JP6016011B2 - インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法 - Google Patents

インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法 Download PDF

Info

Publication number
JP6016011B2
JP6016011B2 JP2012145795A JP2012145795A JP6016011B2 JP 6016011 B2 JP6016011 B2 JP 6016011B2 JP 2012145795 A JP2012145795 A JP 2012145795A JP 2012145795 A JP2012145795 A JP 2012145795A JP 6016011 B2 JP6016011 B2 JP 6016011B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
membrane
liposome
dna
enzyme
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2012145795A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014007983A (ja
Inventor
哲也 四方
哲也 四方
友亮 松浦
友亮 松浦
遥 曽我
遥 曽我
渡邉　肇
肇 渡邉
聡志 藤井
聡志 藤井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to JP2012145795A priority Critical patent/JP6016011B2/ja
Priority to EP13810803.0A priority patent/EP2876159B1/en
Priority to US14/411,892 priority patent/US9862942B2/en
Priority to PCT/JP2013/003767 priority patent/WO2014002424A1/ja
Publication of JP2014007983A publication Critical patent/JP2014007983A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6016011B2 publication Critical patent/JP6016011B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

本発明は、インビトロにおける膜タンパク質の分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。
酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる（非特許文献１）。この従来法では、専ら、可溶性タンパク質が対象であった。
膜タンパク質が細胞の機能において多くの重要な役割を担うことは周知である。そのため、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学が求められている。
Ｓｕｎａｍｉ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｔ．，Ｔｓｕｋａｄａ，Ｋ．，Ｕｒａｂｅ，Ｉ．， ａｎｄ Ｙｏｍｏ，Ｔ．（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５７，１２８−１３６
膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学的手法、特に、酵素進化工学的手法を提供することを、本発明の課題とする。
上記課題は、以下を提供することによって解決された。
（項目１）
一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目２）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目３）
項目１または２に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
（項目４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目３に記載の一枚膜リポソーム。
（項目５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目４に記載の一枚膜リポソーム。
（項目６）
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目７）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目６に記載のライブラリー。
（項目８）
項目６または７に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
（項目９）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目８に記載のライブラリー。
（項目１０）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目９に記載のライブラリー。
（項目１１）
一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目１２）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目１１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１３）
項目１１または１２に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
（項目１４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１３に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１４に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１６）
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目１７）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目１６に記載のライブラリー。
（項目１８）
項目１６または１７に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
（項目１９）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１８に記載のライブラリー。
（項目２０）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１９に記載のライブラリー。
（項目２１）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２２）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；
（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２６）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；
（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２７）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目６〜１０のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
（項目３０）
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目１６〜２０のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
（ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
本発明によって、リポソームを利用する、膜タンパク質を対象としたインビトロでの分子進化工学的手法が可能になった。また、本発明によって、所望の機能を有する膜タンパク質をコードする遺伝子の大規模スクリーニング／選択もまた可能である。
膜タンパク質がトランスポーターである場合、その膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子をリポソーム内に封入してリポソーム内に輸送されたリガンドを捕獲することにより、スクリーニング／選択の感度が向上する。
さらに、本発明に従い核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームを用いることによって、スクリーニング効率が向上する。理論に拘束されることは望まないが、本発明が優れた効果を奏する理由としては、以下が挙げられる。従来用いられていたリポソームは、凍結乾燥法により調製された多重膜リポソームであり、内部に多重構造をもつため、反応容器の体積を制御することができなかった。リポソームの体積は内部の酵素反応速度に影響をあたえるため、効率よく酵素を改良するためには、多重構造をもたない一枚膜リポソームを使うことが望ましい。しかし、これまでの方法では、遠心沈降法でつくった一枚膜リポソームを反応容器として用いた場合、セルソーターでより反応したリポソームを選択しても、高い機能をもつ酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができなかった。これに対して、本発明では、一枚膜リポソームを核酸分解酵素で処理したところ、従来法において使用されていた多重膜リポソームや、酵素処理をしていない一枚膜リポソームと比較して、より高効率のスクリーニングが可能となり、高機能の酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができる。
また、本発明の開示に従い、リポソームを構成する脂質の組成／比率、および、リポソームを調製する際のマグネシウム濃度を最適化することによって、スクリーニング／選択の感度がさらに向上する。
図１は、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３）を含むＤＮＡを用い、タンパク質発現前と発現後のリポソームに対して、標識化抗Ｍｙｃタグ抗体を添加し、セルソータにて分析した結果である。縦軸はリポソーム内部体積を、横軸はＡｌｅｘａ４８８の蛍光強度を示す。ＡおよびＢは、ＧＵＳ配列を用いた結果を示し、ＣおよびＤは、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列を用いた結果を示す。ＡおよびＣは、３７℃でのインキュベーションにてタンパク質を発現する前のリポソームの結果であり、ＢおよびＤは、３７℃で１時間インキュベーションしてタンパク質を発現したリポソームの結果である。 図２は、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１：図２Ａ）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：図２Ｂ）を含むＤＮＡを含むリポソームにおいて、タンパク質を発現させ、異なるｐＨにおいて、ＥｔＢｒの輸送活性を測定した結果である。 図３は、種々の脂質組成を用いた場合の、機能を有する膜タンパク質発現の割合を示す結果である。ヘモリシンが活性発揮した場合、ハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドを高輝度に取り込むので、縦軸は、それらの割合（％）を示す。すなわち、縦軸は、リポソームの中の膜タンパク質活性を発揮する割合を示す。左から順番に、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：１の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５：５の混合物、および、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：７の混合物を用いた結果である。なお、ＰＯＰＣは１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンの略称であり、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。 図４の縦軸は、各種脂質を用いた場合の全リポソームの中のハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドを高輝度に取り込んだリポソームの割合（％）を示す。すなわち、図４のグラフは、チャンネルの相対活性を示すグラフである。用いた脂質は、以下のとおりである：ＥｇｇＰＣは鶏卵から精製したホスファチジルコリンの略称であり、ＰＯＰＣは１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、ＰＳは１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォセリン、ＰＥは１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォエタノールアミン、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。ＰＣ ｍｉｘは、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン：１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン：１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン：１−ステアロイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン＝１２９：６７：４８：２４（質量比）で混ぜたものの略称であり、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＰＯＰＳ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）で混ぜたものの略称である。 図５は、進化実験の結果を示すグラフである。縦軸は、高輝度リポソームの割合（赤点の割合）を示す。サイクルを重ねるにつれて、活性の高い集団の割合が増加した。
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
（定義）
本明細書において使用する場合、用語「微小区画」とは、脂質層、および、その内部の水層から構成される閉じられた微小な空間をいう。「微小区画」としては、例えば、リポソームが挙げられるがこれに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。本発明においては、リポソームの成分としてコレステロールを含ませることが好ましい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有してもよい。本発明において使用するリポソームは、脂質二重層からなる膜が一枚のみからなる「一枚膜リポソーム」である。一枚膜リポソームの調製法としては、種々の周知の方法が利用可能である。
本明細書において使用する場合、用語「プロモーター配列」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。代表的なプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、Ｓｐ６プロモーター配列、および、Ｔ３プロモーター配列が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用する「ＲＮＡポリメラーゼ」は、使用するプロモーター配列に適合する、すなわち、その使用するプロモーターからの転写を行なうＲＮＡポリメラーゼであれば、いかなるＲＮＡポリメラーゼを用いてもよい。好ましくは、プロモーター配列とＲＮＡポリメラーゼとが、同じ、あるいは、近接する生物種に由来する。例えば、原核生物由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、原核生物由来であることが好ましい。あるいは、バクテリオファージ由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、同一または類似のバクテリオファージ由来であることが好ましい。
本明細書において使用する場合、用語「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。
本明細書において使用される用語「無細胞蛋白質合成系」とは、細胞を処理することによって自律複製能を失った細胞由来の成分であって、蛋白質の合成が可能な成分をいう。無細胞蛋白質合成系としては、例えば、市販のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（バイオコゥマー株式会社 東京都文京区）を利用することも可能である。あるいは、無細胞蛋白質合成系に必要とされる成分を精製および／または組換え発現して、作製することも可能である。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において使用される用語「膜タンパク質」とは、脂質二重膜に付着するタンパク質をいう。膜タンパク質は、膜貫通領域を含むタンパク質であっても、膜貫通領域を含まないタンパク質であってもよい。
（膜タンパク質）
本発明は、あらゆる膜タンパク質に適用可能である。代表的な膜タンパク質としては、例えば、トランスポーター、レセプターなどが挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、本発明の膜タンパク質をコードする配列は、タンパク質を膜に挿入するためのリーダー配列を含んでもよい。
（トランスポーター）
本発明の膜タンパク質は、トランスポーターであっても、そうでなくてもよい。本発明のトランスポーターとしては、細胞において物質輸送に関るタンパク質（例えば、ＥｍｒＥタンパク質）、脂質二重膜を透過しない物質を透過させるタンパク質（例えば、ヘモリシン）が挙げられるがこれらに限定されない。
（一枚膜リポソームの製造）
本発明において使用する一枚膜リポソームは、実施例に記載する遠心沈降法を用いて調製することができるが、調製法は、これに限定されない。例えば、遠心沈降法の他にも、静置水和法（Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｔ．Ｆ．Ｃｈｉｅｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９８３，４４，３７５−３８１）、および、エレクトロフォーメーション法（Ｍｉｇｌｅｎａ Ｉ．Ａｎｇｅｌｏｖｅ ａｎｄ Ｄｉｍｉｔｅｒ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，８１，３０３−３１１）を利用することが可能である。
静置水和法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）脂質を溶媒に溶かしフラスコ中で自然乾燥することにより、フラスコ表面に脂質膜を形成させる工程；および、（２）水溶液を添加し、脂質膜を膨潤させる工程。この第２工程によって、脂質膜が水溶液を取り込んだリポソームが浮き上がってくる。
エレクトロフォーメーション法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）導電性電極上に脂質溶液を塗布し、乾燥させて脂質フィルムを形成させる工程；（２）絶縁性スペーサーを介した反対側にも導電性電極を設置し、その間を水溶液で満たす工程；および、（３）二つの電極間に電界を印加することにより、脂質膜を電極から剥がして巨大薄膜リポソームを作製する工程。
（一枚膜リポソームの製造において使用される脂質の成分／組成）
一枚膜リポソームの製造において使用される脂質の成分／組成は、特に限定されることはないが、リン脂質およびコレステロールを含むことが好ましい。脂質としては、例えば、Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｌ−アルファ−ジラウロイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−アルファ−ジラウロイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ−アルファ−モノミリストイルホスファチジコリン、Ｌ−アルファ−ジミリストイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−アルファ−ジミリストイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ−アルファ−ジミリストイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ−アルファ−ジミリストイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ−アルファ−ジオレイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−アルファ−ジオレオイルホスファチジルセリンナトリウム、Ｌ−アルファ−モノパルミトイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジパルミトイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−アルファ−ジパルミトイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ−アルファ−ジパルミトイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ−アルファ−ジパルミトイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ−アルファ−ステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ−アルファ−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−アルファ−ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ−アルファ−ジステアロイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ−アルファ−ジステアロイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ−アルファ−ジエルコイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、ベータ−オレイル−ガンマ−パルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルエタノールアミン、ベータ−オレイル−ガンマ−パルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルグリセロールナトリウム、スフィンゴミエリン、ステアリルアミンが挙げられるがこれらに限定されない。
コレステロールの割合は、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好ましくは７０％以上である。
（一枚膜リポソームの製造に適切なマグネシウム濃度）
マグネシウムの濃度は、好ましくは１５ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１８．８８ｍＭ〜４２．４８ｍＭ、さらにより好ましくは２８．３２ｍＭ〜３７．７６ｍＭ、最も好ましくは３３．０４ｍＭである。
（核酸分解酵素）
本発明において使用する核酸分解酵素としては、例えば、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素が挙げられるがこれらに限定されない。使用する核酸分解酵素の供給源は、特に限定されることはない。核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１Ｕ〜２０Ｕ、より好ましくは、５Ｕ〜１５Ｕ、もっとも好ましくは、約１２．５Ｕである。核酸分解酵素としてＲＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１μｇ〜２０μｇ、より好ましくは、５μｇ〜１５μｇ、もっとも好ましくは、約１０μｇである。当業者は、使用する酵素量を容易に決定することができる。
（使用するＤＮＡまたはＲＮＡ）
例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＤＮＡである場合、そのＤＮＡに、タンパク質のコード配列、ならびに、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列、および、このコード配列に作動可能に連結された転写翻訳調節配列を含ませる。
翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
転写翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列が挙げられるがこれに限定されない。必要に応じて、エンハンサー配列、サプレッサー配列、オペレーター配列、および、転写終結部位を含んでもよい。連結される転写翻訳調節配列は、使用するＲＮＡポリメラーゼと適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡポリメラーゼを利用する場合、連結される転写翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの転写翻訳調節配列である。使用する転写翻訳調節配列とＲＮＡポリメラーゼとは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが転写翻訳調節配列からの転写を開始（あるいは、制御）できる限り、いかなる種由来であってもよい。
例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＲＮＡである場合、そのＲＮＡに、タンパク質のコード配列、および、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列を含ませる。翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
（本発明のリポソームの分子進化工学への応用）
本発明のリポソームを分子進化工学に利用することができる。
例えば、核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを、その内部のＤＮＡまたはＲＮＡがタンパク質産物を生成する条件下にインキュベートし、（１）リポソーム表面の発現したタンパク質の存在を指標として、あるいは、（２）生成された膜タンパク質の活性を測定し、この活性を指標として、高機能性の遺伝情報を含む一枚膜リポソームを選択（スクリーニング）する。利用する活性は、代表的には、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがコードするタンパク質の活性である。例えば、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがトランスポーターをコードする場合、利用する活性は、代表的には、その輸送活性である。トランスポーターの輸送活性を指標とする場合、例えば、そのトランスポーターによってリポソーム内に輸送される物質を標識し（例えば、蛍光標識）、セルソータ（ＦＡＣＳ：蛍光標示式細胞分取器）を用いて標識物質が蓄積したリポソームを選択する。例えば、リポソーム内にトランスポーターが輸送するリガンドに結合する因子を封入し、リポソーム内に輸送されたリガンドを捕獲することにより、スクリーニング／選択の感度を向上することができる。
あるいは、膜タンパク質が有する酵素活性を指標としてもよい。
タンパク質のリン酸化や他の他のタンパク質との結合を膜タンパク質の活性の指標として検出するためには、例えば、以下の方法を用いる：ターゲットとなるタンパク質の端をＦＲＥＴを起こすような蛍光色素でラベルする工程；リン酸化や他のタンパク質との結合によってコンフォメーションが変化し、ＦＲＥＴの程度が変化した場合、その蛍光変化を指標として選択する工程。あるいは、ＧＦＰ遺伝子を例えばＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に配置し、同時にＴ３ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡを用いることにより、よりＲＮＡ合成活性の高いＴ３ＲＮＡポリメラーゼを得ることも可能である。
また、タンパク質のコード配列以外の配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リボソーム結合配列、翻訳開始部位などの遺伝子発現の制御に関連する配列）に変異を導入し、選択することにより、高い活性（例えば、高いプロモーター活性、エンハンサー活性、翻訳活性など）を有するように配列を進化させることができる。
スクリーニングの結果得られた一枚膜リポソームは、その中にＤＮＡないしＲＮＡとして含まれる遺伝情報を単離するために使用される。遺伝情報がＤＮＡである場合、ＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲによって遺伝情報を増幅して、単離することができる。あるいは、ＤＮＡが、宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
遺伝情報がＲＮＡである場合、（１）逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに変換し、その後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いてＰＣＲによってＤＮＡを増幅するか、あるいは、（２）耐熱性逆転写酵素を用いて、一段階で、ＲＮＡの遺伝情報を増幅してもよい。ＲＮＡが宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＲＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
第１ラウンドのスクリーニング後に、必ずしも、遺伝情報を単離（純化）する必要はない。例えば、第１ラウンドのスクリーニングによって、単一クローンのＤＮＡないしＲＮＡを得るのではなく、ＤＮＡないしＲＮＡの集団を取得し、その集団を出発材料として、第２ラウンドのスクリーニングを行なってもよい。第２ラウンドのスクリーニングまたはそれ以降のラウンドのスクリーニングによって得られたＤＮＡないしＲＮＡの集団を、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
あるいは、スクリーニング後に得られたクローン（純化されたクローン）について、変異誘発を行い、異なる複数のクローンを含む集団を作製し、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１：一枚膜リポソームの調製）
以下に記載の遠心沈降法により、一枚膜リポソームを調製した。
・１０ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン：コレステロール＝９：１）を１００μｌクロロホルムに溶解し、２ｍｌの流動パラフィンと混合した。
・８０℃で３０分インキュベーションした。
・リポソーム外液（３３３ｍＭ グルコース、無細胞蛋白質合成系から翻訳タンパク質群とｔＲＮＡを除いたもの）、内液（３３０ｍＭ スクロース、１μＭ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ａｌｅｘａ ６４７、無細胞蛋白質合成系、４０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．４μＭ リボソームＳ１サブユニット、５０ｐＭ ＤＮＡを調製した。ＤＮＡとして、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡを用いた。この条件は、各リポソームに１分子のＤＮＡが封入される条件である。使用した無細胞蛋白質合成系の組成は、以下のとおりである：
各０．３ｍＭ アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン）、３．６μｇ／μｌ ｔＲＮＡ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、１４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ７．８）、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン、２０ｍＭ クレアチンリン酸、２ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｎｇ／μｌ １０−ホルミル−５．６．７．８．−テトラヒドロ葉酸、翻訳タンパク質群（２５００ｎＭ ＩＦ１、４１１ｎＭ ＩＦ２、７２８ｎＭ ＩＦ３、２４７ｎＭ ＲＦ１、４８４ｎＭ ＲＦ２、１６８ｎＭ ＲＦ３、４８５ｎＭ ＲＲＦ、７２７ｎＭ ＡｌａＲＳ、９９ｎＭ ＡｒｇＲＳ、４２０ｎＭ ＡｓｎＲＳ、１２１ｎＭ ＡｓｐＲＳ、１００ｎＭ ＣｙｓＲＳ、１０１ｎＭ ＧｌｎＲＳ、２３２ｎＭ ＧｌｕＲＳ、８６ｎＭ ＧｌｙＲＳ、８５ｎＭ ＨｉｓＲＳ、３６５ｎＭ ＩｌｅＲＳ、９９ｎＭ ＬｅｕＲＳ、１１５ｎＭ ＬｙｓＲＳ、１０９ｎＭ ＭｅｔＲＳ、１３４ｎＭ ＰｈｅＲＳ、１６６ｎＭ ＰｒｏＲＳ、９９ｎＭ ＳｅｒＲＳ、８４ｎＭ ＴｈｒＲＳ、１０２ｎＭ ＴｒｐＲＳ、１０１ｎＭ ＴｙｒＲＳ、１００ｎＭ ＶａｌＲＳ、５８８ｎＭ ＭＴＦ、９２６ｎＭ ＭＫ、４６５ｎＭ ＣＫ、１３０７ｎＭ ＮＤＫ、６２１ｎＭ Ｐｐｉａｓｅ２、１２９０ｎＭ ＥＦ−Ｇ、２３１５ｎＭ ＥＦ−Ｔｕ、３３００ｎＭ ＥＦ−Ｔｓ、５２９ｎＭ Ｔｉｇ、２２ｎＭ ＨｒｐＡ、１４４０ｎＭ ＴｒｘＣ）。
・脂質を溶解した流動パラフィン４００μｌにリポソーム内液２０μｌを入れ、氷上に１分置いた。
・ボルテックスミキサーの最大強度で４０秒攪拌しエマルションを調整後、氷上で１０分置いた。
・新しいチューブにリポソーム外液１５０μｌをいれ、その上に調製したエマルションを積層し、氷上で１０分置いた。
・１４ｋ×ｇ、４℃で３０分遠心した。
・チューブの底に穴を開け、底に溜まったリポソーム懸濁液８０μｌを回収した。
・リポソーム懸濁液に２μｌの５Ｕ／μｌ ＤＮａｓｅ、または、４ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅを添加した。
・リポソーム懸濁液を３７℃で３時間インキュベーションし、タンパク質合成を行った。
・ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ溶液で抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した、抗Ｍｙｃタグ抗体（マウスＩｇＧ１））を希釈し終濃度５μｇ／ｍｌになるようにリポソーム懸濁液に加えた。（リポソーム溶液９μｌに５０ｇ／ｍｌの抗体を１μｌ加えた。）
・室温３０分放置後、抗体を顕微鏡観察で観察した（Ｅｘ：４７０〜４９０ Ｅｍ：５１０〜５５０）。
その結果、ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列からなるポリペプチドに結合した抗体に起因するＡｌｅｘａ４８８蛍光のリポソーム膜への局在が確認された。すなわち、上記方法によって、リポソーム内で膜タンパク質をインビトロ合成し、膜タンパク質がリポソーム膜に組み込まれたことが確認された。
次に、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡを用い、タンパク質発現前と発現後のリポソームに対して、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ溶液で希釈した抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した、抗Ｍｙｃタグ抗体（マウスＩｇＧ１）終濃度５μｇ／ｍｌ）を添加し（リポソーム溶液９μｌに５０ｇ／ｍｌの抗体を１μｌ添加）、室温で３０分放置し、セルソータにて分析した。その結果を図１に示す。縦軸はリポソーム内部体積を、横軸はＡｌｅｘａ４８８の蛍光強度を示す。ＡおよびＢは、ＧＵＳ配列を用いた結果を示し、ＣおよびＤは、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列を用いた結果を示す。ＡおよびＣは、３７℃でのインキュベーションにてタンパク質を発現する前のリポソームの結果であり、ＢおよびＤは、３７℃で１時間インキュベーションしてタンパク質を発現したリポソームの結果である。図１から明らかなように、各リポソームに１分子のＤＮＡを封入する条件でリポソームを調製し、膜タンパク質を発現し、抗体で検出できることが確認された。
（実施例２：一枚膜リポソームにて発現した膜タンパク質の機能の確認）
リポソームに、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡそれぞれ５ｎＭ、および、ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを内封し、３７℃２時間インキュベートしＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓとＧＵＳ−ｍｙｃを発現させた。リポソーム調製後、外液１から、ＥｔＢｒ ５μｇ／ｍｌを含む外液２に交換した。一分間ごとに蛍光を測定し、ＥｔＢｒの取り込みを観測した。その後、同じサンプルを蛍光顕微鏡で観察した（Ｅｘ：５２０〜５５０ Ｅｍ：５８０〜）。
外液１の組成（すなわち、リポソーム合成時の外液）は、以下のとおりである：ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）１００ｍＭ、Ｋ−Ｇｌｕ ２００ｍＭ、スペルミジン４ｍＭ、酢酸マグネシウム２５ｍＭ、ＣＰ ４０ｍＭ、ＤＴＴ ２ｍＭ、ＦＤ ２０μｇ／ｍｌ、２０種類のアミノ酸各０．４ｍＭ、ＡＴＰ ８ｍＭ、ＧＴＰ ８ｍＭ、ＵＴＰ ４ｍＭ、ＣＴＰ ４ｍＭ。
外液２の組成（すなわち、プロトン勾配を作るための外液）は、以下のとおりである：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０または７．６） １００ｍＭ、Ｋ−Ｇｌｕ ２００ｍＭ、スペルミジン ４ｍＭ、酢酸マグネシウム ２５ｍＭ、ＣＰ ４０ｍＭ、ＤＴＴ ２ｍＭ、ＦＤ ２０μｇ／ｍｌ、２０種類のアミノ酸 各０．４ｍＭ、ＡＴＰ ８ｍＭ、ＧＴＰ ８ｍＭ、ＵＴＰ ４ｍＭ、ＣＴＰ ４ｍＭ。
その結果を図２に示す。図２Ａは、ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列（配列番号１）を含むＤＮＡを用いた結果を、図２Ｂは、ＧＵＳ配列（配列番号３）を含むＤＮＡを用いた結果を示す。ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列から膜タンパク質を発現したリポソームでは、ｐＨ依存性の蛍光強度が観察された。この結果は、リポソームにて発現した膜タンパク質が輸送能を発揮したことを実証する結果である。
（実施例３：Ｍｇ濃度の検討）
リポソームに、ヘモリシン配列を含むＤＮＡ５ｎＭ、ハロタグタンパク質および、ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを内封した。この際、リポソーム内液及び外液のＭｇ濃度を１８．８８、２３．６、２８．３２、３３．０４、３７．７６、４２．２８、４７．２、５１．９２、５６．６4ｍＭの９条件でリポソーム調整を行った。リポソーム調製後、３７℃、１６時間インキュベートし、ヘモリシンを発現させた。発現したアルファヘモリシンの機能を測定するためにリポソーム外液にハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンド1μＭを加え、３時間後にリポソーム内部に蓄積されたハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドの蛍光量を測定した。その結果、３３．０４ｍＭのＭｇ濃度値で調製したリポソームで最も多くのハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドの蓄積がみられた。したがって、ヘモリシンの活性検出には、好ましくは１８．８８ｍＭ〜２３．６ｍＭ、より好ましくは２３．６ｍＭ〜２８．３２ｍＭ、最も好ましくは２８．３２〜４２．４８ｍＭの条件を用いる事が良い、と判明した。
（実施例４：脂質成分／組成の検討−１）
実施例１で用いたＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓ配列のかわりにヘモリシンをコードする配列（配列番号５）をトランスポーターを発現するために用いた。さらに、ヘモリシンが輸送するリガンドであるハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドに結合する因子として、ハロタグタンパク質（配列番号７）を用いた。ヘモリシンは、膜にポアを作る膜タンパク質であり、３ｋＤａよりも小さい物質を透過させる。そのため、ヘモリシンが発現すると、リポソームにポアが生じ、その結果、脂質膜を透過できないハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドを透過させる。ポアを介して透過したハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドは、ハロタグタンパク質と結合し、その結果、リポソーム内に移動したハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドはリポソーム内に蓄積する。
リポソームを形成する脂質として、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：１の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５：５の混合物、および、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：７の混合物を用いた。なお、ＰＯＰＣは１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンの略称であり、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。その結果、図３に示されるように、コレステロールの比率が高くなるにつれて、ＤＮＡを含むリポソームの中の膜タンパク質活性を発揮する割合が上昇した。

（実施例５：脂質成分／組成の検討−２）
次に、実施例４と同様の手法で、種々の脂質を用いてリポソームを合成し、発現した膜タンパク質の活性を比較した。結果を図４に示す。
図４の縦軸は、各種脂質を用いた場合の全リポソームの中のハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドを高輝度に取り込んだリポソームの割合（％）を示す。用いた脂質は、以下のとおりである：ＥｇｇＰＣは鶏卵から精製したホスファチジルコリンの略称であり、ＰＯＰＣは１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、ＰＳは１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォセリン、ＰＥは１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォエタノールアミン、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。ＰＣ ｍｉｘは、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン：１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン：１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン：１−ステアロイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン＝１２９：６７：４８：２４（質量比）で混ぜたものの略称であり、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＰＯＰＳ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）で混ぜたものの略称である。
これらの結果からホスファチジルコリンの種類を変える事や複数種類を混和する事、１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォセリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスフォエタノールアミンを混和する事がヘモリシンの活性発揮に有意に影響を与えない事が判明した。
（実施例６：所望の核酸の濃縮）
野生型ヘモリシン（配列番号５）と致死変異型ヘモリシン（配列番号８）を用い、実施例４と同様の手法を用いて、実験を行った。野生型と致死変異型との比率は、１：１２として、１０倍以上多くの致死変異型を用いた。３７℃で１６０分間培養し、膜タンパク質を発現させ、その後、セルソーターで輸送活性を示したリポソームを選択し、リポソームに含まれる野生型遺伝子と変異型遺伝子との割合を決定したところ、野生型：変異型＝８：１であった。この結果は、本発明のスクリーニング／選択によって１００倍の濃縮がされたことを実証するものである。
例えば、所望の性質を示すリポソームを選択し、含まれるＤＮＡ（またはＲＮＡ）に変異誘導（例えば、ランダム変異）し、その変異誘導した集団を出発材料としてセルソータでの選択を行うこともできる。この手順を繰り返すことによって、所望の特性を有する変異型遺伝子を濃縮することが可能である。
（実施例７：進化実験）
以下の手順を用いて、進化実験を行った。
１）遠心沈降法によりでリポソームを作成した。
脂質組成はＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝１：１ （ｗｔ／ｗｔ）を用いた。内液組成には、実施例１に記載の無細胞蛋白質合成系と同様の組成（ただし、酢酸マグネシウム濃度を３３．０４ｍＭに変更）を用いた。さらに、１００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、２００ｍＭ スクロース、５ｍＭ β−グルクロニダーゼ結合体化ハロペプチド、１ｍＭ トランスフェリン結合体化ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７、５ｐＭ ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター制御下にヘモリシンのＯＲＦを配置）を用いた。外液組成には、実施例１に記載の無細胞蛋白質合成系と同様の組成（ただし、酢酸マグネシウム濃度を３３．０４ｍＭに変更）の小分子のみに加え、２００ｍＭ グルコースを含む溶液を用いた。
２）外液交換をして外液に混入したリポソーム内液を除去した。６０００Ｇ ５分間遠心し、上清を捨てた後に沈殿を３００ｍｌの新しいリポソーム外液で再懸濁した。
３）ヘモリシンタンパク質をリポソーム内部で合成し、脂質膜に呈示させた。３７℃で１６時間インキュベートした。
４）ＤＮＡｓｅを加えてリポソーム外液に残るＤＮＡを分解した。４μｌのＤＮＡｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ組換えＤｎａｓｅ１）をリポソーム液に加えた。
５）外環境に蛍光基質を加えた。リポソーム液に新たな外液を９００ ｍｌ加え、最終体積を１．２ｍｌにした。最終濃度２ｎＭになるようにし、ハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドを外液に加えた。継時的にフローサイトメータ―でリポソームの蛍光強度を測定した。
６）蛍光基質取り込みを無蛍光の脂質二重膜透過性の拮抗阻害基質で停止した。適当な蛍光強度が得られた時に、最終濃度２００ｎＭ ハロタグビオチンリガンドを外液に加えた。
７）リポソーム溶液の濃縮。６０００Ｇ ５分間遠心し、上清を捨てて沈殿を新しい外液３００ｍｌで再懸濁した。
８）セルソーター（ＢＤ， ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ２）で高輝度リポソームを最高輝度値から１万個分取した。
９）遺伝情報を増幅した。分取したリポソーム液は簡易型のＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。その後、ＰＣＲを４０サイクル行った（ＤＮＡポリメラーゼはＴＯＹＯＢＯ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏを使用）。ＰＣＲは再度ＤＮＡ精製カラムを用いて精製した。その後、アガロース電気泳動により、ゲルバンドを精製した（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｅ−Ｇｅｌ ＣｌｏｎｅＷｅｌｌ ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ Ｇｅｌを使用）。再度ＤＮＡ精製カラムを用いて精製した後、再度ＰＣＲを２０サイクル行った。ＰＣＲ産物は再度ＤＮＡ精製カラムで精製し、次のサイクルのＤＮＡストックとした。
結果を図５に示す。図５は、蛍光強度が２６０以上である高輝度リポソームの集団の割合を示したグラフである。ハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンドがヘモリシン活性がないネガティブコントロールのリポソームに対して吸着する蛍光値が上限で２６０であることから、この数値以上の蛍光値を示したサンプルは、ヘモリシンによる特異的なハロタグＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８リガンド取り込みを示したサンプルである。
スクリーニング／選択のサイクルを繰り返すことによって、より活性の高い遺伝子の割合が増加したことが示された。なお、ＤＮＡを単離した後に変異導入をしてもよい。
核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを用いることによって、より高効率のスクリーニングが可能となり、所望の機能を有する膜タンパク質をコードする遺伝子を選択して回収することができる。
配列番号１：ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓのヌクレオチド配列
配列番号２：ＥｍｒＥ−ｍｙｃ−ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＧＵＳのヌクレオチド配列
配列番号４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＧＵＳのアミノ酸配列
配列番号５：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のヘモリシンをコードするヌクレオチド配列
配列番号６：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のヘモリシンのアミノ酸配列
配列番号７：ハロタグタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の致死変異型ヘモリシンをコードするヌクレオチド配列
配列番号９：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の致死変異型ヘモリシンのアミノ酸配列

Claims (24)

  1. 一枚膜リポソームであって、以下：
    （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    （ｃ）リボヌクレオチド；、
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    （ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む、一枚膜リポソーム。
  2. 請求項１に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
  3. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項２に記載の一枚膜リポソーム。
  4. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項３に記載の一枚膜リポソーム。
  5. 複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
    （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    （ｃ）リボヌクレオチド；
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    （ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む、ライブラリー。
  6. 請求項５に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
  7. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項６に記載のライブラリー。
  8. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項７に記載のライブラリー。
  9. 一枚膜リポソームであって、以下：
    （ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、、
    を含む、一枚膜リポソーム。
  10. 請求項９に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
  11. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１０に記載の一枚膜リポソーム。
  12. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１１に記載の一枚膜リポソーム。
  13. 複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
    （ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む、ライブラリー。
  14. 請求項１３に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
  15. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１４に記載のライブラリー。
  16. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１５に記載のライブラリー。
  17. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    （ｃ）リボヌクレオチド；
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    （ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法。
  18. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１８に記載の方法。
  20. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    （ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    （ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法。
  21. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項２１に記載の方法。
  23. 一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
    （ｉ）請求項５〜８のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
    （ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
    （ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
    （ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
    を包含する方法。
  24. 一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
    （ｉ）請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
    （ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
    （ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
    （ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
    （ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
    を包含する方法。
JP2012145795A 2012-06-28 2012-06-28 インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法 Expired - Fee Related JP6016011B2 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012145795A JP6016011B2 (ja) 2012-06-28 2012-06-28 インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法
EP13810803.0A EP2876159B1 (en) 2012-06-28 2013-06-17 Molecular engineering method for in vitro evolution of membrane protein
US14/411,892 US9862942B2 (en) 2012-06-28 2013-06-17 In vitro membrane protein molecular evolutionary engineering technique
PCT/JP2013/003767 WO2014002424A1 (ja) 2012-06-28 2013-06-17 インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012145795A JP6016011B2 (ja) 2012-06-28 2012-06-28 インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014007983A JP2014007983A (ja) 2014-01-20
JP6016011B2 true JP6016011B2 (ja) 2016-10-26

Family

ID=49782623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012145795A Expired - Fee Related JP6016011B2 (ja) 2012-06-28 2012-06-28 インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9862942B2 (ja)
EP (1) EP2876159B1 (ja)
JP (1) JP6016011B2 (ja)
WO (1) WO2014002424A1 (ja)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007060995A (ja) * 2005-08-31 2007-03-15 Hitachi Ltd 新規膜機能蛋白質のスクリーニング方法
JP5467320B2 (ja) * 2011-03-30 2014-04-09 独立行政法人科学技術振興機構 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発

Also Published As

Publication number Publication date
EP2876159A4 (en) 2015-12-16
US9862942B2 (en) 2018-01-09
US20150176004A1 (en) 2015-06-25
EP2876159B1 (en) 2019-08-07
EP2876159A1 (en) 2015-05-27
JP2014007983A (ja) 2014-01-20
WO2014002424A1 (ja) 2014-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Blanken et al. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes
Foshag et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production
Fujii et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins
Kotzsch et al. Biochemical composition and assembly of biosilica-associated insoluble organic matrices from the diatom Thalassiosira pseudonana
US8592569B2 (en) Small RNA-dependent translational regulatory system in cell or artificial cell model
Hwang et al. Characterization of protein complexes of the endoplasmic reticulum-associated degradation E3 ubiquitin ligase Hrd1
JP2012210172A (ja) 外部環境に応答して内部の物質組成を変えるリポソーム
Rath et al. Functional expression of the PorAH channel from Corynebacterium glutamicum in cell-free expression systems: implications for the role of the naturally occurring mycolic acid modification
JP7460700B2 (ja) 未精製膜からのサポシンリポタンパク質粒子およびライブラリー
Vemula et al. Cytoplasmic peptidoglycan intermediate levels in Staphylococcus aureus
JP5467320B2 (ja) 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発
AU2017272493A1 (en) Ligand identification by co-fractionation
JP6016011B2 (ja) インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法
Caliskan et al. Pseudomonas aeruginosa responds to altered membrane phospholipid composition by adjusting the production of two-component systems, proteases and iron uptake proteins
Dods et al. Acyl transfer from membrane lipids to peptides is a generic process
CA3140144A1 (en) Expression of modified proteins in a peroxisome
Fujii et al. In vitro directed evolution of alpha-hemolysin by liposome display
Sugue Towards understanding the mechanisms of the periplasmic pyoverdine maturation
EP3847462B1 (en) Detection of membrane proteins by mass spectrometry
Hoefer et al. Structural determinants of the interactions between influenza A virus matrix protein M1 and lipid membranes
Jaitzig Reconstituted nonribosomal biosynthesis of the peptide antibiotic valinomycin in Escherichia coli as recombinant whole-cell biocatalyst
Bauer et al. The use of immunoaffinity purification approaches coupled with LC-MS/MS offers a powerful strategy to identify protein complexes in filamentous fungi
JP2007528718A (ja) タンパク質チップ作製用試薬
Van Raad Semi-permeable artificial cells and their applications
Schienschang Monitoring Infection of E. Coli By Bacteriophage T7 through Mass Spectrometry-Based Proteomics

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150610

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160715

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160805

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160825

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160914

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6016011

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees