WO2016104490A1 - 新規な敗血症治療剤及び／又はそのスクリーニング方法 - Google Patents

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sepsis
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岸本　忠三
和哉 増田
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岸本　忠三
中外製薬株式会社
和哉 増田
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Definitions

  • the present invention relates to a novel therapeutic agent for sepsis and / or a screening method thereof.
  • Sepsis is a disease characterized by a systemic inflammatory response syndrome caused by a pathogen. Sepsis manifests symptoms such as fever, tachypnea, tachycardia, leukocytosis, etc. If progressed, consciousness, circulatory insufficiency such as decreased blood pressure, and organ dysfunction such as renal, lung, liver, and coagulation dysfunction . If severe, acute respiratory distress syndrome (ARDS), disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), etc. may occur, leading to cardiac arrest and death due to septic shock. As sepsis progresses, the prognosis worsens and the mortality rate increases, so it is necessary to conduct early diagnosis and treatment at the earliest possible stage.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • Septic shock is a severe sepsis that involves organ hypoperfusion and hypotension that are largely unresponsive to early fluid composition, most of which is caused by nosocomial gram-negative or gram-positive cocci. Septic shock often occurs in immunocompromised patients, patients with chronic and debilitating diseases, with an average mortality rate of about 40%.
  • antibiotics for the purpose of suppressing the production of lipopolysaccharide (LPS) and nonsteroidal anti-inflammatory drugs for suppressing inflammatory reactions are performed.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Sepsis is understood to occur as a result of complex interactions between infection-causing bacteria and the patient's immunity, inflammation and coagulation system. Organ failure resulting from sepsis is believed to cause host organ damage by amplifying the patient's response to infection-causing bacteria. Therefore, it has been investigated as a therapeutic agent for sepsis by antagonists to TNF- ⁇ , IL-6, etc., which are inflammatory cytokines that are greatly involved in the inflammatory response of patients. (For example, see Non-Patent Documents 1 and 2). There is a need for the development of a more effective treatment method for sepsis and septic shock for which a reliable therapeutic agent has not yet been developed despite the high mortality rate.
  • AT rich interactive domain 5A (AT Rich Interactive Domain 5A, hereinafter abbreviated as Arid5A) has been reported as a stabilized protein of IL-6 mRNA (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a more effective therapeutic agent for sepsis and / or septic shock, and a screening method thereof.
  • the present invention includes the following.
  • a therapeutic agent for sepsis and / or septic shock comprising an Arid5A inhibitor as an active ingredient.
  • Arid5A inhibitor is one or more substances selected from the group consisting of a nucleic acid oligo and an Arid5A antibody.
  • the nucleic acid oligo is an oligo composed of natural and non-natural RNA or DNA.
  • a screening method for candidate substances useful for treatment of sepsis and / or septic shock comprising: (A) a step of evaluating the influence of the test substance on the expression and / or function of Arid5A, and (b) a process of selecting a substance that decreases the expression and / or function of Arid5A compared to the case where the test substance is not used.
  • a method comprising: [5] A screening method for a candidate substance useful for the treatment of sepsis and / or septic shock according to [4], wherein the method comprises: (A) a step of evaluating the effect of the test substance on the expression of Arid5A, and (b) a process of selecting a substance that decreases the expression of Arid5A as compared with the case where the test substance is not used.
  • a method comprising: [6] A screening method for a candidate substance useful for the treatment of sepsis and / or septic shock according to [4], the method comprising: (A) a step of administering a test substance to an experimental animal; (B) measuring the effect on the expression of Arid5A by PCR, and (c) selecting a substance that decreases Arid5A compared to the case where the test substance is not administered to an experimental animal,
  • a method comprising: [7] A screening method for a candidate substance useful for the treatment of sepsis and / or septic shock according to [4], wherein the method comprises: (A) evaluating the influence of the test substance on the function of Arid5A, and (b) selecting a substance that reduces the function of Arid5A compared to the case where the test substance is not used.
  • a method comprising: [8] The method for screening a candidate substance useful for the treatment of sepsis and / or septic shock according to [7], wherein the function of Arid5A is stabilization of IL-6 mRNA. [9] A method for treating sepsis and / or septic shock, comprising administering an Arid5A inhibitor. [10] An Arid5A inhibitor for use in the treatment of sepsis and / or septic shock. [11] Use of an Arid5A inhibitor for the manufacture of a therapeutic agent for sepsis and / or septic shock.
  • the therapeutic agent for sepsis and / or septic shock according to the present invention has a high therapeutic effect on sepsis and / or septic shock.
  • the present invention can provide a screening method for a therapeutic agent exhibiting a high therapeutic effect.
  • Arid5A-deficient mice (A) Upper: wild-type Arid5A allele, middle: targeting vector, lower: expected mutant allele. The major part of the DNA binding domain is replaced with Neo-cassette with both ends sandwiched by loxp sequences. (B) Genotype analysis by Southern blotting analysis; wild type (+ / +), heterozygous type (+/-). It is a graph which shows the 7-day survival rate by a septic shock model. It is the graph which quantified the mRNA level of Arid5A in a macrophage cell line by qPCR. It is the graph which identified the density
  • 2 is a graph in which the concentration of TNF- ⁇ in the culture supernatant of a macrophage cell line is specified by an ELISA method. It is the graph which showed the expression of mRNA of Arid5A in a peritoneal macrophage. It is the graph which showed the expression of mRNA of IL-6 in a peritoneal macrophage. 2 is a graph showing the expression of TNF- ⁇ mRNA in peritoneal macrophages.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for sepsis and / or septic shock, and a screening method thereof.
  • the therapeutic agent for sepsis and / or septic shock of the present invention comprises an Arid5A inhibitor as an active ingredient.
  • Arid5A in the present invention refers to AT rich interactive domain 5A (AT Rich Interactive Domain 5A, hereinafter abbreviated as “Arid5A”), and is reported as a stabilizing protein of IL-6 mRNA.
  • human Arid5A includes various isoforms (NCBI accession numbers NP997646.1, XP0067122666.1, XP0067122655.1, XP005263918.1, XP005263913.1, XP0052639.17.1, etc.).
  • various isoforms are also included for mouse Arid5A (NCBI accession numbers NP00165676.1, NP00165677.1, NP0012775655.1, NP0012777656.1, NP666108.2, etc.).
  • the “Arid5A inhibitor” refers to a substance that inhibits the expression of Arid5A and / or a substance that inhibits the function of Arid5A.
  • the Arid5A inhibitor may be a substance that directly inhibits Arid5A expression itself, or may be a substance that binds to a molecule affected by Arid5A (such as IL-6 mRNA) and indirectly inhibits the biological function of Arid5A.
  • a substance that inhibits stabilization of IL-6 mRNA by binding to IL-6 mRNA competitively with Arid5A can be mentioned.
  • human IL-6 mRNA includes various isoforms (NCBI accession numbers NM000000600.3, XM005249745.2, etc.).
  • mouse IL-6 mRNA includes various isoforms (NCBI accession number NM031168.1, etc.).
  • Examples of the Arid5A inhibitor in the present invention include, but are not particularly limited to, low molecular weight substances such as anti-Arid5A antibodies, nucleic acid oligos, and chlorpromazine.
  • Preferable examples of the Arid5A inhibitor of the present invention include at least one selected from the group consisting of a nucleic acid oligo and an Arid5A antibody, more preferably a nucleic acid oligo, and still more preferably siRNA.
  • RNA interference is a method (Genes and Development, 16, 948-958 (2002)) reported as a method for suppressing gene expression using RNA, and has a double or double sequence having the same or similar sequence as the target gene.
  • strand RNA is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene is both reduced.
  • the expression of the Arid5A gene can be inhibited using siRNA or antisense nucleic acid that exhibits an RNA interference effect on the expression of the Arid5A gene.
  • nucleic acid oligo in the present invention is an oligo composed of natural and non-natural RNA or DNA, and means an oligomer of nucleic acid that controls the function of the Arid5A gene or protein.
  • the nucleic acid oligo in the present invention includes siRNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, and nucleic acid aptamer.
  • the nucleic acid oligo in the present invention includes siRNA or shRNA, and more preferably siRNA.
  • siRNA means a double-stranded RNA consisting of short strands that are not toxic to cells, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs. It can be.
  • ShRNA is RNA in which single-stranded RNA constitutes a double strand through a hairpin structure.
  • SiRNA and shRNA need not be completely identical to the target gene, but have at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence homology.
  • the portion of double-stranded RNA in which the RNAs in siRNA and shRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (base corresponding to one strand) Etc.) may include an unpaired portion.
  • both bulges and mismatches may be contained in the double-stranded RNA region where the RNAs in the dsRNA pair with each other.
  • the “antisense nucleic acid” in the present invention is an antisense nucleic acid complementary to a transcription product of DNA encoding Arid5A. There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene.
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of Arid5A mRNA is designed, it is considered effective for inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 'untranslated region can also be used.
  • a translation region of a gene but also a sequence complementary to an untranslated region can be used.
  • the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of an untranslated region is included in the antisense nucleic acid used in the present invention.
  • the antisense nucleic acid preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcription product of the target gene.
  • the length of the antisense RNA that effectively inhibits the expression of the target gene using the antisense sequence is not particularly limited.
  • the “decoy nucleic acid” in the present invention is a nucleic acid oligo having homology with the IL-6 mRNA sequence recognized by Arid5A. Instead of IL-6 mRNA sequence, it binds to Arid5A and inhibits the function of Arid5A.
  • the “nucleic acid aptamer” in the present invention is a nucleic acid encoding a stem loop region present in IL-6 3′UTR or a similar nucleic acid.
  • the “anti-Arid5A antibody” in the present invention can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using known means.
  • the origin of the antibody used in the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal, more preferably a human-derived antibody.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. This antibody inhibits the functional expression of Arid5A by binding to Arid5A.
  • Antibody-producing hybridomas can basically be prepared as follows using known techniques. That is, using Arid5A as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and monoclonal antibodies are obtained by a normal screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • the anti-Arid5A antibody can be prepared as follows.
  • human Arid5A used as an antigen for obtaining an antibody can be obtained by using the Arid5A gene / amino acid sequence disclosed in known literature.
  • Arid5A The gene sequence of Arid5A is inserted into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, and then the desired Arid5A protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method. What is necessary is just to use Arid5A protein as a sensitizing antigen.
  • An Arid5A protein prepared by chemical synthesis may also be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc. and suspended, and if necessary, an appropriate amount of an ordinary adjuvant such as Freund's complete adjuvant is mixed and emulsified. It is preferred to administer several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Spleen cells are particularly preferred as preferable immune cells to be subjected to cell fusion.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells to be fused with the immune cells are already known in various cell lines such as P3X63Ag8.653 (J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979)). Used as appropriate.
  • the cell fusion of the immunocytes and myeloma cells can be basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)).
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion accelerator, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution and heated to about 37 ° C. in advance, for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually 30
  • the target fused cell is formed by adding and mixing at a concentration of ⁇ 60% (w / v). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma can be removed by adding an appropriate culture solution successively and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture solution such as a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. Then, a normal limiting dilution method is performed to screen and clone hybridomas that produce the target antibody.
  • a normal selective culture solution such as a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. Then, a normal limiting dilution method is performed to screen and clone hybridomas that produce the target antibody.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are human myeloma cells such as U266.
  • a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or antigen-expressing cells can be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • antigens or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above (see International Patent Application Publication No. WO93 / 12227, etc.).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a normal method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, A method of obtaining ascites is employed.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique can be used.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique.
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from a cell producing the target antibody, for example, a hybridoma. Isolation of mRNA may be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • the antibody V region cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • the synthesis of cDNA can be performed using AMV Reverse Transscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.) are used for cDNA synthesis and amplification. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. (1989) 17, 2919-2932).
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the desired antibody V region is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing xenoantigenicity to humans such as a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, etc.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody or a humanized antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, is transplanted to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP125023, International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. It is obtained by ligating the obtained DNA with DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Patent Application Publication No. WO92). -19759).
  • the FR of the human antibody to be linked via CDR one that forms a favorable antigen binding site in the complementarity determining region is selected. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer). Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • Examples of the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody, and the humanized antibody is a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a framework region and a C region derived from a human antibody Since the antigenicity in the human body is reduced, it is useful as an antibody used in the present invention.
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (svFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • svFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector of the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • it can be expressed by a commonly used useful promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA in which a poly A signal is operably linked to the 3 'downstream side thereof, or a vector containing the same.
  • a promoter / enhancer a human cytomegalovirus early promoter / enhancer (human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer) can be mentioned.
  • viral promoters / enhancers such as retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ).
  • a promoter enhancer derived from mammalian cells such as the above may be used.
  • Escherichia coli it can be expressed by functionally combining a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), when using the araB promoter, the method of Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043) may be used.
  • the pe1B signal sequence As a signal sequence for antibody secretion, the pe1B signal sequence (Lei, SP et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. . After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO 96/30394).
  • the origin of replication those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can be used. Further, for the purpose of gene copy number amplification in the host cell system, the expression vector is used as a selection marker.
  • An aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero, etc. (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known and may be cultured in callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus aspergillus.
  • yeasts such as Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus aspergillus.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640, and IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • the antibody may be produced in vivo by transferring the cell into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity of the animal.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat ⁇ -casein and adjusted as a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat obtained from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used in the transgenic goat as appropriate (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12 699-702).
  • silkworms When silkworms are used, silkworms are infected with baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted, and desired antibodies are obtained from body fluids of these silkworms (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). ). Further, when tobacco is used, the target antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. This bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and a desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). .
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector and simultaneously transformed into the host.
  • the host may be transformed by incorporating DNAs encoding H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO94-11523).
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the inside and outside of the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F., and the like. F etc. are mentioned.
  • the antibodies used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like other than the affinity chromatography.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatography methods can be applied to HPLC (high performance liquid chromatography). Moreover, you may use reverse phase HPLC (reverse phase HPLC).
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance, ELISA, or the like. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS ( ⁇ ), the absorbance at 280 nm is measured, and 1 mg / ml is calculated as 1.350D.
  • the measurement can be performed as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (manufactured by TAG) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc) and incubated at 4 ° C. overnight. Is immobilized. After blocking, 100 ⁇ l of appropriately diluted antibody used in the present invention or a sample containing the antibody, or human IgG (manufactured by CAPPEL) as a standard is added, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the antibody of the present invention includes not only a bivalent antibody typified by IgG but also a monovalent antibody or a multivalent antibody typified by IgM as long as it binds to Arid5A.
  • the multivalent antibodies of the present invention include multivalent antibodies that all have the same antigen-binding site, or multivalent antibodies that have some or all different antigen-binding sites.
  • the antibody of the present invention may be a bispecific antibody as long as it binds to Arid5A.
  • Bispecific antibody refers to an antibody having variable regions that recognize different epitopes in the same antibody molecule, but the epitope may exist in different molecules or in the same molecule. It may be. That is, in the present invention, the bispecific antibody can also have an antigen-binding site that recognizes a different epitope of Arid5A. It is also possible to use a bispecific antibody in which one recognition site recognizes Arid5A and the other recognition site recognizes an antigen other than Arid5A.
  • bispecific antibodies can be produced by combining two types of antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody to be bound may be a half molecule of an antibody each having an H chain and an L chain, or may be a quarter molecule of an antibody consisting of only an H chain.
  • bispecific antibody-producing fused cells can be prepared by fusing hybridomas that produce different monoclonal antibodies.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody of the present invention may be a low molecular weight antibody as long as it binds to Arid5A.
  • the low molecular weight antibody includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (a whole antibody, such as a whole IgG) is deleted. As long as it binds to Arid5A, partial deletion of the antibody molecule is tolerated.
  • the antibody fragment in the present invention preferably contains either or both of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequence of VH or VL can include additions, deletions and / or substitutions. Furthermore, as long as it binds to Arid5A, either or both of VH and VL can be deleted.
  • the antibody fragment may be chimerized or humanized.
  • Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv and the like.
  • Specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single-chain Fv), diabody (Diabody), sc (Fv) 2 (single- chain (Fv) 2).
  • Multimers eg, dimers, trimers, tetramers, polymers
  • Antibody fragments can be generated by digesting antibodies with enzymes.
  • enzymes that produce antibody fragments include, for example, papain, pepsin, and plasmin.
  • DNA encoding these antibody fragments can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co MS et al., J. Immunol. (1994) 152). , 2968-2976, Better M. & Horwitz A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Puckthun A. & Skerra A., Methods in Enzymology, (1989) 15L4, 1989-157 , Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663, Rousseaux J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669, ird R.E. & Walker B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9,132-137).
  • a digestive enzyme cleaves an antibody at a specific position to give an antibody fragment having a specific structure as follows.
  • any part of the antibody can be deleted: Papain digestion: Fab; Pepsin digest: F (ab ′) 2 or F (ab ′); Plasmin digestion: Facb.
  • ScFv is obtained by linking antibody VH and VL.
  • VH and VL are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • VH and VL in scFv may be derived from any of the antibodies described herein as antibodies.
  • any single chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • V regions can be linked by, for example, the PCR method as described above.
  • DNA sequence encoding antibody H chain or H chain V region and all or desired partial amino acid sequence of DNA sequence encoding antibody L chain or L chain V region The encoding DNA is used as a template.
  • DNAs encoding the V regions of the H chain and the L chain are each amplified by PCR using primers having sequences corresponding to the sequences at both ends of the DNA to be amplified.
  • DNA encoding a peptide linker moiety is prepared.
  • DNA encoding a peptide linker can also be synthesized using PCR.
  • the assembly PCR primer is a primer set capable of amplifying DNA encoding the full-length sequence of scFv to be synthesized.
  • a base sequence that can be linked to each V region DNA is added to [peptide linker DNA].
  • these DNAs are ligated, and the full length of scFv is finally generated as an amplification product by the primer for assembly PCR.
  • an expression vector containing them and a recombinant cell transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Further, the scFv can be obtained by culturing the resulting recombinant cells and expressing the DNA encoding the scFv.
  • Diabodies refer to bivalent low molecular weight antibodies constructed by gene fusion (Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 6444-6448, EP 404097, WO 93 / 11161). Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains. Usually, in the polypeptide chain constituting the dimer, VL and VH are connected to each other by a linker in the same chain.
  • the polypeptide chain linker in the diabody is generally short enough that VL and VH in the same chain cannot bind to each other.
  • the amino acid residues constituting the linker are preferably 2 to 12 residues, more preferably 3 to 10 residues, and particularly about 5 residues. Therefore, VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form scFv, but dimerize so as to form two Fvs between different polypeptide chains. As a result, the diabody has two antigen binding sites.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two VHs and two VLs are linked to form a single chain by a linker (Hudson PJ & Kortt AA, J. Immunol. Methods ( 1999) 231, 177-189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by linking two scFvs with a linker.
  • two VH and two VL with a linker starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide, [VH]-[Linker]-[VL]-[Linker]-[VH]-[Linker]-[VL] It can also be produced by tying in the order of.
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above arrangement, and may be arranged in any order. For example, the following arrangements can also be mentioned.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker (for example, a linker disclosed in Protein Engineering (1996) 9, 299-305) or the like may be used. it can.
  • a peptide linker is preferred.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • the amino acid residue constituting the peptide linker is 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • the amino acid sequence constituting the peptide linker can be any sequence as long as it does not inhibit the scFv binding action.
  • the V regions can be linked using a synthetic chemical linker (chemical crosslinking agent).
  • a crosslinking agent usually used for crosslinking such as peptide compounds can be used in the present invention.
  • a crosslinking agent usually used for crosslinking such as peptide compounds can be used in the present invention.
  • the Arid5A inhibitor used in the present invention has the general formula: Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Chlorpromazine also inhibits IL-6 mRNA expression through inhibition of Arid5A expression, specifically inhibiting IL-6 mRNA stabilization.
  • a septic and / or septic shock therapeutic or preventive agent may be added with pharmaceutically acceptable materials such as preservatives and stabilizers.
  • “Pharmaceutically acceptable” may be a material that itself has a therapeutic effect on sepsis and / or septic shock, or may be a material that does not have the therapeutic effect. It means a pharmaceutically acceptable material that can be administered together. Moreover, it is a material which does not have a therapeutic effect, Comprising: The material which has a synergistic effect or an additive stabilization effect by using together with an Arid5A inhibitor may be sufficient.
  • Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water, physiological saline, preservatives, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like. Can do.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomylate.
  • nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomylate.
  • Typical examples include those having HLB 6-18 such as glycerin fatty acid ester such as glycerin monostearate.
  • surfactant examples include anionic surfactants such as alkyl sulfates having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, and sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group of 10 to 18 carbon atoms such as sodium lauryl sulfate; Carbon atoms of the alkyl group such as sodium lauryl sulfosuccinate Typical examples include alkylsulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 numbers; natural surfactants such as lecithin, glycerophospholipid; fingophospholipids such as sphingomyelin; and sucrose fatty acid esters of fatty acids having 12 to 18 carbon atoms. Can be mentioned.
  • anionic surfactants such as alkyl sulfates having an
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pluronic F-68 (registered trademark) is also preferable.
  • buffering agent phosphoric acid, citric acid buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, gluconic acid, caprylic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine, fumaric acid Other organic acids, etc., or carbonate buffer, Tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the drug in the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin
  • saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, glucose, fructose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • the drug in the present invention is an aqueous solution for injection
  • isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • a suitable solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • the drug in the present invention is encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanocapsules). Particles and nanocapsules, etc. (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed., 1980, etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; US Pat. No.
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is selected appropriately or in combination from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the Arid5A inhibitor of the present invention when used as a medicine for humans or other animals, in addition to directly administering these substances to a patient, it can also be formulated and administered by a known pharmaceutical method. It is. In the case of formulation, the above-described formulation-acceptable materials may be added.
  • All drugs in the present invention can be administered in the form of pharmaceuticals, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc.
  • the effective dose is selected in the range of 0.001 mg to 100 mg per kg of body weight per time.
  • a dose of 0.1 to 1000 mg, preferably 0.1 to 50 mg per patient can be selected.
  • an effective dose is an effective dose such that an amount of free antibody is present in the blood.
  • the administration schedule is 2 times / week or once / week to once / 2 weeks, once / 3 weeks, once / 4 weeks, etc. while observing the state after administration and observing the trend of blood test values It is also possible to adjust such as extending the administration interval.
  • the present invention relates to a method for screening candidate substances useful for the treatment or prevention of sepsis and / or septic shock by suppressing the expression and / or function of Arid5A.
  • the screening method is: (A) a step of evaluating the influence of the test substance on the expression and / or function of Arid5A, and (b) a process of selecting a substance that decreases the expression and / or function of Arid5A compared to the case where the test substance is not used. , And comprising.
  • the screening method of the present invention first comprises evaluating the influence of the test substance on the expression and / or function of Arid5A.
  • the function of Arid5A is to stabilize IL-6 mRNA by, for example, binding specifically to the stem loop of IL-6 mRNA and competitively inhibiting the action of Regnase-1 that specifically destroys IL-6 mRNA.
  • the effects on the expression and / or function of Arid5A include, for example, suppressing the expression of Arid5A, inhibiting the function of Arid5A by binding to Arid5A, and binding to IL-6 mRNA competitively with Arid5A Examples include, but are not limited to, inhibiting the function of Arid5A.
  • the process of selecting the substance which reduces the expression and / or function of this Arid5A compared with the case where a test substance is not used is included.
  • Arid5A is contacted with a test substance.
  • Arid5A used in the method of the present invention includes proteins functionally equivalent to the above-mentioned known Arid5A.
  • proteins include, but are not limited to, Arid5A mutants, alleles, variants, homologs, Arid5A partial peptides, or fusion proteins with other proteins.
  • the variant of Arid5A in the present invention is a naturally occurring protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence described above, and the amino acid described above
  • a protein functionally equivalent to a protein consisting of a sequence can be mentioned.
  • a protein encoded by a naturally derived DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the aforementioned base sequence, and a protein functionally equivalent to a protein comprising the aforementioned amino acid sequence It can be mentioned as a variant of Arid5A.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G).
  • “functionally equivalent” means that the target protein has a biological function or biochemical function equivalent to Arid5A.
  • Arid5A specifically binds to the stem loop of IL-6 mRNA and contributes to stabilization of IL-6 mRNA by antagonistically inhibiting the action of Regnase-1 that specifically destroys IL-6 mRNA.
  • the biological function and biochemical function of Arid5A include stabilization of IL-6 mRNA.
  • DNA encoding a “functionally equivalent protein” of the target protein methods well known to those skilled in the art include methods using hybridization technology or polymerase chain reaction (PCR) technology. It is done. That is, for those skilled in the art, DNA having high homology with Arid5A is usually isolated using the base sequence of Arid5A or a part thereof as a probe, and an oligonucleotide that specifically hybridizes to Arid5A as a primer. That is. Thus, DNA encoding a protein having a function equivalent to Arid5A that can be isolated by hybridization technology or PCR technology is also included in the DNA of the present invention.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions refer to hybridization of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC or equivalent stringency. Isolation of DNA with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 ⁇ SSC.
  • the isolated DNA is considered to have high homology with the amino acid sequence of the target protein at the amino acid level. High homology means a sequence of at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) in the entire amino acid sequence.
  • the biological species from which Arid5A used in the method of the present invention is derived is not limited to a specific biological species.
  • human, monkey, mouse, rat, guinea pig, pig, cow, yeast, insect and the like can be mentioned.
  • the state of Arid5A used in the first embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a purified state, a state expressed in a cell, a state expressed in a cell extract, or the like.
  • the purification of Arid5A can be performed by a known method.
  • Examples of cells expressing Arid5A include cells expressing endogenous Arid5A and cells expressing exogenous Arid5A.
  • Examples of the cells expressing the endogenous Arid5A include, but are not limited to, cells derived from animal tissues and cultured cells.
  • the cultured cells are not particularly limited, and for example, commercially available cells can be used.
  • the biological species from which cells expressing endogenous Arid5A are derived is not particularly limited and includes humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, cows, yeasts, insects and the like.
  • the exogenous Arid5A-expressing cell can be prepared, for example, by introducing a vector containing DNA encoding Arid5A into the cell. Introduction of the vector into the cells can be performed by a general method such as calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation, lipofectamine method, microinjection method and the like.
  • the exogenous Arid5A-containing cells can be prepared, for example, by inserting DNA encoding Arid5A into a chromosome by a gene transfer method using homologous recombination.
  • the biological species from which the cells into which such exogenous Arid5A is introduced are not limited to mammals, and may be any biological species for which a technique for expressing foreign proteins in the cells has been established.
  • examples of the cell extract in which Arid5A is expressed include, for example, those obtained by adding a vector containing DNA encoding Arid5A to a cell extract contained in an in vitro transcription / translation system.
  • the in vitro transcription / translation system is not particularly limited, and a commercially available in vitro transcription / translation kit can be used.
  • test substance in the present invention is not particularly limited.
  • a single substance such as a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a nucleic acid, a protein, a peptide, and a compound library, a nucleic acid library, and a peptide library
  • gene library expression products include gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts or animal cell extracts, etc. Can do.
  • the test substance can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label. Further, in addition to the test substance, a mixture obtained by mixing a plurality of these test substances is also included.
  • “contact” is performed according to the state of Arid 5A.
  • Arid5A if Arid5A is in a purified state, it can be carried out by adding a test substance to the purified preparation.
  • the test substance if it is expressed in a cell or in a cell extract, the test substance is added to the cell culture solution or cell extract, or the test substance is administered directly to the experimental animal, respectively. This can be done.
  • the test substance is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell expressing Arid5A, or the vector is added to a cell extract expressing Arid5A. It is also possible to do this.
  • a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the influence of the test substance on the expression and / or function of the test substance is then evaluated by measuring the expression and / or function of Arid5A.
  • the function of Arid5A can include stabilization of IL-6 mRNA.
  • the function of Arid5A can be indirectly measured by coexisting Arid5A and a test substance and measuring the degradation inhibitory effect of IL-6 mRNA. Then, a test substance that reduces the expression and / or function of Arid5A is selected as compared with the case where the test substance is not contacted.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription-chainase chain reaction
  • real-time PCR-based techniques hybridization-based techniques, and / or other detection techniques. Etc. can be appropriately selected.
  • PCR in the present application includes a method for measuring various DNAs, RNAs, and the like by a technique based on PCR and amplification derived therefrom.
  • Arid5A is a protein that contributes to the stabilization of IL-6 mRNA
  • IL-6 mRNA expression is suppressed, but TNF- ⁇ mRNA expression is suppressed. Is known to have no effect. Therefore, by confirming that the test substance affects the expression of IL-6 mRNA but does not affect the expression of TNF- ⁇ mRNA, a substance that affects the expression of Arid5A, ie, As a result, it is possible to screen a substance having an effect of treating or preventing sepsis and / or septic shock.
  • the selected test substance includes a substance that decreases the expression and / or function of Arid5A, and thereby suppresses the expression and / or function of Arid5A, thereby treating or preventing sepsis and / or septic shock. It is thought that it shows the effect to do.
  • the test substance is first brought into contact with Arid5A, and then the binding between Arid5A and the test substance is detected to evaluate the influence of the test substance on the expression and / or function of Arid5A.
  • the binding between Arid5A and the test substance can be detected by, for example, a label attached to the test substance bound to Arid5A (for example, a label capable of quantitative measurement such as a radiolabel or a fluorescent label).
  • a labeling agent can also be bound to Arid5A. Binding can also be detected by immobilizing a test substance or Arid5A on a resin or chip.
  • a change in the function of Arid5A caused by the binding of the test substance to Arid5A can also be detected as an index.
  • a test substance that binds to Arid5A is then selected.
  • the selected substance includes a substance that decreases the expression or function of Arid5A as compared to the case where the test substance is not contacted.
  • the test substance is first brought into contact with cells expressing Arid5A, and then the expression level of Arid5A is measured to evaluate the influence of the test substance on the expression of Arid5A.
  • the expression level of Arid5A can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the transcription level of the gene can be measured by extracting mRNA of the gene according to a standard method and performing Northern hybridization or RT-PCR using the mRNA as a template.
  • the expression level of the gene can be measured using DNA array technology.
  • a fraction containing Arid5A encoded by the gene can be collected according to a standard method, and the expression level of the Arid5A can be detected by electrophoresis such as SDS-PAGE to measure the translation level of the gene.
  • electrophoresis such as SDS-PAGE
  • the antibody against Arid5A those described above can be used.
  • a test substance having a reduced expression level of Arid5A is then selected as compared with the case where the test substance is not contacted.
  • the selected substance includes a substance that decreases the expression of Arid5A, and suppressing the expression of Arid5A is considered to exhibit an effect of treating or preventing sepsis and / or septic shock as a result.
  • Arid5A is a protein that contributes to the stabilization of IL-6 mRNA, when Arid5A expression is inhibited in the cell, IL-6 mRNA expression is suppressed, but TNF- ⁇ mRNA is suppressed. It is known that expression is not affected.
  • test substance affects the expression of IL-6 mRNA but does not affect the expression of TNF- ⁇ mRNA
  • a substance that affects the expression of Arid5A ie
  • a cell or a cell extract having DNA having a reporter gene operably linked downstream of the promoter region of DNA encoding Arid5A is first provided.
  • “functionally linked” means that the transcriptional factor binds to the promoter region of the Arid5A gene so that expression of the reporter gene is induced, and the promoter region of the Arid5A gene and the reporter gene Is connected. Therefore, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the expression of the fusion protein is caused by the transcription factor binding to the promoter region of the Arid5A gene. If it is derived, it is included in the meaning of the above “functionally coupled”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected.
  • a CAT gene, a lacZ gene, a luciferase gene, a ⁇ -glucuronidase gene (GUS) and a GFP that are commonly used by those skilled in the art.
  • a gene etc. can be mentioned.
  • the reporter gene also includes DNA encoding Arid5A.
  • a cell or cell extract having a DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of the promoter region of DNA encoding Arid5A can be prepared by the method described above.
  • test substance is then brought into contact with the cells or the cell extract. Subsequently, the influence of the test substance on the expression of Arid5A is evaluated by measuring the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting acetylation of chloramphenicol by the gene product. When the reporter gene is a lacZ gene, the color of the dye compound is detected by the catalytic action of the gene expression product. When the reporter gene is a luciferase gene, the fluorescence of the fluorescent compound by the catalytic action of the gene product is detected.
  • the expression level of the gene can be measured by the method described above.
  • a test substance that decreases or increases the expression level of the reporter gene is then selected as compared with the case where the test substance is not contacted.
  • the selected substance includes a substance that decreases the expression of Arid5A, and suppressing the expression of Arid5A is considered to have an effect of treating or preventing sepsis and / or septic shock as a result.
  • the test substance is first brought into contact with IL-6 mRNA, and then the binding of IL-6 mRNA to the test substance is detected to evaluate the influence of the test substance on the expression and / or function of Arid5A.
  • the binding between IL-6 mRNA and the test substance can be detected by, for example, a label attached to the test substance bound to IL-6 mRNA (for example, a label capable of quantitative measurement such as a radiolabel or a fluorescent label).
  • a labeling agent can also be bound to IL-6 mRNA. Binding can also be detected by immobilizing a test substance or IL-6 mRNA on a resin or chip.
  • Changes in the activity of IL-6 mRNA caused by binding of a test substance to IL-6 mRNA can also be detected as an indicator.
  • a test substance that binds to IL-6 mRNA is then selected.
  • the selected substance includes a substance that decreases the expression and / or function of Arid5A. By suppressing the expression or function of Arid5A, the substance exhibits an effect of treating or preventing sepsis and / or septic shock as a result. It is considered a thing.
  • the test substance is first contacted with IL-6 mRNA, then Arid5A is further contacted, and then the function of Arid5A is measured to evaluate the effect on the function of Arid5A.
  • the function of Arid5A can be measured as described above.
  • a test substance having a reduced function as compared with the case where the test substance is not contacted is selected.
  • the selected test substance includes a substance that decreases the function of Arid5A, and suppressing the function of Arid5A is considered to exhibit an effect of treating or preventing sepsis and / or septic shock as a result.
  • the test substance is first administered to an experimental animal, and further, the influence on the expression of Arid5A is measured by PCR, and then the expression of Arid5A is reduced as compared with the case where the test substance is not administered to the experimental animal.
  • Administration to experimental animals and measurement by PCR are as described above.
  • Example 1 Generation of Arid5A knockout mouse (FIG. 1) C57BL / 6 wild type mice (6-8 weeks) were obtained from CLEA, and Arid5A knockout mice (No. CDB0602K: www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html ) were obtained from www.cdb. It was prepared by the method of riken.jp/arg/Methods.html .
  • Example 2 Septic shock in Arid5A knockout mice Escherichia coli sera were obtained from type 0127: B8 against 8-9 week old Arid5A knockout mice (Arid5A-/-) and wild type mice (body weight 18-20 g, respectively). The obtained LPS (Sigma-Aldrich) was administered intraperitoneally and the mortality was observed for 7 days.
  • an anti-IL-6 receptor antibody MR16-1 antibody, 250 mg / kg
  • an anti-IFN ⁇ antibody R4-6A2 BioLegend, 25 mg / kg
  • mice administered with wild type, IL-6 receptor antibody, and TNF antibody died, whereas Arid5A knockout mice did not develop septic shock.
  • Arid5A siRNA (SASI_Mm02_00341523 (sigma)) or control siRNA (100 nM) was introduced into the mouse macrophage cell line RAW264.7 by electroporation. After culturing for 24 hours, the cells were stimulated with LPS (100 ng / mL) for 24 hours, and RNA was extracted from the obtained cells. The mRNA level of Arid5A was quantified by qPCR (FIG. 3). In addition, the concentrations of IL-6 and TNF- ⁇ in each culture supernatant were quantified by ELISA (FIGS. 4 and 5). As shown in FIG.
  • Example 4 Screening method of candidate substances useful for treatment of sepsis and / or septic shock C57BL / 6 mice (6 to 8 weeks old) peritoneal macrophages in the presence or absence of a test substance (20 ⁇ M) Stimulated with LPS (1 ⁇ g / mL).
  • the relative expression levels of Arid5A, IL-6 and TNF- ⁇ mRNA in the stimulated peritoneal macrophages were measured by quantitative PCR (qPCR).
  • qPCR quantitative PCR
  • For Arid5A mRNA the expression level was measured 2 hours after LPS stimulation, and for IL-6 mRNA and TNF- ⁇ mRNA 2 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours after LPS stimulation.
  • the results of using chlorpromazine (CPZ) as a test substance are shown in FIGS.
  • CPZ is a substance that inhibits the expression of Arid5A mRNA itself.
  • CPZ is a substance that also inhibits the expression of IL-6 mRNA affected by Arid5A, and has no effect on TNF- ⁇ mRNA that is known not to be affected by Arid5A. It was a substance. This suggests that CPZ is a substance that specifically inhibits IL-6 mRNA stabilization and is effective in the treatment of sepsis and / or septic shock involving inflammatory cytokines such as IL-6. It was done.
  • Arid5A intracellular Arid5A mRNA
  • a substance that inhibits the action of Arid5A can be efficiently screened by screening a substance that inhibits the expression of mRNA but does not affect the mRNA of TNF- ⁇ .
  • a substance effective for the treatment of sepsis and / or septic shock can be efficiently screened.
  • a pharmaceutical composition having a high therapeutic effect on sepsis and septic shock is provided by the therapeutic agent for sepsis and / or septic shock of the present invention.
  • the present invention can provide a screening method for a therapeutic agent exhibiting a high therapeutic effect.

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Abstract

　本発明は、敗血症及び／または敗血症性ショックの治療剤ならびにそのスクリーニング方法を提供する。　本発明は、Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分として含有する敗血症及び／または敗血症性ショックの治療剤に関する。本発明はまた、敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、 （ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能に対する影響を評価する工程、及び （ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能を減少させる物質を選択する工程、 とを含んでなる方法に関する。

Description

新規な敗血症治療剤及び／又はそのスクリーニング方法
　本発明は、新規な敗血症治療剤及び／又はそのスクリーニング方法に関する。
　敗血症は、病原体によって引き起こされた全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）によって特徴付けられる疾患である。敗血症は、発熱、頻呼吸、頻脈、白血球増加等の症状を現し、進行すれば意識障害、血圧低下などの循環不全、さらに、腎・肺・肝・凝固機能異常などの臓器機能障害をきたす。そして重篤に至れば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）や播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）などを併発し、敗血症性ショックによる心停止・死亡に至る。敗血症は、段階が進むにつれて予後が悪くなり、死亡率が高くなるので、可能な限り初期の段階で早期診断・早期治療を行なう必要がある。
　敗血症性ショックは重症の敗血症で、初期の輸液組成にほとんど反応しない臓器低灌流と低血圧を伴うものであり、その大部分は院内感染によるグラム陰性桿菌またはグラム陽性球菌によって引き起こされる。敗血症性ショックは免疫不全状態の患者、慢性および消耗性疾患患者でしばしばおこり、その死亡率の平均は約４０%である。
　敗血症の治療としては、一般的には輸液蘇生法や、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の産生を抑制する目的の抗生物質や炎症性反応を抑える非ステロイド抗炎症薬の投与が行なわれている。
　敗血症は、感染原因菌と患者の免疫、炎症並びに凝固系の間の複雑な相互作用の結果として発生するものと理解されている。敗血症で生じる臓器不全は、患者の感染原因菌に対する反応が増幅しすぎることにより、宿主の臓器損傷を引き起こすと考えられている。そのため、患者の炎症反応に大きくかかわる炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－６などに対する拮抗物質による敗血症の治療剤としての可能性が検討されているが、有効な治療法の開発にはいたっていない（例えば、非特許文献１～２参照）。このように高い死亡率を示すにもかかわらず、未だ確実な治療剤が開発されていない敗血症及び敗血症性ショックに対する、より有効な治療方法の開発が求められている。
　ＡＴリッチインターラクティブドメイン５Ａ（ＡＴ　Ｒｉｃｈ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　Ｄｏｍａｉｎ　５Ａ、以下Ａｒｉｄ５Ａと略す）はＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化タンパク質として報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｇｕｌ　Ｉｎｔｅｇｒ　Ｃｏｍｐ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　２８９，Ｒ１０４８－Ｒ１０５３（２００５） Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｒａｃｔ，６８，４，５２０－５２８（２０１４） ＰＮＡＳ，１１０，２３，９４０４－９４１４（２０１３）
　しかしながら、Ａｒｉｄ５Ａと敗血症性ショックとの関係は知られていなかった。
　本発明は、より有効な敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明は、具体的には以下を含む。
〔１〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分とする、敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤である。
〔２〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤が、核酸オリゴ、及びＡｒｉｄ５Ａ抗体からなる群より選ばれる１種以上の物質である、〔１〕記載の敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤である。
〔３〕核酸オリゴが、天然及び非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴである、〔２〕記載の敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤である。
〔４〕敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能に対する影響を評価する工程、及び
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔５〕〔４〕に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を評価する工程、及び
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔６〕〔４〕に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質を、実験動物に投与する工程、
（ｂ）該Ａｒｉｄ５Ａの発現に対する影響についてＰＣＲにて測定する工程、及び
（ｃ）被験物質を実験動物に投与しない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａを減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔７〕〔４〕に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの機能に対する影響を評価する工程、及び
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの機能を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔８〕〔７〕に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該Ａｒｉｄ５Ａの機能がＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化である方法である。
〔９〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を投与することを含んでなる、敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療方法である。
〔１０〕敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に使用するためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤である。
〔１１〕敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療剤の製造のためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤の使用である。
　本発明の敗血症および／または敗血症性ショック治療剤により、敗血症及び／または敗血症性ショックの高い治療効果が奏される。また、本発明により高い治療効果を示す治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
Ａｒｉｄ５Ａ欠損マウスの作製：(Ａ)上：野生型Ａｒｉｄ５Ａアレル、中：ターゲッティングベクター、下：予想変異アレル。ＤＮＡ結合ドメインの主要部分は、両端をloxp配列で挟んだＮｅｏ－ｃａｓｓｅｔｔｅで置換されている。（Ｂ）サザンブロッティング解析による遺伝子型解析；野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/-)。 敗血症性ショックモデルによる７日生存率を示すグラフである。 マクロファージ細胞株におけるＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって定量したグラフである。 マクロファージ細胞株の培養上清中のＩＬ－６の濃度をＥＬＩＳＡ法により特定したグラフである。 マクロファージ細胞株の培養上清中のＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡ法により特定したグラフである。 腹腔マクロファージにおけるＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現を示したグラフである。 腹腔マクロファージにおけるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現を示したグラフである。 腹腔マクロファージにおけるＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現を示したグラフである。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明は、敗血症および／又は敗血症性ショック治療剤、並びにそのスクリーニング方法に関する。本発明の敗血症および／又は敗血症性ショック治療剤は、Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分とする。
　本発明における「Ａｒｉｄ５Ａ」とは、ＡＴリッチインターラクティブドメイン５Ａ（ＡＴ　Ｒｉｃｈ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　Ｄｏｍａｉｎ　５Ａ、以下Ａｒｉｄ５Ａと略す）のことであり、ＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化タンパク質として報告されている。例えばヒトＡｒｉｄ５Ａとしては、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ９９７６４６．１、ＸＰ００６７１２２６６．１、ＸＰ００６７１２２６５．１、ＸＰ００５２６３９１８．１、ＸＰ００５２６３９１３．１、ＸＰ００５２６３９１７．１など）。また、マウスＡｒｉｄ５Ａについても同様に、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ００１６５６７６．１、ＮＰ００１６５６７７．１、ＮＰ００１２７７６５５．１、ＮＰ００１２７７６５６．１、ＮＰ６６６１０８．２など）。
　本発明における「Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤」とは、Ａｒｉｄ５Ａの発現を阻害する物質及び／またはＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害する物質のことをいう。Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤は、Ａｒｉｄ５Ａの発現自体を直接阻害する物質でもよいし、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受ける分子（ＩＬ－６ｍＲＮＡ等）に結合してＡｒｉｄ５Ａの生物学的機能を間接的に阻害する物質でもよいが、好ましくは、Ａｒｉｄ５Ａと競合的にＩＬ－６ｍＲＮＡと結合することによりＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化を阻害する物質が挙げられる。例えばヒトＩＬ－６ｍＲＮＡとしては、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００６００．３、ＸＭ００５２４９７４５．２など）。また、マウスＩＬ－６ｍＲＮＡについても同様に、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０３１１６８．１など）。
　本発明におけるＡｒｉｄ５Ａ阻害剤としては、例えば、抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体、核酸オリゴ、クロルプロマジンなどの低分子物質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＡｒｉｄ５Ａ阻害剤の好ましい例として、核酸オリゴ、及びＡｒｉｄ５Ａ抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、より好ましくは、核酸オリゴが挙げられ、さらに好ましくは、ｓｉＲＮＡが挙げられる。
　Ａｒｉｄ５Ａの発現阻害は、例えばＡｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果を利用することによって実現可能である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡを利用して遺伝子の発現を抑制する方法として報告された方法（Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１６，　９４８－９５８（２００２））であり、標的遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在遺伝子の発現がいずれも抑制される減少である。具体的には、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸を使用して、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現阻害が可能である。
　本発明における「核酸オリゴ」は、天然及び非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴであり、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子もしくはタンパク質の機能を制御する核酸のオリゴマーを意味する。本発明における核酸オリゴとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、核酸アプタマーが含まれる。
　本発明における核酸オリゴとして好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを挙げることができ、より好ましくは、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。ｓｉＲＮＡは、細胞で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば１５～４９塩基対と、好適には１５～３５塩基対と、さらに好適には２１～３０塩基対とすることが出来る。また、ｓｈＲＮＡは、一本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して二重鎖を構成しているＲＮＡである。
　ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
　ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においてはｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
　また、本発明における「アンチセンス核酸」は、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、ＲＮＡ二重鎖認識によるＲＮａｓｅ活性による分解、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらの中でも、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
　本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域に相補的な配列も使用しうる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。アンチセンス核酸は標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡの長さは、特に制限されない。
　本発明における「デコイ核酸」はＡｒｉｄ５Ａが認識するＩＬ－６のｍＲＮＡ配列と相同性がある核酸オリゴである。ＩＬ－６のｍＲＮＡ配列の代わりにＡｒｉｄ５Ａに結合し、Ａｒｉｄ５Ａの機能を阻害する。本発明における「核酸アプタマー」は、ＩＬ－６　３’ＵＴＲに存在するステムループ領域をコードする核酸あるいはそれに類する核酸のことである。
　本発明における「抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体」は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＡｒｉｄ５Ａと結合することにより、Ａｒｉｄ５Ａの機能発現を阻害する。
　抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、Ａｒｉｄ５Ａを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング方法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の抗原として使用されるヒトＡｒｉｄ５Ａは公知の文献に開示されたＡｒｉｄ５Ａ遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　Ａｒｉｄ５Ａの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＡｒｉｄ５Ａタンパク質を公知の方法で精製し、この精製Ａｒｉｄ５Ａタンパク質を感作抗原として用いればよい。また、化学合成によって作製したＡｒｉｄ５Ａタンパク質も感作抗原として用いても良い。また、Ａｒｉｄ５Ａタンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を感作抗原として用いてもよい。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
　感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行なわれる。具体的には。感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバンド、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
　このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８－１５５０（１９７９））等が適宜使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３－４６（１９８１））等に準じて行なうことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加熱したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００～６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
　当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行なわれる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原タンパク質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７等を参照）。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得する方法としては、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ　Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ　Ｌａｒｒｉｃｋ　Ｊ．Ｗ．　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，　１９９０参照）。
　具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４－５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６－１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することが出来る。
　得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等を用いて行なうことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’‐Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’－ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ。Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８－９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．（１９８９）１７，　２９１９－２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
　目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
　本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト（Ｈｕｍａｎ）抗体等を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２－１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２－１９７５９参照）。
　具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２－１９７５９参照）。
　ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１－８５６）。
　キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
　キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
　また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｖＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列の適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８等の各号を参考にすることができる。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
　また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）等の哺乳類細胞由来のプロモーターエンハンサーを用いればよい。
　例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８－１１４）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることが出来る。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４－５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．（１９９２）６，２４２２－２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１－１０４３）に従えばよい。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９－４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
　複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ）、Ｈｅｌａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両性類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
　これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔内へ移すことにより、ｉｎ　ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
　一方、ｉｎ　ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
　哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ　Ｇｌａｓｅｒｍ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調整する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから得られるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９－７０２）。
　また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２－５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．－Ｃ．Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１－１３８）。
　上記のようにｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４－１１５２３参照）。
　前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行なうことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
　例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーにとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用しうる。また、逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ＨＰＬＣ）を用いてもよい。
　上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行なうことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（－）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５０Ｄとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
　洗浄後、５０００倍アルカリフォスフォターゼ標識ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏ　Ｓｏｕｒｃｅ製）１００μｌ加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ　ＲＥＡＤＥＲ　Ｍｏｄｅｌ　３５５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
　本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　本発明の抗体には、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、ＩｇＧに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはＩｇＭに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
　さらに、本発明の抗体は、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はＡｒｉｄ５Ａの異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することもできる。また、一方の認識部位がＡｒｉｄ５Ａを認識し、他方の認識部位がＡｒｉｄ５Ａ以外の抗原を認識する二重特異性抗体とすることも可能である。
　二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがＨ鎖とＬ鎖を有する抗体の１／２分子であっても良いし、Ｈ鎖のみからなる抗体の１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
　本発明の抗体は、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、低分子化抗体であってもよい。低分子化抗体は、全長抗体（ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、付加、欠失および／または置換を含むことができる。さらにＡｒｉｄ５Ａに結合する限り、ＶＨおよびＶＬのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。また、抗体断片はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ　（Ｆｖ）２）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の抗体に含まれる。
　抗体断片は、抗体を酵素で消化して生成させることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Ｃｏ　Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８－２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ　Ｍ．＆　Ｈｏｒｗｉｔｚ　Ａ．Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６－４９６、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ　Ａ．＆　Ｓｋｅｒｒａ　Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７－５１５、Ｌａｍｏｙｉ　Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２－６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ　Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３－６６９、Ｂｉｒｄ　Ｒ．Ｅ．＆　Ｗａｌｋｅｒ　Ｂ．Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２－１３７）。
　消化酵素は、抗体を特定の位置で切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。一方、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる：
パパイン消化：Ｆａｂ；
ペプシン消化：Ｆ（ａｂ'）２またはＦ（ａｂ'）；
プラスミン消化：Ｆａｃｂ。
　ｓｃＦｖは、抗体のＶＨとＶＬとを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ　Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬは、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。
　Ｖ領域は、たとえば上記のようなＰＣＲ法によって連結することができる。ＰＣＲ法によるＶ領域の連結のために、抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列、および抗体のＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡが鋳型として利用される。増幅すべきＤＮＡの両端の配列に対応する配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ法によって、Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡを用意する。ペプチドリンカーをコードするＤＮＡもＰＣＲを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの５'側に、別に合成された各Ｖ領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［ＶＨ　ＤＮＡ］、［ペプチドリンカーＤＮＡ］、［ＶＬ　ＤＮＡ］の各ＤＮＡと、アセンブリーＰＣＲ用のプライマーを利用してＰＣＲ反応を行う。アセンブリーＰＣＲ用のプライマーは、［ＶＨ　ＤＮＡ］の５'側にアニールするプライマーと、［ＶＬ　ＤＮＡ］の３'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーＰＣＲ用プライマーとは、合成すべきｓｃＦｖの全長配列をコードするＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーＤＮＡ］には各Ｖ領域ＤＮＡと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのＤＮＡが連結され、さらにアセンブリーＰＣＲ用のプライマーによって、最終的にｓｃＦｖの全長が増幅産物として生成される。一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを発現させることにより、該ｓｃＦｖが取得できる。
　ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の低分子化抗体を指す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ　Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，６４４４－６４４８、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ９３／１１１６１）。ダイアボディーは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でＶＬおよびＶＨがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおける当該ポリペプチド鎖のリンカーは、一般に、同一鎖中のＶＬとＶＨが互いに結合できない程度に十分短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、２～１２残基が好ましく、さらに３～１０残基が好ましく、特には５残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、ｓｃＦｖを形成できず、別のポリペプチド鎖間で２つのＦｖを形成するように二量体化する。その結果、ダイアボディーは２つの抗原結合部位を有することとなる。
　ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカーで結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ Ｐ．Ｊ．＆　Ｋｏｒｔｔ　Ａ．Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１，１７７－１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。あるいは、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカーで、
［ＶＨ］－［リンカー］－［ＶＬ］－［リンカー］－［ＶＨ］－［リンカー］－［ＶＬ］
の順に結ぶことによっても作製できる。なお２つのＶＨと２つのＶＬの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］－［リンカー］－［VH］－［リンカー］－［VH］－［リンカー］－［VL］
［VH］－［リンカー］－［VL］－［リンカー］－［VL］－［リンカー］－［VH］
［VH］－［リンカー］－［VH］－［リンカー］－［VL］－［リンカー］－［VL］
［VL］－［リンカー］－［VL］－［リンカー］－［VH］－［リンカー］－［VH］
［VL］－［リンカー］－［VH］－［リンカー］－［VL］－［リンカー］－［VH］
　複数のリンカーは、同じ種類のリンカーであってもよいし、異なる種類のリンカーであってもよい。
　抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９，２９９－３０５に開示されるリンカー）等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、１から１００アミノ酸、好ましくは３から５０アミノ酸、更に好ましくは５から３０アミノ酸、特に好ましくは１２から１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、ｓｃＦｖの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。
　あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してＶ領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－ＤＳＴ）、ビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２－（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-ＢＳＯＣＯＥＳ）などを用いることが可能である。
　本発明において使用されるＡｒｉｄ５Ａ阻害剤は、一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
で表されるクロルプロマジン又はその医薬上許容しうる塩を含む。クロルプロマジンは、Ａｒｉｄ５Ａ発現の阻害を介してＩＬ－６のｍＲＮＡの発現も阻害し、ＩＬ－６のｍＲＮＡの安定化を特異的に阻害する。
　本発明における敗血症および／または敗血症性ショックの治療剤または予防剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の敗血症および／または敗血症性ショックの治療効果を有する材料であってもよいし、当該治療効果を有さない材料であってもよく、上記治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、治療効果を有さない材料であって、Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤と併用することによって相乗的効果もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
　製剤上許容される材料としては、例えば滅菌水や生理食塩水、保存剤、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。
　本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル等のＨＬＢ６～１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
　また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０～１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２～４でアルキル基の炭素原子数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８～１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２～１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
　本発明における薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０、４０、６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ－６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
　本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
　また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１～５００ｍＭであり、好ましくは５～１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０～２０ｍＭである。
　また、本発明における薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
　本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
　本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
　本発明における薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられる）、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。
　所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
　また、必要に応じ、本発明における薬剤をマイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)としたりすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer,Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
　使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明のＡｒｉｄ５Ａ阻害剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加しても良い。
　本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１～１０００ｍｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
　本発明は、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を抑制することによる、敗血症および／または敗血症性ショックの治療または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法に関する。当該スクリーニング方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能に対する影響を評価する工程、及び
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる。
　本発明のスクリーニング方法は、まず被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能に対する影響を評価することを含む。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては例えば、ＩＬ－６ｍＲＮＡのステムループに特異的に結合し、ＩＬ－６ｍＲＮＡを特異的に破壊するＲｅｇｎａｓｅ－１の作用を拮抗的に阻害することにより、ＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化に寄与することが挙げられる。したがって、Ａｒｉｄ５Ａの発現および／または機能に対する影響としては例えば、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制すること、Ａｒｉｄ５Ａに結合することによりＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害すること、Ａｒｉｄ５Ａと競合的にＩＬ－６ｍＲＮＡと結合することによりＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害すること等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　また、被験物質を用いない場合と比較して、該Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を減少させる物質を選択する工程を含む。
　本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まずＡｒｉｄ５Ａに被験物質を接触させる。
　本発明の方法に使用されるヒト由来のＡｒｉｄ５Ａのアミノ酸配列は既述の通りである。本発明の方法に使用されるＡｒｉｄ５Ａには、上記の公知のＡｒｉｄ５Ａと機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、Ａｒｉｄ５Ａの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Ａｒｉｄ５Ａの部分ペプチド、または他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明におけるＡｒｉｄ５Ａの変異体としては、既述のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、既述の塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のＤＮＡよりコードされるタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Ａｒｉｄ５Ａの変異体として挙げることができる。
　本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸配列による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは既に知られている。
　本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Ａｒｉｄ５Ａと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ－６ｍＲＮＡのステムループに特異的に結合し、ＩＬ－６ｍＲＮＡを特異的に破壊するＲｅｇｎａｓｅ－１の作用を拮抗的に阻害することにより、ＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化に寄与する。本発明において、Ａｒｉｄ５Ａの生物学的機能や生化学的機能としてはＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化を挙げることができる。
　目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするＤＮＡを調製するために、当業者に良く知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Ａｒｉｄ５Ａの塩基配列もしくはその一部をプローブとして、またＡｒｉｄ５Ａに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ａｒｉｄ５Ａと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＡｒｉｄ５Ａと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
　このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＳＡ　８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００，ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０，ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本発明の方法に使用されるＡｒｉｄ５Ａの由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。
　第一の態様に用いられるＡｒｉｄ５Ａの状態としては、特に制限はなく、例えば精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
　Ａｒｉｄ５Ａの精製は周知の方法で行うことができる。また、Ａｒｉｄ５Ａが発現している細胞としては、内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞、又は外来性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞としては、動物の組織由来の細胞、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞は、例えば、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また、上記外来性のＡｒｉｄ５Ａを有する細胞は、例えばＡｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを、相同組み替えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＡｒｉｄ５Ａが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
　また、Ａｒｉｄ５Ａが発現している細胞抽出液は、例えば試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
　本発明における「被験物質」は、特に限定されるものではなく、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一物質、並びに化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験物質に加えて、これらの被験物質を複数種混合した混合物も含まれる。
　また、本発明において「接触」は、Ａｒｉｄ５Ａの状態に応じて行う。例えば、Ａｒｉｄ５Ａが精製された状態であれば、精製標品に被験物質を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験物質を添加することにより、若しくは被験物質を実験動物に直接投与することにより、行うことができる。被験物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターをＡｒｉｄ５Ａが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＡｒｉｄ５Ａが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
　第一の態様では、次いで、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を測定することで、被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能に対する影響を評価する。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては、ＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化を挙げることができる。具体的にはＡｒｉｄ５Ａと被験物質を共存させ、ＩＬ－６ｍＲＮＡの分解抑制効果を測定すること等により間接的にＡｒｉｄ５Ａの機能を測定することができる。次いで被験物質を接触させない場合と比較して、上記Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を減少させた被験物質を選択する。なお、被験物質を実験動物に投与した場合には、脾臓等の組織を摘出し、マクロファージ等の特定の細胞におけるＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能、ＩＬ－６ｍＲＮＡの発現量等を測定する。発現量の測定はＰＣＲ（polymerase chain reaction）やＲＴ－ＰＣＲ（reverse transcription- polymerase chain reaction）、リアルタイムＰＣＲなどの増幅を基にした技術やハイブリダイゼーションを基にした技術、および/または他の検出技術など適宜選択できる。本願における「ＰＣＲ」はＰＣＲおよびそれから派生した増幅を基にした技術による各種ＤＮＡ、ＲＮＡ等の測定方法が含まれる。Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ－６のｍＲＮＡの安定化に寄与するタンパクであるため、細胞内でＡｒｉｄ５Ａの発現が阻害されると、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現は抑制されるが、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現には影響がないことが知られている。そこで、被験物質について、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現には影響を与えるがＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現には影響を与えないことを確認することで、Ａｒｉｄ５Ａの発現に影響を与える物質、即ち、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を有する物質をスクリーニングすることも可能である。選択された被験物質には、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。
　第二の態様では、まずＡｒｉｄ５Ａに被験物質を接触させ、次いでＡｒｉｄ５Ａと被験物質との結合を検出することで、被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能に対する影響を評価する。検出方法としては、特に制限はない。Ａｒｉｄ５Ａと被験物質との結合は、例えば、Ａｒｉｄ５Ａに結合した被験物質に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、Ａｒｉｄ５Ａに標識剤を結合することもできる。被験物質またはＡｒｉｄ５Ａを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。Ａｒｉｄ５Ａへの被験物質の結合により生じるＡｒｉｄ５Ａの機能変化を指標に検出することもできる。
　本態様では、次いで、Ａｒｉｄ５Ａと結合する被験物質を選択する。選択された物質には、被験物質を接触させない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現または機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現または機能を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。
　本発明のスクリーニング法の第三の態様としては、まずＡｒｉｄ５Ａを発現する細胞に被験物質を接触させ、次いでＡｒｉｄ５Ａの発現レベルを測定することで、被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を評価する。Ａｒｉｄ５Ａの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ－ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
　また、該遺伝子からコードされるＡｒｉｄ５Ａを含む画分を定法に従って回収し、該Ａｒｉｄ５Ａの発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、Ａｒｉｄ５Ａに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッディング法を実施し、Ａｒｉｄ５Ａの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。Ａｒｉｄ５Ａに対する抗体については、上記に記載したものを用いることができる。
　第三の態様では、次いで被験物質を接触させていない場合と比較して、該Ａｒｉｄ５Ａの発現レベルを減少させた被験物質を選択する。選択された物質には、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。なお、Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ－６のｍＲＮＡの安定化に寄与するタンパクであるため、細胞内でＡｒｉｄ５Ａの発現が阻害されると、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現は抑制されるが、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現には影響がないことが知られている。そこで、被験物質について、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現には影響を与えるがＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現には影響を与えないことを確認することで、Ａｒｉｄ５Ａの発現に影響を与える物質、即ち、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を有する物質をスクリーニングすることも可能である。
　本発明のスクリーニング法の第四の態様としては、まずＡｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
　第四の態様において、「機能的に結合した」とは、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
　上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡもまた含まれる。
　Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液は、上述の方法にて調製することが可能である。
　第四の態様では、次いで上記細胞または上記細胞抽出液に被験物質を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定することで、被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を評価する。
　レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
　また、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、上述した方法で行うことができる。
　第四の態様においては、次いで被験物質を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被験物質を選択する。選択された物質にはＡｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。
　第五の態様においては、まずＩＬ－６ｍＲＮＡに被験物質を接触させ、次いでＩＬ－６ｍＲＮＡと被験物質との結合を検出することで、被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能に対する影響を評価する。検出方法としては、特に制限はない。ＩＬ－６ｍＲＮＡと被験物質との結合は、例えば、ＩＬ－６ｍＲＮＡに結合した被験物質に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、ＩＬ－６ｍＲＮＡに標識剤を結合することもできる。被験物質またはＩＬ－６ｍＲＮＡを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。ＩＬ－６ｍＲＮＡへの被験物質の結合により生じるＩＬ－６ｍＲＮＡの活性変化を指標に検出することもできる。
　本態様では、次いで、ＩＬ－６ｍＲＮＡと結合する被験物質を選択する。選択された物質にはＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現または機能を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。
　第六の態様においては、まずＩＬ－６ｍＲＮＡに被験物質を接触させ、さらにＡｒｉｄ５Ａを接触させ、次いで、Ａｒｉｄ５Ａの機能を測定することで、Ａｒｉｄ５Ａの機能に対する影響を評価する。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては、上述のような形で測定することができる。次いで被験物質を接触させない場合と比較して、上記機能を減少させた被験物質を選択する。選択された被験物質には、Ａｒｉｄ５Ａ機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの機能を抑制することによって、結果的に敗血症および／または敗血症性ショックを治療または予防する効果を示すものと考えられる。
　第七の態様においては、まず被験物質を実験動物に投与し、さらにＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響についてＰＣＲにて測定し、次いで被験物質を実験動物に投与しない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する。実験動物への投与や、ＰＣＲでの測定については、上記のとおりである。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスの作製（図１）
　ＣＬＥＡ社からＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（６－８週）を入手し、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウス(Ｎｏ．ＣＤＢ０６０２Ｋ:www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)をwww.cdb.riken.jp/arg/Methods.htmlの方法により作製した。Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のＤＮＡ結合ドメインの主要部分を、両端をloxP配列で挟んだＮｅｏ－ｃａｓｓｅｔｔｅによって置換するように構築したターゲッティングベクターを、ＴＴ２株ＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。相同的組み換えによる遺伝子破壊は、Ａｒｉｄ５Ａの遺伝子の３’ＵＴＲに対するプローブを使用したサザンブロッティング法により確認し、得られた変異ＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製した。変異アレルのジャームライントランスミッションの確認は、キメラマウスをＣ５７ＢＬマウスと交配して得られた次世代のマウスのゲノムＤＮＡを用いた、サザンブロッティング解析およびゲノムＰＣＲ（プライマー１：５’－ＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡ－３’；プライマー２：５’－ＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧ－３’）により行った。ヘテロ接合型の変異マウスは特定病原体のフリーの環境下で飼育し、Ｃ５７ＢＬマウスと５回の戻し交配を行った。
実施例２：Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスにおける敗血症性ショック
　８～９週齢のＡｒｉｄ５Ａノックアウトマウス（Ａｒｉｄ５Ａ-/-）及び野生型マウス（それぞれ体重１８-２０g）に対し、Escherichia coli血清を型０１２７：Ｂ８から得られたＬＰＳ（シグマ－アルドリッチ社）を腹腔内に投与し、７日間死亡率を観察した。また、ＬＰＳ投与４時間後にＩＬ－６とＩＦＮγの役割を調べるために抗ＩＬ－６受容体抗体（ＭＲ１６－１抗体、２５０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＩＦＮγ抗体（Ｒ４－６Ａ２　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，　２５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、７日間死亡率を観察した。
　その結果、野生型、ＩＬ－６受容体抗体、ＴＮＦ抗体を投与したマウスは死亡したのに対し、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスでは敗血症性ショックが起こらなかった。
実施例３：Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡによるＩＬ－６の発現制御
　マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７に、Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡ（ SASI_Mm02_00341523　(sigma)）又はコントロールのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）をエレクトロポレーション法にて導入した。２４時間の培養後、細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間刺激し、得られた細胞からＲＮＡを抽出した。Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって定量した（図３）。また、それぞれの培養上清中のＩＬ－６及びＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡ法によって定量した（図４及び５）。図３に示す通り、ＲＡＷ２６４．７にＡｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡを導入したことにより、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡ発現レベルが顕著に低下した。また、図４及び図５に示す通り、Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡを導入した細胞においては、ＬＰＳ刺激によって産生されるＩＬ－６の量が減少したのに対して、ＴＮＦ－αの量には変化がなかった。
実施例４：敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法
　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）の腹腔マクロファージを、被験物質（２０μＭ）存在下又は非存在下において、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、上記刺激した腹腔マクロファージにおけるＡｒｉｄ５Ａ、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの相対発現レベルを測定した。Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡについては、ＬＰＳ刺激２時間後、ＩＬ－６のｍＲＮＡ及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡついては、ＬＰＳ刺激２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後の発現レベルを測定した。被験物質として、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を使用した結果を図６～８に示す。
　図６に示す通り、ＣＰＺ存在下でＬＰＳ刺激した腹腔マクロファージにおいては、ＣＰＺ非存在下の場合と比較して、ＬＰＳ刺激２時間後において、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。また、図７に示す通り、ＣＰＺ存在下でＬＰＳ刺激した腹腔マクロファージにおいては、ＣＰＺ非存在下の場合と比較して、ＬＰＳ刺激２時間後、６時間後において、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。一方、図８に示す通り、ＣＰＺは、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現に対しては何らの影響も与えなかった。
　この結果より、ＣＰＺは、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現自体を阻害する物質であることがわかった。また、ＣＰＺは、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受けるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現も阻害する物質であり、かつ、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受けないことが知られているＴＮＦ－αのｍＲＮＡには何ら影響を与えない物質であった。このことから、ＣＰＺはＩＬ－６のｍＲＮＡの安定化を特異的に阻害する物質であり、ＩＬ－６等の炎症性サイトカインが関与する敗血症及び／又は敗血症ショックの治療に有効であることが示唆された。このように、細胞内のＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現を阻害する物質をスクリーニングすることにより、敗血症及び／又は敗血症ショックの治療に有効である物質を得ることが可能であるし、また、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現を阻害するが、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡには何ら影響を与えない物質をスクリーニングすることによっても、Ａｒｉｄ５Ａの作用を阻害する物質を効率的にスクリーニングすることが可能であると考えられる。これらの方法によって、敗血症及び／又は敗血症ショックの治療に有効である物質を効率よくスクリーニングすることができる。
　本発明の敗血症および／または敗血症性ショック治療剤により、敗血症及び敗血症性ショックの高い治療効果を有する医薬組成物が提供される。また、本発明により高い治療効果を示す治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分とする、敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤。
  2. 　Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤が、核酸オリゴ、及びＡｒｉｄ５Ａ抗体からなる群より選ばれる１種以上の物質である、請求項１記載の敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤。
  3. 　核酸オリゴが、天然及び非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴである請求項２記載の敗血症及び／又は敗血症性ショック治療剤。
  4. 　敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
    （ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能に対する影響を評価する工程、及び
    （ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現及び／又は機能を減少させる物質を選択する工程、
    とを含んでなる方法。
  5. 　請求項４に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
    （ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を評価する工程、及び
    （ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
    とを含んでなる方法。
  6. 　請求項４に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
    （ａ）被験物質を、実験動物に投与する工程、
    （ｂ）該Ａｒｉｄ５Ａの発現に対する影響についてＰＣＲにて測定する工程、及び
    （ｃ）被験物質を実験動物に投与しない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
    とを含んでなる方法。
  7. 　請求項４に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
    （ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの機能に対する影響を評価する工程、及び
    （ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの機能を減少させる物質を選択する工程、
    とを含んでなる方法。
  8. 　請求項７に記載の敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該Ａｒｉｄ５Ａの機能がＩＬ－６ｍＲＮＡの安定化である方法。
  9. 　Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を投与することを含んでなる、敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療方法。
  10. 　敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に使用するためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤。
  11. 　敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療剤の製造のためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤の使用。
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