WO2014002424A1 - インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法 - Google Patents

インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法 Download PDF

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友亮 松浦
遥 曽我
渡邉　肇
聡志 藤井
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to the field of novel single membrane liposomes for use in molecular evolution engineering of membrane proteins in vitro.
  • the present invention also relates to novel molecular evolution engineering, particularly enzyme evolution engineering, for membrane proteins using single membrane liposomes.
  • a method for improving the enzyme in terms of evolutionary engineering a method using a liposome and a cell sorter encapsulating a gene library and a cell-free protein synthesis system is used.
  • a gene library in which a random mutation is introduced into an enzyme gene and a cell-free protein synthesis system are encapsulated in a liposome, and the enzyme is expressed inside.
  • the gene which codes a higher function enzyme can be selected by selecting the liposome containing a higher function enzyme with a cell sorter. By repeating this selection, the gene encoding the enzyme can be evolved (Non-patent Document 1). In this conventional method, only soluble proteins were targeted.
  • membrane proteins play many important roles in cell function. Therefore, there is a need for novel molecular evolution engineering, particularly enzyme evolution engineering, for membrane proteins.
  • An object of the present invention is to provide a novel molecular evolution engineering technique, particularly an enzyme evolution engineering technique, for membrane proteins.
  • (Item 1) Single-membrane liposomes, the following: (A) DNA comprising a promoter sequence, a translation initiation sequence, and a sequence encoding a membrane protein; (B) RNA polymerase; (C) ribonucleotides; and (D) a cell-free protein synthesis system, Single-membrane liposomes. (Item 2) The membrane protein is a transporter, and the single membrane liposome is further (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein; The monolayer liposome according to item 1, comprising (Item 3) 3.
  • (Item 5) Item 5.
  • a library comprising a plurality of unilamellar liposomes, wherein the unilamellar liposomes are: (A) DNA comprising a promoter sequence, a translation initiation sequence, and a sequence encoding a membrane protein; (B) RNA polymerase; (C) ribonucleotides; and (D) a cell-free protein synthesis system, Including the library.
  • the membrane protein is a transporter, and the single membrane liposome is further (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein;
  • the library according to item 6, comprising (Item 8) 8.
  • Item 9 Item 9. The library according to Item 8, wherein the nucleolytic enzyme is selected from the group consisting of an RNase and a DNA degrading enzyme.
  • Item 10 Item 10. The library according to item 9, wherein the nucleolytic enzyme is an RNase.
  • Item 11 Single-membrane liposomes, the following: (A) an RNA comprising a translation initiation sequence and a sequence encoding a membrane protein; and (d) a cell-free protein synthesis system, Single-membrane liposomes.
  • the membrane protein is a transporter, and the single membrane liposome is further (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein;
  • the nucleolytic enzyme is selected from the group consisting of an RNase and a DNA degrading enzyme.
  • the nucleolytic enzyme is an RNase.
  • a library comprising a plurality of unilamellar liposomes, wherein the unilamellar liposomes are: (A) an RNA comprising a translation initiation sequence and a sequence encoding a membrane protein; and (d) a cell-free protein synthesis system, Including the library.
  • the membrane protein is a transporter, and the single membrane liposome is further (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein;
  • the library according to item 16 comprising (Item 18) 18.
  • Item 19 Item 19.
  • the nucleolytic enzyme is an RNase.
  • a method for producing a single membrane liposome treated with a nucleolytic enzyme comprising: (1) The following: (A) DNA comprising a promoter sequence, a translation initiation sequence, and a sequence encoding a membrane protein; (B) RNA polymerase; (C) ribonucleotides; and (D) a cell-free protein synthesis system, A step of preparing a single membrane liposome encapsulating (2) a step of treating the single membrane liposome prepared in step (1) with a nucleolytic enzyme, Including the method.
  • a method for producing a single membrane liposome treated with a nucleolytic enzyme comprising: (1) Following: (A) a DNA comprising a promoter sequence, a translation initiation sequence, and a sequence encoding a membrane protein that is a transporter; (B) RNA polymerase; (C) ribonucleotides; (D) a cell-free protein synthesis system; and (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein; A step of preparing a single membrane liposome encapsulating (2) a step of treating the single membrane liposome prepared in step (1) with a nucleolytic enzyme, Including the method. (Item 23) Item 23.
  • nucleolytic enzyme is selected from the group consisting of an RNase and a DNA degrading enzyme.
  • nucleolytic enzyme is selected from the group consisting of an RNase and a DNA degrading enzyme.
  • nucleolytic enzyme is an RNase.
  • a method for producing a single membrane liposome treated with a nucleolytic enzyme comprising: (1) The following: (A) an RNA comprising a translation initiation sequence and a sequence encoding a membrane protein; and (D) a cell-free protein synthesis system, A step of preparing a single membrane liposome encapsulating (2) a step of treating the single membrane liposome prepared in step (1) with a nucleolytic enzyme, Including the method.
  • a method for producing a single membrane liposome treated with a nucleolytic enzyme comprising: (1) The following: (A) an RNA comprising a translation initiation sequence and a sequence encoding a membrane protein that is a transporter; (D) a cell-free protein synthesis system; and (E) a factor that binds to a ligand transported by the membrane protein; A step of preparing a single membrane liposome encapsulating (2) a step of treating the single membrane liposome prepared in step (1) with a nucleolytic enzyme, Including the method. (Item 27) 27.
  • nucleolytic enzyme is selected from the group consisting of an RNA degrading enzyme and a DNA degrading enzyme.
  • nucleolytic enzyme is an RNase.
  • a screening method using a library of single membrane liposomes comprising: (I) providing the library according to any one of items 6 to 10; (Ii) selecting unilamellar liposomes having desired characteristics from the library; (Iii) amplifying the DNA contained in the unilamellar liposome; and (Iv) isolating the amplified DNA; Including the method.
  • a screening method using a library of single membrane liposomes comprising: (I) providing the library according to any one of items 16 to 20; (Ii) selecting unilamellar liposomes having desired characteristics from the library; (Iii) a step of producing a DNA by allowing a reverse transcriptase to act on RNA contained in the unilamellar liposome; (Iv) amplifying the generated DNA; and (V) isolating the amplified DNA; Including the method.
  • the present invention has enabled in vitro molecular evolution engineering techniques targeting membrane proteins using liposomes.
  • large-scale screening / selection of a gene encoding a membrane protein having a desired function is also possible.
  • the sensitivity of screening / selection is improved by encapsulating the factor that binds to the ligand transported by the membrane protein in the liposome and capturing the ligand transported in the liposome.
  • the sensitivity of screening / selection is further improved by optimizing the composition / ratio of lipids constituting the liposome and the magnesium concentration when preparing the liposome.
  • FIG. 1 shows labeled anti-Myc using a DNA containing an EmrE-myc-his sequence (SEQ ID NO: 1) or a DNA containing a GUS sequence (SEQ ID NO: 3) before and after protein expression. It is the result of adding a tag antibody and analyzing with a cell sorter.
  • the vertical axis represents the liposome internal volume, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of Alexa488.
  • a and B show the results using the GUS sequence
  • C and D show the results using the EmrE-myc-his sequence.
  • FIG. 2 shows that proteins are expressed in liposomes containing DNA containing EmrE-myc-his sequence (SEQ ID NO: 1 FIG. 2A) or DNA containing GUS sequence (SEQ ID NO: 3 FIG. 2B) at different pHs. It is the result of having measured the transport activity of EtBr.
  • FIG. 3 is a result showing the ratio of the expression of a membrane protein having a function when various lipid compositions are used.
  • FIG. 4 shows the ratio (%) of liposomes incorporating halotag Alexa Fluor 488 ligand with high luminance in all liposomes when various lipids are used. That is, the graph of FIG. 4 is a graph showing the relative activity of channels.
  • the lipids used are as follows: EggPC is an abbreviation for phosphatidylcholine purified from eggs, POPC is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine, PS is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoserine, PE Is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoethanolamine, and Chol is an abbreviation for cholesterol.
  • PC mix is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine: 1-palmitoyl-2-linoleoylphosphatidylcholine: 1-stearoyl-2-oleoylphosphatidylcholine: 1-stearoyl-2-linoylphosphatidylcholine 129: 67: It is an abbreviation of what was mixed at 48:24 (mass ratio).
  • Each of EggPC / PS / PE is 3: 1: 1 (mass ratio) in order, and each of EggPC / PS / PE / Chol is 2: 1: 1 in order.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the evolution experiment.
  • shaft shows the ratio (ratio of a red spot) of a high-intensity liposome. As the cycle was repeated, the proportion of the highly active population increased.
  • microcompartment refers to a closed microscopic space composed of a lipid layer and an aqueous layer therein.
  • examples of the “microcompartments” include, but are not limited to, liposomes.
  • the term “liposome” generally means a closed vesicle composed of a lipid layer assembled in a membrane and an aqueous layer inside.
  • cholesterol typically used, cholesterol, glycolipids and the like can also be incorporated.
  • the liposome is a structural unit having a functional group that imparts an ester bond (eg, glycolipid, ganglioside, phosphatidylglycerol, etc.) or a structural unit that has a functional group that imparts a peptide bond in order to attach a modifying group. (For example, phosphatidylethanolamine).
  • the liposome used in the present invention is a “single-membrane liposome” in which a membrane composed of a lipid bilayer consists of only one membrane.
  • Various well-known methods can be used as a method for preparing the unilamellar liposome.
  • promoter sequence refers to a region on DNA that determines the start site of transcription of a gene and directly regulates its frequency, and RNA polymerase binds to transcription. This is the base sequence to start.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene.
  • the promoter may be inducible, constitutive, site specific, or time specific. Any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as mammalian cells, E. coli, and yeast.
  • Exemplary promoter sequences include, but are not limited to, T7 promoter sequence, T5 promoter sequence, Sp6 promoter sequence, and T3 promoter sequence.
  • RNA polymerase may be any RNA polymerase as long as it is compatible with the promoter sequence used, that is, RNA polymerase that performs transcription from the promoter used.
  • the promoter sequence and the RNA polymerase are derived from the same or adjacent species.
  • the RNA polymerase to be used is also preferably prokaryotic.
  • the RNA polymerase used is also derived from the same or similar bacteriophage.
  • translation initiation sequence means any sequence that can provide a functional ribosome entry site. In bacterial systems, this region is also referred to as the Shine-Dalgarno sequence.
  • cell-free protein synthesis system refers to a component derived from a cell that has lost its autonomous replication ability by treating the cell and is capable of protein synthesis.
  • the cell-free protein synthesis system for example, commercially available PURESYSTEM (registered trademark) (Biocommer Co., Ltd., Bunkyo-ku, Tokyo) can be used.
  • components required for a cell-free protein synthesis system can be produced by purification and / or recombinant expression.
  • operably linked refers to a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that has the expression (operation) of a desired sequence. That means.
  • the promoter In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
  • membrane protein refers to a protein that adheres to a lipid bilayer membrane.
  • the membrane protein may be a protein containing a transmembrane region or a protein not containing a transmembrane region.
  • membrane protein The present invention is applicable to any membrane protein.
  • Representative membrane proteins include, but are not limited to, transporters, receptors, and the like.
  • the sequence encoding the membrane protein of the invention may include a leader sequence for inserting the protein into the membrane.
  • the membrane protein of the present invention may or may not be a transporter.
  • the transporter of the present invention include, but are not limited to, a protein involved in substance transport (eg, EmrE protein) in a cell and a protein (eg, hemolysin) that permeates a substance that does not permeate the lipid bilayer.
  • the single membrane liposome used in the present invention can be prepared using the centrifugal sedimentation method described in the Examples, but the preparation method is not limited thereto.
  • the centrifugal sedimentation method static hydration method (P. Mueller and TF Chien, Biophys. J., 1983, 44, 375-381) and electroformation method (Miglena I. Angelove) and Dimiter S. Dimitrov, Faraday Discs. Chem. Soc., 1986, 81, 303-311).
  • the static hydration method is typically a method including the following steps: (1) a step of dissolving a lipid in a solvent and naturally drying in a flask to form a lipid film on the surface of the flask; (2) A step of adding an aqueous solution to swell the lipid membrane. By this second step, the liposome in which the lipid membrane has taken in the aqueous solution rises.
  • the electro-formation method is typically a method including the following steps: (1) a step of applying a lipid solution on a conductive electrode and drying to form a lipid film; (2) an insulating spacer. A process of installing a conductive electrode on the opposite side of the electrode and filling it with an aqueous solution; and (3) applying an electric field between the two electrodes to peel the lipid membrane from the electrode to produce a giant thin film liposome Process.
  • compositions of lipids used in the production of unilamellar liposomes are not particularly limited, but preferably include phospholipids and cholesterol.
  • the lipid examples include L-alpha-phosphatidylcholine, cholesterol, L-alpha-dilauroylphosphatidylcholine, L-alpha-dilauroylphosphatidylethanolamine, L-alpha-dilauroylphosphatidylglycerol sodium, L-alpha-monomyristoylphosphati Dicholine, L-alpha-dimyristoyl phosphatidylcholine, L-alpha-dimyristoyl phosphatidylethanolamine, L-alpha-dimyristoyl phosphatidylglycerol ammonium, L-alpha-dimyristoyl phosphatidylglycerol sodium, L-alpha-dimyristoyl phosphatidate sodium , L-alpha-dioleoylphosphatidylcholine, L-alpha-dioleoyl Sphatidylethanolamine, L-alpha-dioleoylphosphat
  • the proportion of cholesterol is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, even more preferably 50% or more, and most preferably 70% or more.
  • the concentration of magnesium is preferably 15 mM to 50 mM, more preferably 18.88 mM to 42.48 mM, even more preferably 28.32 mM to 37.76 mM, and most preferably 33.04 mM.
  • nucleolytic enzyme examples include, but are not limited to, an RNA degrading enzyme and a DNA degrading enzyme.
  • the source of the nucleolytic enzyme to be used is not particularly limited.
  • DNase is used as the nucleolytic enzyme
  • the enzyme activity used is from 1 U to 20 U, more preferably from 5 U to 15 U, and most preferably about 12.5 U per 100 ⁇ L of liposome solution.
  • RNase is used as the nucleolytic enzyme
  • the enzyme activity used is 1 ⁇ g to 20 ⁇ g, more preferably 5 ⁇ g to 15 ⁇ g, and most preferably about 10 ⁇ g per 100 ⁇ L of liposome solution.
  • One skilled in the art can easily determine the amount of enzyme to use.
  • DNA or RNA used when the genetic information contained in the liposome is DNA, the DNA is operably linked to the coding sequence of the protein, a translational regulatory sequence operably linked to the coding sequence, and the coding sequence. Include transcriptional translational regulatory sequences.
  • translation regulatory sequences include, but are not limited to, translation initiation sequences. If necessary, a translation stop codon may be included. It is preferable that the translational regulatory sequence to be linked is compatible with the cell-free protein synthesis system to be used. For example, E.I. When using a cell-free protein synthesis system derived from E. coli, the translational regulatory sequence to be linked is preferably E. coli. E. coli translation start sequence.
  • the translation regulatory sequence used and the cell-free protein synthesis system do not necessarily have to be derived from the same species and can be compatible with each other, that is, as long as the cell-free protein synthesis system can initiate translation from the translation regulatory sequence. It may be derived from.
  • transcription / translation control sequences include, but are not limited to, promoter sequences.
  • an enhancer sequence, suppressor sequence, operator sequence, and transcription termination site may be included.
  • the transcriptional translational regulatory sequence to be ligated is compatible with the RNA polymerase used.
  • the transcriptional translational regulatory sequence to be ligated is preferably E. coli. is a transcriptional translational regulatory sequence of E. coli.
  • the transcriptional translational regulatory sequence used and the RNA polymerase need not be from the same species, as long as they are compatible, ie any RNA polymerase can initiate (or control) transcription from the transcriptional translational regulatory sequence. It may be derived from a species.
  • the RNA when the genetic information included in the liposome is RNA, the RNA includes a protein coding sequence and a translational regulatory sequence operably linked to the coding sequence.
  • translation regulatory sequences include, but are not limited to, translation initiation sequences. If necessary, a translation stop codon may be included.
  • the translational regulatory sequence to be linked is compatible with the cell-free protein synthesis system to be used. For example, E.I. When using a cell-free protein synthesis system derived from E. coli, the translational regulatory sequence to be linked is preferably E. coli. E. coli translation start sequence.
  • the translation regulatory sequence used and the cell-free protein synthesis system do not necessarily have to be derived from the same species and can be compatible with each other, that is, as long as the cell-free protein synthesis system can initiate translation from the translation regulatory sequence. It may be derived from.
  • the liposome of the present invention can be used for molecular evolution engineering.
  • a single membrane liposome treated with a nucleolytic enzyme is incubated under conditions in which the DNA or RNA inside thereof produces a protein product, and (1) the presence of the expressed protein on the surface of the liposome is used as an index, or ( 2) The activity of the produced membrane protein is measured, and single membrane liposomes containing highly functional genetic information are selected (screened) using this activity as an index.
  • the activity to be utilized is typically the activity of the protein encoded by DNA or RNA in the single membrane liposome.
  • DNA or RNA in a single membrane liposome encodes a transporter
  • the activity utilized is typically its transport activity.
  • a substance transported into liposomes by the transporter is labeled (for example, fluorescent labeling), and labeled using a cell sorter (FACS: fluorescent labeling cell sorter).
  • FACS fluorescent labeling cell sorter
  • the enzyme activity of the membrane protein may be used as an index.
  • T3 RNA polymerase having higher RNA synthesis activity can be obtained by arranging the GFP gene, for example, downstream of the T3 RNA polymerase promoter and simultaneously using T3 RNA polymerase RNA.
  • a mutation into a sequence other than the protein coding sequence (for example, a sequence related to the control of gene expression such as a promoter sequence, an enhancer sequence, a ribosome binding sequence, a translation initiation site), a high activity (for example, sequences can be evolved to have high promoter activity, enhancer activity, translation activity, and the like.
  • a sequence other than the protein coding sequence for example, a sequence related to the control of gene expression such as a promoter sequence, an enhancer sequence, a ribosome binding sequence, a translation initiation site
  • a high activity for example, sequences can be evolved to have high promoter activity, enhancer activity, translation activity, and the like.
  • the unilamellar liposome obtained as a result of the screening is used for isolating genetic information contained therein as DNA or RNA.
  • the genetic information is DNA
  • the genetic information can be amplified and isolated by PCR using primers that specifically amplify the DNA.
  • the DNA may be introduced into an appropriate host cell and isolated after amplification.
  • RNA When the genetic information is RNA, (1) RNA is converted into DNA using reverse transcriptase, and then DNA is amplified by PCR using heat-resistant DNA polymerase enzyme, or (2) heat-resistant RNA genetic information may be amplified in one step using reverse transcriptase. If the RNA contains the sequences necessary for autonomous replication in the host cell, the RNA may be introduced into a suitable host cell and isolated after amplification.
  • ⁇ ⁇ It is not always necessary to isolate (purify) genetic information after the first round of screening. For example, instead of obtaining a single clone of DNA or RNA by the first round of screening, a DNA or RNA population may be obtained, and the second round of screening may be performed using that population as a starting material. The DNA or RNA population obtained by the second round screening or subsequent round screening may be used as a starting material for the next round screening.
  • clones obtained after screening may be mutagenized to produce a population containing a plurality of different clones, and may be used as starting materials for the next round of screening.
  • Example 1 Preparation of single membrane liposome
  • composition of Are as: 2. 0.3 mM amino acids (alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, serine, threonine, proline, tryptophan, phenylalanine, glutamine, glutamic acid, asparagine, aspartic acid, lysine, arginine, histidine, methionine, cysteine, tyrosine) 6 ⁇ g / ⁇ l tRNA, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 14 mM magnesium acetate, 50 mM Hepes-KOH (pH 7.8), 100 mM potassium glutamate, 2 mM spermidine, 20 mM creatine phosphate, 2 mM dithiothreitol, 10 ng / ⁇ l 10-formyl-5.5.6.7.8.
  • amino acids alanine, glycine, leucine, isole
  • Liquid-dissolved liquid paraffin 400 ⁇ l was charged with 20 ⁇ l of liposome internal solution and placed on ice for 1 minute. -After stirring for 40 seconds at the maximum intensity of a vortex mixer to prepare an emulsion, it was placed on ice for 10 minutes. -Into a new tube, 150 ⁇ l of the liposome external solution was placed, and the prepared emulsion was layered thereon and placed on ice for 10 minutes. -It centrifuged at 14kxg and 4 degreeC for 30 minutes. -A hole was made in the bottom of the tube, and 80 ⁇ l of the liposome suspension accumulated in the bottom was collected.
  • Alexa 488 fluorescence was localized in the liposome membrane due to an antibody bound to a polypeptide consisting of a sequence containing a myc tag and a his tag at the C-terminus of the EmrE gene. That is, it was confirmed that the membrane protein was synthesized in vitro in the liposome by the above method, and the membrane protein was incorporated into the liposome membrane.
  • a DNA containing an EmrE-myc-his sequence (SEQ ID NO: 1: a sequence containing a myc tag and a his tag at the C-terminus of the EmrE gene), or a GUS sequence (SEQ ID NO: 3: a negative containing a GUS sequence and a myc sequence)
  • an antibody diluted with PBS + 1% BSA solution against a liposome before and after protein expression (anti-Myc tag antibody (mouse IgG1) final concentration 5 ⁇ g / ml labeled with Alexa Fluor 488) (1 ⁇ l of 50 g / ml antibody was added to 9 ⁇ l of liposome solution), left at room temperature for 30 minutes, and analyzed with a cell sorter.
  • the result is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the liposome internal volume
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of Alexa488.
  • a and B show the results using the GUS sequence
  • C and D show the results using the EmrE-myc-his sequence.
  • a and C are the results of the liposomes before the protein was expressed by incubation at 37 ° C.
  • B and D are the results of the liposomes that were incubated at 37 ° C. for 1 hour and expressed the protein.
  • FIG. 1 it was confirmed that liposomes were prepared under conditions in which one molecule of DNA was encapsulated in each liposome, the membrane protein was expressed, and the antibody could be detected.
  • the liposome contains a DNA containing an EmrE-myc-his sequence (SEQ ID NO: 1: a sequence containing a myc tag and a his tag at the C-terminus of the EmrE gene), or a GUS sequence (SEQ ID NO: 3: a negative containing a GUS sequence and a myc sequence) 5 nM each of DNA containing the control) and PURE system were encapsulated and incubated at 37 ° C. for 2 hours to express EmrE-myc-his and GUS-myc.
  • SEQ ID NO: 1 a sequence containing a myc tag and a his tag at the C-terminus of the EmrE gene
  • a GUS sequence SEQ ID NO: 3: a negative containing a GUS sequence and a myc sequence
  • the external solution 1 was replaced with an external solution 2 containing EtBr 5 ⁇ g / ml. Fluorescence was measured every minute and EtBr uptake was observed. Thereafter, the same sample was observed with a fluorescence microscope (Ex: 520 to 550 Em: 580 to).
  • the composition of external liquid 1 (that is, the external liquid during liposome synthesis) is as follows: HEPES-KOH (pH 7.6) 100 mM, K-Glu 200 mM, spermidine 4 mM, magnesium acetate 25 mM, CP 40 mM, DTT 2 mM FD 20 ⁇ g / ml, 20 kinds of amino acids 0.4 mM each, ATP 8 mM, GTP 8 mM, UTP 4 mM, CTP 4 mM.
  • the composition of outer solution 2 (ie, the outer solution for creating a proton gradient) is as follows: Tris-HCl (pH 9.0 or 7.6) 100 mM, K-Glu 200 mM, spermidine 4 mM, magnesium acetate 25 mM , CP 40 mM, DTT 2 mM, FD 20 ⁇ g / ml, 20 amino acids 0.4 mM each, ATP 8 mM, GTP 8 mM, UTP 4 mM, CTP 4 mM.
  • FIG. 2A shows the results using DNA containing the EmrE-myc-his sequence (SEQ ID NO: 1)
  • FIG. 2B shows the results using DNA containing the GUS sequence (SEQ ID NO: 3).
  • pH-dependent fluorescence intensity was observed in liposomes expressing membrane proteins from the EmrE-myc-his sequence. This result is a result demonstrating that the membrane protein expressed in the liposome exerted the transport ability.
  • Example 3 Examination of Mg concentration
  • the liposome was encapsulated with 5 nM DNA containing a hemolysin sequence, a halotag protein, and a PURE system. At this time, the Mg concentration of the liposome internal solution and the external solution was 18.8.
  • Liposomes were prepared under 9 conditions of 8, 23.6, 28.32, 33.04, 37.76, 42.28, 47.2, 51.92, and 56.64 mM. After preparation of liposomes, Incubate for 6 hours to express hemolysin.
  • the halotag Alexa Fluor 488 ligand 1 ⁇ M was added, and the fluorescence amount of the halo tag Alexa Fluor 488 ligand accumulated in the liposome after 3 hours was measured.
  • accumulation of the most halotag Alexa Fluor 488 ligand was observed in the liposome prepared with a Mg concentration value of 33.04 mM. Therefore, it has been found that it is preferable to use conditions of 18.88 mM to 23.6 mM, more preferably 23.6 mM to 28.32 mM, and most preferably 28.32 to 42.48 mM for detecting the activity of hemolysin. did.
  • Example 4 Examination of lipid component / composition-1)
  • a sequence encoding hemolysin (SEQ ID NO: 5) was used to express the transporter.
  • a halotag protein (SEQ ID NO: 7) was used as a factor that binds to the halotag Alexa Fluor 488 ligand, which is a ligand transported by hemolysin.
  • Hemolysin is a membrane protein that creates pores in the membrane, and allows permeation of substances smaller than 3 kDa.
  • halotag Alexa Fluor 488 ligand that cannot permeate the lipid membrane is permeated.
  • the halotag Alexa Fluor 488 ligand that permeates through the pore binds to the halotag protein, and as a result, the halotag Alexa Fluor 488 ligand that has migrated into the liposome accumulates in the liposome.
  • Example 5 Examination of lipid component / composition-2
  • liposomes were synthesized using various lipids, and the activities of the expressed membrane proteins were compared. The results are shown in FIG.
  • the vertical axis of FIG. 4 shows the ratio (%) of liposomes incorporating halotag Alexa Fluor 488 ligand with high luminance in all liposomes when various lipids are used.
  • the lipids used are as follows: EggPC is an abbreviation for phosphatidylcholine purified from eggs, POPC is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine, PS is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoserine, PE Is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoethanolamine, and Chol is an abbreviation for cholesterol.
  • PC mix is 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine: 1-palmitoyl-2-linoleoylphosphatidylcholine: 1-stearoyl-2-oleoylphosphatidylcholine: 1-stearoyl-2-linoylphosphatidylcholine 129: 67: It is an abbreviation of what was mixed at 48:24 (mass ratio).
  • Each of EggPC / PS / PE is 3: 1: 1 (mass ratio) in order, and each of EggPC / PS / PE / Chol is 2: 1: 1 in order.
  • the activity of hemolysin can be determined by changing the type of phosphatidylcholine, mixing multiple types, and mixing 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoserine and 1-palmitoyl-2-oleoylphosphoethanolamine. It was found that there was no significant effect on performance.
  • Example 6 Concentration of desired nucleic acid
  • SEQ ID NO: 5 wild-type hemolysin
  • SEQ ID NO: 8 lethal mutant hemolysin
  • the ratio of wild type to lethal mutant was 1:12, and more than ten times more lethal mutants were used.
  • a liposome that showed transport activity with a cell sorter was selected, and the ratio of the wild type gene to the mutant gene contained in the liposome was determined.
  • Mutant type 8: 1. This result demonstrates that 100-fold enrichment was achieved by the screening / selection of the present invention.
  • Liposomes were prepared by centrifugal sedimentation.
  • the same composition as the cell-free protein synthesis system described in Example 1 (however, the magnesium acetate concentration was changed to 33.04 mM) was used.
  • 100 nM T7 RNA polymerase, 200 mM sucrose, 5 mM ⁇ -glucuronidase-conjugated halopeptide, 1 mM transferrin-conjugated alexa fluor 647, 5 pM DNA (hemolysin ORF placed under T7 promoter control) were used.
  • a solution containing 200 mM glucose was used in addition to a small molecule having the same composition as that of the cell-free protein synthesis system described in Example 1 (however, the magnesium acetate concentration was changed to 33.04 mM).
  • Hemolysin protein was synthesized inside the liposome and presented on the lipid membrane. Incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • DNAse was added to decompose the DNA remaining in the liposome outer solution.
  • 4 ⁇ l of DNAse (TAKARA recombinant Dnase1) was added to the liposome solution.
  • a fluorescent substrate was added to the outside environment. 900 ml of fresh external solution was added to the liposome solution to make the final volume 1.2 ml. The final concentration was 2 nM, and halotag Alexa Fluor 488 ligand was added to the external solution. The fluorescence intensity of the liposome was measured with a flow cytometer over time.
  • Fluorescent substrate uptake was stopped with a non-fluorescent lipid bilayer permeable antagonistic inhibitor substrate.
  • a final concentration of 200 nM halotag biotin ligand was added to the external solution.
  • the sorted liposome solution was purified using a simple DNA purification column (QIAGEN MinElute PCR Purification Kit). Thereafter, 40 cycles of PCR were performed (DNA polymerase uses TOYO KOD FX Neo). PCR was purified again using a DNA purification column. Thereafter, the gel band was purified by agarose electrophoresis (using life technologies, E-Gel CloneWell SYBR Safe Gel). After purification using a DNA purification column again, PCR was repeated 20 cycles. The PCR product was purified again with a DNA purification column, and used as a DNA stock for the next cycle.
  • FIG. 5 is a graph showing the proportion of a population of high-intensity liposomes having a fluorescence intensity of 260 or more. Since the upper limit of the fluorescence value of the halotag Alexa Fluor 488 ligand adsorbed to the negative control liposome without hemolysin activity is 260, samples showing a fluorescence value higher than this value are specific halotag Alexa Fluor by hemolysin. This is a sample showing 488 ligand uptake.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of EmrE-myc-his SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of EmrE-myc-his SEQ ID NO: 3: Nucleotide sequence of GUS from Escherichia coli SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of GUS from Escherichia coli SEQ ID NO: 5: nucleotide sequence encoding hemolysin from Staphylococcus aureus SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of hemolysin from Staphylococcus aureus SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of halotag protein SEQ ID NO: 8: nucleotide encoding lethal mutant hemolysin from Staphylococcus aureus SEQ ID NO: 9: Amino acid sequence of lethal mutant hemolysin from Staphylococcus aureus

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Abstract

　分子進化工学（例えば、酵素進化法）における膜タンパク質のスクリーニング／選択の効率を向上させることを課題とする。　一枚膜リポソームであって、以下： （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ； （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ； （ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、 （ｄ）無細胞蛋白質合成系、 を含む、一枚膜リポソームを提供することによって上記課題は、解決された。一つの局面において、本発明は、膜タンパク質がトランスポーターであり、一枚膜リポソームがさらに、 （ｅ）膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、 を含む。

Description

インビトロ膜タンパク質進化分子工学的手法
　本発明は、インビトロにおける膜タンパク質の分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。
　酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる（非特許文献１）。この従来法では、専ら、可溶性タンパク質が対象であった。
　膜タンパク質が細胞の機能において多くの重要な役割を担うことは周知である。そのため、膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学が求められている。
Ｓｕｎａｍｉ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｔ．，Ｔｓｕｋａｄａ，Ｋ．，Ｕｒａｂｅ，Ｉ．，　ａｎｄ　Ｙｏｍｏ，Ｔ．（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５７，１２８－１３６
　膜タンパク質を対象とする、新規の分子進化工学的手法、特に、酵素進化工学的手法を提供することを、本発明の課題とする。
　上記課題は、以下を提供することによって解決された。
（項目１）
一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目２）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目３）
項目１または２に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
（項目４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目３に記載の一枚膜リポソーム。
（項目５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目４に記載の一枚膜リポソーム。
（項目６）
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目７）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目６に記載のライブラリー。
（項目８）
項目６または７に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
（項目９）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目８に記載のライブラリー。
（項目１０）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目９に記載のライブラリー。
（項目１１）
一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目１２）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目１１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１３）
項目１１または１２に記載の一枚膜リポソームであって、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソーム。
（項目１４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１３に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１４に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１６）
複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目１７）
前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
（ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を含む項目１６に記載のライブラリー。
（項目１８）
項目１６または１７に記載のライブラリーであって、前記一枚膜リポソームが核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームである、ライブラリー。
（項目１９）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１８に記載のライブラリー。
（項目２０）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１９に記載のライブラリー。
（項目２１）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
　（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
　（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
　（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
　（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２２）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
　（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
　（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
　（ｃ）リボヌクレオチド；
　（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
　（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
　（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
　（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２６）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
　（ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；
　（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
　（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目２７）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
　一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目６～１０のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
（項目３０）
　一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目１６～２０のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
（ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
　本発明によって、リポソームを利用する、膜タンパク質を対象としたインビトロでの分子進化工学的手法が可能になった。また、本発明によって、所望の機能を有する膜タンパク質をコードする遺伝子の大規模スクリーニング／選択もまた可能である。
　膜タンパク質がトランスポーターである場合、その膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子をリポソーム内に封入してリポソーム内に輸送されたリガンドを捕獲することにより、スクリーニング／選択の感度が向上する。
　さらに、本発明に従い核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームを用いることによって、スクリーニング効率が向上する。理論に拘束されることは望まないが、本発明が優れた効果を奏する理由としては、以下が挙げられる。従来用いられていたリポソームは、凍結乾燥法により調製された多重膜リポソームであり、内部に多重構造をもつため、反応容器の体積を制御することができなかった。リポソームの体積は内部の酵素反応速度に影響をあたえるため、効率よく酵素を改良するためには、多重構造をもたない一枚膜リポソームを使うことが望ましい。しかし、これまでの方法では、遠心沈降法でつくった一枚膜リポソームを反応容器として用いた場合、セルソーターでより反応したリポソームを選択しても、高い機能をもつ酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができなかった。これに対して、本発明では、一枚膜リポソームを核酸分解酵素で処理したところ、従来法において使用されていた多重膜リポソームや、酵素処理をしていない一枚膜リポソームと比較して、より高効率のスクリーニングが可能となり、高機能の酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができる。
　また、本発明の開示に従い、リポソームを構成する脂質の組成／比率、および、リポソームを調製する際のマグネシウム濃度を最適化することによって、スクリーニング／選択の感度がさらに向上する。
図１は、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３）を含むＤＮＡを用い、タンパク質発現前と発現後のリポソームに対して、標識化抗Ｍｙｃタグ抗体を添加し、セルソータにて分析した結果である。縦軸はリポソーム内部体積を、横軸はＡｌｅｘａ４８８の蛍光強度を示す。ＡおよびＢは、ＧＵＳ配列を用いた結果を示し、ＣおよびＤは、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列を用いた結果を示す。ＡおよびＣは、３７℃でのインキュベーションにてタンパク質を発現する前のリポソームの結果であり、ＢおよびＤは、３７℃で１時間インキュベーションしてタンパク質を発現したリポソームの結果である。 図２は、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１：図２Ａ）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：図２Ｂ）を含むＤＮＡを含むリポソームにおいて、タンパク質を発現させ、異なるｐＨにおいて、ＥｔＢｒの輸送活性を測定した結果である。 図３は、種々の脂質組成を用いた場合の、機能を有する膜タンパク質発現の割合を示す結果である。ヘモリシンが活性発揮した場合、ハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドを高輝度に取り込むので、縦軸は、それらの割合（％）を示す。すなわち、縦軸は、リポソームの中の膜タンパク質活性を発揮する割合を示す。左から順番に、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：１の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５：５の混合物、および、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：７の混合物を用いた結果である。なお、ＰＯＰＣは１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリンの略称であり、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。 図４の縦軸は、各種脂質を用いた場合の全リポソームの中のハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドを高輝度に取り込んだリポソームの割合（％）を示す。すなわち、図４のグラフは、チャンネルの相対活性を示すグラフである。用いた脂質は、以下のとおりである：ＥｇｇＰＣは鶏卵から精製したホスファチジルコリンの略称であり、ＰＯＰＣは１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン、ＰＳは１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォセリン、ＰＥは１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォエタノールアミン、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。ＰＣ　ｍｉｘは、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン：１－パルミトイル－２－リノレオイルホスファチジルコリン：１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルコリン：１－ステアロイル－２－リノレオイルホスファチジルコリン＝１２９：６７：４８：２４（質量比）で混ぜたものの略称であり、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＰＯＰＳ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）で混ぜたものの略称である。 図５は、進化実験の結果を示すグラフである。縦軸は、高輝度リポソームの割合（赤点の割合）を示す。サイクルを重ねるにつれて、活性の高い集団の割合が増加した。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
　（定義）
　本明細書において使用する場合、用語「微小区画」とは、脂質層、および、その内部の水層から構成される閉じられた微小な空間をいう。「微小区画」としては、例えば、リポソームが挙げられるがこれに限定されない。
　本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。本発明においては、リポソームの成分としてコレステロールを含ませることが好ましい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有してもよい。本発明において使用するリポソームは、脂質二重層からなる膜が一枚のみからなる「一枚膜リポソーム」である。一枚膜リポソームの調製法としては、種々の周知の方法が利用可能である。
　本明細書において使用する場合、用語「プロモーター配列」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。代表的なプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、Ｓｐ６プロモーター配列、および、Ｔ３プロモーター配列が挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において使用する「ＲＮＡポリメラーゼ」は、使用するプロモーター配列に適合する、すなわち、その使用するプロモーターからの転写を行なうＲＮＡポリメラーゼであれば、いかなるＲＮＡポリメラーゼを用いてもよい。好ましくは、プロモーター配列とＲＮＡポリメラーゼとが、同じ、あるいは、近接する生物種に由来する。例えば、原核生物由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、原核生物由来であることが好ましい。あるいは、バクテリオファージ由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、同一または類似のバクテリオファージ由来であることが好ましい。
　本明細書において使用する場合、用語「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。
　本明細書において使用される用語「無細胞蛋白質合成系」とは、細胞を処理することによって自律複製能を失った細胞由来の成分であって、蛋白質の合成が可能な成分をいう。無細胞蛋白質合成系としては、例えば、市販のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（バイオコゥマー株式会社　東京都文京区）を利用することも可能である。あるいは、無細胞蛋白質合成系に必要とされる成分を精製および／または組換え発現して、作製することも可能である。
　本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
　本明細書において使用される用語「膜タンパク質」とは、脂質二重膜に付着するタンパク質をいう。膜タンパク質は、膜貫通領域を含むタンパク質であっても、膜貫通領域を含まないタンパク質であってもよい。
　（膜タンパク質）
　本発明は、あらゆる膜タンパク質に適用可能である。代表的な膜タンパク質としては、例えば、トランスポーター、レセプターなどが挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、本発明の膜タンパク質をコードする配列は、タンパク質を膜に挿入するためのリーダー配列を含んでもよい。
　（トランスポーター）
　本発明の膜タンパク質は、トランスポーターであっても、そうでなくてもよい。本発明のトランスポーターとしては、細胞において物質輸送に関るタンパク質（例えば、ＥｍｒＥタンパク質）、脂質二重膜を透過しない物質を透過させるタンパク質（例えば、ヘモリシン）が挙げられるがこれらに限定されない。
　（一枚膜リポソームの製造）
　本発明において使用する一枚膜リポソームは、実施例に記載する遠心沈降法を用いて調製することができるが、調製法は、これに限定されない。例えば、遠心沈降法の他にも、静置水和法（Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｔ．Ｆ．Ｃｈｉｅｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９８３，４４，３７５－３８１）、および、エレクトロフォーメーション法（Ｍｉｇｌｅｎａ　Ｉ．Ａｎｇｅｌｏｖｅ　ａｎｄ　Ｄｉｍｉｔｅｒ　Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｆａｒａｄａｙ　Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，８１，３０３－３１１）を利用することが可能である。
　静置水和法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）脂質を溶媒に溶かしフラスコ中で自然乾燥することにより、フラスコ表面に脂質膜を形成させる工程；および、（２）水溶液を添加し、脂質膜を膨潤させる工程。この第２工程によって、脂質膜が水溶液を取り込んだリポソームが浮き上がってくる。
　エレクトロフォーメーション法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）導電性電極上に脂質溶液を塗布し、乾燥させて脂質フィルムを形成させる工程；（２）絶縁性スペーサーを介した反対側にも導電性電極を設置し、その間を水溶液で満たす工程；および、（３）二つの電極間に電界を印加することにより、脂質膜を電極から剥がして巨大薄膜リポソームを作製する工程。
　（一枚膜リポソームの製造において使用される脂質の成分／組成）
　一枚膜リポソームの製造において使用される脂質の成分／組成は、特に限定されることはないが、リン脂質およびコレステロールを含むことが好ましい。脂質としては、例えば、Ｌ－アルファ－ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｌ－アルファ－ジラウロイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファ－ジラウロイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ－アルファ－モノミリストイルホスファチジコリン、Ｌ－アルファ－ジミリストイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファ－ジミリストイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ－アルファ－ジミリストイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ－アルファ－ジミリストイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ－アルファ－ジオレイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファ－ジオレオイルホスファチジルセリンナトリウム、Ｌ－アルファ－モノパルミトイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジパルミトイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファ－ジパルミトイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ－アルファ－ジパルミトイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ－アルファ－ジパルミトイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ－アルファ－ステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｌ－アルファ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファ－ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム、Ｌ－アルファ－ジステアロイルホスファチジルグリセロールアンモニウム、Ｌ－アルファ－ジステアロイルホスファチジン酸ナトリウム、Ｌ－アルファ－ジエルコイルホスファチジルコリン、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン、ベータ－オレイル－ガンマ－パルミトイル－Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、ベータ－オレイル－ガンマ－パルミトイル－Ｌ－アルファ－ホスファチジルグリセロールナトリウム、スフィンゴミエリン、ステアリルアミンが挙げられるがこれらに限定されない。
　コレステロールの割合は、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好ましくは７０％以上である。
　（一枚膜リポソームの製造に適切なマグネシウム濃度）
　マグネシウムの濃度は、好ましくは１５ｍＭ～５０ｍＭ、より好ましくは１８．８８ｍＭ～４２．４８ｍＭ、さらにより好ましくは２８．３２ｍＭ～３７．７６ｍＭ、最も好ましくは３３．０４ｍＭである。
　（核酸分解酵素）
　本発明において使用する核酸分解酵素としては、例えば、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素が挙げられるがこれらに限定されない。使用する核酸分解酵素の供給源は、特に限定されることはない。核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１Ｕ～２０Ｕ、より好ましくは、５Ｕ～１５Ｕ、もっとも好ましくは、約１２．５Ｕである。核酸分解酵素としてＲＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１μｇ～２０μｇ、より好ましくは、５μｇ～１５μｇ、もっとも好ましくは、約１０μｇである。当業者は、使用する酵素量を容易に決定することができる。
　（使用するＤＮＡまたはＲＮＡ）
　例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＤＮＡである場合、そのＤＮＡに、タンパク質のコード配列、ならびに、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列、および、このコード配列に作動可能に連結された転写翻訳調節配列を含ませる。
　翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
　転写翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列が挙げられるがこれに限定されない。必要に応じて、エンハンサー配列、サプレッサー配列、オペレーター配列、および、転写終結部位を含んでもよい。連結される転写翻訳調節配列は、使用するＲＮＡポリメラーゼと適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡポリメラーゼを利用する場合、連結される転写翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの転写翻訳調節配列である。使用する転写翻訳調節配列とＲＮＡポリメラーゼとは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが転写翻訳調節配列からの転写を開始（あるいは、制御）できる限り、いかなる種由来であってもよい。
　例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＲＮＡである場合、そのＲＮＡに、タンパク質のコード配列、および、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列を含ませる。翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
　（本発明のリポソームの分子進化工学への応用）
　本発明のリポソームを分子進化工学に利用することができる。
　例えば、核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを、その内部のＤＮＡまたはＲＮＡがタンパク質産物を生成する条件下にインキュベートし、（１）リポソーム表面の発現したタンパク質の存在を指標として、あるいは、（２）生成された膜タンパク質の活性を測定し、この活性を指標として、高機能性の遺伝情報を含む一枚膜リポソームを選択（スクリーニング）する。利用する活性は、代表的には、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがコードするタンパク質の活性である。例えば、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがトランスポーターをコードする場合、利用する活性は、代表的には、その輸送活性である。トランスポーターの輸送活性を指標とする場合、例えば、そのトランスポーターによってリポソーム内に輸送される物質を標識し（例えば、蛍光標識）、セルソータ（ＦＡＣＳ：蛍光標示式細胞分取器）を用いて標識物質が蓄積したリポソームを選択する。例えば、リポソーム内にトランスポーターが輸送するリガンドに結合する因子を封入し、リポソーム内に輸送されたリガンドを捕獲することにより、スクリーニング／選択の感度を向上することができる。
　あるいは、膜タンパク質が有する酵素活性を指標としてもよい。
　タンパク質のリン酸化や他の他のタンパク質との結合を膜タンパク質の活性の指標として検出するためには、例えば、以下の方法を用いる：ターゲットとなるタンパク質の端をＦＲＥＴを起こすような蛍光色素でラベルする工程；リン酸化や他のタンパク質との結合によってコンフォメーションが変化し、ＦＲＥＴの程度が変化した場合、その蛍光変化を指標として選択する工程。あるいは、ＧＦＰ遺伝子を例えばＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に配置し、同時にＴ３ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡを用いることにより、よりＲＮＡ合成活性の高いＴ３ＲＮＡポリメラーゼを得ることも可能である。
　また、タンパク質のコード配列以外の配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リボソーム結合配列、翻訳開始部位などの遺伝子発現の制御に関連する配列）に変異を導入し、選択することにより、高い活性（例えば、高いプロモーター活性、エンハンサー活性、翻訳活性など）を有するように配列を進化させることができる。
　スクリーニングの結果得られた一枚膜リポソームは、その中にＤＮＡないしＲＮＡとして含まれる遺伝情報を単離するために使用される。遺伝情報がＤＮＡである場合、ＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲによって遺伝情報を増幅して、単離することができる。あるいは、ＤＮＡが、宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
　遺伝情報がＲＮＡである場合、（１）逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに変換し、その後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いてＰＣＲによってＤＮＡを増幅するか、あるいは、（２）耐熱性逆転写酵素を用いて、一段階で、ＲＮＡの遺伝情報を増幅してもよい。ＲＮＡが宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＲＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
　第１ラウンドのスクリーニング後に、必ずしも、遺伝情報を単離（純化）する必要はない。例えば、第１ラウンドのスクリーニングによって、単一クローンのＤＮＡないしＲＮＡを得るのではなく、ＤＮＡないしＲＮＡの集団を取得し、その集団を出発材料として、第２ラウンドのスクリーニングを行なってもよい。第２ラウンドのスクリーニングまたはそれ以降のラウンドのスクリーニングによって得られたＤＮＡないしＲＮＡの集団を、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
　あるいは、スクリーニング後に得られたクローン（純化されたクローン）について、変異誘発を行い、異なる複数のクローンを含む集団を作製し、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
　以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１：一枚膜リポソームの調製）
　以下に記載の遠心沈降法により、一枚膜リポソームを調製した。
・１０ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン：コレステロール＝９：１）を１００μｌクロロホルムに溶解し、２ｍｌの流動パラフィンと混合した。
・８０℃で３０分インキュベーションした。
・リポソーム外液（３３３ｍＭ　グルコース、無細胞蛋白質合成系から翻訳タンパク質群とｔＲＮＡを除いたもの）、内液（３３０ｍＭ　スクロース、１μＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ａｌｅｘａ　６４７、無細胞蛋白質合成系、４０Ｕ／μｌ　ＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．４μＭ　リボソームＳ１サブユニット、５０ｐＭ　ＤＮＡを調製した。ＤＮＡとして、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡを用いた。この条件は、各リポソームに１分子のＤＮＡが封入される条件である。使用した無細胞蛋白質合成系の組成は、以下のとおりである：
各０．３ｍＭ　アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン）、３．６μｇ／μｌ　ｔＲＮＡ、２ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　ＣＴＰ、１ｍＭ　ＵＴＰ、１４ｍＭ　酢酸マグネシウム、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ　（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　グルタミン酸カリウム、２ｍＭ　スペルミジン、２０ｍＭ　クレアチンリン酸、２ｍＭ　ジチオスレイトール、１０ｎｇ／μｌ　１０－ホルミル－５．６．７．８．－テトラヒドロ葉酸、翻訳タンパク質群（２５００ｎＭ　ＩＦ１、４１１ｎＭ　ＩＦ２、７２８ｎＭ　ＩＦ３、２４７ｎＭ　ＲＦ１、４８４ｎＭ　ＲＦ２、１６８ｎＭ　ＲＦ３、４８５ｎＭ　ＲＲＦ、７２７ｎＭ　ＡｌａＲＳ、９９ｎＭ　ＡｒｇＲＳ、４２０ｎＭ　ＡｓｎＲＳ、１２１ｎＭ　ＡｓｐＲＳ、１００ｎＭ　ＣｙｓＲＳ、１０１ｎＭ　ＧｌｎＲＳ、２３２ｎＭ　ＧｌｕＲＳ、８６ｎＭ　ＧｌｙＲＳ、８５ｎＭ　ＨｉｓＲＳ、３６５ｎＭ　ＩｌｅＲＳ、９９ｎＭ　ＬｅｕＲＳ、１１５ｎＭ　ＬｙｓＲＳ、１０９ｎＭ　ＭｅｔＲＳ、１３４ｎＭ　ＰｈｅＲＳ、１６６ｎＭ　ＰｒｏＲＳ、９９ｎＭ　ＳｅｒＲＳ、８４ｎＭ　ＴｈｒＲＳ、１０２ｎＭ　ＴｒｐＲＳ、１０１ｎＭ　ＴｙｒＲＳ、１００ｎＭ　ＶａｌＲＳ、５８８ｎＭ　ＭＴＦ、９２６ｎＭ　ＭＫ、４６５ｎＭ　ＣＫ、１３０７ｎＭ　ＮＤＫ、６２１ｎＭ　Ｐｐｉａｓｅ２、１２９０ｎＭ　ＥＦ－Ｇ、２３１５ｎＭ　ＥＦ－Ｔｕ、３３００ｎＭ　ＥＦ－Ｔｓ、５２９ｎＭ　Ｔｉｇ、２２ｎＭ　ＨｒｐＡ、１４４０ｎＭ　ＴｒｘＣ）。
・脂質を溶解した流動パラフィン４００μｌにリポソーム内液２０μｌを入れ、氷上に１分置いた。
・ボルテックスミキサーの最大強度で４０秒攪拌しエマルションを調整後、氷上で１０分置いた。
・新しいチューブにリポソーム外液１５０μｌをいれ、その上に調製したエマルションを積層し、氷上で１０分置いた。
・１４ｋ×ｇ、４℃で３０分遠心した。
・チューブの底に穴を開け、底に溜まったリポソーム懸濁液８０μｌを回収した。
・リポソーム懸濁液に２μｌの５Ｕ／μｌ　ＤＮａｓｅ、または、４ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅを添加した。
・リポソーム懸濁液を３７℃で３時間インキュベーションし、タンパク質合成を行った。・ＰＢＳ＋１％　ＢＳＡ溶液で抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８で標識した、抗Ｍｙｃタグ抗体（マウスＩｇＧ１））を希釈し終濃度５μｇ／ｍｌになるようにリポソーム懸濁液に加えた。（リポソーム溶液９μｌに５０ｇ／ｍｌの抗体を１μｌ加えた。）
・室温３０分放置後、抗体を顕微鏡観察で観察した（Ｅｘ：４７０～４９０　Ｅｍ：５１０～５５０）。
　その結果、ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列からなるポリペプチドに結合した抗体に起因するＡｌｅｘａ４８８蛍光のリポソーム膜への局在が確認された。すなわち、上記方法によって、リポソーム内で膜タンパク質をインビトロ合成し、膜タンパク質がリポソーム膜に組み込まれたことが確認された。
　次に、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡを用い、タンパク質発現前と発現後のリポソームに対して、ＰＢＳ＋１％　ＢＳＡ溶液で希釈した抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８で標識した、抗Ｍｙｃタグ抗体（マウスＩｇＧ１）終濃度５μｇ／ｍｌ）を添加し（リポソーム溶液９μｌに５０ｇ／ｍｌの抗体を１μｌ添加）、室温で３０分放置し、セルソータにて分析した。その結果を図１に示す。縦軸はリポソーム内部体積を、横軸はＡｌｅｘａ４８８の蛍光強度を示す。ＡおよびＢは、ＧＵＳ配列を用いた結果を示し、ＣおよびＤは、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列を用いた結果を示す。ＡおよびＣは、３７℃でのインキュベーションにてタンパク質を発現する前のリポソームの結果であり、ＢおよびＤは、３７℃で１時間インキュベーションしてタンパク質を発現したリポソームの結果である。図１から明らかなように、各リポソームに１分子のＤＮＡを封入する条件でリポソームを調製し、膜タンパク質を発現し、抗体で検出できることが確認された。
　（実施例２：一枚膜リポソームにて発現した膜タンパク質の機能の確認）
　リポソームに、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１：ＥｍｒＥ遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびｈｉｓタグを含む配列）を含むＤＮＡ、または、ＧＵＳ配列（配列番号３：ＧＵＳ配列およびｍｙｃ配列を含むネガティブコントロール）を含むＤＮＡそれぞれ５ｎＭ、および、ＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを内封し、３７℃２時間インキュベートしＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓとＧＵＳ－ｍｙｃを発現させた。リポソーム調製後、外液１から、ＥｔＢｒ　５μｇ／ｍｌを含む外液２に交換した。一分間ごとに蛍光を測定し、ＥｔＢｒの取り込みを観測した。その後、同じサンプルを蛍光顕微鏡で観察した（Ｅｘ：５２０～５５０　Ｅｍ：５８０～）。
　外液１の組成（すなわち、リポソーム合成時の外液）は、以下のとおりである：ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）１００ｍＭ、Ｋ－Ｇｌｕ　２００ｍＭ、スペルミジン４ｍＭ、酢酸マグネシウム２５ｍＭ、ＣＰ　４０ｍＭ、ＤＴＴ　２ｍＭ、ＦＤ　２０μｇ／ｍｌ、２０種類のアミノ酸各０．４ｍＭ、ＡＴＰ　８ｍＭ、ＧＴＰ　８ｍＭ、ＵＴＰ　４ｍＭ、ＣＴＰ　４ｍＭ。
　外液２の組成（すなわち、プロトン勾配を作るための外液）は、以下のとおりである：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０または７．６）　１００ｍＭ、Ｋ－Ｇｌｕ　２００ｍＭ、スペルミジン　４ｍＭ、酢酸マグネシウム　２５ｍＭ、ＣＰ　４０ｍＭ、ＤＴＴ　２ｍＭ、ＦＤ　２０μｇ／ｍｌ、２０種類のアミノ酸　各０．４ｍＭ、ＡＴＰ　８ｍＭ、ＧＴＰ
　８ｍＭ、ＵＴＰ　４ｍＭ、ＣＴＰ　４ｍＭ。
　その結果を図２に示す。図２Ａは、ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列（配列番号１）を含むＤＮＡを用いた結果を、図２Ｂは、ＧＵＳ配列（配列番号３）を含むＤＮＡを用いた結果を示す。ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列から膜タンパク質を発現したリポソームでは、ｐＨ依存性の蛍光強度が観察された。この結果は、リポソームにて発現した膜タンパク質が輸送能を発揮したことを実証する結果である。
　（実施例３：Ｍｇ濃度の検討）
　リポソームに、ヘモリシン配列を含むＤＮＡ５ｎＭ、ハロタグタンパク質および、ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを内封した。この際、リポソーム内液及び外液のＭｇ濃度を１８．８
８、２３．６、２８．３２、３３．０４、３７．７６、４２．２８、４７．２、５１．９２、５６．６4ｍＭの９条件でリポソーム調整を行った。リポソーム調製後、３７℃、１
６時間インキュベートし、ヘモリシンを発現させた。発現したアルファヘモリシンの機能を測定するためにリポソーム外液にハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンド1
μＭを加え、３時間後にリポソーム内部に蓄積されたハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドの蛍光量を測定した。その結果、３３．０４ｍＭのＭｇ濃度値で調製したリポソームで最も多くのハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドの蓄積がみられた。したがって、ヘモリシンの活性検出には、好ましくは１８．８８ｍＭ～２３．６ｍＭ、より好ましくは２３．６ｍＭ～２８．３２ｍＭ、最も好ましくは２８．３２～４２．４８ｍＭの条件を用いる事が良い、と判明した。
　（実施例４：脂質成分／組成の検討－１）
　実施例１で用いたＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓ配列のかわりにヘモリシンをコードする配列（配列番号５）をトランスポーターを発現するために用いた。さらに、ヘモリシンが輸送するリガンドであるハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドに結合する因子として、ハロタグタンパク質（配列番号７）を用いた。ヘモリシンは、膜にポアを作る膜タンパク質であり、３ｋＤａよりも小さい物質を透過させる。そのため、ヘモリシンが発現すると、リポソームにポアが生じ、その結果、脂質膜を透過できないハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドを透過させる。ポアを介して透過したハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドは、ハロタグタンパク質と結合し、その結果、リポソーム内に移動したハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドはリポソーム内に蓄積する。
　リポソームを形成する脂質として、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：１の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３の混合物、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５：５の混合物、および、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：７の混合物を用いた。なお、ＰＯＰＣは１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリンの略称であり、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。その結果、図３に示されるように、コレステロールの比率が高くなるにつれて、ＤＮＡを含むリポソームの中の膜タンパク質活性を発揮する割合が上昇した。
　（実施例５：脂質成分／組成の検討－２）
　次に、実施例４と同様の手法で、種々の脂質を用いてリポソームを合成し、発現した膜タンパク質の活性を比較した。結果を図４に示す。
　図４の縦軸は、各種脂質を用いた場合の全リポソームの中のハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドを高輝度に取り込んだリポソームの割合（％）を示す。用いた脂質は、以下のとおりである：ＥｇｇＰＣは鶏卵から精製したホスファチジルコリンの略称であり、ＰＯＰＣは１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン、ＰＳは１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォセリン、ＰＥは１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォエタノールアミン、Ｃｈｏｌはコレステロールの略称である。ＰＣ　ｍｉｘは、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン：１－パルミトイル－２－リノレオイルホスファチジルコリン：１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルコリン：１－ステアロイル－２－リノレオイルホスファチジルコリン＝１２９：６７：４８：２４（質量比）で混ぜたものの略称であり、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＥｇｇＰＣ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＣｍｉｘ／ＰＳ／ＰＥ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＳ／ＰＥはそれぞれを順に３：１：１（質量比）、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＰＯＰＳ／Ｃｈｏｌはそれぞれを順に２：１：１：１（質量比）で混ぜたものの略称である。
　これらの結果からホスファチジルコリンの種類を変える事や複数種類を混和する事、１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォセリン、１－パルミトイル－２－オレオイルホスフォエタノールアミンを混和する事がヘモリシンの活性発揮に有意に影響を与えない事が判明した。
　（実施例６：所望の核酸の濃縮）
　野生型ヘモリシン（配列番号５）と致死変異型ヘモリシン（配列番号８）を用い、実施例４と同様の手法を用いて、実験を行った。野生型と致死変異型との比率は、１：１２として、１０倍以上多くの致死変異型を用いた。３７℃で１６０分間培養し、膜タンパク質を発現させ、その後、セルソーターで輸送活性を示したリポソームを選択し、リポソームに含まれる野生型遺伝子と変異型遺伝子との割合を決定したところ、野生型：変異型＝８：１であった。この結果は、本発明のスクリーニング／選択によって１００倍の濃縮がされたことを実証するものである。
　例えば、所望の性質を示すリポソームを選択し、含まれるＤＮＡ（またはＲＮＡ）に変異誘導（例えば、ランダム変異）し、その変異誘導した集団を出発材料としてセルソータでの選択を行うこともできる。この手順を繰り返すことによって、所望の特性を有する変異型遺伝子を濃縮することが可能である。
　（実施例７：進化実験）
　以下の手順を用いて、進化実験を行った。
　１）遠心沈降法によりでリポソームを作成した。
脂質組成はＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝１：１　（ｗｔ／ｗｔ）を用いた。内液組成には、実施例１に記載の無細胞蛋白質合成系と同様の組成（ただし、酢酸マグネシウム濃度を３３．０４ｍＭに変更）を用いた。さらに、１００ｎＭ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ、２００ｍＭ　スクロース、５ｍＭ　β－グルクロニダーゼ結合体化ハロペプチド、１ｍＭ　トランスフェリン結合体化ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　６４７、５ｐＭ　ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター制御下にヘモリシンのＯＲＦを配置）を用いた。外液組成には、実施例１に記載の無細胞蛋白質合成系と同様の組成（ただし、酢酸マグネシウム濃度を３３．０４ｍＭに変更）の小分子のみに加え、２００ｍＭ　グルコースを含む溶液を用いた。
　２）外液交換をして外液に混入したリポソーム内液を除去した。６０００Ｇ　５分間遠心し、上清を捨てた後に沈殿を３００ｍｌの新しいリポソーム外液で再懸濁した。
　３）ヘモリシンタンパク質をリポソーム内部で合成し、脂質膜に呈示させた。３７℃で１６時間インキュベートした。
　４）ＤＮＡｓｅを加えてリポソーム外液に残るＤＮＡを分解した。４μｌのＤＮＡｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ組換えＤｎａｓｅ１）をリポソーム液に加えた。
　５）外環境に蛍光基質を加えた。リポソーム液に新たな外液を９００　ｍｌ加え、最終体積を１．２ｍｌにした。最終濃度２ｎＭになるようにし、ハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドを外液に加えた。継時的にフローサイトメータ―でリポソームの蛍光強度を測定した。
　６）蛍光基質取り込みを無蛍光の脂質二重膜透過性の拮抗阻害基質で停止した。適当な蛍光強度が得られた時に、最終濃度２００ｎＭ　ハロタグビオチンリガンドを外液に加えた。
　７）リポソーム溶液の濃縮。６０００Ｇ　５分間遠心し、上清を捨てて沈殿を新しい外液３００ｍｌで再懸濁した。
　８）セルソーター（ＢＤ，　ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　２）で高輝度リポソームを最高輝度値から１万個分取した。
　９）遺伝情報を増幅した。分取したリポソーム液は簡易型のＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を用いて精製した。その後、ＰＣＲを４０サイクル行った（ＤＮＡポリメラーゼはＴＯＹＯＢＯ　ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏを使用）。ＰＣＲは再度ＤＮＡ精製カラムを用いて精製した。その後、アガロース電気泳動により、ゲルバンドを精製した（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｅ－Ｇｅｌ　ＣｌｏｎｅＷｅｌｌ　ＳＹＢＲ　Ｓａｆｅ　Ｇｅｌを使用）。再度ＤＮＡ精製カラムを用いて精製した後、再度ＰＣＲを２０サイクル行った。ＰＣＲ産物は再度ＤＮＡ精製カラムで精製し、次のサイクルのＤＮＡストックとした。
　結果を図５に示す。図５は、蛍光強度が２６０以上である高輝度リポソームの集団の割合を示したグラフである。ハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンドがヘモリシン活性がないネガティブコントロールのリポソームに対して吸着する蛍光値が上限で２６０であることから、この数値以上の蛍光値を示したサンプルは、ヘモリシンによる特異的なハロタグＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８リガンド取り込みを示したサンプルである。
　スクリーニング／選択のサイクルを繰り返すことによって、より活性の高い遺伝子の割合が増加したことが示された。なお、ＤＮＡを単離した後に変異導入をしてもよい。
　核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを用いることによって、より高効率のスクリーニングが可能となり、所望の機能を有する膜タンパク質をコードする遺伝子を選択して回収することができる。
配列番号１：ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓのヌクレオチド配列
配列番号２：ＥｍｒＥ－ｍｙｃ－ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のＧＵＳのヌクレオチド配列
配列番号４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のＧＵＳのアミノ酸配列
配列番号５：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のヘモリシンをコードするヌクレオチド配列
配列番号６：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のヘモリシンのアミノ酸配列
配列番号７：ハロタグタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来の致死変異型ヘモリシンをコードするヌクレオチド配列
配列番号９：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来の致死変異型ヘモリシンのアミノ酸配列

Claims (17)

  1. 一枚膜リポソームであって、以下：
    （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    （ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を含む、一枚膜リポソームであって、
    　ここで、該一枚膜リポソームが、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであり、
    　該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、
    一枚膜リポソーム。
  2. 前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
    （ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。
  3. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。
  4. 複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
    （ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    （ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を含む、ライブラリーであって、
    　ここで、該一枚膜リポソームが、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであり、
    　該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、
    ライブラリー。
  5. 前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
    （ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む請求項４に記載のライブラリー。
  6. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項４に記載のライブラリー。
  7. 一枚膜リポソームであって、以下：
    （ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を含む、一枚膜リポソームであって、
    　ここで、該一枚膜リポソームが、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであり、
    　該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、
    一枚膜リポソーム。
  8. 前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
    （ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む請求項７に記載の一枚膜リポソーム。
  9. 複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該一枚膜リポソームは、以下：
    （ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
    （ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を含む、ライブラリーであって、
    　ここで、該一枚膜リポソームが、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであり、
    　該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、
    ライブラリー。
  10. 前記膜タンパク質がトランスポーターであり、前記一枚膜リポソームがさらに、
    （ｅ）前記膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を含む請求項９に記載のライブラリー。
  11. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    　（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    　（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    　（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
    　（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法であって、
    　ここで、該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、
    方法。
  12. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    　（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ；
    　（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
    　（ｃ）リボヌクレオチド；
    　（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    　（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法であって、
    　ここで、該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、
    方法。
  13. 前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    　（ａ）翻訳開始配列、および、膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；ならびに、
    　（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法であって、
    　ここで、該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、
    方法。
  15. 核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
    （１）以下：
    　（ａ）翻訳開始配列、および、トランスポーターである膜タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ；
    　（ｄ）無細胞蛋白質合成系；ならびに、
    　（ｅ）該膜タンパク質が輸送するリガンドに結合する因子、
    を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
    （２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
    を包含する、方法であって、
    　ここで、該核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、
    方法。
  16. 　一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
    （ｉ）請求項４～６のいずれか一項に記載のライブラリーを提供する工程；
    （ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
    （ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
    （ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
    を包含する方法。
  17. 　一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
    （ｉ）請求項９または１０に記載のライブラリーを提供する工程；
    （ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
    （ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
    （ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
    （ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
    を包含する方法。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012210170A (ja) * 2011-03-30 2012-11-01 Japan Science & Technology Agency 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007060995A (ja) * 2005-08-31 2007-03-15 Hitachi Ltd 新規膜機能蛋白質のスクリーニング方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012210170A (ja) * 2011-03-30 2012-11-01 Japan Science & Technology Agency 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARUKA SOGA ET AL.: "Construction of an in vitro gene screening system for membrane proteins", ABSTRACTS OF THE ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY, vol. 64, 25 September 2012 (2012-09-25), pages 197, XP008176026 *
HOVIJITRA NT ET AL.: "Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 104, no. 1, 2009, pages 40 - 49, XP055069341 *
KURUMA Y ET AL.: "Question 7: biosynthesis of phosphatidic acid in liposome compartments - toward the self-reproduction of minimal cells", ORIG. LIFE EVOL. BIOSPH., vol. 37, no. 4-5, 2007, pages 409 - 413, XP019532459 *
MIGLENA I. ANGELOVE; DIMITER S. DIMITROV: "Faraday Discuss", CHEM. SOC., vol. 81, 1986, pages 303 - 311
NISHIKAWA T ET AL.: "Construction of a gene screening system using giant unilamellar liposomes and a fluorescence-activated cell sorter", ANAL. CHEM., vol. 84, no. 11, 5 June 2012 (2012-06-05), pages 5017 - 5024, XP055181679 *
NISHIKAWA T ET AL.: "Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes", J. NUCLEIC ACIDS, vol. 2012, 2012, XP055181685 *
NOIREAUX V ET AL.: "A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly", PNAS, vol. 101, no. 51, 2004, pages 17669 - 17674, XP003003270 *
OHTSUKA T ET AL.: "Synthesis and in situ insertion of a site-specific fluorescently labeled membrane protein into cell-sized liposomes", ANAL. BIOCHEM., vol. 418, no. 1, 2011, pages 97 - 101, XP028277287 *
P. MUELLER; T. F. CHIEN, BIOPHYS. J., vol. 44, 1983, pages 375 - 381
See also references of EP2876159A4
SUNAMI, T.; SATO, K.; MATSUURA, T.; TSUKADA, K.; URABE, I.; YOMO, T, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 357, 2006, pages 128 - 136
TAKEHIRO NISHIKAWA ET AL.: "Liposome o Hannoba to suru Idenshi Screening ni yoru Kasseigata Glucuronidase no Tansaku", ABSTRACTS, ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY OF POLYMER SCIENCE, vol. 61, no. 1, 15 May 2012 (2012-05-15), pages ROMBUNNO.2G26, XP008175853 *
TAKEHIRO NISHIKAWA ET AL.: "Tanso Maku Liposome o Hannoba to suru Idenshi Screening System no Teiryoteki Hyoka", SYMPOSIUM ON MACROMOLECULES YOKOSHU, vol. 60, no. 2, 13 September 2011 (2011-09-13), pages 4773 - 4774, XP008175900 *

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