JP5455284B2 - 非特異的タンパク質結合および細胞付着に対する抵抗性がある表面を生成する方法 - Google Patents

Description

本発明は、非特異的タンパク質結合または細胞付着に対する抵抗性があるプラスチック表面を処理する方法、およびそれによって調製した表面に関する。

ポリスチレン表面などのプラスチックの直表面は、通常、非特異的タンパク質結合または細胞付着に対する抵抗性がない。ポリエチレングリコールなどの高密度で安定なポリマー層またはデキストランなどのヒドロゲルで修飾した表面は、非特異的タンパク質結合および細胞付着に対する抵抗性があることが知られている。従来技術では、プラスチック表面上に高密度で安定な保護ポリマーまたはヒドロゲルの層を形成するために、プラスチック表面を、通常、表面活性化のための光化学反応、または関連する表面に対し高い親和性を有する従来の特別に選定された化学物質で処理していた。

生体分子の非特異的結合および細胞の付着に抵抗性をもたせるためのポリマー表面の処理方法が本明細書に開示される。

この方法は、ポリマー表面に電荷を付与して帯電表面を生成するステップと、帯電表面を窒素に富んだポリマーに曝露して重合表面を形成するステップと、重合表面を酸化多糖類に曝露してアルデヒド表面を形成するステップと、アルデヒド表面を還元剤に曝露するステップとを含む。非特異的タンパク質結合および細胞付着に対する抵抗性を有するものであって、光化学反応または従来の特別に選定された化合物を使用しないという有利な点をもった表面形成方法が提供される。

本発明の、これら、および、その他の特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面の検討によってより良く理解することができるであろう。

図１を参照するに、方法１０は、生体分子の非特異的結合および細胞の付着に対する抵抗性がつくようにポリマー表面１２を処理することを示している。

最初のステップ３０では、容器または受け器のポリマー表面１２に電荷を供給して帯電表面１４を生成する。容器は、試験管、バイアル、フラスコなど任意の既知の構造であってよい。ポリマー表面１２は、マルチウェルプレートの表面であることが好ましい。ポリマー表面１２は、マルチウェルプレートのウェルの表面であることがより好ましい。マルチウェルプレートは、薬物アッセイ取り扱い装置（例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）装置）で使用できるように、従来のマルチウェルプレート標準（例えば、生体分子スクリーニング学会の標準（the Standards of the Society of Biomolecular Screening））に適合することがさらに好ましい。

本明細書では、「ポリマー表面」という用語は、当業者に周知の任意の適当なポリマー表面を意味する。ポリマー表面の適当な例には、高分子炭化水素から得られたものがある。本明細書では、「高分子炭化水素」という用語は、炭素および水素から構成されるモノマー単位の繰返しによって得られたポリマーおよびコポリマーを意味するものとする。高分子炭化水素は、飽和または不飽和、および置換または非置換であってよい。置換基は、ポリマーの実質的な炭化水素性質を損なわない量でそれらが存在する限り、水素および炭素以外の原子を含んでいてよい。こうした置換基には、アセタール、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、アミノ、アミド、カルバモイル、およびカルバミド基がある。高分子炭化水素表面の典型例には、置換および非置換ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ、ＰＶＣ、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデン、およびその混合物から作製したものがある。好ましい実施形態では、高分子炭化水素表面はポリスチレンである。

「ポリマー表面」という用語は、また、炭素および水素に加えて、１種または複数の酸素、窒素、または硫黄などのヘテロ原子を含むポリマーから得られた表面を含むものである。こうしたポリマー表面の典型例には、置換および非置換ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミン、ポリイミン、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリスルフィド、ポリスルホン、およびポリスルフィドから得られた表面がある。

また、本発明の範囲内であると意図されるのは、シリコーンなどのヘテロ原子から相当程度構成される主鎖を含むポリマーから得られた表面である。

ポリマー表面１２に電荷を付与して帯電表面１４を生成するために、任意の既知の技術を使うことができる。好ましくは、プラズマ処理またはコロナ放電処理を利用することができる。このプロセスを用いる場合、実質的にガスを含まないチャンバー内にポリマー表面１２を配置し、チャンバー内にガスを導入し、ガスを励起させることによって電荷をポリマー表面１２に付与する。結果として、プラズマが生成し、ポリマー表面１２に加えて、帯電表面１４が生成する。高周波発生器を使用して、ガスをイオン化してプラズマにすることができる。さらに、プラズマは、約０．１から約３０分の持続時間、約０．１から約３．０トンのガス圧で、最大約２００ワットまでのＡＣまたはＤＣ出力レベル、約０．１から約５０メガヘルツの高周波（ＲＦ）励起など従来のプラズマ条件を用いて発生させることができる。従来のプラズマチャンバーを使用してもよいが、使用中にチャンバーが排気されていることが好ましい。

ＲＦ励起プラズマが好ましいが、ガスプラズマを発生させる任意の他の方法、例えばグロー放電またはコロナ放電を使用してもよい。例えば、ＲＦ励起の代わりに、またはそれに加えてマイクロ波振動数を使用してもよい。

通常プラズマ処理で使用され、プラズマチャンバーに導入されるガスには、Ａｒ、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｈｅ、Ｈｅ／Ｈ_２、Ｏ_２、Ｎ_２、ＮＨ_３、およびＣＦ_４がある。本発明の一実施形態では、帯電表面１４は、負に帯電していてよい。負に帯電した表面は、図１の参照数字１４（ａ）によって明確に示されている。プラズマ処理プロセスで酸素ガスを使用して負に帯電した表面１４（ａ）を生成することが好ましい。

あるいは、別の実施形態では、帯電表面１４は正に帯電していてもよい。正に帯電した表面は、図１の参照数字１４（ｂ）によって明確に示されている。プラズマ処理プロセスでアンモニアガスを使用して正に帯電した表面１４（ｂ）を生成することが好ましい。具体的に言うと、ポリマー表面１２にアンモニアガスプラズマ処理を施すと、いくつかの窒素含有の、正に帯電した官能基が表面上に形成され、正に帯電した表面１４（ｂ）が得られる。

方法１０の次のステップ３２では、帯電表面１４を窒素に富んだポリマーに曝露して重合表面１６を形成する。負に帯電した表面１４（ａ）は、任意の介在ステップなしに窒素に富んだポリマーに曝露することができる。しかし、正に帯電した表面１４（ｂ）を窒素に富んだポリマーに曝露する前に、正に帯電した表面１４（ｂ）は、まず１種または複数の適当なリンカーに曝露することが好ましい。一般に「架橋剤」と称される種々のリンカーを使用することができる。適当なリンカーには、ジアルデヒド、ジエステル、ジイミドエステル、ＮＨＳエステル、ヒドラジド、カルボジイミド、およびアリールアジドがある。さらに本発明の範囲内であると企図されているのは、ヘテロ二官能性リンカー、すなわち各末端に異なる官能基を有するものである。例えば、適当なヘテロ二官能性リンカーは、一方の末端にエステルを、またもう一方の末端にアルデヒドを有するものである。好ましい実施形態では、リンカーは、構造：

を有するジアルデヒドであり、式中、Ｒ^１は、Ｃ_２からＣ_３０アルキレニルである。より好ましい実施形態では、ジアルデヒドは、グルタルアルデヒドである。

正に帯電した表面１４（ｂ）をリンカーの溶液に曝露することが好ましい。当業者に周知の任意の適当な溶媒または適当な溶媒の混合物をリンカーと一緒に使用することができる。適当な溶媒には、水、バッファー、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がある。

準備が整った後、帯電表面１４を窒素に富んだポリマーに曝露して重合表面１６を形成する。「窒素に富んだ」という用語は、Ｎ（Ｒ^２）_２および＝ＮＲ^２（式中、各Ｒ^２は、それぞれ独立にＨまたはＣ_１からＣ_１０アルキルである）などペンダントアミノ基を含有するポリマーを意味するものとする。本明細書では、「アルキル」という用語は、指示された数の炭素原子を有する分枝および直鎖飽和脂肪族炭化水素基を意味するものとする。アルキル基は、非置換、または置換であってよい。適当な置換基には、Ｃ_１〜５アルキル、アミノ、アミド、シアノ、カルバモイル、フェニル、ヘテロアリール、ハロゲン、Ｃ_１〜５アルコキシ、Ｃ_１〜５アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、ＣＯ_２Ｈ、およびＣＯ_２−Ｃ_１〜５アルキルがある。「アルキレニル」という用語は、アルキル基のジラジカル変形形態を含むものとする。

窒素に富んだポリマーは、ポリエチレンイミンなどのポリアルキレンイミンであることが好ましい。本発明に適した別のクラスの窒素に富んだポリマーは、高分子アミノ酸である。「高分子アミノ酸」という用語は、一連の繰返しアミノ酸を意味するものとする。したがって、任意の適当なペプチドを窒素に富んだポリマーとして使用することができる。一連のアミノ酸は、一連の同一のアミノ酸または一連の異なるアミノ酸を含んでいてよく、どちらの場合にも天然でも人工でもよい。リシンおよびアルギニンなどのアミノ酸に基づく窒素に富んだポリマーは、適当な窒素に富んだポリマーの好適な例になるほど十分な窒素特徴をもつ。高分子アミノ酸として本発明で特に有用な合成高分子アミノ酸は、ポリ−リシンである。より好ましい実施形態では、合成高分子アミノ酸はポリ−ｄ−リシンである。

通常、帯電表面１４は、窒素に富んだポリマーの溶液に曝露して、重合表面１６を形成する。当業者に周知の任意の適当な溶媒または適当な溶媒の混合物を使用することができる。適当な溶媒には、水、バッファー、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がある。

次のステップ３４では、アルデヒド含有ポリマーに重合表面１６を曝露し、それによってアルデヒド表面１８を得る。任意のポリマーを含有するペンダントヒドロキシアルキル基は、アルデヒド含有ポリマーとして働くことができる。このようなポリマー上のアルコールは、アルデヒドに酸化されることが好ましく、このアルデヒドは、重合表面１６の窒素と以下で論じている外層の窒素の両方と結合する受容性に富む。しかし、アルデヒド表面１８は、生物学的に害のない必要があるので、アルコール含有ポリマーは、生物学的または細胞培養に対して毒性がないことが好ましい。アルデヒド含有ポリマーは、ペンダントアルコール基がアルデヒド基に転換された酸化多糖類であることが好ましい。適当な酸化多糖類には、酸化アミロース、酸化アミロペクチン、酸化セルロース、酸化キチン、酸化グアラン、酸化グルコマンナン、および酸化デキストランなどの酸化多糖類がある。これらのうち、酸化デキストランが特に好ましい。好ましい方法では、多糖類は、ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）を多糖類溶液に加えることによって酸化され、得られた溶液を暗所で４時間、室温でインキュベートし、続いてｍ−過ヨウ素酸ナトリウムを除去する（例えば、透析による）。

通常、重合表面１６は、アルデヒド含有ポリマーの溶液に曝露して、アルデヒド表面１８を形成する。当業者に周知の任意の適当な溶媒または適当な溶媒の混合物を使用することができる。適当な溶媒には、水、バッファー、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールがある。

アルデヒド表面１８は、安定化表面２０を形成するのに１つのステップまたは２つのサブステップを含んでいてよいステップ３６に示すようにさらに処理を行う。

一実施形態では、重合表面１８は還元剤に曝露してもよく、それによってこの実施形態では図１の安定化表面２０（ａ）として具体的に示している安定化表面２０が生成する。還元剤は、ＮａＢＨ_４またはＮａＣＮＢＨ_３などのホウ素系還元剤であることが好ましい。

あるいは、別の実施形態では、重合表面１８は、まずアミン末端ポリマーに曝露する。アミン末端ポリマーは、アミン末端ヒドロカルビルポリマーまたはアミン末端ポリエーテルであることが好ましい。「ヒドロカルビルポリマー」という用語は、先に論じた「高分子炭化水素」と同義のものとする。より好ましい実施形態では、アミン末端ポリエーテルは、アミン末端ポリエチレングリコールである。通常、アミン末端ポリマーは、重合表面１８に曝露する場合、適当な溶媒に溶解させる。当業者に周知の任意の適当な溶媒または適当な溶媒の混合物を使用することができる。適当な溶媒には、水、バッファー、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールがある。

アルデヒド表面１８とアミン末端ポリマーのアミン基の反応により、可逆的なシッフ塩基結合が形成され、次いでそれは適当な還元剤で安定化でき、それによってこの実施形態では図１の安定化表面２０（ｂ）として具体的に示している安定化表面２０が生成する。適当な還元剤は、安定化表面２０（ａ）に関して先に述べたようなものである。

実施例Ａ
ポリスチレン表面を酸素ガスプラズマ処理に曝露し、負に帯電した表面を形成する。負に帯電した表面を１％ポリエチレンイミン溶液に２時間曝露する。ポリエチレンイミン被膜表面を１０ｍｇ／ｍＬ酸化デキストラン溶液に２時間曝露する。デキストラン被膜表面をアミン末端ポリエチレングリコール溶液に１時間曝露する。ポリエチレングリコール表面を１ｍｇ／ｍＬ水素化ホウ素ナトリウム溶液に１時間曝露する。

実施例Ｂ
ポリスチレン表面をアンモニアガスに曝露して、正に帯電した表面を形成する。正に帯電した表面を１０％グルタルアルデヒド溶液に１時間曝露する。グルタルアルデヒド活性化表面を１％ポリエチレンイミン溶液に２時間曝露する。ポリエチレンイミン被膜表面を１０ｍｇ／ｍＬ酸化デキストラン溶液に２時間曝露する。デキストラン被膜表面を１ｍｇ／ｍＬアミン末端ポリエチレングリコール溶液に１時間曝露する。ポリエチレングリコール被膜表面を１ｍｇ／ｍＬ水素化ホウ素ナトリウム溶液に１時間曝露する。

当業者によって理解されるように、本発明は、生体分子の非特異的結合および細胞の付着に対する抵抗性があるポリマー表面を提供する。安定化表面２０は、こうした抵抗性をもたらす。図２に関しては、２つの異なる表面、すなわち本発明の方法によって処理していない表面と本発明によって処理した表面に対するＩｇＧの非特異的結合に関するデータが示されている。この実証では、実施例Ａの方法を用いて９６ウェルポリスチレンプレートを処理した。別の９６ウェルポリスチレンプレートは処理せず、対照として使用した。両方のプレートのウェル中の表面を５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧと２時間接触させ、続いてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。次いで、表面をマウスＩｇＧ−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合体（濃度範囲０．０１μｇ／ｍＬから０．３３μｇ／ｍＬ）と１時間接触させ、続いてＰＢＳで洗浄した。その後、表面をＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）溶液と８分間接触させ、続いて２Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。酸化ＴＭＢによって生じた色の強度（４５０ｎｍで検出）によって表面に結合した抗マウスＩｇＧおよび関連マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体の量を定量した。図２に示すように、処理した表面によって無視できる量の免疫グロブリンＧが吸収された。

２つの異なる表面、すなわち本発明の方法によって処理していない表面と本発明によって処理した表面に対する様々な種類の付着細胞の付着に関する実験を行った。以下に記載の実験では、実施例Ａの方法を用いて６ウェルポリスチレンプレートを処理した。別の６ウェルポリスチレンプレートは未処理であり、対照として使用した。

第１の実験では、ＨＴ−１０８０（ヒト線維肉腫細胞系）細胞を、同じ培養条件（３７℃における増殖培地中でのインキュベーション）下で６ウェルプレートの未処理および処理表面の両方の上で培養した。表面への細胞付着および伸展を分析し、数日の細胞培養後に顕微画像を撮影した。ＨＴ−１０８０細胞は、予想通り未処理表面に付着し、表面上に伸展した。しかし、ＨＴ−１０８０細胞は、処理表面には付着しないままであり、培地中に浮遊している細胞凝集体を形成した。処理表面は、培地を除去した後も細胞が付いていない状態のままであり、処理表面がＨＴ−１０８０細胞付着に抵抗できることが実証された。

第２の実験では、マウス胚線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）を、同じ培養条件（３７℃における増殖培地中でのインキュベーション）下で６ウェルプレートの未処理および処理表面の両方の上で培養した。表面への細胞付着および伸展を分析し、数日の細胞培養後に顕微画像を撮影した。線維芽細胞は、予想通り未処理表面に付着し、表面上に単層を形成した。しかし、線維芽細胞は、処理表面には付着しないままであり、培地中に浮遊している細胞凝集体を形成した。処理表面は、培地を除去した後も細胞が付いていない状態のままであり、処理表面が線維芽細胞付着に抵抗できることが実証された。

第３の実験では、イヌ軟骨細胞を、同じ培養条件（３７℃における増殖培地中でのインキュベーション）下で６ウェルプレートの未処理および処理表面の両方の上で培養した。表面への細胞付着および伸展を分析し、数日の細胞培養後に顕微画像を撮影した。軟骨細胞は、予想通り未処理表面に付着し、表面上に伸展した。しかし、軟骨細胞は、処理表面には付着しないままであり、培地中に浮遊している細胞凝集体を形成した。処理表面は、培地を除去した後も細胞が付いていない状態のままであり、処理表面が軟骨細胞付着に抵抗できることが実証された。

胚性幹細胞からの胚様体の形成に関する実験を行った。胚様体の形成を、本発明の方法によって処理した６ウェルポリスチレンプレートを用いて達成することに成功した。未処理６ウェルポリスチレンプレートを対照として使用し、長いインキュベーション期間（最長７日）中、胚性幹細胞の未処理表面への付着によって胚様体は形成しなかった。処理表面を用いた場合、胚性幹細胞の付着は全般的に回避され、胚性幹細胞はインキュベーション中懸濁したままであった。したがって、付着しなければ、胚性幹細胞は全般的に付着媒介分化を回避し、それによって後の胚様体形成の増大が可能になった。

本発明は、様々な状況で適用することができる。非限定的な例として、本発明を使用してポリマー表面を調製して、以下の利点：細胞を懸濁した付着していない状態で溶液中に維持し；幹細胞を付着媒介分化から防ぎ；胚性幹細胞からの胚様体のより一層の形成を可能にし；足場依存性細胞が分裂するのを防ぎ；血清タンパク質の結合を減らし；また、シンチレーション近接アッセイなどの均一アッセイにおいて信号対雑音比を増大させることを得ることができる。

本発明による方法を表すフローチャートである。 ２つの異なる表面に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の非特異的結合を比較したグラフである：一方の表面は未処理であり、もう一方の表面は本発明によって処理した。表面に結合したＩｇＧの量は、それが結合できるＩｇＧ−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合体の量によって検出し、ＩｇＧ−ＨＲＰ結合体の量は、酸化すると色が変わるＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）のＨＲＰ触媒酸化によって定量した。

Claims (14)

1. 生体分子の非特異的結合および細胞の付着に対する抵抗性をもたらすポリマー表面の処理方法であって、
   ａ）前記ポリマー表面に正の電荷を付与して得られる正の帯電表面をリンカーに暴露して活性化表面を生成するステップと、
   ｂ）前記活性化表面をポリアルキレンイミンに曝露して重合表面を形成するステップと、
   ｃ）前記重合表面をアルデヒド含有ポリマーに曝露してアルデヒド表面を形成するステップと、
   ｄ）前記アルデヒド表面をアミン末端ヒドロカルビルポリマーおよびアミン末端ポリエーテルからなる群から選択されるアミン末端ポリマーに曝露し、次いで前記表面を還元剤に曝露するステップと、
   を含み、
   前記リンカーは、ジアルデヒド、ジエステル、ジイミドエステル、ＮＨＳエステル、ヒドラジド、カルボジイミド、アリールアジド、および一方の末端にエステルを他方の末端にアルデヒドを有するヘテロ二官能性リンカーからなる群から選択される、
   ことを特徴とする方法。
2. 前記アミン末端ポリエーテルは、アミン末端ポリエチレングリコールである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリマー表面に前記正の電荷を付与するステップは、実質的にガスを含まないチャンバー内に前記ポリマー表面を配置し、前記チャンバー内にガスを導入し、前記ガスを励起させて前記正に帯電した表面を生成することを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記ガスを励起させることは、前記ガスを高周波励起にかけることを含む、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記ガスは、アンモニアガスである、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
6. 前記リンカーは、グルタルアルデヒドである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記アルデヒド含有ポリマーは、酸化多糖類である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記酸化多糖類は、酸化アミロース、酸化アミロペクチン、酸化セルロース、酸化キチン、酸化グアラン、酸化グルコマンナン、および酸化デキストランからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記ポリマー表面は、ポリスチレン表面である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記ポリマー表面は、マルチウェルプレートの表面である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 請求項１の方法によって処理した、ことを特徴とする表面。
14. 前記表面は、マルチウェルプレートの表面である、ことを特徴とする請求項１３に記載の表面。

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