JP5465231B2 - 調節性t細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法及び予防方法 - Google Patents
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Description
制的な作用を有するということによって定義付けられる(非特許文献8)。免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例えばTh1 細胞及びTh2 細胞はお互いに夫々の免疫応答に拮抗的に働き、一方が他方に対する調節性T細胞として作用する。調節性T細胞としての細胞集団の存在の検証とその性状解析については依然多くの議論が残されている。このような調節性T細胞はin vitro又はin vivoにおいて特定の免疫応答を抑制又は調節する機能を有する細胞として研究され、細胞表面マーカーや産生サイトカインの種類や抑制および調節の機構などによって、種々の細胞集団として報告されている(非特許文献9)。
かについては不明な点が多い。
Tsutsui, J., et al., Cancer Res., 53, 1281-1285 (1993) Kadomatsu, K., et al., Brit. J. Cancer, 75, 354-359 (1997) Horiba, M., et al., J. Clin. Invest., 105, 489-495 (2000) Sato, W., et al., J. immunol., 167, 3463-3469 (2001) Takada T., et al., J.Biochem, 122(2), 453-458 (1997) Maruyama K., et al., Arthritis Rheum., 50(5), 1420-1429 (2004) Shevach, E.M. 2000. Annu. Rev. Immunol. 18:423-449. McGuirk P., et al., TRENDS in Immunol. 23, 450-455 (2002) Roncarolo, M.G., and M.K. Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12:676-683. Sakaguchi, S., et al., 1985. J. Exp. Med.161:72 Itoh, M.,et al., 1999. J. Immunol. 162:5317-5326. Jonuleit, H.et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1285-1294 Levings, M. K. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1295-1301 Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1303-1310 Taama, L. S.et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1122-1131 Stephens, L. A. et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1247-1245 Baecher-Allan, C. et al., 2001. J. Immunol. 167:1245-1253. Groux, H. et al.,1997.Nature.389:737-742 Jonuliet, H. et al., 2000. J. Exp. Med.192:1213-1222. 坂口志文、2003、実験医学21:2164−2168 Viglietta et al., 2004, J. Exp. Med. 199: 971-979 Haas, et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35: 3343-3352 Huan et al., 2005, J. Neurosci. Res. 81: 45-52 Furtado et al., 2001, Immunol. Rev. 182: 122-134 Hori et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8213-8218 Kohm et al., 2002, J. Immunol. 169: 4712-4716 Balandina et al., 2005, Blood 105, 735-741 Coombes et al., 2005, Immunol. Rev. 204: 184-194 Read et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 295-302 Alvarado-Sanchez et al., 2006, J. Autoimmunity 27, 110-118 Green et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10878-10883 Dai et al., 2004, J. Clin. Invest. 113, 310-317 Wei et al., 2004, Cancer Immunol Immunother 53: 73-78
とを発見した。また、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル(以下EAEと記載することもある)における研究において以下のような結果を得た。
さらに、EAEモデルマウスに、MK阻害剤であるMKアプタマーを投与し、その臨床症状を観察した。その結果、抗MK抗体投与と同様にEAEモデルマウスの臨床症状の軽減がみられた。(図9)。
〔1〕MK阻害剤を有効成分として含有する、調節性T細胞増殖剤。
〔2〕MK阻害剤が、抗MK抗体、MKに対するアプタマー、アンチセンスRNAおよびdsRNAから選択されるMK阻害剤である〔1〕に記載の調節性T細胞増殖剤。
〔3〕MK阻害剤が、抗MK抗体又はMKに対するアプタマーである〔1〕に記載の調節性T細胞増殖剤。
〔4〕MK阻害剤を有効成分として含有する調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔5〕MK阻害剤が、抗MK抗体、MKに対するアプタマー、アンチセンスRNAおよびdsRNAから選択されるMK阻害剤である〔4〕に記載の調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔6〕MK阻害剤が、抗MK抗体又はMKに対するアプタマーである〔4〕に記載の調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔7〕調節性T細胞の機能異常に基づく疾患が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、1型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である〔4〕から〔6〕
のいずれか1項に記載の治療剤又は予防剤。
〔8〕調節性T細胞の機能異常に基づく疾患が、多発性硬化症である〔4〕から〔6〕のいずれか1項に記載の治療剤。
〔9〕MKを阻害することによる、調節性T細胞の増殖方法。
〔10〕MK阻害剤を投与することからなる調節性T細胞の増殖方法。
〔11〕調節性T細胞増殖剤の製造のためのMK阻害剤の使用。
〔12〕MKを阻害することによる、調節性T細胞の機能異常に基く疾患の治療方法または予防方法。
〔13〕MK阻害剤を投与することからなる調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法。
〔14〕調節性T細胞の機能異常に基づく疾患治療剤または予防剤の製造のためのMK阻害剤の使用。
〔15〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、MKの発現と結合することにより、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。(a)MKに被検化合物を接触させる工程
(b)該MKと被検化合物との結合を検出する工程
(c)該MKと結合する被検化合物を選択する工程
〔16〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、MKの発現を阻害することにより、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。(a)MK遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
(b)該MKの発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該MKの発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔17〕以下の(a)〜(d)の工程を含む、MKの発現を抑制を阻害することにより調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
(a)MKをコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔18〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、MKの活性を抑制し調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
(a)MKを発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
(b)該細胞におけるMKの活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程
〔19〕MKの発現量を測定する工程を含む、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法。
〔20〕ミッドカインと結合する物質を含む、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬。
このような抗MK抗体としては、公知の文献(Sun XZ, et al., J.Neuropathol Exp Neurol. 56(12), 1339-48 (1997)、Muramatsu H, et al., J. Biochem 119:1171-76 (2004))に記載の抗体が挙げられる。
アミノ酸配列を配列番号:2に示す。
(1978) 81, 1-7)、NS−1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519)、MPC−11(Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 )、SP2/0(Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270)、FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21)、S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323)、R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133)等が適宜使用される。
種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
の合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびPCRを用いた5’−RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932)を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
。
ウィルス(BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌が知られている。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
94)24, 131-138)。
チドのものである。
アプタマーを医薬品として使用する場合、最小化および安定化する必要がある。具体的には、活性に影響しないヌクレオチドを削除することで最小化し、修飾を入れることで安定化する。天然型のRNAの血清中での半減期は数秒であるが、例えば、リボースの2’位をO−メチル化し両末端にinverted dTを結合することで、半減期が1週間以上に延びる。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
また、ヒトおよびマウスのMK遺伝子の5’上流域には、レチノイン酸受容体の結合部位が存在し、MKはレチノイン酸応答性遺伝子の産物であることから(Matsubara, S., et al., J. Biochem., 115, 1088-1096 (1994))、レチノイン酸阻害剤もMKの阻害剤として用いることが出来る。
また、ウィルムス腫瘍の抑制遺伝子として知られているWT1は、MKプロモーターによる下流の遺伝子の発現を抑えることから(Adachi, Y., et al., Oncogene, 13, 2197-2203 (1996))、WT1もMKの阻害剤として用いることが出来る。
さらに、MKはMK受容体、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどの分子と強く結合することから(Ueoka, C., et al., J. Biol. Chem. 275, 37407-37413 (2000)、これらの分子およびこれらの分子の一部もMKの阻害剤として用いることができる。
本発明において、「調節性T細胞の機能異常に基づく疾患」とは、調節性T細胞の生体内における細胞数の減少に伴う疾患または調節性T細胞の機能低下に伴う疾患を意味する。本発明の「調節性T細胞の機能異常に基づく疾患」として、好ましくは、CD4・CD25陽性調節性T細胞の機能異常に伴う疾患である。
(PBC)、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血炎症性腸炎、クローン病等を挙げることができる。好ましくは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、炎症性腸炎、1型糖尿病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症または重症筋無力症をあげることができる。本発明においては、多発性硬化症をより好ましい疾患の例として挙げることができる。
これら上記の疾患において、調節性T細胞の減少に基づくと診断されたものに関しては、本発明の「調節性T細胞増殖剤」または「調節性T細胞の機能異常に基づく疾患治療剤」は特に有効である。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
16th edition”, Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も
公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
進(神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進)、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
、上記外来性のMKを有する細胞は、例えば、MKをコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のMKが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
本態様では、次いで、MKと結合する被験化合物を選択する。選択された化合物にはMKの発現または活性を減少させる化合物が含まれ、MKの発現または活性を抑制することによって、結果的に調節性T細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
第二の態様では、次いでMKの発現レベルを測定する。MKの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT−PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
施し、MKの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。MKに対する抗体については、上記に記載したものを用いることが出来る。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、MK遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、MK遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、MK遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
MKをコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製することが可能である。
ポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、MK遺伝子の発現レベルを減少させる化合物が含まれ、MKの発現を抑制することによって、結果的に調節性T細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
第四の態様では、次いで、上記MKの活性を測定する。MKの活性としては、細胞の増殖促進(繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進)、細胞の生存促進(胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進)、細胞の移動促進(神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進)、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。具体的には、好中球、マクロファージの遊走能の測定、繊維芽細胞の増殖能により間接的にMKの活性を測定することができる。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下もしくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、MKの活性を低下させる化合物が含まれ、MKの活性を抑制することによって、結果的に調節性T細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
から20mgを1回から数回に分けて、例えば2回/週、1回/週、1回/2週、1回/4週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら2回/週あるいは1回/週から1回/2週、1回/3週、1回/4週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。MKアプタマーの場合には、血中にフリーのアプタマーが存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり1ヶ月(4週間)に0.1mgから100mg、好ましくは0.1mgから40mgを1回から数回に分けて、例えば2回/週、1回/週、1回/2週、1回/4週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。
該検査薬における「MKと結合する物質」としては、MK蛋白質、MK遺伝子領域、MKmRNAと結合する物質であれば特に限定はなく、例えば、MK遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはMKを認識する抗体を挙げることができる。このような、MK遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。
素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法(ランダムプライム法等)を例示することができる。
まず、MK欠損マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導し、その病態を観察した。
300μgのMyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55(MOG35−55)(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)(配列番号:3)を500μgの結核死菌(Mycobacterium tuberculosis)を含む不完全Feund’s adjuvantをともにエマルジョン化し、8−10週齢の野生型及びMK欠損のC57BL6マウス(日本、名古屋大学、村松教授より供与、Nakamura, E., et al., Genes Cells 3, 811-822 (1998))に接種した。さらに、感作直後及び48時間後に300ngの百日咳毒素(pertussis toxin)を200μlのPBSに溶かし、尾静脈より投与しEAEを誘導した。以後、毎日以下の基準により臨床症状を評価した(図1)。野生型マウス(n=16)、MK欠損マウス(n=13)について、毎日臨床スコアが付けられ、臨床症状の評価が行われた。図1における臨床スコア値は、0:症状なし、1:尾が垂れる、2:不安定歩行、3:後肢麻痺、4:四肢麻痺、5:死亡の病状を示し、免疫接種後25日までの全ての動物の割合が記録された。
その結果、MK欠損マウスにおいて、臨床症状の軽減が見られた(図1)。具体的には、MOG35−55の免疫接種後、MK欠損マウスにおいては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導させたMK欠損マウスに対して、MKを投与し、臨床
症状へのMKの効果を検討した。
MK欠損マウスに、1mg/mlに溶解したMKをマイクロ浸透ポンプ(Model 1002, Durect Corp. Cupertino, CA)につめて腹腔内に投与した。このマイクロ浸透ポンプにより1時間に0.25μlのMKを14日間投与し、総量として200mg/日のMKを投与した。実施例1と同様の方法により、臨床症状の評価を行った(n=13)。PBSのみをつめたマイクロ浸透ポンプを同様に腹腔内に投与したものを対照とした。
その結果、MK欠損マウスにおける臨床症状の軽減効果が、消失することが明らかとなった(図1)。
EAE発症後(感作後14日目)の、実施例1および2の各群の脊髄を取り出し、ホルマリン固定後、公知の方法でヘマトキシリン・エオジン染色をし、病理学的検索を行った。
その結果、MK欠損マウスにおいてMOG35−55の免疫接種後のCNS炎症の減少が見られた。
該自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるCD4・CD25陽性調節性T細胞の動態を検索して、MKのEAE発現やCD4・CD25陽性調節性T細胞の機能に対する役割を検討した。
野生型、MK欠損マウス、MK投与群のEAE発症後(免疫接種12−14日後)のマウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節よりリンパ球を分離し、CD4・CD8陽性細胞およびCD4・CD25陽性細胞をフローサイトメトリーにより測定した。
その結果、MOG35−55接種後の野生型マウスおよびMK欠損マウスの末梢リンパ節においては、CD4陽性T細胞の比率に大きな違いは見られなかった(図2)。一方、CD4・CD25陽性T細胞は、MK欠損マウスの末梢リンパ節において活性増加が見られた(図3)。
その結果、MK欠損マウスにMKを投与することで、CD4・CD25陽性T細胞の発現が抑えられることが明らかとなった(図4)。
態への影響の解析
次に、0、20、100ng/mlのMKの存在下、MK欠損マウスの脾臓由来のCD4陽性T細胞をMOG35−55により刺激後、実施例4と同様の方法で、CD4・CD25陽性T細胞の比率、およびFoxp3 mRNAの発現を解析した。
その結果、添加MKの濃度の増大に伴い、MK欠損マウスにおいてCD4・CD25陽性T細胞の比率および発現が低下することが明らかとなった(図5)。
EAEは1型ヘルパーT細胞(Th1)により誘導される疾患であるので、MK欠損マウスにおけるTh1/Th2バランスを検討し、MKのTh1/Th2バランスに対する効果についても検討を行った。
具体的には、EAE臨床症状のピーク時にマウスの脾細胞からCD4陽性T細胞を純化し、該細胞(ウェルあたり2×105個)を、in vitroにおいてMOG35−55(20μg/ml)およびAPC存在下で3日間培養した。培養上澄み中のIFN−γおよびIL−4を、ELISAにより解析した。
その結果、ミッドカイン欠損マウスでは、細胞性免疫を誘導する1型ヘルパーT細胞も抑制されることが明らかとなった(図6)。
マウス抗ヒトMKモノクローナル抗体の作製
(MK遺伝子ノックアウトマウスの作製)
MK遺伝子ノックアウトマウスは、公知の方法(特開2002−85058号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.)により作製した。
ヒトMKmRNAを、ウィルムス腫瘍由来の培養株細胞G−401より調整した(Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797, 1991)。プライマーとして、制限酵素EcoRIに認識される配列(5’-GAATTC-3’)を含むように設計した、センスPCRプライマー:5’-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3’(配列番号:4)、及び、アンチセンスPCRプライマー:5’-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3’(配列番号:5)を用い、ヒトMKmRNAを鋳型として、93℃→37℃→72℃の温度変化を1サイクルとする30サイクルのPCR(Polymerase Chain Reaction)を行い、MKコーディング領域の両端にEcoRI認識部位をもつヒトMKcDNAを調製した。
MKcDNA及び酵母ピキア・パトリスGS115(Pichia pastoris GS115、以下、「ピキア酵母GS115」という)用発現ベクターpHIL301(ヒスチジン及びネオマイシン耐性遺伝子含有、特開平2−104292号、欧州特許公開0339568号公報参照)を、制限酵素EcoRIで消化した後、ライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて結合させ、組み換え発現ベクターを作製した。
エレクトロポレーション法を用いて、上記で調製した組み換え発現ベクターをピキア酵母GS115(インビトロゲン社)へ導入した。ベクターを導入したピキア酵母GS115を、ヒスチジンを含まない、G418含有培地で培養することにより、目的のMK遺伝子を持つ複数のクローンを得た。得られたクローンを、メタノールで誘導しながら培養を行った。培養上清を採取し、ウサギ抗マウスMKポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を行うことにより、当該クローンがMKを分泌するかどうか確認した。
誘導により、培養上清中にMKを分泌するクローンの1つをT3L−50−4Pと名付け、このクローンを培養した(特開平7−39889号公報参照)。培養上清からMKの分泌産物を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、高純度MKを得た。
抗原をMKノックアウトマウスに免疫した。抗原の調整はマウス1匹あたり10μgを生理食塩水で0.1mlに希釈したものを抗原溶液とし、FCA0.1mlと混合し乳化させマウスの背皮に皮下投与した。2週間毎に8回免疫操作をした。8回目の免疫は抗原溶液のまま10μgを生理食塩水0.1mlに溶解し、マウス尾静脈に静脈注射した。
4回免疫後6日目と、6回免疫後8日目に、マウスの眼底から採取した血清を用いて、血中抗体価をELISA法にて調べた。
ELISA法は、以下の方法により行った。まず、抗原溶液をPBS(pH7.2〜7.4)で、1.0μg/mlの濃度に調製し、50μl/wellで96wellアッセイプレート(FALCON社製、353912)に分注して4℃で一晩静置して抗原を固相化させた。0.05%Tween-PBSで3回洗浄後、ブロックエース(大日本製薬製)4倍希釈を100μl/wellで加え、37℃で2時間静置してブロッキングを行った。0.05%Tween-PBSで3回洗浄後、培養上澄原液を50μl/well加え、37℃で1時間静置した。0.05%Tween-PBSで3回洗浄後、2次抗体として、ブロックエースで10倍に希釈したヤギ抗マウスIgG+IgM HRP標識(Goat anti-Mouse IgG+IgM HRP conjugate)(BIOSOUCE社製、AMI3704)10000倍希釈を50μl/well加え、37℃で1時間静置した。0.05%Tween-PBSで3回洗浄後、HRP基質(基質液(クエン酸一水和物 10.206mg/ml、リン酸水素二ナトリウム12水 36.82mg/ml in distilled H2O)25ml、OPD 10mg、30%H2O2 5μl)を50μl/wellで加え、室温、遮光した状態で20分間静置した。1N硫酸50μl/wellを加えて反応を停止させ、492nmの波長で測定した。
6回免疫後8日目に行なったELISA法で十分な抗体価があったので追加で2回免疫した3日後に細胞融合を行なった。
マウスを捕定し胸部をアルコール綿で拭き、2.5mlのシリンジと23Gの針を用いて心臓採血を行った。採血した後、マウスを消毒用アルコール20mlの入ったビーカーに3分間程度入れた。採血した血液は1.5mlチューブに入れ37℃で1時間放置した後、4℃で一晩放置し、3,000rpmで10分間遠心分離した。血清を他の1.5mlチューブに移し0.05%アジ化ナトリウムを加え4℃で保存した。
採血したマウスの上皮をはさみとピンセット用いて剥がした。さらに、内皮を持ち上げ切込みをいれて脾臓を取り出した。あらかじめシャーレ5枚に分注しておいた200mlのRPMI1640 S.P培地で順に5回洗浄した。洗浄後、脾臓をメッシュに乗せハサミで数回切込みを入れ、ガラス棒ですり潰し、RPMI1640 S.P培地で網を洗い、40mlのガラス遠沈管に脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞は1200rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸い上げ、RPMI1640 S.P培地を40ml入れ1200rpmで10分間遠心分離した。得られた秘蔵細胞にRPMI1640 S.P培地を40ml加えよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
シャーレに入っているミエロ―マ細胞(P3U1)を、ピペットを用いて数回吹きつけ、50mlの遠沈管に集めた。1000rpmで5分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで除きRPMI1640 S.P培地を40ml加え、1000rpmで5分間遠心分離した。得られたミエローマ細胞にRPMI1640 S.P培地を40ml加えてよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
上述の細胞数の計測の結果を基に、脾臓細胞5に対してミエローマ細胞1となるよう、脾臓細胞が入っていた50mlのガラス遠沈管にミエローマ細胞を入れた。混合した後、1200rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引ピッペットで吸い取りタッピングをした。タッピング後、PEG(ポリエチレングリコール)1mlを、1分間かけて混合しながらゆっくり添加し、そのまま、2分間混合する。PEGの混合後、あらかじめウォーターバスに入れ37℃に加温しておいたRPMI1640 S.P培地1mlを、1分間かけて混合しながらゆっくり添加した。これを3回繰り返した。その後、37℃に加温しておいたRPMI16
40 S.P培地10mlを、3分間かけて混合しながらゆっくり添加した。培地添加後、37℃、5%CO2インキュベーターで5分間加温した後、1,000rpmで5分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸いタッピングをした。
タッピング後、(細胞を播種するプレートの枚数)×10mlのRPMI1640 S.P 15%FCS HAT培地を吹き付け、8連のマイクロピッペット(各100μl)と専用の受け皿を使い、イエローチップを用いて96wellプレートに細胞を播種した。37℃、5%CO2インキュベーターで7日〜14日培養し、コロニーの成長具合を見てELISAで抗体作成能をスクリーニングした。
細胞融合から10日後、96well培養プレートの上清を使用しELISA法にて優位に吸光度の高い12wellをクローニング用サンプルとした。ハイブリドーマの細胞数を数え、96well培養プレートの3列に5 cells/well、3列に1 cell/well、2列に0.5 cells/wellとなるようにハイブリドーマ細胞を播種した。また、各wellにフィダー細胞を1×106cells/wellとなるように播種した。クローニング後5日目にコロニーカウントを行い、コロニーが1個であるwellを確認し、2〜3日毎に培地を交換し、コロニーがwellの1/3をしめてきたところでELISA法を用いてコロニーが1個で陽性反応を示すwellを選択し、コロニー1個でELISAにおいて陽性であり、かつ細胞の状態が良好なwellから得られた細胞を樹立株(IP−13)とした。
次に、上述の方法で得られた抗MK抗体(IP−13)が、MKのCD4・CD25陽性T細胞増殖抑制活性を阻害するかどうか、実施例4と同様な方法を用いて調べた。EAE臨床症状がピークとなった野生型マウスの脾臓からCD4陽性T細胞を分離し、IP−13(30μg/mL)、MOG35−55(30μg/ml)およびAPC存在下で培養した。培養5日後にCD4陽性T細胞中のCD4・CD25陽性T細胞の割合をフローサイトメーターを用いて測定した。コントロールとしてIP−13抗体の代わりにIgGを用いた実験も平行しておこなった。
その結果、コントロール実験でCD4・CD25陽性T細胞の存在割合が2%であったのに対し、IP−13を加えた実験ではCD4・CD25陽性T細胞の存在割合が4%と上昇していることがわかった。以上より、抗MK抗体を用いることで、MKのCD4・CD25陽性細胞増殖抑制活性を阻害することができることが示された(図7)。
実施例1の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導したEAE臨床症状の野生型マウスに対して、抗MK抗体を投与し、その臨床症状を観察した。
まず、野生型EAEモデルマウス(C57BL−6,♀、8週令)に対して、MOG35−55投与後0日目,3日目,7日目,10日目,14日目,17日目,21日目,24日目(合計8回)に、抗MK抗体(IP14)の投与を行った。マウスを4つの群に分け(一群の匹数:5)、マウス重さ(kg)あたり、それぞれ75mg/kg、7.5mg/kg、0.75mg/kg、0mg/kg(コントロール)の量の抗MK抗体を尾静脈投与した。次に、6段階の臨床スコア(0:症状なし、1:尾が垂れる、2:仰向けにして起き上がれない、3:不安定歩行、4:軽度の後肢麻痺、5:重度の後肢麻痺、6:死亡)で毎日臨床スコアを付け、臨床症状の評価を行った。
その結果、抗MK抗体を投与したマウス群において、臨床症状の軽減が見られた(図8)。具体的には、MOG35−55の免疫接種後、抗MK抗体を投与したマウス群においては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
実施例1の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した野生型マウスにMKアプタマーを投与し、EAE発症抑制効果を観察した。
MKに特異的に結合するアプタマーはSELEX法を用いて作製した。得られたアプタマーのうち、1つを、化学合成できる長さまで短くした。また、化学修飾を加えることでヌクレアーゼ耐性を向上させたアプタマーAを得た。
アプタマーAがヒトMKの細胞遊走活性を阻害するか、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるUMR106細胞(ATCC No. CRL1661)を用いて調べた。ケモタキセル(膜孔径8μm、クラボウ社製)の膜外面に1.5μMのMKを30μL塗布し、膜外面にMKを固定化した。アプタマー500nMを含む500μLの培地(0.3%ウシ血清アルブミン添加、Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)を添加した24穴カルチャープレートに、MKを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはUMR106細胞を1×106cells/mLの濃度で200μL入れ、37℃で4時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、MK塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを1%クリスタルバイオレット水溶液に30分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、200μLの1%SDSと1%tritonX100の混合液で色素を抽出した。抽出液の150μLを96穴マイクロプレートに移し、590nmの吸光度を測定した。測定の結果、アプタマーAは強い細胞遊走阻害活性を有していることがわかった。アプタマーを添加しない場合に移動した細胞の数を100とした場合、アプタマーAを添加したときに移動した細胞の数は約2.3であり、98%の阻害活性が確認された。一方、コントロールとして用いたRNAは阻害活性を示さなかった。
アプタマーAがCD4・CD25陽性調節性T細胞の増殖に関与するかどうか調べた。実験は実施例7と同様におこなった。MOG処理後4週目のEAE臨床症状を示したC57BL/6マウスの脾臓よりCD4陽性T細胞を分離し、該細胞(ウェルあたり2×105個)を、in vitroにおいてMOG35−55(20μg/ml)およびAPC存在下でアプタマーAを添加し、3日間培養した。FACSによりCD4・CD25陽性T細胞の発現を解析した。さらに細胞内Foxp3を抗マウスFoxp3染色セット(eBioscience社)を用いCD4陽性細胞を同時染色しフローサイトメトリーにより検出した。実験の結果、コントロールとしてPBSを添加した系ではCD4・CD25陽性調節性T細胞の存在割合が6.2%であったのに対して、アプタマーAを125nM添加した系ではCD4・CD25陽性調節性T細胞の存在割合は11%であり、アプタマーを加えることでCD4・CD25陽性調節性T細胞の割合が増加することが確認された。また、調節性T細胞の発生や分化に関係しているFoxp3の発現を調べたところ、コントロールとしてPBSを添加した系ではCD4陽性細胞のうち25%の細胞で発現が確認されたのに対し、アプタマーAを125nM添加した系では33%と増加していた。以上より、アプタマーAを加えることでCD4・CD25陽性調節性T細胞が増加することが示された。
アプタマーAを用いてEAEモデルマウスの発症抑制実験をおこなった。8週令のマウス(C57Bl/6、♀)にMOGを処理したEAEモデルマウスを用い、MOG処理日より、2日に1回の間隔で計10回、それぞれ15mg/kg,2.5mg/kg,0.25mg/kg、0mg/kg(コントロール)のアプタマーを腹腔内投与した。一群当たりの匹数は5〜6匹とした。観察は毎日行い、次に示す臨床スコアをもとに各個体の臨床症状をスコア化した。0:症状なし、1:尾が垂れる、2:仰向けにして起き上がれない、3:不安定歩行、4:軽度の後肢麻痺、5:重度の後肢麻痺、6:死亡。実験の結果、15mg/kg投与群においてコントロール群に比較しMOG処理後15、16、17、18日目においてp値が1%以下を示し統計学的な有意差が認められた(図9)。統計学的処理はDunnett検定を用いた。病態発症の遅延効果が、15mg/kgおよび2.5mg/kg投与群で認められた。
以上より、MK阻害剤であるMKに特異的に結合するアプタマーは、CD4・CD25陽性調節性T細胞の減少に関連する疾患である多発性硬化症の治療薬として利用可能であることが示された。
Claims (2)
- ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有するCD4 + CD25 + 調節性T細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤であって、該疾患が多発性硬化症である、剤。
- ミッドカインに対するアプタマーによりミッドカインを阻害することによる、CD4 + CD25 + 調節性T細胞の増殖方法(但し、該アプタマーをヒトに投与することによりミッドカインを阻害することを除く)。
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