9448。
Figure 2023514584000032
2-ホルミル安息香酸シアノメチル（14）。一般的な手続きに従い、2-ホルミル安息香酸（150 mg、1.00 mmol）、トリメチルアミン（153 μL、1.10 mmol）、クロロアセトニトリル（191 μL、3.00 mmol）、およびジクロロメタン（2.0 mL）を用いて調製した。生成物が透明な油として得られた（146 mg、77％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.58 (s, 1H)、7.99 (d, J = 7.5 Hz, 2H)、7.73 (m, 2H)、5.01 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 191.2、164.7、137.2、133.5、133.2、130.5、129.4、124.7、114.0、49.3；HRMS (EI)：C10H6NO3に関する正確な質量計算値[M]+ 189.0348、実測値189.0363。
Figure 2023514584000033
4-メトキシ安息香酸シアノメチル（15）。一般的な手続きに従い、4-メトキシ安息香酸（100 mg、0.66 mmol）、トリメチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（102 mg、81％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J = 9.0 Hz, 2H)、6.95 (d, J = 8.9 Hz, 2H)、4.93 (s, 2H)、3.88 (s, 3H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.6、164.3、132.2、120.1、114.7、114.0、55.5、48.6；HRMS (EI)：C10H9NO3に関する正確な質量計算値[M]+ 191.0582、実測値191.0581。
Figure 2023514584000034
4-エチニル安息香酸シアノメチル（16）。一般的な手続きに従い、4-エチニル安息香酸（96 mg、0.66 mmol）、トリメチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（87 mg、76％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、7.59 (d, J = 8.4 Hz, 2H)、4.97 (s, 2H)、3.29 (s, 1H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.3、132.4、129.9、128.1、127.7、114.3、82.4、81.0、49.0；HRMS (EI)：C11H7NO2に関する正確な質量計算値[M]+ 185.0477、実測値185.0476。
Figure 2023514584000035
4-(ヒドロキシメチル)安息香酸シアノメチル（17）。一般的な手続きに従い、4-(ヒドロキシメチル)安息香酸（500 mg、3.29 mmol）、トリエチルアミン（700 μL、4.94 mmol）、クロロアセトニトリル（266 μL、3.95 mmol）、およびジクロロメタン（1.2 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（470 mg、75％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H)、7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1H)、4.96 (s, 2H)、4.79 (s, 2H)、2.10 (br s, 1H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.8、147.4、130.3、126.9、126.6、114.5、64.4、48.8；HRMS (ESI)：C10H9NNaO3に関する正確な質量計算値[M+Na]+ 214.0480、実測値214.0486。
Figure 2023514584000036
4-アミノ安息香酸シアノメチル（18）。一般的な手続きに従い、4-(Boc-アミノ)安息香酸（78 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）を含むDMF（0.4 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（39 mg、68％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.66 (td, J = 8.7 Hz, 2H)、6.59 (td, J = 8.6 Hz, 2H)、6.18 (s, 2H)、5.08 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 165.1、154.9、132.2、117.0、113.9、113.3、49.3；C9H8N2O2 に関する正確な質量計算値[M]+ 176.0586、実測値176.0585。
Figure 2023514584000037
3-ヒドロキシ-4-ニトロ安息香酸シアノメチル（19）。一般的な手続きに従い、3-ヒドロキシ-4-ニトロ安息香酸（200 mg、1.09 mmol）、トリエチルアミン（232 μL、1.64 mmol）、クロロアセトニトリル（88 μL、1.31 mmol）、およびジクロロメタン（1.2 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の固体として得られた（92 mg、38％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.51 (s, 1H)、8.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H)、7.87 (d, J = 1.9 Hz, 1H)、7.65 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H)、5.00 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 162.9、154.7、136.4、135.4、125.7、122.3、120.8、113.7、49.5；HRMS (EI)：C9H6N2O5に関する正確な質量計算値[M]+ 222.0276、実測値222.0272。
Figure 2023514584000038
3-アミノ-4-ニトロ安息香酸シアノメチル（20）。一般的な手続きに従い、3-アミノ-4-ニトロ安息香酸（198 mg、1.09 mmol）、トリエチルアミン（232 μL、1.64 mmol）、クロロアセトニトリル（88 μL、1.31 mmol）、およびジクロロメタン（1.2 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の固体として得られた（210 mg、87％）。1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) δ 8.10 (dd, J = 9.0, 1.0 Hz, 1H)、7.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H)、7.65 (s, 2H)、7.09 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 1H)、5.24 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, d6-DMSO) ppm 163.7、145.7、133.6、132.5、126.5、121.5、115.9、114.5、50.4；HRMS (ESI)：C9H7N3NaO4に関する正確な質量計算値[M+Na]+ 244.0334、実測値244.0335。
Figure 2023514584000039
4-アミノ-3-ニトロ安息香酸シアノメチル（21）。一般的な手続きに従い、4-アミノ-3-ニトロ安息香酸（198 mg、1.09 mmol）、トリエチルアミン（232 μL、1.64 mmol）、クロロアセトニトリル（88 μL、1.31 mmol）、およびジクロロメタン（1.2 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の固体として得られた（120 mg、49％）。1H NMR (500 MHz, d6-アセトン) δ 8.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H)、7.96 (dd, J = 8.9, 2.0 Hz, 1H)、7.68 (s, 2H)、7.19 (d, J = 9.0 Hz, 1H)、5.17 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, d6-アセトン) ppm 164.3、150.2、136.0、129.9、120.3、120.2、116.3、116.2、49.9；HRMS (ESI)：C9H7N3NaO4に関する正確な質量計算値[M+Na]+ 244.0334、実測値244.0329。
Figure 2023514584000040
イソニコチン酸シアノメチル（22）。一般的な手続きに従い、イソニコチン酸（81 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が赤色の油として得られた（50 mg、47％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.85 (d, J = 3.9 Hz, 2H)、7.87 (d, J = 6.1 Hz, 2H)、5.01 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 163.7、150.9、135.0、122.9、113.8、49.4；HRMS (EI)：C8H6N2O4に関する正確な質量計算値[M]+ 162.0429、実測値162.0430。
Figure 2023514584000041
2-フルオロイソニコチン酸シアノメチル（23）。一般的な手続きに従い、2-フルオロイソニコチン酸（93 mg、0.66 mmol）、トリメチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（102 mg、86％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.43 (d, J = 5.1 Hz, 1H)、7.77 (m, 1H)、7.52 (dd, J = 2.6, 1.2 Hz, 1H)、5.02 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 164.4 (d, 1JCF = 241.1 Hz)、162.7 (d, 4JCF = 4.5 Hz)、149.4 (d, 3JCF = 14.6 Hz)、140.6 (d, 3JCF = 7.8 Hz)、121.1 (d, 4JCF = 4.9 Hz)、113.8、110.4 (d, 2JCF = 39.7 Hz)、49.9；HRMS (EI)：C8H5FN2O2に関する正確な質量計算値[M]+ 180.0335、実測値180.0332。
Figure 2023514584000042
2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸シアノメチル（24）。一般的な手続きに従い、2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸（125 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（118 mg、78％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.67 (s, 1H)、7.72 (dd, J = 8.0, 7.5 Hz, 1H)、7.67 (d, J = 7.2 Hz, 1H)、7.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H)、7.39 (dd, J = 8.0, 7.5 Hz, 1H)、4.99 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 161.5、156.0、155.5、150.9、135.5、130.0、125.2、117.5、117.0、115.7、113.9、49.3；HRMS (EI)：C12H7NNO4に関する正確な質量計算値[M]+ 229.0375、実測値229.0382。
Figure 2023514584000043
1H-ピロール-2-カルボン酸シアノメチル（25）。一般的な手続きに従い、1H-ピロール-2-カルボン酸（37 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.5 mmol）、クロロアセトニトリル（26.5 μL、0.4 mmol）、およびジクロロメタン（0.2 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（24 mg、49％）。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.15 (s, 1H)、7.13 (m, 1H)、6.91 (m, 1H)、6.23 (m, 1H)、5.12 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 159.4、126.2、120.3、117.2、116.7、110.6、49.2；ESI-MS；C7H6N2O2に関する質量計算値：[M]+ 150.0429、実測値150.0432。
Figure 2023514584000044
チオフェン-2-カルボン酸シアノメチル（26）。一般的な手続きに従い、チオフェン-2-カルボン酸（84 mg、0.66 mmol）、トリエチルアミン（140 μL、0.99 mmol）、クロロアセトニトリル（53 μL、0.79 mmol）、およびジクロロメタン（0.7 mL）を用いて調製した。生成物が茶色の油として得られた（72 mg、79％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89 (dd, J = 3.8, 1.3 Hz, 1H)、7.67 (dd, J = 5.0, 1.3 Hz, 1H)、7.15 (dd, J = 4.9, 3.8 Hz, 1H)、4.94 (s, 2H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 160.4、135.2、134.3、130.7、128.2、114.2、48.7；HRMS (EI)：C7H5NO2Sに関する正確な質量計算値[M]+ 167.0041、実測値167.0038。
ABTエステルを形成するための一般的な手続き。標準的な手続き3に従い、撹拌棒を備えるガラス製バイアルに、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（ABT）（1当量）、カルボン酸（1.4当量）、CH2Cl2（0.3 M）、DMAP（2.8当量）、およびEDC・HCl（2.8 当量）を添加した。25℃で3時間撹拌した後、反応物を減圧下で蒸発させ、EtOAcで希釈し、1MのHClと飽和NaHCO3で洗浄した。有機相を乾燥させ、濃縮すると、Boc保護された粗生成物が得られた。このBoc保護された生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製した。精製した生成物を4MのHCl・ジオキサンに溶かし、1時間撹拌した。減圧下で濃縮すると、生成物が十分な純度で得られた。
Figure 2023514584000045
2-(4-(((1H-ピロール-2-カルボニル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（25a）。一般的な手続きに従い、1H-ピロール-2-カルボン酸（50 mg、0.45 mmol）、ABT（100 mg、0.32 mmol）、DMAP（109 mg、0.9 mmol）、EDC・HCl（171 mg、0.9 mmol）、およびジクロロメタン（2.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（60 mg、15％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-25a：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.26 (s, 1H)、7.77 (d, J = 7.9 Hz, 2H)、7.43 (d, J = 8.1 Hz, 2H)、7.14 (s, 1H)、7.03 (d, J = 11.4 Hz, 2H)、6.29 (d, J = 3.0 Hz, 1H)、4.97 (s, 1H)、4.31 (s, 2H)、3.57 (q, J = 5.1 Hz, 2H)、3.45 - 3.38 (m, 2H)、1.44 (s, 9H)。13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 180.48、167.37、133.06、129.71、129.02、127.32、123.84、115.37、110.92、42.09、40.00、31.91、28.34。HRMS (ESI)：C20H26N3O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 404.1644、実測値404.1632.。
Figure 2023514584000046
2-(4-(((チオフェン-2-カルボニル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（26a）。一般的な手続きに従い、チオフェン-2-カルボン酸（57 mg、0.45 mmol）、ABT（100 mg、0.32 mmol）、DMAP（109 mg、0.9 mmol）、EDC・HCl（171 mg、0.9 mmol）、およびジクロロメタン（2.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（150 mg、76％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-26a：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.84-7.75 (m, 3H)、7.65 (dd, J = 4.9, 1.1 Hz, 1H)、7.44 (d, J = 8.1 Hz, 2H)、7.22 ( br, 1H)、7.13 (dd, J = 4.9, 3.9 Hz, 1H)、5.00 (s, 1H)、4.35 (s, 2H)、3.56 (q, J = 5.1 Hz, 2H)、3.45-3.37 (m, 2H)、1.44 (s, 9H)。13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 182.92、167.32、157.50、141.52、141.06、133.22、132.98、131.34、129.11、128.38、128.32、127.96、127.39、126.09、42.12、39.99、32.99、28.34。HRMS (ESI)：C20H25N2O4S2に関する正確な質量計算値[M+H]+ 421.1256、実測値421.1249。
Figure 2023514584000047
2-(4-((ペンタノイルチオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（G）。一般的な手続きに従い、吉草酸（47 μL、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（66 mg、56％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-G: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 2H)、7.30 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.28 (br s, 1H)、5.14 (br s, 1H)、4.11 (s, 2H)、3.52 (q, 5.3 Hz, 2H)、3.37 (m, 2H)、2.56 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.63 (p, J = 7.5 Hz, 2H)、1.40 (s, 9H)、1.33 (p, J = 7.5 Hz, 2H)、0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 198.6、167.4、157.5 141.4、133.0、128.8、127.3、79.9、43.5、42.0、39.9、32.7、28.3、27.6、22.0、13.7；HRMS (ESI)：C20H31N2O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 395.2005、実測値395.2009。
Figure 2023514584000048
2-(4-((ペント-4-エノイルチオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（27）。一般的な手続きに従い、4-ペンテン酸（44 μL、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（61 mg、52％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-15：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H)、7.29 (br s, 1H)、5.77 (ddt, J = 16.8, 10.2, 6.5 Hz, 1H)、5.16 (br s, 1H)、5.04 (dd, J = 17.1, 1.7 Hz, 1H)、4.99 (dd, J = 10.2, 5.1 Hz, 1H)、4.12 (s, 2H)、3.52 (q, 5.2 Hz, 2H)、3.37 (m, 2H)、2.65 (dd, J = 8.3, 6.7 Hz, 2H)、2.40 (tdd, J = 8.5, 5.9, 3.5 Hz, 2H)、1.40 (s, 9H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 197.8、167.4、157.5、141.3、135.9、133.0、128.8、127.3、115.9、79.9、42.8、42.0、39.9、32.7、29.3、28.3；HRMS (ESI)：C20H29N2O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 393.1848、実測値393.1850。
Figure 2023514584000049
2-(4-(((3-シアノプロパノイル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（28）。一般的な手続きに従い、3-シアノプロパン酸（43 mg、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（42 mg、36％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-16：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.9 Hz, 2H)、7.32 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、7.27 (br s, 1H)、5.07 (br s, 1H)、4.18 (s, 2H)、3.53 (q, 5.1 Hz, 2H)、3.38 (q, J = 5.8 Hz, 2H)、2.94 (dd, J = 7.7, 6.7 Hz, 2H)、2.68 (dd, J = 7.7, 6.7 Hz, 2H)、1.42 (s, 9H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 194.5、167.2、157.5、140.3、133.4、128.9、127.4、118.0、80.0、42.1、39.9、38.3、33.0、28.3、12.8；HRMS (ESI)：C19H26N3O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 392.1644、実測値392.1658。
Figure 2023514584000050
2-(4-(((4-メトキシ-4-オキソブタノイル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（29）。一般的な手続きに従い、モノメチルコハク酸（57 mg、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（57 mg、45％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-17：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 2H)、7.30 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.29 (br s, 1H)、5.14 (br s, 1H)、4.13 (s, 2H)、3.67 (s, 3H)、3.51 (q, 5.3 Hz, 2H)、3.37 (m, 2H)、2.89 (t, J = 6.9 Hz, 2H)、2.66 (t, J = 6.9 Hz, 2H)、1.41 (s, 9H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 196.8、172.3、167.3、157.5、141.0、133.1、128.9、127.3、79.9、51.9、42.0、39.9、38.1、32.8、28.9、28.3；HRMS (ESI)：C20H29N2O6Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 425.1746、実測値425.1759。
Figure 2023514584000051
2-(4-(((3-ニトロプロパノイル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（30）。一般的な手続きに従い、3-ニトロプロピオン酸（51 mg、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（57 mg、46％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-13：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.33 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、7.19 (br s, 1H)、4.97 (br s, 1H)、4.70 (t, J = 6.2 Hz, 2H)、4.19 (s, 2H)、3.54 (q, 5.2 Hz, 2H)、3.40 (m, 2H)、3.25 (t, J = 6.2 Hz, 2H)、1.43 (s, 9H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 194.0、167.2、157.6、140.3、133.4、129.0、127.4 80.1、69.3、42.2、39.9、39.3、33.0、28.3；HRMS (ESI)：C18H26N3O6Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 244.0334、実測値412.1531。
Figure 2023514584000052
2-(4-(((シクロヘキサンカルボニル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（31）。一般的な手続きに従い、シクロヘキサンカルボン酸（53 μL、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（77 mg、61％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-12：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 2H)、7.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、7.29 (br s, 1H)、5.15 (br s, 1H)、4.08 (s, 2H)、3.52 (q, 5.2 Hz, 2H)、3.37 (m, 2H)、2.48 (tt, J = 11.5, 3.6 Hz, 1H), 1.90 (dd, J = 12.9, 3.3 Hz, 2H)、1.76 (dt, J = 12.7, 3.4 Hz, 2H)、1.69-1.57 (m, 1H), 1.45 (qd, J = 12.0, 3.1 Hz, 2H)、1.40 (s, 9H)、1.31-1.12 (m, 3H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 202.0、167.4、157.4、141.6、132.9、128.8、127.3、79.9、52.7、41.9、39.9、32.3、29.5、28.3、25.5、25.4；HRMS (ESI)：C22H33N2O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 421.2161、実測値421.2151。
Figure 2023514584000053
2-(4-(((2-ブロモ-2-メチルプロパノイル)チオ)メチル)ベンズアミド)エタン-1-アミニウムクロリド（32）。一般的な手続きに従い、α-ブロモイソ酪酸（72 mg、0.43 mmol）、ABT（93 mg、0.30 mmol）、DMAP（105 mg、0.86 mmol）、EDC・HCl（165 mg、0.86 mmol）、およびジクロロメタン（1.0 mL）を用いて調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィ（SiO2 30％～50％の酢酸エチルを含むヘキサン）により、Boc保護された生成物が白色の固体として生成した（93 mg、68％）。4MのHCl・ジオキサンを用いたBoc脱保護により生成物が得られ、それをさらなる精製と特徴づけなしに使用した。Boc-14：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H)、7.29 (br s, 1H)、5.16 (br s, 1H)、4.12 (s, 2H)、3.52 (q, 5.3 Hz, 2H)、3.38 (m, 2H)、1.93 (s, 6H), 1.40 (s, 9H)；13C NMR (125 MHz, CDCl3) ppm 199.1、167.4、157.5、140.4、133.2、128.9、127.4、79.9、63.9、42.0、39.9、34.2、31.3 28.3；HRMS (ESI)：C19H28BrN2O4Sに関する正確な質量計算値[M+H]+ 459.0953、実測値459.0964。
RNAのためのDNA鋳型の調製
DNA鋳型は、以下のプライマーを用いて以前に記載されているようにして合成した4。
1) 伸長（異なる3’末端を伸長させることによるFx誘導体の生成。
A．フレキシザイム
Fx_F：5’-GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGC-3’（配列番号1）
eFx_R1：5’-ACCTAACGCTAATCCCCTTTCGGGGCCGCGGAAATCTTTCGATCC-3’（配列番号2）
dFx_R1：5’-ACCTAACGCCATGTACCCTTTCGGGGATGCGGAAATCTTTCGATCC-3’（配列番号3）
aFx_R1：5’-ACCTAACGCCACTTACCCCTTTCGGGGGTGCGGAAATCTTTCGATCC-3’（配列番号4）
0.5 μLの200 μM Fx_Fプライマーと、10.5 μLの200 μM Fx_R1プライマー（eFx_R1、dFx_R1、およびaFx_Rを用いてそれぞれeFx、dFx、およびaFxを生成させた）を、PCRチューブの中の99 μLのマスターミックス（9.9 μLの10×PCRバッファ（500 mM KCL、100 mMのトリス-HCL（pH 9.0）、および1％のTriton X-100）、0.99 μLの250 mM MgCl2、4.95 μLの5 mM dNTP、0.66 μLのTaq DNAポリメラーゼ（NEB）、および82.5 μLの水を含有する）に添加した。温度サイクリング条件は、1分間95℃にした後、50℃1分間と72℃1分間を5サイクルであった。生成物のサイズを3％(w/v)アガロースゲルの中でチェックした。
2）PCR増幅
A．フレキシザイム
5 μLの伸長生成物をPCR鋳型として使用した。200 μLの5×OneTaq（登録商標）標準バッファ、20 μLの10 mM dNTP、5 μLの200 μM Fx_T7Fプライマー、および5 μLの200 μM Fx_R2（eFx_R2、dFx_R2、およびaFx_R2を用いてそれぞれeFx、dFx、およびaFxを生成させた）、10 μLのOneTaq（登録商標）ポリメラーゼ、および755 μLの無ヌクレアーゼ水を1.5 mLの微量遠心チューブの中で混合した。この混合物を10本のPCRチューブに移し、以下の温度サイクリング条件：1分間95℃にした後、95℃40秒間と50℃40秒間と72℃40秒間を12サイクルでDNAを増幅した。生成物を3％(w/v)アガロースゲルの中でチェックした。
Fx_T7F：5’-GGCGTAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号5）
eFx_R2：5’-ACCTAACGCTAATCCCCT-3’（配列番号6）
dFx_R2：5’-ACCTAACGCCATGTACCCT-3’（配列番号7）
aFx_R2：5’-ACCTAACGCCACTTACCCC-3’（配列番号8）
PCR反応によって生成する最終DNA鋳型の配列
eFx
5’-GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGCGGCCCCGAAAGGGGATTAGCGTTAGGT-3’（配列番号9）
dFx
5’-GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGCATCCCCGAAAGGGTACATGGCGTTAGGT-3’（配列番号10）
aFx
5’-GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGCACCCCCGAAAGGGGTAAGTGGCGTTAGGT-3’（配列番号11）
B．tRNA
tRNA調製のためのDNA鋳型を完全長オリゴから、鋳型の5’末端と3’末端の両方に対応する一対のプライマー（GluE2_fwd：5’-GTAATACGACTCACTATAGTCC-3’（配列番号19）；GluE2_rev：5’-TGGCGTCCCCTAGGGGATTCG-3’（配列番号20））によって直接増幅した。tRNAのための5 μLのDNA鋳型（100 μM）を、5 μLの200 μM GluE2_fwdとGlu_E2_rev、200 μLの5×HFバッファ、10 μLのPhusionポリメラーゼ（NEB）、20 μLの10 mM dNTP、および755 μLの水と混合した。温度サイクリング条件は、1分間95℃にした後、95℃5秒間、60℃10秒間、および72℃10秒間を35サイクルであり、最終伸長は72℃を1分間である。生成物のサイズを3％(w/v)アガロースゲルの中でチェックした。
PCR反応によって生成した最終DNA鋳型の配列
GluE2_GGU
5'-GTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTGGTAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGCCA（配列番号12）
fMet_CAU
5'-GTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAACCA（配列番号13）
3）DNA沈降
PCR産物を1つにまとめ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、沈降させ、EtOHで洗浄した。サンプルを室温で5分間乾燥させ、100 μLの無ヌクレアーゼ水の中に再懸濁させた。DNAの濃度は分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000C分光光度計）によって求めた。
インビトロでの転写。Integrated DNA Technologies（IDT）からマイクロヘリックス （5’-rGrGrCrUrCrUrGrUrUrCrGrCrArGrArGrCrCrGrCrCrA-3’（配列番号21））を取得し、直接使用した。フレキシザイムとtRNAはHiScribe T7高収率RNA合成キット（NEB）を用いて調製した。インビトロでの転写のため、5 μgのDNA鋳型を、10 μLの10×T7反応バッファ、ATP、CTP、GTP、UTP、T7 RNAポリメラーゼミックスのそれぞれ、および100 μLまでの無ヌクレアーゼ水とともに使用した。この混合物を37℃で一晩インキュベートした。
DNA鋳型の消化。5 μLのDNase I（NEB）と20 μLのDNase I反応バッファを100 μLの転写反応生成物に添加することによってDNA鋳型を除去した。反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。
インビトロで転写されたRNAの精製。消化された転写反応物を100 μLの2×RNAローディング染料4と混合し、15％TBE-Ureaゲル（Invitrogen）にロードした。ゲルを、室温にて160 Vでトリス-ホウ酸塩-EDTA（89 mMのトリス、89 mMのホウ酸、2 mMのEDTA、およびpH 8.3）バッファの中を2.5時間にわたって走らせた。ゲルを、蛍光インディケータで被覆された20 cm×20 cmのTLCシリカゲルガラスプレート（EMD Millipore）をカバーする粘着フィルムの上に置き、転写されたRNAを、UVランプ（260 nm）を照射することによって可視化した。1枚の粘着フィルムをゲルの上に載せ、望むサイズのバンドにフルム上で印をつけた。RNA産物をゲルから切除し、2 mLの水に添加した。ゲルをつぶした後、冷えた部屋の中で4時間震盪した。ゲルを遠心分離フィルタ（EMD Millipore）に移し、4,000 gで2分間遠心分離した。フロースルーを回収し、120 μLの5 M NaClと5 mLの100％EtOHとの溶液に添加し、そして。この溶液を16時間にわたって-20℃にし、4℃にて15,000 gで45分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを室温で5分間乾燥させた。乾燥させたRNAペレットを無ヌクレアーゼ水に溶かし、Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度計で測定した吸光度から濃度を求めた。
マイクロヘリックスのアシル化。マイクロヘリックスを用いる実験を、2種類のフレキシザイム（eFxとaFx）を用いて実施した。活性化されたエステルとマイクロヘリックスのカップリング反応を以下のように実施した：1 μLの0.5 M HEPES（pH 7.5）またはビシン（pH 8.8）、1 μLの10 μMマイクロヘリックス、および3 μLの無ヌクレアーゼ水をPCRチューブの中でそれぞれ1 μLの10 μM eFx、dFx、およびaFxと混合した。この混合物を2分間95℃に加熱した後、5分間かけて室温まで冷やした。2 μLの300 mM MgCl2をこの冷やした混合物に添加し、室温で5分間インキュベートした。この反応混合物を氷の上で2分間インキュベートした後、25 mMの活性化されたエステル基質2 μLを含むDMSOを反応混合物に添加した。冷えた部屋の中で反応混合物を氷の上でさらに6～120時間インキュベートした。
酸性PAGE分析。1 μLの粗反応混合物を望む時点でアリコートに分け、反応をそのアリコートと4 μLの酸性ローディングバッファ（150 mMのNaOAc、pH 5.2、10 mMのEDTA、0.02％BPB、93％ホルムアミド）によってクエンチした。この粗混合物を50 mMのNaOAc（pH 5.2）を含有する20％ポリアクリルアミドゲルにロードしたが、さらなるRNA沈降プロセスはない。電気泳動を、冷えた部屋の中でランニングバッファとして50 mMのNaOAc（pH 5.2）を用いて実施した。ゲルをGelRed（Biotium）で染色し、Bio-Rad Gel Doc XR+上で可視化した。アシル化収率は、ImageJ（NIH）を用いてマイクロヘリックスバンドの強度を定量することによって求めた。
tRNAのアシル化。tRNAのアシル化反応を以下のようにして実施した：2 μLの0.5 M HEPES（pH 7.5）、2 μLの250 μM tRNA、マイクロヘリックス実験で選択された2 μLの250 μM Fx、および6 μLの無ヌクレアーゼ水をPCRチューブの中で混合した。この混合物を95℃に2分間加熱した後、5分間かけて室温まで冷やした。4 μLの300 mM MgCl2をこの冷やした混合物に添加し、室温で5分間インキュベートした。その後氷の上で反応混合物を2分間インキュベートし、次いで25 mMの活性化されたエステル基質を含む4 μLのDMSOを反応混合物に添加した。この反応混合物を、冷えた部屋の中の氷上のマイクロヘリックス実験で決定された最適な時間にわたってさらにインキュベートした。
tRNAの沈降。100 μLのEtOHと40 μLの0.3 M NaOAc（pH 5.2）を収容した1.5 mLの微量遠心チューブにカップリング反応からの混合物を添加し、混合して反応を停止させた。この混合物を室温にて21,000 gで15分間遠心分離し、上清を除去した。RNAペレットを0.1 MのNaOAc（pH 5.2）を含有する50 μLの70％(v/v)エタノールで洗浄したを、撹拌することによってこの溶液に再懸濁させた後、室温にて21,000 gで5分間遠心分離した。洗浄工程を2回繰り返した。上清を廃棄した後、ペレットを再懸濁された50 μLの70％(v/v)エタノールに再懸濁させ、室温にて21,000 gで3分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを1 μLの1 mM NaOAc（pH 5.2）に溶かした。
インビトロでの翻訳。再プログラムされた遺伝暗号のアプローチを利用して生成したものはPURExpress（Δ aa、Δ tRNA、E6840）系によって生成させた。6 μgの誤アシル化tRNA を1 μLの1 mM NaOAc（pH 5.2）に溶かし、9 μLの溶液混合物（2 μLの溶液A、1 μLのtRNA、3μLの溶液B、1 μLのDNA鋳型（130 ng/μL）、1 μLの無ヌクレアーゼ水、および1 μLの5 mMアミノ酸混合物を20 mMのトリスバッファ（pH 7.5）の中に含有する）に添加した。この反応混合物を37℃で4時間インキュベートした。
ペプチドの精製。PURExpressの中で生成したペプチドは、アフィニティタグ精製技術を用いることによって生成させた。2 μLのMagStrep（タイプ3）XTビーズ5％懸濁液（iba）を1.5 mLの微量遠心チューブの中で200 μLと100 μLのStrep-Tactin XT洗浄バッファ（1×）を用いて2回洗浄した。チューブを磁性ラックの上に置くことによってバッファを廃棄した。10 μLのPURExpress反応材料を湿潤な磁性ビーズと混合し、この混合物を収容したチューブを氷の上に30分間置いた。この混合物を10分ごとに5秒間撹拌した。チューブを磁性ラックの上に戻し、上清を除去した。ビーズを200 μLと100 μLの洗浄バッファで2回洗浄し、バッファを廃棄した。ビーズを10 μLの0.1％SDS溶液（水の中のv/v）と混合し、PCRチューブに移し、95℃に2分間加熱した。SDS溶液を96ウエルの磁性ラック上でビーズから分離し、質量スペクトルによってさらに分析した。
ペプチド（NH2-WSHPQFEKST-OH；配列番号14）の収率を計算するため、PURExpressに再送されたヒスチジンタグ付きの酵素を、Ni-NTAで被覆した磁性ビーズ（His-Select（登録商標）ニッケル磁性アガロースビーズ、Sigma）を用いて除去した。2 μLのビーズ懸濁液（iba）を1.5 mLの微量遠心チューブの中で200 μLと100 μLのStrep-Tactin XT Washバッファ（1×）を用いて2回洗浄した。反応混合物をビーズに添加し、室温で10分間撹拌した。ビーズを磁性ラック上で洗浄し、上清を回収した。上清をC18スピンカラム（Pierce C18カラム、Thermo Fisher Scientific）に添加して残留核酸とバッファを除去した。カラムを20％MeCN／水（5％TFA）溶液で2回洗浄した。ペプチドを80％MeCN／水（5％TFA）溶液を用いて溶離させた。
ペプチドの特徴づけ。strepアフィニティタグによって精製した1.5 μLのペプチドを、MALDIプレート上で、0.1％のTFAを含有するTHFの中で1 μLの飽和したα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）と混合した。サンプルを室温で30分間乾燥させた。ペプチドのMALDI-TOF質量スペクトルを、Bruker Autoflex IIIをポジティブレフレクトロンモードで利用して取得した。
実施例4 - 基質合成のさらなる実施例
材料と方法
あらゆる試薬と溶媒は市販グレードであり、必要なときには使用する前に精製した。ジクロロメタンは活性化アルミナのカラムを通過させることによって乾燥させた
(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（ABT）を標準的な手続き3に従って調製した。すべての有機溶液をMgSO4上で乾燥させた。薄層クロマトグラフィ（TLC）はガラス裏当てシリカゲル（250 μm）プレートを用いて実施した。フラッシュクロマトグラフィはBiotage Isolera One自動化精製系で実施した。UV光および／またはKMnO4の使用を利用して生成物を可視化した。
核磁気共鳴スペクトル（NMR）はBruker Advance III-500（500 MHz）またはVarian Unity 500（500 MHz）装置で取得し、MestReNovaによって処理した。化学シフトは、内部標準としてδ 7.26とδ 77.0（CDCl3）、およびδ 2.50とδ 39.5（DMSO-d6）に設定した残留溶媒のピークに対して測定する。質量スペクトルは、 Bruker AmaZon SLまたはWaters Q-TOF Ultima（ESI）と、Impact-IIまたはWaters 70-VSE（EI）という分光器で、記載されているイオン化法を利用して記録した。
ジニトロベンジルエステルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きA。撹拌棒を備えるガラス製バイアルに、カルボン酸（1当量）、CH2Cl2（1.0 M）、トリエチルアミン（1.5当量）、および3,5-ジノトロベンジルクロリド（1.2当量）を添加した。この反応混合物を室温で16時間撹拌した後、EtOAcで希釈し、HCl（0.5 M水溶液）、NaHCO3（水の中に4％(w/v)）、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。有機相を濃縮すると粗生成物が得られた。この生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製した。生成物を含有する得られた画分を100 mLのフラスコの中に回収し、溶媒を減圧下で除去した。2 mLのHCl（無水ジオキサンの中に4N）を添加し、室温で1時間撹拌した。得られた生成物を20 mLのガラス製バイアルに移し、高真空下で一晩乾燥させると最終生成物が得られた。
ジニトロベンジルエステルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きB。隔膜と撹拌棒を備える炎で乾燥させたバイアルに、カルボン酸（1.0当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（2.0当量）、ジメチルアミノピリジン（2.0当量）を添加し、排気し、N2(g)を3回流した後、無水CH2Cl2（0.1 M）を注射器で添加した。次いでこの反応物を10分間撹拌した後、ジニトロベンジルアルコール（無水CH2Cl2の中に0.1M）を注射器で60秒間かけて一滴ずつ添加した。次いでこの反応物を22℃で16時間撹拌した。この反応物をDCMで希釈し、分離漏斗に添加し、HCl（1.0 M水溶液）、H2O、NaHCO3（3.0 M水溶液）でリンスし、NaSO4で乾燥させ、濾過した後、シリカ（SiO2）を添加し、減圧下で濃縮した。次いで化合物／シリカ混合物を乾燥させてロードし、シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；9：1～2：8］によって精製した。
得られた油または固体を、撹拌棒を備える20 mLのシンチレーションバイアルに入れ、 2 mLのHCl（無水ジオキサンの中に4N）を添加し、4時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した後、5 mLのジエチルエーテルを添加し、この不均一な混合物を5分間超音波処理した。この混合物を濾過し、フィルタケークをジエチルエーテルでリンスした。固形物を回収して真空下で乾燥させると最終生成物が得られた。
チオ酸4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きC。隔膜と撹拌棒を備える炎で乾燥させたバイアルに、カルボン酸（1.0当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（2.0当量）、ジメチルアミノピリジン（2.0当量）を添加し、排気し、N2(g)を3回流した後、無水CH2Cl2（0.1 M）を注射器で添加した。次いでこの反応物を10分間撹拌した後、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（無水CH2Cl2の中に0.1M）を注射器で60秒間かけて一滴ずつ添加した。次いでこの反応物を22℃で16時間撹拌した。この反応物をDCMで希釈し、分離漏斗に添加し、HCl（1.0 M水溶液）、H2O、NaHCO3（3.0 M水溶液）でリンスし、NaSO4で乾燥させ、濾過した後、シリカ（SiO2）を添加し、減圧下で濃縮した。次いで化合物／シリカ混合物を溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；8：3～1：9］によって精製した。
得られた油または固体を、撹拌棒を備える20 mLのシンチレーションバイアルに入れ、 2 mLのHCl（無水ジオキサンの中に4N）を添加し、4時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した後、5 mLのジエチルエーテルを添加し、この不均一な混合物を5分間超音波処理した。この混合物を濾過し、フィルタケークをジエチルエーテルでリンスした。固形物を回収して真空下で乾燥させると最終生成物が得られた。
Figure 2023514584000054
3,5-ジニトロベンジル-アミノ-4-ブタン酸塩。一般的な手続きAに従い、N-Boc-4-アミノブタン酸（61.5 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（65 mg、70％）。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (t, J = 2.3 Hz, 1H)、8.59 (d, J = 2.1 Hz, 2H)、5.37 (s, 2H)、2.86-2.79 (m, 2H)、2.58 (t, J = 7.5 Hz, 2H)、1.85 (q, J = 7.6, 7.7, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.4、148.5 (2C)、141.0、128.7 (2C)、118.6、64.2、38.4、30.6、22.7；HRMS (EI)：C11H13N3O6 [M+H]+ に関する正確な質量計算値204.24、実測値204.12。
Figure 2023514584000055
5-アミノ吉草酸3,5-ジニトロベンジル。一般的な手続きAに従い、Boc-5-Ava-OH（72 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の油として得られた（51 mg、53％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.67 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.36 (s, 2H)、2.82-2.77 (m, 2H)、2.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H)、1.66-1.54 (m, 4H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.8、148.5 (2C)、141.0、128.6 (2C)、118.5、64.0、38.8、33.0、26.8、21.7；HRMS (CI)：C12H16N3O6 [M+H]+に関する正確な質量計算値298.27、実測値298.11。
Figure 2023514584000056
6-アミノヘキサン酸3,5-ジニトロベンジル。一般的な手続きAに従い、Boc-5-Ahx-OH（76 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（64 mg、62％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.80 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.66 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.36 (s, 2H)、2.78-2.72 (m, 2H)、2.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H)、1.62-1.53 (m, 4H), 1.38-1.31 (m, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 173.0、148.5 (2C)、141.9、128.5 (2C)、118.5、63.9、38.9、33.5、27.0、25.7、24.2；HRMS (CI)：C13H17N3O6 [M+H]+に関する正確な質量計算値312.29、実測値312.13。
Figure 2023514584000057
一般的な手続きAに従い、4-((boc-(メチル)アミノ)ブタン酸（67 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製された4-(メチルアミノ)ブタン酸3,5-ジニトロベンジル。生成物が黄色の粉末として得られた（70 mg、72％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.72 (s, 1H)、8.59 (s, 2H)、4.76 (s, 2H)、1.82 (q, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H)、；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 173.9、148.4、147.9、128.6、126.7 (2C)、117.4、61.5、47.9、32.7 30.9、21.3；HRMS (EI)：C12H15N3O6 [M+H]+に関する正確な質量計算値298.10、実測値298.14。
Figure 2023514584000058
ピペリジン-4-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル。一般的な手続きAに従い、N-Boc-ピペリジン-4-カルボン酸（76 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（43 mg、46％）。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H)、8.59 (s, 2H)、4.76 (s, 2H)、3.20 (d, J = 6.8, 2H)、2.90 (q, J = 11.4, 10.9 Hz, 2H)、2.60-2.54 (m, 1H)、2.14 (s, 1H), 1.97 (d, J = 14.9, 2H)、1.73 (qd, J = 11.4, 14.9, 4.0, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 175.2、148.4、148.0、129.7、126.7 (2C)、117.3、61.5、42.7 (2C)、38.1、24.9 (2C)；HRMS (EI)：C13H15N3O6 [M+H]+に関する正確な質量計算値310.10、実測値310.02。
Figure 2023514584000059
2-(ピペリジン-4-イル)酢酸3,5-ジニトロベンジル。一般的な手続きAに従い、N-Boc-4-ピペリジン酢酸（80 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.3 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の油として得られた（66 mg、62％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ; 8.72 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.59 (d, J = 1.7 Hz, 2H)、3.15 (d, J = 12.4 Hz, 2H)、2.79 (td, J = 12.7, 2.8 Hz, 2H)、2.37 (d, 2H)、1.99-1.90 (m, 1H), 1.74 (d, J = 14.0 Hz, 2H)、1.33 (qd, J = 12.8, 4.1 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.7、148.5 (2C)、141.0、128.5 (2C)、118.5、64.0、43.2 (2C)、30.6、28.4 (2C)；HRMS (EI)：C14H17N3O6 [M+H]+に関する正確な質量計算値324.31、実測値324.09。
Figure 2023514584000060
2-(ピペラジン-1-イル)酢酸3,5-ジニトロベンジル。一般的な手続きAに従い、2-(4-Boc-1-ピペラジニル)酢酸（80 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.3 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（87 mg、82％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ; 2.69 (t, J = 4.9 Hz, 4H)、2.98 (t, J = 5.1 Hz, 4H)、3.41 (s, 2H)、5.31 (s, 2H)、8.61 (d, J = 1.1 Hz, 2H)、8.73 (t, J = 2.1, 1H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 170.0、148.5 (2C)、140.9、128.8 (2C)、118.8、64.0、57.9、49.1 (2C)、43.3 (2C)；HRMS (EI)：C13H16N4O6 [M+H]+ に関する正確な質量計算値325.11、実測値325.22。
Figure 2023514584000061
4-アミノブタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、7-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)ブタン酸（50.8 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（40.7 mg、55％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C14H22N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値296.1433、実測値296.1435。
Figure 2023514584000062
4-アミノ-2,2-ジメチルブタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、4-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)-2,2-ジメチルブタン酸（57.8 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（51.7 mg、64％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C16H 25N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値323.1667、実測値323.1669。
Figure 2023514584000063
7-アミノヘプタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、7-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘプタン酸（105.5 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（133.7 mg、92％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1]。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C17H28N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値338.1902、実測値338.1902。
Figure 2023514584000064
(1s,3s)-3-アミノシクロブタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、(1s,3s)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（92.5 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（103.3 mg、78％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C15H22N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値308.1433、実測値308.1437。
Figure 2023514584000065
(1r,3r)-3-アミノシクロブタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、(1r,3r)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（92.9 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.6 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.4 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（100.7 mg、76％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C15H22N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値308.1433、実測値308.1436。
Figure 2023514584000066
(1S,3R)-3-アミノシクロペンタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、(1S,3R)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン（98.6 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（91.4 mg、66％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C16H24N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値322.1589 実測値 322.1591。
Figure 2023514584000067
(1S,3R)-3-アミノシクロヘキサン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、(1S,3R)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（104.6 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（99.7 mg、69％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C17H26N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値336.1746、実測値336.1746。
Figure 2023514584000068
(1S,3S)-3-アミノシクロヘキサン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、(1S,3S)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸 104.1 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（95.4 mg、62％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C17H26N3O2S [M+H]+に関する正確な質量計算値336.1746、実測値336.1749。
Figure 2023514584000069
5-(アミノメチル)フラン-3-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)。一般的な手続きCに従い、5-(((t-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)フラン-3-カルボン酸（60.3 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（68.5 mg、82％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) HRMS (EI)：C16H20N3O3S [M+H]+に関する正確な質量計算値334.1225 実測値334.1225。
実施例 5 - 遺伝暗号再プログラミングのための化学的基質のさらなる拡張
分野
フレキシザイム（Fx）、II）の利用によるペプチドのN末端またはC末端への組み込みを受容できる新規な非カノニカルな基質を報告する。
要約
リボソームを媒介とする重合により骨格伸長型単量体をポリペプチドにすることは、α-L-アミノ酸を用いるように進化した翻訳装置に対するそれら単量体の適合性が低いため困難である。ここでは、リボソームによってペプチドに組み込むことのできる基質の範囲を拡張するため、環状構造を持つ16種類の非カノニカルなβ-アミノ酸類似体を合理的に設計する。制限された立体配置のため強力なヘリックス誘導因子であるこれらβ-アミノ酸を、フレキシザイム（tRNA-合成酵素様リボザイム）を用い、EF-P結合のための特別なD-アームモチーフを有するとともに、改善されたEF-Tu結合親和性を持つ操作されたT-ステムモチーフを有するtRNAPro1E2にチャージする。次に、野生型リボソームと操作されたリボソームを用いてペプチドへのこれら環状β-アミノ酸の部位特異的組み込みを実証し、操作された翻訳装置とEF-Pの存在による環状β-アミノ酸の組み込み効率の比較も行なう。EF-Pがペプチドへの環状β-アミノ酸の組み込みが改善され、リボソームを触媒とする変換の範囲が拡張されることが見いだされる。
応用
開示されている技術の応用の非限定的な例に含まれるのは、（i）（アミド結合とエステル結合よりは）新規なA-Bポリ縮合反応をサポートできる新規な機能性ポリマーの生成を可能にする非カノニカルな化学的基質の範囲のさらなる拡張；（ii）非カノニカルな基質を用いた直交tRNAの再定義；（iii）天然（または野生型）のリボソームによって合成されるペプチド、またはその翻訳後修飾された誘導体にはアクセスできない新たな基を組み込むことによる操作されたペプチドの生成；（iv）医薬品化学を変えることのできる新規なプロテアーゼ耐性ペプチドの生成；および（v）ポリマーを特定のタンパク質への結合に適合させることのできるターンとヘリックスを持つ新規なポリマーの生成である。
利点
開示されている技術の利点の非限定的な例に含めることができるのは、（i）アルファ-アミノ酸、ベータ-アミノ酸、およびヒドロキシ酸の従来の非カノニカルな誘導体によっては得ることができない16種類の非カノニカルな化学的基質を合成すること；（ii）ポリペプチドにおいて多彩な螺旋の特徴を提供できる可能性がある異なるキラル中心を持つかさばる環式炭素構造（6、5、4、3員環）を有するベータ-アミノ酸へと、Fxに適合した基質の範囲を拡張すること；（iii）アルファ-アミノ酸、ベータ-アミノ酸、およびヒドロキシ酸の従来の非カノニカルな誘導体によっては得ることのできない螺旋の特徴を与える可能性があるかさばる環式炭素構造（6、5、4、3員環）を有するベータ-アミノ酸へと、Fxに適合した基質の範囲を拡張すること；（iv）4つの異なる立体配置（1R2R；1R2S；1S2R；1S2S）を持つ3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸塩、3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸塩を合成すること；（v）2つの異なる異性体（シス；トランス）を持つ3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロブタン-1-カルボン酸塩、S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)-2-アミノシクロブタン-1-カルボチオ酸塩、3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸塩、S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)-2-アミノシクロプロパン-1-カルボチオ酸塩を合成すること；（vi）異なるインキュベーション時間と異なるpHを用いて反応条件を最適化することにより、基質を高いアシル化収率でチャージするようにFxを適応させること；（vii）最適化されたFx反応条件により16種類の非カノニカルな基質を用いてtRNAチャージング反応を実証すること；（viii）新規なポリマーを生成させるための翻訳機械が無細胞プラットフォームに及ぼす影響を調べるため、ペプチドへのかさばるベータ-アミノ酸の組み込みを野生型リボソームまたは操作されたリボソームを用いて実証すること；これらはすべて、以前に見いだされたことも研究されたこともない；（ix）新規なポリマーを生成させるためのタンパク質翻訳反応における協働活性を調べるため、ペプチドへのかさばるベータ-アミノ酸の組み込みを、野生型リボソームまたは操作されたリボソームのいずれかの存在下で追加の翻訳装置EF-Pを用いて実証すること；（x）ポリペプチドへのかさばる基質の組み込みに関する最も重要な因子を明確にすること；（xi）設計した8つの非カノニカルな基質がtRNAにチャージされることを報告すること；（xii）非カノニカルな化学的基質を含有するレポータペプチド（精製タグ）を用いて無細胞タンパク質合成反応物からペプチドを精製し、質量分析によってそのペプチドを特徴づけること；および（xiii）新規な単量体を用いて基を組み込む能力を実証すること（それが以前に医薬品化学において変革をもたらした）である。
記述
現在の研究は、Fxアプローチによって200を超える非カノニカルな基質がtRNAにチャージされてペプチドに組み込まれることを報告しており、非カノニカルなアミノ酸をチャージされたtRNAを合成するため多くの戦略が考案されてきたが、基質の範囲の制限とギャップが相変わらず存在している。
誤アシル化tRNAは、保護されたpdCpAを使用した後、3’末端CAヌクレオチドを欠く切断型tRNAとの酵素（例えばT4 RNAリガーゼ）による連結で合成することができる。しかしこの方法は合成が面倒であり、リボソームペプチド合成を阻害する環状tRNA副生成物が生成するため結果が悪いことがしばしばある。誤アシル化tRNAのためのエステル結合は、操作された合成酵素／直交tRNAのペアを用いて得ることもできる。しかしアミノ酸基質に対する合成酵素の高い特異性だけが狭い範囲の基質プールのチャージングを可能にしており、そのため新たな合成酵素を開発するのに広範囲の作業（例えば指向性進化）が必要とされることがしばしばある。
誤アシル化tRNAを形成する別の手段は、フレキシザイム（Fx）の使用によるというものである。Fxは任意のtRNAをアミノアシル化する能力を持つ人工的なリボザイムである。Fx系は過去10年間にわたって広い成功を見てきており、その間に広範囲（200超）の化学的基質（α-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、D-アミノ酸、非カノニカルなアミノ酸、N保護された（アルキル化された）アミノ酸、およびヒドロキシ酸）が、誤アシル化tRNAを通じてリボソームペプチド鎖に組み込まれてきた。
しかしながら、遺伝暗号再プログラミングのアプローチを用いて、環状構造を持つかさばるアミノ酸を、Fxを媒介としてtRNAにチャージすることは困難なままである。なぜならリボソームは遺伝暗号再プログラミングのアプローチによって生成させることのできるペプチドライブラリの多様性を基本的に制限するため、tRNAにチャージされた基質がリボソームによって効率的に受け入れられることはないからである。
ここでは、Fx系に適合した16種類の環状β-アミノ酸を合理的に設計することを利用することによって組み込み率を調べる。無細胞プラットフォームにおいて野生型翻訳装置を用い、リボソームを媒介として基質がペプチドのN末端に組み込まれることを実証する。操作された大腸菌リボソームと、操作されたtRNAPro1E2と、操作されたtRNAとより効率的に相互作用するEF-Pとを用い、基質がペプチドのC末端に組み込まれることも示す。われわれが知る限り、これは、操作されたリボソーム、操作されたtRNA、およびそのコグネイト翻訳機械を利用してC末端に環状β-アミノ酸を有する機能化されたペプチドを合成する最初の例である。
20種類のアミノ酸建築ブロックを用いてアミド（ペプチド）結合を形成するよう進化的に最適化された天然リボソームによって新たな共有化学結合を持つ新たな範囲の配列特定ポリマーを創出することに関する包括的な研究は知られていない。
非標準的な化学的基質をペプチドに組み込む以前の研究が存在しているが、これらの研究は多様性を拡張するのにアミノ酸、ヒドロキシ酸、チオ酸バリアントの使用に主に焦点を当てているため、このアプローチによって作製できるポリマーの範囲は、ポリペプチド、ポリエステル、およびポリチオエステルに限られている。それに加え、これらの研究は、長い炭素鎖と環状アミノ酸の基質を設計するための包括的な根拠を提案していない。
合成基質に関するこの包括的な拡張により、Fxに適合していて、tRNAにチャージされ、ペプチドに組み込まれる新しい非カノニカルな基質（ベータ-環状アミノ酸）が明らかにされた。われわれの研究は、かさばるβ-アミノ酸基質の組み込みを、操作されたtRNA、操作されたリボソーム、およびEF-Pの使用によって増強できることと、翻訳装置のセットが、新しいタイプの機能化ペプチドを生成させるための新たなプラットフォームを提供できることも実証する。
Fx系により、大抵はアミノ酸とヒドロキシ酸に限られていた化学物質バリアントの既存の範囲を拡張することが可能になり、そのことによってリボソームにおいて新たな共有結合を形成すると考えられる合成基質の新たな非カノニカルなカテゴリーを開くことが可能になる。非カノニカルな単量体の組み込みのため翻訳機械を操作することに対する興味が増していることに照らし、化学物質の範囲のこの有意な拡張は、新規な非生物タンパク質とポリアミド型ポリマーの効率的な合成にとって極めて貴重である可能性がある。
図23～26に示されているデータを参照されたい。
実施例6 -リボソームを媒介とした長い炭素鎖と環状アミノ酸のインビトロでの重合によるペプチド
Lee J.ら、「リボキソームを媒介とした長鎖炭素と環状アミノ酸のインビトロでの重合によるペプチド」、Nat. Commun. 2020 Aug 27;11(1):4304を参照する。その内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
要約
リボソームを媒介として骨格伸長型単量体を重合させてポリペプチドにすることは、単量体の翻訳装置との適合性が低いため困難であることから、α-L-アミノ酸を用いることが考え出された。さらに、これら単量体をトランスファーRNA（tRNA）にアシル化（またはチャージ）してアミノアシル-tRNA基質にする機構がボトルネックである。ここでは伸長した炭素鎖（γ-、δ-、ε-、およびζ-）または環状構造（シクロブタン、シクロペンタン、およびシクロヘキサン）を持つ非カノニカルなアミノ酸類似体を合理的に設計してtRNAへのチャージを改善する。次いで、野生型リボソームと操作されたリボソームを用いてペプチドのN末端とC末端にこれら非カノニカルな骨格伸長型単量体が部位特異的に組み込まれることを実証する。この仕事は、リボソームを媒介とする重合の範囲を拡張し、新たな薬と材料のための舞台を設定する。
緒言
細胞翻訳系（リボソームとタンパク質生合成のための関連因子）は、アミノ-アシル化トランスファーRNA（tRNA）基質と規定されたコード鋳型（メッセンジャーRNA）のセットを用いた配列特定ポリマー（ポリペプチド）の合成の触媒となる。自然界では、限定されたセットのα-L-アミノ酸単量体だけがこの系によって使用され、そのことによって合成できるポリマーの潜在的な多様性が制限される。しかし過去20年にわたり、遺伝暗号を拡張する努力により、天然翻訳系は広い範囲の非カノニカルな単量体を選択的に組み込めることが示されている1-5。これら単量体には特に、α-6、β-7-9、γ-10-12、D-13,14、芳香族15-17、脂肪族15,18、マロニル16、N-アルキル化された19、およびオリゴマーアミノ酸類似体10,20,21が包含される（図28a）。
ペプチドとタンパク質へのこのようなさまざまな化学物質の部位特異的組み込みが、刺激的な応用の波につながっている。例えばペプチドのN末端に組み込まれたフォルダマーは、独自の生物活性を持つ大環状フォルダマー-ペプチドハイブリッドを生み出した22。それに加え、安息香酸と1,3-ジカルボニル基質がさまざまなアラミド-ペプチドとポリケチド-ペプチドハイブリッド分子に組み込まれており15,16、そのことで新たなクラスの機能材料とポリケチド天然製品が可能になる可能性がある。さらに、β-アミノ酸ペプチドが新たなプロテアーゼ耐性ペプチド模倣薬を可能にした23-27。
リボソームを媒介とする重合のために一層広いレパートリーの単量体にアクセスすることで、配列を特定したやり方で合成できるポリマーの数をさらに増やす見通しが生まれており、それはポリマー科学の次の「聖杯」と呼ばれている28。例えば（ポリペプチドではない）ポリアミドは、ポリマー骨格と鎖微細構造に基づく例外的なポリマー特性（改善された熱安定性、弾性率、および引張強度など）を得るのに特別な分子アーキテクチャの重要なセットを利用する（すなわちナイロン-6対ケブラー29,30、図28b）。これらアーキテクチャをポリペプチドに導入してその特性を変化させる能力は、材料科学と合成生物学の交点に新たな機会を開く可能性があろう。しかしこれら単量体（長鎖炭素アミノ酸（γ-以上））の直接的な組み込みは、2つの重要な理由で困難であることが証明されている。第1に、天然リボソームはα-L-アミノ酸を重合させるのに進化的に最適化されてきているため、骨格伸長型単量体との適合性が悪い。第2に、これら単量体をtRNAにアシル化（またはチャージ）してアミノアシル-tRNA基質にすることは難しい。化学的アミノアシル化は技術的に難しくて面倒であり、アミノアシル-tRNA合成酵素はこれら長鎖炭素単量体のために進化してきたわけではないため、フレキシザイム系（Fx、アミノアシルtRNA合成酵素様リボザイム）23,31を使用する努力は、tRNAチャージング反応の後の分子内ラクタム形成を理由として成功していない（図28c）10,12,25,32,33。合わせて考えると、これらの制限が、リボソームによって配列特定ポリアミドに組み込まれる長鎖炭素（または骨格伸長型）アミノ酸単量体の範囲を制限していた。
ここでは、Fxを触媒としたtRNAへの長鎖炭素構造を含有するγ-、δ-、ε-、およびζ-アミノ酸のチャージを調べることによりこれら制限に対処することを試み、その後、リボソームによるペプチドへのそのようなアミノ酸誘導体のインビトロでの組み込みを実証する。これは、異なる電子的因子と立体的因子を持つ4つの化学的にさまざまな足場（フェニルアラニン、安息香酸、複素芳香族、および脂肪族単量体）と関係するフレキシザイム設計規則を研究するわれわれの最近の研究15とは明確に異なる。ここでは、骨格伸長型単量体の単量体アミノ基の分子内求核攻撃を回避してtRNAチャージングを容易にする方法を考える。それに加え、長鎖炭素と環状単量体に焦点を絞る。これは、多彩な非カノニカルなα-アミノ酸6とβ-アミノ酸の組み込みを示す多くの仕事7,8,25,34とは異なり独自である。最初に、NMRとLC-MS分析を通じ、フレキシザイムによるtRNAへの直線状γ-アミノ酸のチャージが、ラクタム形成を理由として失敗するのを確認する（図28cと図33）。次に、Fxを触媒とするtRNAチャージングのこの制限を、炭素鎖を長くすること、および／または堅固な中心的アーキテクチャを導入することによりtRNA：基質複合体の分子内反応動力学を制御するアミノ酸基質アーキテクチャを設計して回避する（図28d、上部）と、ラクタム形成が減るか、完全に回避される。次いで、野生型リボソームを用いたペプチドのN末端への骨格伸長型単量体の組み込みを実証する。最後に、ペプチジルトランスフェラーゼの中心（PTC）に変異を持つ以前に操作されたリボソーム24,27,34を用い、ペプチドへのこれら非カノニカルなアミノ酸のC末端組み換えを可能にする（図28d、下部）。
結果
フレキシザイムによる長鎖炭素と環状アミノ酸のチャージ。Fxを用いて長鎖炭素アミノ酸基質をtRNAにチャージするための可能な制約に関する見通しを得るため、10種類の基質（図29の中の1～5と、実施例7に示されている補足情報の中の特徴づけの項の2i～2v）を、単量体骨格の中の炭素の数を増やしながら調べた。3-アミノプロパン酸（1、β-アラニン）と4-アミノ酪酸（2と2i）のジニトロベンジルエステル（DNB）誘導体化またはアミノ誘導体化ベンジルチオエステル（ABT）活性化形態を、Fxを媒介とするチャージングのために合成した。tRNA模倣体であるマイクロヘリックスtRNA（mihx）を使用し、従来のFx反応条件20を利用して、Fxを媒介とするアシル化反応の収率を求めた。アミノアシル化効率は酸変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE、図33）によって評価した。1はうまくチャージされるのに対し、2は、以前に報告されているように10,25、そうならないことが見いだされた（図29aと図33）。Fxを媒介とするtRNAチャージングのため4つの追加γ-アミノ酸基質（4-メチルアミノ酪酸（2ii）と2,2-ジメチルアミノ酪酸（2iii）、シス-（2iv）とトランス-2-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（2v））を試験したが、γ-アミノ酸基質（2と2i～v、実施例7に示されている補足情報の中の特徴づけの項を参照されたい）はチャージされないことが見いだされた（図33）。これは、われわれの結果が以前の文献と整合していることと、Fxを媒介とした直線状炭素鎖を持つγ-アミノ酸類似体のチャージングが実際に困難であることを示す。
tRNAチャージングの結果が悪いことの原因がラクタム形成であるという仮説を確認するため、次に、ラクタムがFxを触媒とする反応において観察されるかどうかを調べた。Fxを触媒とする4-メチルアミノ酪酸（2ii）とmihxのアシル化反応を設定し、24時間にわたってモニタした。注目すべきことに、24時間インキュベートした反応混合物のLC-MSによる分析から単一の新しいピークが得られた（2.3分、明るい緑色、図30a）。2.3分の位置のピークを横断して得られた質量スペクトルを組み合わせることによって生じたESI-MSは、ラクタムである1-メチルピロリジン-2-オンの理論的質量に対応する正確な質量を示した（図30b）。さらに、ラクタムは、Fxとmihxの両方が反応混合物の中に存在するときだけ観察される。これは、これらの種が触媒となってラクタムが形成されることを示唆する。
次に、より大きな環（5員超）の形成は5員環形成よりも動力学的に不利であるためtRNAのアシル化収率は増大するというわれわれの仮説をさらに裏付けるため、長鎖炭素誘導体である5-アミノペンタン酸（3）、6-アミノヘキサン酸（4）、および7-アミノヘプタン酸（5）を合成した。予想通り、アミノ酸誘導体の中の炭素鎖の長さを長くするとより高いアシル化収率が観察された（図29aと図33）。これは、遺伝暗号再プログラミングにおける直線状γ-アミノ酸の不足が、Fxを媒介とする触媒作用を利用してこれら基質の間でラクタムを形成する傾向に起因することをさらに支持する。注目すべきことに、この結果は、5員環自己環化に関する速度定数が最大であることを示す閉環反応に関する一般的な規則35,36によく合致する。速度は、環のサイズが5員から10員へと増加するにつれて着実に1～2桁小さくなる（すなわち自己環化が遅くなる）35。
これらの結果に基づき、アミノ基と活性化されたエステル基の立体的制約による分子内ラクタム形成を阻止すると考えられる分子アーキテクチャを設計することを試みた。堅固なスペーサ（環状、アリール、またはビニル）を含有する5つの基質（図29bの6～10）を合成し、アシル化を調べた。注目すべきことに、γ-アミノ酸とδ-アミノ酸であるすべての基質（6～10）が、フレキシザイムを用いてtRNAにうまくチャージされた。さまざまなポリアミドのための単量体の範囲をさらに拡張するため、アミノ酸の中心領域に環状構造を含有する5つの追加アミノ酸（図29cの11～15）を合成した。これら基質がtRNAにチャージされたとき、アシル化収率が他のγ-型アミノ酸と比べて劇的に増加することが見いだされた。これは、堅固な環式炭素足場が分子内5員ラクタム形成反応を効果的に阻止することを示唆する。この観察結果は、フレキシザイムを触媒とするアシル化に関してわれわれが最近記載した設計規則15のほか、ペプチドへの環状ガンマ-アミノ酸の組み込みを示した別の最近の報告12と整合している。簡単に述べると、環状構造は、カルボニルに関して構造（1～5）と比べてより少ない立体障害と、複合体構造（6～8）と比べて増加した求電子性を有するため、効率的なtRNA攻略が可能になる15。結局、13種類の非カノニカルな単量体が6～95％の効率でチャージされ、(E)-4-アミノブト-2-エン酸（7）が最低収率、トランス-3-アミノシクロブタン-1-カルボン酸（12）が最高収率であることがそれぞれ見いだされた。
骨格伸長型単量体のリボソーム重合。次に、tRNAにチャージされる新たに見いだされたフレキシザイム基質が天然タンパク質翻訳機械によって受け入れられるかどうかを調べた。目標は、特別な応用に焦点を絞るよりは、リボソームがこれら基質に適合していることの実証であった。mihxのアシル化反応から得られたのと同じ反応条件下でtRNAのためのFxを触媒とするアシル化反応を実施した（図33）。以前の仕事では、インビトロで転写されたtRNA模倣体（例えばmihxまたはマイクロヘリックス）とtRNAの間のアシル化反応収率と動力学が同等であることが示されている37-41。Fxを媒介とするtRNAアシル化の後、反応しなかった単量体を、エタノール沈降20を利用してtRNAから分離し、tRNA-基質を含む得られたtRNA画分を混合物として、タンパク質の翻訳に必要な最小セットの成分を含有する無細胞タンパク質合成42反応物（PURExpress（商標））43.に補足した。次いでMALDI質量分析により、小さなモデルストレプトアビジンタグのN末端またはC末端のいずれに非カノニカルな基質が組み込まれるかを明らかにした。
開始tRNAとして、tRNAfMetをN末端組み込み研究のために選択した。C末端組み込みに関し、リボソームによってポリペプチドに非カノニカルなアミノ酸を効率的に組み込むため、以前に作製されたいくつかのtRNA（fMet、Pro1E2、GluE2、およびAsnE2)44を評価した。コドンの違いに応じた組み込み効率の有意な差は観察されなかった。そのためPro1E244を選択した。なぜならそれは、チャージされた基質の組み込みを促進する必要があるときに無細胞翻訳反応物に追加して補足することのできる他のタンパク質翻訳因子（EF-TuやEF-Pなど）と相互作用する操作されたD-アームとT-ステムを持つからである8,25,45。コドンについては、AUG（CAUアンチコドン）を使用した。なぜならそれは、N末端組み込みのためのカノニカルな開始コドンだからである。C末端に組み込むため、mRNA上のThr（ACC）コドンをデコードするACCコドン（GGUアンチコドン）を選択した。これを選択したのは、トレオニンが、われわれの研究で使用したポリペプチドストレプトアビジンタグ（WSHPQFEK）から除外されるからである。こうすることで、対応する内在性tRNAがtPURExpress（商標）反応においてアミノアシル化されて翻訳反応で使用されることが阻止された。
14種類の基質すべてをtRNAfMet (CAU)とtRNAPro1E2 (GGU)にチャージしてアシル化tRNAのセットを生み出し、それをその後PURExpress（商標）翻訳反応で使用した。PURExpress（商標）反応は、すべての大腸菌（46超）内在性tRNAmpの存在下で実施したが、ポリペプチドストレプトアビジンタグ（WSHPQFEK）と非カノニカルなアミノアシル-tRN基質をコードする9種類のアミノ酸だけを使用した。2つの異なるセットのアミノ酸（X＋WSHPQFEK＋TとM＋WSHPQFEK＋X）をそれぞれN末端組み込みとC末端組み込みに使用した（ただしXは、Fxによりチャージされる骨格伸長型単量体が組み込まれる位置を示す（図29a、詳細は、実施例7の中の補足的情報を参照されたい）。翻訳後（図31a）、tRNAにチャージすることができたあらゆる基質がペプチドのN末端にうまく組み込まれ、MALDIスペクトルにおいてペプチドの理論的質量に対応するピークによって確認されることが見いだされた（図31b～n）。しかしC末端にこれらアミノ酸を含有するペプチドを生成させる試みは成功しなかった（図32a-cと図34b、e）。これはおそらく、新生ペプチドとアミド結合を形成するC末端組み込みはPTCにおいて基質のより正確なアラインメントを必要とすること46と、野生型リボソームはポリペプチドへの非カノニカルな骨格伸長型基質の組み込みが効率的でないことが理由である。
操作されたリボソームは新規な単量体の組み込みを増強する。最近、Hechtグループによる研究が進展し、操作されたリボソーム（040329と名づける）が、伸長中のポリマー鎖へのリボソームによるジペプチドの組み込み24,27を生体内とインビトロで可能にすることが示され、そこではリボソームが基質の遠く離れたアミンを用いて新生ペプチドとアミド結合を形成する。われわれは、この操作されたリボソームが本明細書に記載されている骨格伸長型単量体に対してより寛容であるとも仮定した。それを調べるため、以前に確立されているプロトコル47（詳細については補足的情報を参照されたい）を利用して細胞内で変異リボソームを同時発現させた。これら細胞について、スクロースクッション上の超遠心分離によってリボソームを溶解させ、精製した（詳細については補足的情報を参照されたい）。得られたリボソームサンプルは、野生型リボソームと040329リボソームの混合物を含有しており、それをその後翻訳アッセイで用いて伸長した骨格単量体に対するその活性を求めた。以前の文献に基づき、040329リボソームは精製したリボソーム集団の約25％を構成すると予想した。ペプチドへの操作されたリボソームを用いた長鎖炭素アミノ酸の組み込みの実現可能性を調べるため、リボソーム混合物（図32d）を、FxによってtRNAPro1E2(GGU)にチャージされた基質を含有するPURExpress（商標）系に添加した。われわれのMALDI質量スペクトルでは、シス-とトランス-3-アミノシクロブタン-1-カルボン酸（ACB、11と12、それぞれ図29から）をC末端に含有する標的ペプチド（図32e、fと図34c、fの中のfMWSHPQFEKS11/12）の理論的質量に対応するピークが観察されたが、それは野生型リボソームだけを用いた実験では観察されなかった（図32b、cと図34b、e 5b、c）。シス-ACBとトランス-ACBをC末端に含有する標的ペプチドの相対収率は、完全長と切断型のペプチド産物（fMWSHPQFE、fMWSHPQFEK、およびfMWSHPQFEKS、図34）の合計に基づくとそれぞれほぼ11％と15％であった。
最後に、C末端にシス-ACBとトランス-ACB（11と12、図32g、hと図34d、g）を組み込んだ後に追加アミノ酸を伸長させることができるかどうかを調べた。2個の追加アミノ酸残基Ile（AUC）とAla（GCC）をコードする新たなプラスミドを設計し、新たなセットの11個のアミノ酸（M＋WSHPQFEK＋X＋IA）を用いて同じ反応条件下でPURExpress（商標）反応を実施した。不効率だが、標的ペプチドの理論的質量に対応するピーク（fMWSHPQFEKS11/12IA）が観察された。これは、操作されたリボソームがシス-ACBとトランス-ACBの挿入後に伸長を継続できることを実証している。
考察
この仕事では、分子翻訳のための骨格伸長型アミノ酸基質の範囲を拡張した。そうするため、FxによるtRNAへのγ-アミノ酸のアシル化工程を制限する機械的側面を調べた。次いで、系統的かつ合理的な基質設計を通じ、長鎖炭素と環状構造を持つ15個のアミノ酸のさまざまなレパートリーをFxによってtRNAに6～95％の収率アシル化できることを示した。次に、リボソームを媒介とする重合でこれらのチャージされたアシル化tRNA-単量体を使用することができて、リボソーム合成によって産生させることのできるポリアミドの多様性が拡張されることを実証した。
遺伝暗号拡張の分野は現在までに数百の非カノニカルなα型アミノ酸を組み込んできたが、リボソームが本明細書に提示されている骨格伸長型（γ-、δ-、ε-、およびζ-）アミノ酸と環状（シクロブタン、シクロペンタン、およびシクロヘキサン）アミノ酸に基づく構造を組み込むことができるかどうかは知られていなかった。われわれの仕事は、リボソームが遺伝暗号再プログラミングのアプローチを利用してそのような構造を重合できることを示す。驚くべきことではないが、特にC末端または鎖中央部での組み込み効率が低い。これは、リボソームの形、生理化学的特性、および動的特性が、カノニカルなα-アミノ酸で、または改変されたリボソーム040329の場合にはβ-アミノ酸で動作するように進化してきたからである可能性が大きい34。野生型リボソームと040329リボソームは、ここで導入される骨格伸長型立体異性体単量体を相変わらず識別する可能性が大きい。将来は、そのような基質の組み込み効率を、EF-Pと操作されたtRNAの組み合わせを補足することによって改善できる可能性がある8,12,48。それに加え、インビトロでのリボソーム組み立て49と選択50のプラットフォームは、ペプチドへの骨格伸長型単量体の組み込み効率を向上させる（すなわち短縮の程度がより少ない生成物を形成する）変化した特性を持つリボソームを進化させ、そのような単量体だけからなるポリマーの合成を容易にする可能性がある。最後に、繋がれるか留められた直交する操作されたリボソーム51-55を用いた細胞系への拡張は、別の刺激的な方向を提供する。しかし細胞内で単量体をtRNAにチャージするアミノアシルtRNA-合成酵素（aaRS）の欠如に対処する必要があろう。
リボソーム重合で利用できる長鎖炭素と環状アミノ酸の範囲を拡張することにより、この仕事が非カノニカルな配列特定ポリマーを合成するための努力における新たな方向の動機づけとなることを期待する。例えばここに示す単量体は、インビトロでのスクリーニング法および選択法とともに用いて革新的なペプチド薬を発見するためのmRNAまたはリボソームの提示などに直接使用することができよう56。それに加え、将来の仕事により、規定された原子配列、正確な単分散長、およびプログラムされた立体化学を持つ独自の機能性材料とポリマーが可能になろう。
方法
一般的なFxを媒介とするアシル化反応
マイクロヘリックスのアシル化；1μLの0.5M HEPES（pH 7.5）またはビシン（pH 8.8）、1μLの10μMのマイクロヘリックス、および3μLの無ヌクレアーゼ水を、PCRチューブの中でそれぞれ1μLの10μM eFx、dFx、およびaFxと混合した。この混合物を2分間95℃に加熱した後、5分間かけて室温まで冷やした。2μLの300mM MgCl2を冷やした混合物に添加し、室温で5分間インキュベートした。その後この反応混合物を氷の上で2分間インキュベートし、次いで25mMの活性化されたエステル基質を含む2μLのDMSOを反応混合物に添加した。この反応混合物を冷えた部屋の中で氷の上にて16～120時間にわたってさらにインキュベートした。
tRNAのアシル化：2μLの0.5M HEPES（pH 7.5）またはビシン（pH 8.8）、2μLの250μM tRNA、マイクロヘリックス実験で選択された2μLの250μM Fx、および6μLの無ヌクレアーゼ水をPCRチューブの中で混合した。この混合物を2分間95℃に加熱し、5分間かけて室温まで冷やした。4μLの300mM MgCl2を冷やした混合物に添加し、室温で5分間インキュベートした反応混合物を氷の上で2分間インキュベートした後、25mMの活性化されたエステル基質を含む4μLのDMSOを反応混合物に添加した。この反応混合物を、マイクロヘリックス実験によって決定した最適な反応条件下でさらにインキュベートした。
インビトロでのポリアミドの合成
N末端組み込み：レポータペプチドとして、T7プロモータに制御されるDNA鋳型（pJL1_StrepII）を、ストレプトアビジン（Strep）タグ、および追加のSerとThrnoのコドン（XWSHPQFEKST（Strepタグ）、ただしXは非カノニカルなアミノ酸基質の位置を示す）をコードするように設計した。翻訳開始コドンAUGを非カノニカルなアミノ酸基質XのN末端組み込みに使用した。ペプチド合成を、開始コドンAUGと精製タグをデコードする9種類のアミノ酸だけを用いて他の11種類のアミノ酸の不在下で実施し、対応する内在性tRNAがアミノアシル化されて翻訳に使用されることを阻止した。PURExpress（商標）Δ（aa、tRNA）キット（NEB、E6840S）をポリアミド合成反応に使用し、反応混合物を37℃で3時間インキュベートした。その後、合成されたペプチドを、Strep-Tactin（登録商標）で被覆された磁性ビーズ（IBA）を用いて精製し、SDSで変性させ、MALDI-TOF質量分析によって特徴づけた。
C末端組み込み：同じアミノ酸（MWSHPQFEKSX、ただしXは環状アミノ酸の位置を示す）をコードする同じプラスミド（pJL1_StrepII）をC末端組み込みのために使用し、特注のPURExpress（登録商標）Δ（aa、tRNA、リボソーム）キット（NEB、E3315Z）を用いて環状アミノ酸をThrコドン（ACC）に組み込んだ。C末端組み込みでは、キットに提供されている野生型リボソームは使用しなかった。15μM（最終濃度）の操作されたリボソームを、Strepタグをデコードする9種類のアミノ酸だけを含有する反応混合物に添加し、37℃で3時間インキュベートした。
中央位置組み込み：追加のIleとAlaをThrの下流でコードするように設計したプラスミド（pJL1-StrepII_TIA）を、ポリアミド（MWSHPQFEKSXIA、ただしXは環状アミノ酸の位置を示す）の中央位置に環状アミノ酸を組み込むのに使用した（詳細はプラスミドマップ参照）。このポリアミドは、C末端組み込みに用いたのと同じ条件下でzPURExpress（商標）Δ（aa、tRNA、リボソーム）キットにおいて11種類のアミノ酸を用いて生成させた。
ポリアミドの精製と特徴づけ。以前に記載されているようにして15、アフィニティタグ精製技術を利用して非カノニカルなアミノ酸を含有するポリアミドを精製し、MALDI分光法によって特徴づけた。サンプルを調製するため、1.5μLの精製したペプチド（水の中に0.1％のSDS）を0.5μLのマトリックス（α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を含むTHF、10mg/mL）で乾燥させた。乾燥させたサンプルをBruker rapifleX MALDI-TOFで特徴づけ、FlexControl v2.0ソフトウエア（Bruker）を用いて処理した。
040329リボソームを含有する細胞の調製。pLプロモータ（pAM552）下のrrnBオペロンを含有するプラスミドを、23S rDNAの中に040329変異と呼ぶ変異2057AGCGTGA2063と2502TGGCAG2507を持つ改変されたrrnB遺伝子を生成させるための鋳型として使用した。野生型（WT）の、または改変された（040329）rrnB遺伝子のいずれかを有するプラスミドを、電気穿孔を利用してPOP2136に入れて形質転換した後、100μg/mLのカルベニシリンを含むLB-寒天に播種した。プレートを30℃で16～18時間インキュベートした（POP2136はcIリプレッサを有するため、30℃で増殖させるときrRNAの発現を抑制する）。プレートからの単一のコロニーを用いて100μg/mLのカルベニシリンを含有する25mLのLB-Millerに接種し、この培養物を30℃で16～18時間増殖させた。培養物が飽和に達したとき、100μg/mLのカルベニシリンを含む2×YTPの培養物2Lを42℃まであらかじめ温め、20mLの一晩培養物を接種した。42℃での増殖によりpLプロモータの抑制が消えたため、040329変異rRNAをコードするrrnBオペロンの発現が誘導される。以前の研究は、得られたリボソームの集団がプラスミドによってコードされるリボソームを20％まで含有することを示唆している。光学密度を、培養物が0.4と0.6の間のODに到達するまで定期的に測定した（1時間ごと、その後は標的ODに近づくと15～30分間ごと）。次いで培養物を8000×gで10分間遠心分離することによってペレット化した。得られた細胞ペレットをバッファA（組成については下記参照）の中に再懸濁させ、再び8000×gで10分間遠心分離した。再懸濁と遠心分離を2回繰り返し、合計3回洗浄した。最後の遠心分離の後、細胞ペレットを液体窒素の中で瞬間凍結させ、さらなる処理まで-80℃で保管した。
リボソーム混合物の精製。凍結した細胞ペレットを指定された割合（1gの細胞ペレットにつき5mLのバッファA）でバッファAの中に再懸濁させ、20,000～25,000psiでの均質化を利用して溶解させた。得られた溶液を12,000×gで10分間遠心分離すると、透明なライセートが得られた。次いでこの透明なライセートを均一な体積比（1mLのバッファB（組成については下記参照）につき1mLの細胞ライセート）でスクロースクッションの上に層にし、90,000×gで18時間超遠心分離した。するとリボソームを含有する超遠心分離チューブの底にペレットが生成した。リボソーム混合物を、バッファC（組成については下記参照）を用いて4℃で4～8時間にわたって軽く震盪しながら再懸濁させた後、希釈し、分光光度計で260nmの吸光度によって測定して20～25μMの濃度のリボソームを得た（1 A260単位＝4.17×10-5μMのリボソーム）。サンプルを完全に再懸濁させて希釈した後、アリコートに分け、液体窒素で瞬間凍結させ、PURE反応で使用するまで-80℃で保管した。さらなる精製法（スクロース勾配など）を実施できたであろうが、リボソーム混合物の中に存在する変異リボソームの絶対数を最大にするため粗混合物を用いる判断をした。*使用した試薬-バッファA：20mMのトリス-HCl（pH 7.2）、100mMのNH4CL、10mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、2mMのDTT；バッファB：20mMのトリス-HCl（pH 7.2）、500mMのNH4CL、10mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、2mMのDTT、37.7％(v/v)スクロース；バッファC：10mMのトリス-OAc、（pH 7.5）、500mMのNH4Cl、7.5mMのMg(OAc)2、0.5mMのEDTA、2mMのDTT。040329リボソームプラスミドの構築に使用したオリゴ：
（1）インサートを生成させるため：
5'-AGTGTACCCGCGGCAAGACGAGCGTGACCCGTGAACCTTTACTATAGCTTGA-3'と5'-GCCCCAGGATGTGATGAGCCCTGCCAGAGGTGCCAAACACCGCCGTC-3'、
（2）骨格を生成させるため：
5'-GGCTCATCACATCCTGGGGCTG-3'と5'-CGTCTTGCCGCGGGTACACT-3'。得られたPCR産物は等温DNAアセンブリ57を用いて組み立てた。
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実施例7 - 実施例6のための補足情報
材料と方法。あらゆる試薬と溶媒は市販グレードであり、必要なときには使用する前に精製した。ジクロロメタンはGrubbs1が記載しているようにして活性化アルミナのカラムを通過させることによって乾燥させた。
(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（ABT）を標準的な手続きに従って調製した。2すべての有機溶液をMgSO4上で乾燥させた。薄層クロマトグラフィ（TLC）はガラス裏当てシリカゲル（250 μm）プレートを用いて実施した。フラッシュクロマトグラフィはBiotage Isolera One自動化精製系で実施した。UV光および／またはKMnO4の使用を用いて生成物を可視化した。
核磁気共鳴スペクトル（NMR）はBruker Advance III-500（500 MHz）またはVarian Unity 500（500 MHz）装置で取得し、ACD（v12.01）またはMnova（v14）によって処理した。化学シフトは、内部標準としてδ 7.26とδ 77.0（CDCl3）、およびδ 2.50とδ 39.5（DMSO-d6）に設定した残留溶媒のピークに対して測定する。質量スペクトルは、 Bruker AmaZon SLまたはWaters Q-TOF Ultima（ESI）と、Impact-IIまたはWaters 70-VSE（EI）という分光器で、記載されているイオン化法を利用して記録した。
ジニトロベンジルエステルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きA。撹拌棒を備えるガラス製バイアルに、カルボン酸（1当量）、CH2Cl2（1.0 M）、トリメチルアミン（1.5 当量）、および3,5-ジノトロベンジルクロリド（1.2当量）を添加した。室温で16時間撹拌した後、反応混合物をEtOAcで希釈し、HCl（0.5 M水溶液）、NaHCO3（水の中に4％(w/v)）、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。有機相を濃縮すると粗生成物が得られた。この生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製した。生成物を含有する得られた画分を100 mLのフラスコに回収し、溶媒を減圧下で除去した。2 mLのHCl（無水ジオキサンの中に4N）を添加し、室温で1時間撹拌した。得られた生成物を20 mLのガラス製バイアルに移し、高真空下で一晩乾燥させると最終生成物が得られた。
ジニトロベンジルエステルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きB。隔膜と撹拌棒を備える炎で乾燥させたバイアルに、カルボン酸（1.0当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（2.0当量）、ジメチルアミノピリジン（2.0当量）を添加し、排気し、N2（g）を3回流した後、無水CH2Cl2（0.1 M）を注射器で添加した。次いで反応物を10分間撹拌した後、ジニトロベンジルアルコール（無水CH2Cl2の中に0.1M）を注射器で一滴ずつ60秒間かけて添加した。次いで反応物を22℃で16時間撹拌した。反応物をDCMで希釈し、分離漏斗に添加し、HCl（1.0 M水溶液）、H2O、NaHCO3（3.0 M水溶液）でリンスし、NaSO4で乾燥させ、濾過した後、シリカ（SiO2）を添加し、減圧下で濃縮した。次いで化合物／シリカ混合物を乾燥させてロードし、シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；9：1～2：8］によって精製した。
チオ酸4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジルの形成とBoc脱保護のための一般的な手続きC。隔膜と撹拌棒を備える炎で乾燥させたバイアルに、カルボン酸（1.0当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（2.0当量）、ジメチルアミノピリジン（2.0当量）を添加し、排気し、N2（g）を3回流した後、無水CH2Cl2（0.1 M）を注射器で添加した。次いで反応物を10分間撹拌した後、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（無水CH2Cl2の中に0.1M）を注射器で一滴ずつ60秒間かけて添加した。次いで反応物を22℃で16時間撹拌した。反応物をDCMで希釈し、分離漏斗に添加し、HCl（1.0 M水溶液）、H2O、NaHCO3（3.0 M水溶液）でリンスし、NaSO4で乾燥させ、濾過した後、シリカ（SiO2）を添加し、減圧下で濃縮した。次いで化合物／シリカ混合物を乾燥させてロードし、シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；8：3～1：9］によって精製した。
得られた油または固形物を、撹拌棒を備える20 mLのシンチレーションバイアルに入れ、2 mLのHCl（無水ジオキサンの中に4N）を添加し、4時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した後、5 mLのジエチルエーテルを添加し、この不均一な混合物を5分間超音波処理した。この混合物を濾過し、フィルタケークをジエチルエーテルでリンスした。固形物を回収し、真空下で乾燥させると最終生成物が得られた。
基質の特徴づけ
Figure 2023514584000070
3-アミノプロパン酸3,5-ジニトロベンジル（1）。一般的な手続きAに従い、N-Boc-ベータ-アライン（62.4 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（45 mg、51％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.70 (s, J = 2.1 Hz, 2H)、5.39 (s, 2H)、3.07 (t, J = 6.7 Hz, 2H)、2.80 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.3、148.6、148.5、142.3、129.7 (2C)、118.8、61.6、35.2、31.9；HRMS (m/z)：C10H11N3O6に関する計算値[M]+ 270.2107、実測値270.2238
Figure 2023514584000071
3,5-ジニトロベンジル-アミノ-4-ブタン酸塩（2）。一般的な手続きAに従い、N-Boc-4-アミノブタン酸（71.6 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（65 mg、70％）。1H NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (t, J = 2.3 Hz, 1H)、8.59 (d, J = 2.1 Hz, 2H)、7.98 (s, 3H)、5.37 (s, 2H)、2.86-2.79 (m, 2H)、2.58 (t, J = 7.5 Hz, 2H)、1.85 (q, J = 7.6, 7.7, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.4、148.5 (2C)、141.0、128.7 (2C)、118.6、64.2、38.4、30.6、22.7；HRMS (m/z)：C11H13N3O6に関する計算値[M]+ 204.24、実測値204.12。
Figure 2023514584000072
4-アミノブタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（2i）。一般的な手続きCに従い、7-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)ブタン酸（50.8 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（40.7 mg、55％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.76 (s, 1H)、8.15 (s, 3H)、8.06 (s, 3H)、7.79 (d, J = 6.8 Hz, 2H)、7.29 (d, J = 7.1 Hz, 2H)、4.09 (s, 2H)、3.43 (s, 3H)、2.88 (s, 2H)、2.42 (s, 1H)、1.78 (s, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 197.20、166.13、141.15、132.63、128.39、127.57、39.87、38.41、37.77、36.96、31.80、22.63。HRMS (m/z)：C14H22N3O2Sに関する計算値[M]+ 297.1511、実測値297.1511。
Figure 2023514584000073
4-(メチルアミノ)ブタン酸3,5-ジニトロベンジル（2ii）。一般的な手続きAに従い、4-((boc-(メチル)アミノ)ブタン酸（67 mg、0.33 mmol）、トリメチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（70 mg、72％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.86 (s, 2H)、8.72 (s, 1H)、8.59 (s, 2H)、4.76 (s, 2H)、δ 2.86 (dq, J= 12.4, 6.9 Hz, 2H)、2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H)、1.81 (p, J = 7.5 Hz, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSOd6) ppm 173.9、148.4、147.9、128.6、126.7 (2C)、117.4、61.5、47.9、32.7 30.9、21.3；HRMS (m/z)：C12H15N3O6に関する計算値[M]+ 298.10、実測値298.14。
Figure 2023514584000074
4-アミノ-2,2-ジメチルブタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（2iii）。一般的な手続きCに従い、4-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)-2,2-ジメチルブタン酸（57.8 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（51.7 mg、64％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H)、8.13 (s, 4H)、8.03 (s, 3H)、7.82 (d, J = 7.2 Hz, 2H)、7.33 (d, J =7.4 Hz, 2H)、4.11 (s, 2H)、3.47 (s, 3H)、2.92 (s, 2H)、2.61 (s, 2H)、1.90-1.70 (m, 2H)、1.14 (s, 6H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 204.04、166.23、141.10、132.71、128.42、127.62、47.78、38.47、36.99、34.93、31.71、24.53。HRMS (m/z)：C16H25N3O2Sに関する計算値[M]+ 325.1824、実測値325.1825。
Figure 2023514584000075
rac-シス-3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸塩（2iv）。一般的な手続きAに従い、シス-2-Boc-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（66.4 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（48.2 mg、52％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.73 (d, J = 0.9 Hz, 2H)、5.42 (dd, J = 44.2, 13.0 Hz, 2H)、2.34-2.26 (m, 2H)、2.22-2.09 (m, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 171.53、148.54 (2C)、140.65、129.08 (2C)、118.70、64.70、45.95、25.44、20.29。HRMS (m/z)：C11H11N3O6に関する計算値[M]+ 282.0726、実測値282.0733。
Figure 2023514584000076
rac-トランス-3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸塩（2v）。一般的な手続きAに従い、トランス-2-Boc-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（66.4 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（35.3 mg、38％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.79 (s, 1H)、8.767 (広い, 2H)、5.36 (広い, 2H)、3.66 (t, J = 22.6 Hz, 1H)、2.74 (t, J = 47.9 Hz, 1H)、1.6-1.2 (m, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 172.44、148.53 (2C)、141.09、128.61 (2C)、118.57、64.14、44.10、29.51、26.62。HRMS (m/z)：C11H11N3O6に関する計算値[M]+ 282.0726、実測値282.0729。
Figure 2023514584000077
5-アミノ吉草酸3,5-ジニトロベンジル（3）。一般的な手続きAに従い、Boc-5-Ava-OH（72 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の油として得られた（51 mg、53 ％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.67 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、7.89 (s, 3H)、5.36 (s, 2H)、2.82-2.77 (m, 2H)、2.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H)、1.66-1.54 (m, 4H)；13C NM R (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.8、148.5 (2C)、141.0、128.6 (2C)、118.5、64.0、38.8、33.0、26.8、21.7；HRMS (m/z)：C12H16N3O6に関する計算値[M]+ 298.27、実測値298.11
Figure 2023514584000078
6-アミノヘキサン酸3,5-ジニトロベンジル（4）。一般的な手続きAに従い、Boc-5-Ahx-OH（76 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が白色の固体として得られた（64 mg、62 ％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.80 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.66 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、7.87 (s, 3H)、5.36 (s, 2H)、2.78-2.72 (m, 2H)、2.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H)、1.62-1.53 (m, 4H)、1.38-1.31 (m, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 173.0、148.5 (2C)、141.9、128.5 (2C)、118.5、63.9、38.9、33.5、27.0、25.7、24.2；HRMS (m/z)：C13H17N3O6に関する計算値[M]+ 312.29、実測値312.13。
Figure 2023514584000079
7-アミノヘプタンチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（5）。一般的な手続きCに従い、7-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘプタン酸（105.5 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（133.7 mg、92％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H)、8.22 (s, 3H)、8.04 (s, 3H)、7.89 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、7.37 (d, J = 8.1 Hz, 2H)、4.16 (s, 2H)、2.98 (q, J = 5.5 Hz, 2H)、2.72 (q, J = 6.6 Hz, 2H)、2.61 (t, J = 7.3 Hz, 2H)、2.51 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 1.55 (dp, J = 15.9, 7.9, 7.5, 7.3 Hz, 4H), 1.38 - 1.21 (m, 4H)。13C NMR (126 MHz, DMSOd6) δ 198.11、166.32、141.50、132.74、128.48、127.72、42.95、38.62、38.54、37.10、31.82、27.64、26.67、25.44、24.81。HRMS (m/z)：C17H27N3O2Sに関する計算値[M]+ 339.1980、実測値339.1982。
Figure 2023514584000080
5-(アミノメチル)フラン-3-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（6）。一般的な手続きCに従い、5-(((t-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)フラン-3-カルボン酸（60.3 mg、0.25 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（95.9 mg、0.50 mmol）、ジメチルアミノピリジン（61.1 mg、0.50 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（84.6 mg、0.25 mmol）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（68.5 mg、82％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.78 (s, 1H)、8.60 (m, 4H)、8.14 (s, 3H)、7.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H)、7.39 (d, J = 7.5 Hz, 2H)、6.88 (s, 1H)、4.29 (s, 2H)、4.05 (s, 2H)、3.47 (d, J = 5.6 Hz, 2H)、2.93 (s, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 183.42、166.23、150.18、147.34、141.06、132.82、128.57、127.67、126.52、108.03、38.48、37.03、34.70、31.45。HRMS (m/z)：C16H21N3O3Sに関する計算値[M]+ 335.1304、実測値335.1304。
Figure 2023514584000081
(E/Z)-4-アミノブト-2-エン酸3,5-ジニトロベンジル（7）。一般的な手続きAに従い、(E)-4-((t-ブトキシカルボニル)アミノ）ブト-２-エン酸（66.4 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（24.1 mg、26％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (t, J = 2.2 Hz, 1H)、8.69 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、8.39 (s, 3H)、6.97 (m, 1H)、6.34-6.19 (m, 1H)、5.47 (s, 2H)、3.71 (d, J = 5.4 Hz, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 164.53、148.08、141.86、140.32、130.69、128.28、122.76、118.25、63.95。HRMS (m/z)：C11H12N3O6に関する計算値[M]+ 282.0726、実測値282.0728。
Figure 2023514584000082
3-(アミノメチル)ベンゾチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（8）。一般的な手続きCに従い、3-(((t-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)安息香酸（108.1 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（98.9 mg、67％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.79 (t, J = 5.5 Hz, 1H)、8.52 (s, 3H)、8.17 (s, 3H)、7.99 (s, 1H)、7.83 (d, J = 8.2 Hz, 3H)、7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H)、7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H)、7.39 (d, J = 8.1 Hz, 2H)、4.31 (s, 2H)、4.02 (q, J = 5.8 Hz, 2H)、3.44 (q, J = 6.0 Hz, 2H)、2.89 (q, J = 5.9 Hz, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 190.32、166.31、141.10、136.24、135.28、134.78、132.92、129.43、128.71、127.78、127.62、126.90、41.66、38.54、37.12、32.16。HRMS (m/z)：C18H23N3O2Sに関する計算値[M]+ 345.1511、実測値345.1511。
Figure 2023514584000083
2-(ピペリジン-4-イル)酢酸3,5-ジニトロベンジル（9）。一般的な手続きAに従い、N-Boc-4-ピペリジン酢酸（80 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.3 mL）を用いて調製した。生成物が黄色の油として得られた（66 mg、62％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ; 8.72 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.59 (d, J = 1.7 Hz, 2H)、3.15 (d, J = 12.4 Hz, 2H)、2.79 (td, J = 12.7, 2.8 Hz, 2H)、2.37 (d, 2H)、1.99-1.90 (m, 1H)、1.74 (d, J = 14.0 Hz, 2H)、1.33 (qd, J = 12.8, 4.1 Hz, 2H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.7、148.5 (2C)、141.0、128.5 (2C)、118.5、64.0、43.2 (2C)、30.6、28.4 (2C)；HRMS (m/z)：C14H17N3O6に関する計算値[M]+ 324.31、実測値324.09。
Figure 2023514584000084
2-(ピペラジン-1-イル)酢酸3,5-ジニトロベンジル（10）。一般的な手続きAに従い、2-(4-Boc-1-ピペラジニル)酢酸（80 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.3 mL）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（87 mg、82％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ; 2.69 (t, J = 4.9 Hz, 4H)、2.98 (t, J = 5.1 Hz, 4H)、3.41 (s, 2H)、5.31 (s, 2H)、8.61 (d, J = 1.1 Hz, 2H)、8.73 (t, J = 2.1, 1H)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 170.0、148.5 (2C)、140.9、128.8 (2C)、118.8、64.0、57.9、49.1 (2C)、43.3 (2C)；HRMS (m/z)：C13H16N4O6に関する計算値[M]+ 325.11、実測値325.22。
Figure 2023514584000085
(1s,3s)-3-アミノシクロブタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（11）。一般的な手続きCに従い、(1s,3s)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（92.5 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（103.3 mg、78％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系: 1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.81 (d, J = 7.3 Hz, 2H)、7.40 (d, J = 7.3 Hz, 2H)、4.19 (s, 2H)、3.74 (d, J = 10.5 Hz, 1H)、3.65 (s, 2H)、3.29-3.22 (m, 1H)、3.16 (s, 2H)、2.59 (s, 2H)、2.38 (s, 2H)。13C NMR (126 MHz, メタノール-d4) δ 199.70、170.55、143.56、133.69、130.04、128.84、42.36、41.06、40.33、38.77、33.30、32.37。HRMS (m/z)：C15H21N3O2Sに関する計算値[M]+ 309.1511、実測値309.1512。
Figure 2023514584000086
(1r,3r)-3-アミノシクロブタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（12）。一般的な手続きCに従い、(1r,3r)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（92.9 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.6 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.4 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（100.7 mg、76％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 8.72 (s, 1H)、7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、4.23 (s, 2H)、3.90 (t, J = 7.7 Hz, 1H)、3.65 (q, J = 5.7 Hz, 2H)、3.50 (dp, J = 10.0, 5.2, 4.2 Hz, 1H)、3.16 (t, J = 5.9 Hz, 2H)、2.69 - 2.56 (m, 2H)、2.45 (q, J = 9.7 Hz, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 199.63、166.26、141.13、132.76、128.49、127.66、42.81、40.90、38.50、37.04、31.92、29.97。HRMS (m/z)：C15H21N3O2S [M]+に関する計算値309.1511、実測値309.1512。
Figure 2023514584000087
(1S,3R)-3-アミノシクロペンタン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（13）。一般的な手続きCに従い、(1S,3R)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン（98.6 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（91.4 mg、66％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 2H)、7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H)、4.20 (s, 2H)、3.23 (p, J = 8.0 Hz, 1H)、3.15 (t, J = 6.0 Hz, 3H)、2.35 (dt, J = 13.5, 7.8 Hz, 1H)、2.16-2.08 (m, 1H)、2.08-2.02 (m, 1H)、2.02-1.93 (m, 1H), 1.89 (dt, J = 13.6, 7.8 Hz, 2H)、1.78-1.66 (m, 1H), 1.40 (d, J = 9.6 Hz, 2H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 199.88、166.31、141.31、132.80、128.53、127.76、50.54、50.35、38.51、37.09、34.12、31.91、29.70、27.39。HRMS (m/z)：C16H25N3O2Sに関する計算値[M]+ 323.1667、実測値322.1669。
Figure 2023514584000088
(1S,3R)-3-アミノシクロヘキサン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（14）。一般的な手続きCに従い、(1S,3R)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（104.6 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が白色の粉末として得られた（99.7 mg、69％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.80 (d, J = 8.3 Hz, 2H)、7.39 (d, J = 8.3 Hz, 2H)、4.17 (s, 2H)、3.64 (t, J = 5.9 Hz, 2H)、3.15 (t, J = 5.9 Hz, 3H)、2.73 (tt, J = 3.4 Hz, 1H)、2.20 (d, J = 12.4 Hz, 1H)、2.09 - 1.86 (m, 3H), 1.62-1.24 (m, 4H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 201.22、166.83、141.85、133.30、129.00、128.23、46.49、46.37、39.04、37.59、32.23、31.04、28.78、28.00、19.92。HRMS (m/z)：C17H27N3O2Sに関する計算値[M]+ 337.1824、実測値337.1824
Figure 2023514584000089
(1S,3S)-3-アミノシクロヘキサン-1-カルボチオ酸S-(4-((2-アミノエチル)カルバモイル)ベンジル)（15）。一般的な手続きCに従い、(1S,3S)-3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸 104.1 mg、0.43 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド（EDCI）（165.1 mg、0.86 mmol）、ジメチルアミノピリジン（105.2 mg、0.86 mmol）、(2-(4-(メルカプトメチル)ベンズアミド)エチル)カルバミン酸t-ブチル（145 mg、0.43 mmol）を用いて調製した。生成物が黄色の粉末として得られた（95.4 mg、62％）。シリカゲルカラムクロマトグラフィ［溶媒系：ヘキサン-酢酸エチル；1：1、Rf＝0.1］。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (t, J = 5.5 Hz, 1H)、8.18 (s, 6H)、7.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H)、7.31 (d, J = 8.3 Hz, 2H)、4.11 (s, 2H)、3.46 (q, J = 6.0 Hz, 2H)、3.26-3.18 (m, 1H)、3.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H)、2.92 (t, J = 6.1 Hz, 2H)、2.44 (p, J = 1.8 Hz, 1H)、1.96 (ddd, J = 13.5, 7.0, 4.0 Hz, 1H)、1.71 (dtd, J = 12.8, 8.2, 4.2 Hz, 1H)、1.61 (d, J = 5.6 Hz, 2H)、1.46 (qt, J = 7.9, 2.9 Hz, 1H)、1.33 (dtt, J = 12.8, 8.8, 4.2 Hz, 1H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 200.74、166.35、141.37、132.82、128.52、127.75、46.01、45.89、38.56、37.11、31.75、30.56、28.30、27.52、19.44。HRMS (m/z)：C17H27N3O2Sに関する計算値[M]+ 337.1824、実測値337.1824。
RNAのためのDNA鋳型の調製。フレキシザイムとtRNAを調製するためのDNA鋳型は以下のプライマーを用いて以前に記載されているようにして合成した3。
Figure 2023514584000090
FxとtRNAの調製。フレキシザイムとtRNAはHiScribeTM T7高収率RNA合成キット（NEB、E2040S）を用いて調製し、以前に報告されている方法3によって精製した。
補足の参考文献
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実施例8 - インビトロ翻訳を利用したペプチドへの環状β-アミノ酸のリボソーム組み込み
Leeら「インビトロ翻訳を利用したペプチドへの環状β-アミノ酸のリボソーム組み込み」、Chem. Comm., 2020, 56, 5597-5600を参照する。その内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
遺伝暗号再プログラミングを通じたリボソームによるペプチドへの環状β-アミノ酸のインビトロでの組み込みを実証する。さらに、伸長因子Pの添加を通じて組み込み効率を増大させうることを示す。この仕事はリボソームを媒介とする重合の範囲を拡張し、新たな薬と材料のための舞台を設定する。
リボソーム単量体の天然のレパートリーを拡張すると、遺伝子にコードされるさまざまな化学を用いて新しいクラスの酵素、薬、および材料が生まれる可能性があろう1-5。すでに、遺伝暗号を拡張する努力により、天然翻訳系と操作された翻訳系が広い範囲の非カノニカルな単量体を特にN末端に選択的に組み込めることが示されている6。例えばフレキシザイム系7-9（Fx、活性化された化学的基質をtRNAにチャージするトランスファーRNA（tRNA）合成酵素様リボザイム）を用いた遺伝暗号再プログラミングにより、非カノニカルな側鎖を持つアアミノ酸10、β-アミノ酸11-13、N修飾アミノ酸14、ヒドロキシ酸15,16 非アミノカルボン酸9,17-19、チオ酸20、脂肪族9、マロニル基質19、長い炭素鎖のアミノ酸（例えばγ-、δ-など）21,22の組み込みが示され、フォルダマー23の組み込みさえも示されている。これらの達成により、新規なペプチド薬24-26と新しいクラスの配列特定ポリマー性材料（アラミドまたはポリアミドなど）9,19,21が可能になる。
これらの仕事は分子翻訳に関するわれわれの理解を深めてくれた一方で、継続した研究も触発してきた。基本的な観点からは、天然翻訳装置の制限を探ると、リボソームによって重合させることのできる単量体のサイズ、形、および化学に関する制約を明らかにする助けになろう。応用の観点からは、リボソームを媒介とする重合のためより一層広いレパートリーの単量体にアクセスすると、バイオマニュファクチャリングを通じて入手できるバイオベースの製品の数がさらに増えることが期待される。
ここでは、Fxを触媒とするtRNAへの環状β-アミノ酸（cβAA）のチャージを調べることを試み、その後、リボソームによってそのようなアミノ酸誘導体がペプチドにインビトロで組み込まれることを実証する。cβAAを選択したのは、われわれの知る限り、それがリボソームによって伸長中のポリペプチド鎖にまだ組み込まれていないからである。さらに、それらの堅固な構造が、ヘリックスの幾何学的配置とペプチドのターンの異なる特徴を生み出すはずであり、それが、天然翻訳機械の限界と単量体適合性の解明を助けるであろう。具体的には、3つの環状β-2,3-アミノ酸誘導体（2-アミノシクロブタンカルボン酸、2-アミノシクロペンタンカルボン酸、および2-アミノシクロヘキサンカルボン酸）とその立体異性体を調べる（図35）。最初に、cβAAをtRNAにチャージできることを確認する。次いでインビトロでリボソームを媒介とするタンパク質合成プラットフォーム（PURExpress（商標））を用いたペプチドのN末端またはC末端への組み込みを評価する。それに加え、細菌のタンパク質翻訳因子である伸長因子P（EF-P）がペプチドへの異なるcβAA立体異性体のC末端組み込みに及ぼす効果をわれわれの反応において調べる。
この仕事の目標は、部位特異的に導入されたcβAAを持つペプチドのリボソーム合成を評価することであった。1つの鍵となる疑問は、そのような単量体をペプチドのC末端に組み込む可能性を評価することであった。cβAAの研究を開始する前に、C末端組み込みにおける翻訳機械の非環状β-アミノ酸との適合性をα-アミノ酸との適合性と比較した。α-炭素上にメトキシベンジル基を含有するα-とβ-ピューロマイシン（Pu）に由来する2つのシアノメチルエステル（CME）基質（図36a）を調製した。天然アミノ酸（炭素鎖と官能基の両方）に対して翻訳機械が有する可能性のあるあらゆる偏りをなくすため、比較において天然官能基（したがってメトキシベンジル基）を用いることを意図的に回避し、単量体骨格のより直接的な比較ができるようにした。
Fxを媒介とするα-とβ-Pu類似体のチャージングの収率を求めるのと最適化するのにマイクロヘリックスtRNA（mihx）と呼ばれる短いtRNA模倣体（22nt）を使用した7,8。収率は酸性ポリアクリルアミドゲルを使用して求めた（図39）。両方の単量体が、α-基質とβ-基質のそれぞれについて31％と87％の効率でチャージされることが見いだされた。
次に、tRNAにチャージされたFx基質が天然タンパク質翻訳機械によって受け入れられたかどうかを調べた。以前の仕事11,13,22,があるため、それが起こると予想した。mihx実験から得られたのと同じ反応条件下でFxを媒介とするtRNAPro1E2(GGU)のアシル化を実施した。反応しなかった単量体を、エタノール沈降27を利用してtRNAから分離し、基質をチャージされたtRNA（α-Pu:tRNA対β-Pu:tRNA）を包含する得られたtRNA画分を、インビトロでのリボソームを媒介とする組み込み反応物に添加した（図36a）。アシル化収率の差を規格化するため、2.8倍多い量のα-Pu:tRNAエタノール沈降サンプルを最終反応物に添加した（図39d）。リボソームを触媒とする組み込みのため、タンパク質の翻訳に必要な最小セットの成分を含有するPURE系（ΔtRNA、Δaa、NEB）を使用した。反応物には、ストレプトアビジンタグ（アミノ酸配列M＋WSHPQFEK）の発現に必要な9種類のアミノ酸だけを、そのタグの下流で鋳型メッセンジャーRNA（mRNA）上のACCコドンの位置に組み込まれたピューロマイシン誘導体基質とともに補足した。インキュベーションの後、得られたペプチドを親和性に基づく精製を利用して単離し、MALDIを利用した質量分析によってペプチドを分析した。予想通り、a-ピューロマイシンを含有するペプチドの理論的質量に対応するピークは、β-ピューロマイシンを含有するペプチドよりも約14倍高かった（図36b）。これは、天然翻訳系がβ-アミノ酸骨格と比べてα-アミノ酸骨格を持つ単量体をより高い効率で組み込むことができ、効率的な組み込みには操作されたリボソーム12,28,29を必要とすることを示す。
次に、アミン基の周囲の異なるレベルの立体的なかさばりに対する自然のリボソームの寛容性を調べることを試みた。これを検証するため、異なる立体異性特性を持つシクロブチル骨格、シクロペンチル骨格、およびシクロへキシル骨格を含有する3つのcβAAを設計した（図35）。以前の研究21において、われわれは、2-アミノシクロプロパンカルボン酸（3-cβAA）を用いたFxを媒介とするアシル化のため2つのシクロプロピルエステル基質を合成したが、おそらくラクタム形成を駆動する環状鎖内のγ型特徴が原因で、それらの基質をFxによってtRNAにチャージすることはできなかった。この研究では、2つの異性体（シスとトランス）があるシクロブチルb-アミノ酸（4-cβAA）と、シクロペンチルβ-アミノ酸（5-cβAA）と、それぞれαとβ炭素上の4つの異なる立体異性配置（1R,2R、1R,2S、1S,2R、および1S,2S）があるシクロへキシルβ-アミノ酸（6-cβAA）を用いて10種類の追加のジニトロベンジル（DNB）エステル基質を合成した。mihxを用いてFxを媒介とするアシル化（図39a～c）を実施し、高アシル化収率を与える最高の反応条件を明らかにした。4-cβAAに関するアシル化収率は、6員環とラクタムを効率的に形成することのできる基質上のアミンのd型特徴がおそらく原因で、低いことが観察された（0～9％、図37）。この結果は、5-アミノペンタン酸についてmihxでわずか8％のアシル化が観察されたわれわれの以前の観察21と整合している。逆に、他の8つの5-と6-cβAA基質は、第1級アミンによる分子内求核攻撃を通じたラクタムの形成が顕著に遅延するために高いアシル化収率（30～67％）を示した。興味深いことに、アシル化の収率は、同じ反応条件下でさえ、基質の立体配座に応じて変動した。これは、立体異性体がtRNAおよびFxの活性部位と異なる相互作用をすることを示す。
次に、tRNAfMetに、mRNA上のAUGコドンをデコードする4、5、および6-cβAAをアシル化して結合させ、N末端での基質の組み込みを可能にした。アシル化の後、精製したtRNAを、PURE翻訳反応におけるリボソームを媒介とする組み込みに使用し、得られたペプチドを上述のように質量分析によって分析した。4-cβAAを含有するペプチドの理論的質量に対応するピークは観察されなかったが、それは、低いアシル化収率に起因する基質の制限が理由である可能性が最も大きい。しかしtRNAfMet(CAU)にチャージすることができた5-と6-cbβAAはペプチドにN末端でうまく組み込まれることが見いだされた（図40a、b）。これは、天然翻訳機械はN末端組み込みに関し、伸長した骨格単量体に対して柔軟であるという以前の観察結果4,6,9,23,24,30とよく一致する。C末端組み込みを検証するため、5-と6-cβAAがアシル化されて結合していてThr（ACC）コドンをデコードするtRNAPro1E2(GGU)を用いて上記の実験を繰り返した。質量分析のデータから望む生成物の収率は制限されていることが明らかになったが、すべての5-cβAAの組み込みが見られた（図38a、ピークを円で示す）のに対し、(1S, 2R)-6-cβAAに対応するピークは見られなかった（図38c）。これらの結果は、天然リボソームには改変された骨格を特徴とする基質を用いた伸長に制限があり、第1級アミンの位置だけでなく、アミンの周囲の全体的な立体的かさばりも重要である可能性があることを示唆する。
単量体が翻訳装置と適合性がよくないことに対処するため、最近の仕事では、翻訳因子、特にEF-P31の濃度を最適にすることの重要性が実証されている。EF-Pは、連続したプロリン間のペプチド結合形成を加速する細菌翻訳因子であり、リボソームの失速の緩和を助けることが示されている。β-アミノ酸の場合には、それぞれEF-TuおよびEF-Pと相互作用するT-ステムとD-アームのモチーフの配列が最適化されたtRNAProに基づく操作されたβ-アミノアシル-tRNAの利用が、組み込み効率を増大させる31。
EF-Pは、操作されたD-アームとT-ステムを持つtRNAPro1E2にチャージされるcβAAのより多い組み込みを同様に可能にするであろうという仮説を立てた13。この仮説を検証するため、活性なEF-Pを、以前に記載されているようにして3つのアクセサリー遺伝子YjeA、YjeK、YfcMを大腸菌の中で同時に発現させることによって調製した32（詳細な調製についてはSIを参照されたい）。次いで、精製したEF-P（最終濃度10 μM）を、tRNAPro1E2(GGU)にチャージされた基質を含有するPURE系に補足した。得られたMALDIスペクトルにおいて、調べたすべての5-と6-cβAAを含有するペプチドの理論的質量に対応するピークが、EFPなしで実施した実験（図38a、c）と比べて顕著に増強された強度で発見された（図38b、d）。
まとめると、われわれの仕事は分子翻訳のための骨格伸長型アミノ酸基質の範囲を拡張する。具体的には、10種類のcβAAアミノ酸のさまざまなレパートリーをFx系によってtRNAにアシル化できることと、これらのアシル化tRNA-単量体を、野生型リボソームを用いたリボソームを媒介とする重合で使用できることが示された。立体異性特性に基づく異なるレベルの組み込み効率が観察され、操作されたtRNAと追加EF-Pの組み合わせがcβAA組み込みを改善することが実証された。
合わせて考えると、われわれの結果は、cβAAの以前はアクセス不能であった単量体空間を開放する。そのため、この仕事が、翻訳機械の目的をそのような非カノニカルな構造を持つ単量体へと変更する新たな方向を動機づけることを期待する。部位特異的に導入されたcβAAを含有するポリマーがリボソームで合成されると、プログラムされた立体化学を必要とする新規なペプチド薬とペプチド系ポリマーにつながる可能性がある。
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実施例9 - 実施例8のための補足情報
材料と方法
あらゆる試薬と溶媒は市販グレードであり、必要なときには使用する前に精製した。ジクロロメタンは、Grubbs1が記載しているようにして活性化アルミナのカラムを通過させて乾燥させた。
DNBエステルとCMEエステルを含有する基質を以前に記載されているようにして調製した2。ガラス裏当てシリカゲル（250 μm）プレートを用いて薄層クロマトグラフィ（TLC）を実施した。UV光および／またはKMnO4の使用を用いて生成物を可視化した。フラッシュクロマトグラフィは、Biotage Isolera One自動化精製系、またはシリカカラムで実施した。
核磁気共鳴スペクトル（NMR）はBruker Advance III-500（500 MHz）装置で取得し、TopSpinによって処理した。化学シフトは、δ 2.50とδ 39.5（DMSO-d6）に設定した内部標準としての残留溶媒のピークと比べて測定する。質量スペクトルはBruker AmaZon SL（ESI）で記録し、データはCompass DataAnalysis 4.2ソフトウエア（Bruker）を用いて処理した。
Figure 2023514584000091
シス-3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロブタン-1-カルボン酸塩（1a）。シス-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（71 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）を含むジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (s, 1H)、8.74 (s, 2H)、5.42 (dd, J = 14.6 Hz, 2H)、3.95 (s, 1H)、3.61 (br,1H)、2.30 (br, 2H)、2.14 (br, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.5、148.5 (2C)、140.6、129.1 (2C)、118.7、64.7、45.9、40.7。25.4、20.2；MS (ESI)：C12H13N3O6 [M+H]+ に関する質量計算値296.08、実測値296.07。
Figure 2023514584000092
トランス-3,5-ジニトロベンジル-2-アミノシクロブタン-1-カルボン酸塩（1b）。トランス-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロブタン-1-カルボン酸（71 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）を含むジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (t, J = 2.1 Hz, 1H)、8.70 (s, J = 2.1 Hz, 2H)、5.39 (dd, J = 17.5, 13.5 Hz, 2H)、3.87 (br, 1H)、3.65 (m, 2H)、2.80 (m, 3H)、1.95 (m, 1H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.7、148.5 (2C)、140.8、128.8 (2C)、118.6、64.6、46.5、42.6。23.9、19.6；MS (ESI)：C12H13N3O6 [M+H]+ に関する質量計算値296.08、実測値296.05
Figure 2023514584000093
(1R,2R)-2-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（2a）。(1R,2R)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン酸（102 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (s, 1H)、8.71 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.40 (dd, J = 21.5, 13.5 Hz, 2H)、3.02 (m, 1H)、2.14 (m, 1H)、2.05 (m, 1H)、1.83 (t, J = 10.5 Hz, 2H)、1.75 (m, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 173.1、148.5 (2C)、140.8、128.7 (2C)、118.6、64.6、53.8、48.2、31.2、29.6、23.6；MS (ESI)：C13H15N3O6 [M+H]+に関する質量計算値310.09、実測値310.09。
Figure 2023514584000094
(1R,2S)-2-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（2b）。(1R,2S)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン酸（102 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.74 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.40 (m, 2H)、3.73 (br, 1H)、3.20 (dd, J = 15.0, 8.5 Hz, 1H)、2.00 (m, 3H)、1.82 (m, 2H)、1.73 (m, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 171.9、148.5 (2C)、140.7、128.9 (2C)、118.6、64.7、52.8、46.3、30.4、26.7、21.6；MS (ESI)：C13H15N3O6 [M+H]+に関する質量計算値310.09、実測値310.08。
Figure 2023514584000095
(1S,2R)-2-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（2c）。(1S,2R)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン酸（102 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.70 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.42 (dd, J = 30.5, 13 Hz, 2H)、3.49 (br, 1H)、3.09 (m, 1H)、1.98 (dd, J = 12.5, 7.0 Hz, 1H)、1.82 (m, 1H)、1.75 (dd, J = 24.5, 17 Hz, 2H)、1.64 (d, J = 7 Hz, 1H)、1.43 (t, J = 5 Hz, 3H)。13C NMR (125 MHz, DMSOd6) ppm 172.0、148.5 (2C)、140.8、128.8 (2C)、118.6、64.6、49.0、42.6、27.7、25.0、22.6；MS (ESI)：C13H15N3O6 [M+H]+ に関する質量計算値310.09、実測値310.05。
Figure 2023514584000096
(1S,2S)-2-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（2d）。(1S,2S)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロペンタン-1-カルボン酸（102 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.71 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.40 (dd, J = 22.5, 13.5 Hz, 2H)、3.73 (dd, J = 13, 7 Hz, 2H)、2.56 (dd, J = 16, 7.5 Hz, 1H)、2.13 (m, 1H)、2.06 (m, 1H)、1.80 (dd, J = 14, 7 Hz, 2H)、1.73 (dd, J = 14, 7 Hz, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 173.1、148.5 (2C)、140.8、128.7 (2C)、118.6、64.6、53.8、48.2、31.2、29.6、23.6；MS (ESI)：C13H15N3O6 [M+H]+に関する質量計算値310.09、実測値310.09。
Figure 2023514584000097
(1R,2R)-2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（3a）。(1R,2R)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（107 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 8.82 (t,1H, J = 2.3 Hz)、8.72 (d, 2H, J = 2.1 Hz)、5.41 (s, 2H)、3.25 (dt, 1H, J = 10.1 Hz, 3.9 Hz)、2.62 (dt, 1H, J = 11.5 Hz, 3.8 Hz)、2.02 (d, 2H, J = 9.3 Hz)、1.73-1.66 (m, 2H)、1.48-1.19 (m, 6H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.6、148.5 (2C)、140.7、128.8 (2C)、118.7、64.8、50.3、46.5、29.8、28.5、24.1、23.5；MS (ESI)：C14H17N3O6 [M+H]+に関する質量計算値324.11、実測値324.07。
Figure 2023514584000098
(1R,2S)-2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（3b）。(1R,2S)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（107 mg、0.33 mmol)、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol)、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.72 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.42 (dd, J = 31.5, 13 Hz, 2H)、3.49 (m, 1H)、3.08 (m, 1H)、1.97 (m, 1H)、1.72 (m, 4H)、1.42 (m, 5H)。13C NMR (125 MHz, DMSOd6) ppm 172.0、148.5 (2C)、140.8、128.8 (2C)、118.6、64.6、49.0、42.6、28.8、27.7、22.6、21.7；MS (ESI)：C14H17N3O6 [M+H]+に関する質量計算値324.11、実測値324.05。
Figure 2023514584000099
(1S,2R)-2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（3c）。(1S,2R)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（107 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。0 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.0 Hz, 1H)、8.72 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.42 (dd, J = 31.5, 13 Hz, 2H)、3.08 (m, 1H)、1.97 (m, 2H)、1.72 (m, 5H)、1.35 (m, 6H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.0、148.5 (2C)、140.8、128.8 (2C)、118.6、64.6、49.0、42.6、27.7、25.0、22.6、21.7；MS (ESI)：C14H17N3O6 [M+H]+に関する質量計算値324.11、実測値324.11
Figure 2023514584000100
(1S,2S)-2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸3,5-ジニトロベンジル（3d）。(1S,2S)-2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)シクロヘキサン-1-カルボン酸（107 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、3,5-ジニトロベンジルクロリド（86 mg、0.40 mmol）、およびジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (t, J = 2.10 Hz, 1H)、8.72 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、5.08 (s, 2H)、3.18 (m, 1H)、2.57 (m, 1H)、2.01 (dd, J = 10.5, 7 Hz, 2H)、1.69 (m, 3H)、1.43 (m, 6H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.6、148.5 (2C)、140.7、128.8 (2C)、118.6、64.8、50.3、46.5、29.8、28.5、24.1、23.5；MS (ESI)：C14H17N3O6 [M+H]+に関する質量計算値324.11、実測値324.03。
Figure 2023514584000101
2-アミノ-3-(4-メトキシフェニル)プロパン酸シアノメチル（4）。2-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-(4-メトキシフェニル)プロパン酸（98 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、クロロアセトニトリル（26 μL、0.40 mmol）を含むジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、6.90 (d, J = 8.5 Hz, 2H)、5.11 (d, J = 2.0 Hz, 2H)、4.42 (t, J = 6.5 Hz, 1H)、3.74 (s, 3H)、3.16-3.02 (m, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 168.8、159.1、131.0 (2C)、126.2、115.6、114.6 (2C)、55.5、53.6、50.6、35.4。MS (ESI)：C12H14N2O3 [M+H]+に関する質量計算値235.10、実測値235.13。
Figure 2023514584000102
3-アミノ-2-(4-メトキシベンジル)プロパン酸シアノメチル（5）。3-((t-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(4-メトキシベンジル)プロパン酸（102 mg、0.33 mmol）、トリエチルアミン（70 μL、0.50 mmol）、クロロアセトニトリル（26 μL、0.40 mmol）を含むジクロロメタン（0.5 mL）を用いて調製した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.24 (d, J = 9.0 Hz, 2H)、7.09 (d, J = 9.0 Hz, 2H)、4.95 (dd, J = 15.0, 15.0 Hz, 2H)、3.99 (s, 3H)、2.80 (m,3.47-2.94)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ppm 172.0、159.1、129.8 (2C)、127.1、114.5、113.8 (2C)、55.3、49.2、43.9、40.0、34.9；MS (ESI)：C13H16N2O3 [M+Na]+に関する質量計算値267.11、実測値267.01。
RNAのためのDNA鋳型の調製
フレキシザイムとtRNAを調製するためのDNA鋳型は以下のプライマーを用いて以前に記載されているようにして合成した2。- T7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写に使用した最終DNA鋳型の配列
FxとtRNAの調製
HiScribeTM T7高収率RNA合成キット（NEB、E2040S）を用いてフレキシザイムとtRNAを調製し、以前に報告されている方法2によって精製した。
EF-Pの調製
Lys34の位置がベータリシル化された活性なEF-P3の発現には、3つのアクセサリー遺伝子YjeA（EPM-A）、YjeK（EPM-B）、およびYfcM（EPM-C）の発現が必要とされる。Cdを参照配列NC_000913、大腸菌（K-12、MG1655）から採用し、各クローニング部位に6×Hisタグを持つ2つのlac発現クローニングベクターpRSFDuet-1とpETDuet-1に入れてクローニングするためGene Blocks（IDT）として注文した。pRSFDuet-1は2つの遺伝子EF-PとEPM-Aを含有しており、pETDuet-1はEPM-BとEPM-Cを持っていた。プラスミドを同時に導入してBL21大腸菌細胞（NEB）を形質転換し、二重抗生剤（カナマイシンとアンピシリン）プレートに播種した。コロニーを採取し、二重抗生剤を含むSuperior Broth（AthenaES）の中で250 rpmで震盪しながら37℃で一晩増殖させた。2日目、1リットルのSuperior Brothに一晩増殖物からの10mLの細胞を播種し、250 rpmで震盪しながら37℃でインキュベートし、0.6のODで1 mMのIPTG（Promega）を用いて誘導した。細胞を4時間後に回収し、あらかじめ冷やした4℃の遠心分離機（Beckman-Coulter Avanti J-26 XPI）の中で4,000 gにて20分間遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、冷たいバッファIの中で洗浄した後、再び遠心分離した。細胞ペレットを-80℃で一晩凍結させた。3日目、ペレットを優しく破壊し、50 mLの冷やしたバッファIIに再懸濁させ、超音波処理のため50mLのOak Ridgeチューブ（ThermoFisher）に移した。細胞を氷の上で、Sonic Dismembrator Model 500（Fisher Scientific）の3/4インチのプローブを用いて40％の振幅、1秒間のオン／オフで4分間超音波処理した。超音波処理を一度繰り返した後、ライセートを30,000 gで30分間遠心分離した。ライセートを、バッファIIで平衡させた500 μLのHisPur NTA Nickel樹脂（Thermo Scientific）を収容した50 mLの円錐形チューブに移し、4℃で30分間にわたって優しく揺らした。ライセート／樹脂混合物をピペットで使い捨てのフレット付きの10mLのポリプロピレンカラム（Thermo Scientific）に入れ、重力流によってカラムを空にした。樹脂を75 mLのバッファIIIでただちに洗浄した。洗浄後、タンパク質を1.5 mLの冷やしたバッファIVの3連続溶離によって溶離させた。溶離液を10,000 MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Scientific）に移し、2リットルの冷やしたバッファV（20 mM HEPESKOH、pH 7.0、40 mMのKCL、1 mMのMgCl2、0.1mMのEDTA、および10％グリセロール）の中で4℃にて透析した。2時間後、タンパク質を含む透析カセットを2リットルの新鮮なバッファVに移し、4℃で一晩透析した。濃度をPierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）を用いて求めた。Lys 34の位置のリシル化は、PTM局在分析のための193 nm UVPD-MSで確認した。
バッファI：50 mMのトリス-HCl（pH 7.6）、60 mMのKCl、7mMのMgCl2
バッファII：7 mMのb-メルカプトエタノール（Sigma）、0.1mMのPMSF（Sigma）、および10％グリセロール（Fisher）を含むバッファI
バッファIII：50 mMのトリス-HCl（pH 7.6）、5 mMのb-メルカプトエタノール、1MのNH4Cl、10 mMのイミダゾール、および10％グリセロール
バッファIV：イミダゾールの濃度を150 mMまで大きくしたバッファIII
インビトロでのペプチド合成
以下に、アミノアシル化tRNAの調製と、ペプチドのN末端とC末端の両方の位置に非カノニカルなアミノ酸が組み込まれるインビトロでのペプチド合成を記述する。
1）tRNAのFxを媒介とするアシル化と精製を以前に記載されているようにして実施した2。
2）N末端組み込み。レポータペプチドとして、T7プロモータが制御するDNA鋳型（pJL1_StrepII）を、ストレプトアビジン（Strep）タグと追加のSerおよびThrのコドン（XWSHPQFEKST（strepタグ）であり、その中のXはcβAA基質の位置を示す）をコードするように設計した。翻訳開始コドンAUGをcβAA基質XのN末端組み込みに使用した。ペプチド合成を、開始コドンAUGと精製タグをデコードする9種類のアミノ酸だけを用いて他の11種類のアミノ酸の不在下で実施し、対応する内在性tRNAがアミノアシル化されて翻訳に使用されることを阻止した。PURExpress（登録商標）Δ（aa、tRNA）キット（NEB、E6840S）をポリペプチド合成反応のために使用し、反応混合物を37℃で3時間インキュベートした。その後、合成されたペプチドをStrep-Tactin（登録商標）で被覆された磁性ビーズ（IBA）を用いて精製し、SDSで変性させ、MALDI-TOF質量分析によって特徴づけた。
3）C末端組み込み。同じアミノ酸（MWSHPQFEKSX、ただしXはcβAA基質の位置を示す）をコードする同じプラスミド（pJL1-StrepII）をC末端組み込みに使用し、同じキットを用いてcβAA基質をThrコドン（ACC）に組み込んだ。C末端cβAA組み込みのため200 μM（最終濃度）のEF-Pを反応混合物に添加した。
ペプチド生成物の精製
cβAAを含有するポリペプチドを、以前に記載されているようにして2アフィニティタグ精製技術を利用して調製した。
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これまでの記述において、本発明の範囲と精神を逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に対してさまざまな置換と改変をなすことが可能であることが当業者には明らかであろう。本明細書の中で説明的な記載がなされている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限なしで適切に実践することができる。ここまで使用してきた用語と表現は記述のために使用されているのであり、制限するためではなく、そのような用語と表現の使用において、示され記載されている特徴のあらゆる等価物またはその部分を除外する意図はないが、さまざまな改変が本発明の範囲内で可能であることが認識されている。したがって、本発明を具体的な実施形態とオプションの特徴によって説明してきたが、当業者は本明細書に開示されている考え方の改変および／またはバリエーションに頼ることができ、そのような改変とバリエーションは本発明の範囲内と見なされることを理解すべきである。
本明細書では多数の特許文献と非特許文献が引用されている。引用されている参考文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。明細書の中のある用語の定義が引用されている文献の中のその用語の定義と一致しない場合には、その用語は本明細書の中の定義に基づいて解釈すべきである。

Claims (26)

  1. Figure 2023514584000103
     として定義される式を持つアシル化tRNA分子（ただし前記式において、
    tRNAは3'末端リボヌクレオチドを介して連結されたトランスファーRNAであり；
    Rは、式：
    Figure 2023514584000104
     を持ち、その中の
    nは0～6であり；
    R1またはR2は、水素、場合によりアミノで置換されたアルキル；ヘテロシクロアルキル； (ヘテロシクロアルキル)アルキル；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール；ヘテロアリール；(アリール)アルキル；(ヘテロ)アルキル)；または(アリール)アルケニルから選択され；その中の前記アリール、前記ヘテロアリール、前記(アリール)アルキル、前記(ヘテロアリール)アルキル、または前記(アリール)アルケニルは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されているか；
    R1とR2は合わさって、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換された炭素環、場合により3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成する）。
  2. R1またはR2が置換された(アリール)アルキルまたは(ヘテロアリール)アルキルであり、場合により、3,4-ジヒドロキシフェニル-メチル、ピロル-2-イル-メチル、および4-アミノ-フェニル-メチルから選択される、請求項1の分子。
  3. R1またはR2が置換されたフェニルであり、場合により、4-ニトロフェニル、4-シアノフェニル、4-アジドフェニル、3-アセチルフェニル、4-ニトロメチフェニル、2-フルオロフェニル、4-メトキシフェニル、3-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル、3-アミノ-4-ニトロフェニル、および3-ニトロ-4-アミノフェニルから選択される、請求項1の分子。
  4. R1またはR2がへテロアリールまたは置換されたへテロアリールであり、場合により、ピリジニル、フルオロピリジニル、クマリニル、ピロリル、チオフェン-2-イル、および5-アミノメチル-フラン-3-イルから選択される、請求項1の分子。
  5. R1またはR2が第1級アミン基または第2級アミン基を含み、場合によりR1またはR2は、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノブチル、1,1-ジメチル-3-アミノプロパニル、3-メチルアミノ-プロパニル、6-アミノへキシル、3-アミノ-1-プロペニル、2-アミノシクロブチル、2-アミノシクロペンチル、および2-アミノシクロへキシルから選択される、請求項1の分子。
  6. R1またはR2が、場合によりアミノで置換されたシクロアルキル基を含む、請求項1の分子。
  7. R1またはR2が、ピペリジニルまたはピペラジニルなどの環状第2級アミンを含み、Rが、場合によりピペリジン-4-イル、(ピペリジン-4-イル)メチル、ピペラジン-4-イル、および(ピペラジン-4-イル)メチルから選択される、請求項1の分子。
  8. R1またはR2が、アルキル、アルケニル、シアノアルキル、およびアルキルカルボキシルアルキルエステルから選択される、請求項1の分子。
  9. 式：
    Figure 2023514584000105
     を持つ、請求項1の分子。
  10. 式：
    Figure 2023514584000106
     を持つ、請求項1の分子。
  11. 式：
    Figure 2023514584000107
     を持つ（ただしXは(CH2)mであり、mは1～6から選択される）、請求項1の分子。
  12. 配列特定ポリマーを調製する方法であって、前記配列特定ポリマーが、請求項1～11いずれかのアシル化tRNA分子のアンチコドンに対応するコドンを含むmRNAの翻訳を通じて調製され、そのアシル化tRNA分子のR基が、前記mRNAの翻訳中に前記配列特定ポリマーに組み込まれる方法。
  13. インビトロで実施される、請求項12の方法。
  14. 生体内で実施される、請求項12の方法。
  15. 前記コドンが前記mRNAの開始コドン（AUG）である、請求項12の方法。
  16. 前記コドンが、トレオニンのコドン、イソロイシンのコドン、およびアラニンのコドンから選択される、請求項12の方法。
  17. 前記配列特定ポリマーが、ポリオレフィンポリマー、アラミドポリマー、ポリウレタンポリマー、ポリケチドポリマー、共役ポリマー、D-アミノ酸ポリマー、β-アミノ酸ポリマー、γ-アミノ酸ポリマー、δ-アミノ酸ポリマー、ε-アミノ酸ポリマー、ζ-アミノ酸ポリマー、およびポリカーボネートポリマーから選択される、請求項12の方法。
  18. Figure 2023514584000108
     として定義される式を持つアシル化tRNA分子（ただしこの式において、
    tRNAは3'末端リボヌクレオチドを介して連結されたトランスファーRNAであり；
    Rは、式：
    Figure 2023514584000109
     を持ち、その中の
    nは0～6であり；
    R1またはR2は、水素、場合によりアミノで置換されたアルキル；ヘテロシクロアルキル； (ヘテロシクロアルキル)アルキル；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール；ヘテロアリール；(アリール)アルキル；(ヘテロ)アルキル)；または(アリール)アルケニルから選択され；その中の前記アリール、前記ヘテロアリール、前記(アリール)アルキル、前記(ヘテロアリール)アルキル、または前記(アリール)アルケニルは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されているか；
    R1とR2は合わさって、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換された炭素環、場合により3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成する）を調製する方法であって、
    （i）フレキシザイム（Fx）：
    （ii）前記tRNA分子；および
    （iii）式：
    Figure 2023514584000110
     を持つドナー分子（この式において、
    Rは上に定義した通りであり；
    LGは離脱基であり；
    XはOまたはSである）という反応混合物の中で反応させることを含み；前記Fxが前記tRNAの3'末端リボヌクレオチドと前記ドナー分子の間のアシル化反応の触媒となって前記アシル化tRNA分子が調製される方法。
  19. 前記Fxが、aFx、dFx、およびeFxから選択される、請求項18の方法。
  20. 前記tRNAが、アンチコドンCAU）、アンチコドンGGU、アンチコドンGAU、またはアンチコドンGGCから選択されるアンチコドンを含む、請求項18の方法。
  21. LGがシアノメチル部分を含み、前記ドナー分子がシアノメチルエステル（CME）を含む、請求項18の方法。
  22. LGがジニトロベンジル部分を含み、前記ドナー分子がジニトロベンジルエステル（DNB）を含む、請求項18の方法。
  23. LGが(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジル部分を含み、前記ドナー分子が(2-アミノエチル)アミドカルボキシベンジルチオエステル（ABT）を含む、請求項18の方法。
  24. 前記反応混合物の中の前記tRNAの少なくとも約50％が、その反応混合物を120時間反応させた後にアシル化されるような反応条件下、好ましくは前記反応混合物の中の前記tRNAの少なくとも約50％が、その反応混合物を16時間反応させた後にアシル化されるような反応条件下で実施する、請求項18の方法。
  25. 式：
    Figure 2023514584000111
     を持つ分子（ただしこの式において、
    Rは式：
    Figure 2023514584000112
     を持ち（この式の中の
    nは0～6であり；
    R1またはR2は、水素、場合によりアミノで置換されたアルキル；ヘテロシクロアルキル； (ヘテロシクロアルキル)アルキル；アルケニル；シアノアルキル；アミノアルキル；アミノアルケニル；カルボキシアルキル；アルキルカルボキシアルキルエステル；ハロアルキル；ニトロアルキル；アリール；ヘテロアリール；(アリール)アルキル；(ヘテロ)アルキル)；または(アリール)アルケニルから選択され；その中の前記アリール、前記ヘテロアリール、前記(アリール)アルキル、前記(ヘテロアリール)アルキル、または前記(アリール)アルケニルは、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されているか；
    R1とR2は合わさって、場合により、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、アジド、シアノ、アセチル、ニトロ、ニトロアルキル、ハロ、アルコキシ、およびアルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換された炭素環、場合により3員、4員、5員、6員、7員、または8員の炭素環を形成する）；
    LGは離脱基であり；
    XはOまたはSである）。
  26. LGが、
    Figure 2023514584000113
     から選択される式を持つ、請求項25の分子。
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