JPS6338164A - 抗体タンパクの固定化方法 - Google Patents
抗体タンパクの固定化方法Info
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- JPS6338164A JPS6338164A JP18201586A JP18201586A JPS6338164A JP S6338164 A JPS6338164 A JP S6338164A JP 18201586 A JP18201586 A JP 18201586A JP 18201586 A JP18201586 A JP 18201586A JP S6338164 A JPS6338164 A JP S6338164A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は抗体タンパクの固定化方法に関する。
更に詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その抗原−抗体
反応活性を完全に保持しながら固体基板上に該タンパク
を高密度に固定化する方法に関する。
反応活性を完全に保持しながら固体基板上に該タンパク
を高密度に固定化する方法に関する。
〈背景及び従来技術〉
抗体タンパクの抗原−抗体反応を利用した診断技術に於
て、抗体タンパクを固体基板上に固定化する方法がこれ
まで数多く提案されてきた。これらの内、あるものは、
抗体タンパクのアミノ基又はカルボキシル基と反応又は
吸着結合できる官能基を有する固体表面に固定化するも
のであるが、この場合、固定化のための反応条件の設定
によっては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があった。
て、抗体タンパクを固体基板上に固定化する方法がこれ
まで数多く提案されてきた。これらの内、あるものは、
抗体タンパクのアミノ基又はカルボキシル基と反応又は
吸着結合できる官能基を有する固体表面に固定化するも
のであるが、この場合、固定化のための反応条件の設定
によっては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があった。
また、親水性ゲルの中に抗体タンパクを抱き込ませて、
固体基板上に固定化する方法も可能性のある方法である
が、この場合、抗原タンパクがゲル中の抗体タンパクに
接近でき難くなり、抗原抗体反応を利用した診断材料と
しての感度低下を招き易い。こうした方法に対して近年
、水面上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性酵素
(例、カタラーL、フエリヂン、ヘミグロビン。
固体基板上に固定化する方法も可能性のある方法である
が、この場合、抗原タンパクがゲル中の抗体タンパクに
接近でき難くなり、抗原抗体反応を利用した診断材料と
しての感度低下を招き易い。こうした方法に対して近年
、水面上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性酵素
(例、カタラーL、フエリヂン、ヘミグロビン。
グルコースオキシダーゼ、etc、)や抗体タンパク[
免疫グ「JプリンG (IgG)、 IgE、 etc
lを成心固定化する試みが報吉されている[バイオキミ
カ・エト・バイオフイジカ・アクタ(Biochem、
Bio−phys、八cta、) 225ff、 3
82 (1971)ヤジャーナル・オブ・セルラー・バ
イオケミストリー(J、 Ce1l。
免疫グ「JプリンG (IgG)、 IgE、 etc
lを成心固定化する試みが報吉されている[バイオキミ
カ・エト・バイオフイジカ・アクタ(Biochem、
Bio−phys、八cta、) 225ff、 3
82 (1971)ヤジャーナル・オブ・セルラー・バ
イオケミストリー(J、 Ce1l。
Biochem、) 29.239 (1985)等参
照]。
照]。
これらは確かにタンパクを、その活性を保持したまま固
定化する優れた方法であるが、この方法に於て従来用い
られてきた脂質膜は、ステアリン酸、アラキン酸及びジ
パルミトイルホスファチジルコリン(DPPC>等の如
く、水に対して可溶性(少くとも、1μg/lに水の溶
解度)のもの、又は水中で二分子膜ベシクルを形成しや
すいもの(DPPC等)でおった。従って、水面上で該
膜に吸着された抗体タンパクは、時間が経つにつれ、脂
質膜と共に再び水中に再溶解したり、一旦固体基板−L
に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した際、脱離しゃ寸
いという問題点を有していた。
定化する優れた方法であるが、この方法に於て従来用い
られてきた脂質膜は、ステアリン酸、アラキン酸及びジ
パルミトイルホスファチジルコリン(DPPC>等の如
く、水に対して可溶性(少くとも、1μg/lに水の溶
解度)のもの、又は水中で二分子膜ベシクルを形成しや
すいもの(DPPC等)でおった。従って、水面上で該
膜に吸着された抗体タンパクは、時間が経つにつれ、脂
質膜と共に再び水中に再溶解したり、一旦固体基板−L
に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した際、脱離しゃ寸
いという問題点を有していた。
〈発明の目的〉
本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服し、高い抗
原−抗体反応活性の保持率と、高密度な抗体タンパクの
固定化を可能にすべく鋭意検討の結果、本発明に到達し
たものである。
原−抗体反応活性の保持率と、高密度な抗体タンパクの
固定化を可能にすべく鋭意検討の結果、本発明に到達し
たものである。
〈発明の開示〉
すなわら本発明は、水相面上に展開された水不溶性ポリ
(オレフィン−無水マレイン酸)単分子膜に当該水相中
に溶解した水溶性抗体タンパクを接触させることにより
当該水相界面で抗体タンパク−単分子膜複合体を形成さ
せ、それを固体基板上に積層することを特徴とする抗体
タンパクの固定化方法であり、就中、当該ポリ(オレフ
ィン−無水マレイン酸)がポリ(オクタデセン−無水マ
レイン酸)である上記抗体タンパクの固定化方法である
。
(オレフィン−無水マレイン酸)単分子膜に当該水相中
に溶解した水溶性抗体タンパクを接触させることにより
当該水相界面で抗体タンパク−単分子膜複合体を形成さ
せ、それを固体基板上に積層することを特徴とする抗体
タンパクの固定化方法であり、就中、当該ポリ(オレフ
ィン−無水マレイン酸)がポリ(オクタデセン−無水マ
レイン酸)である上記抗体タンパクの固定化方法である
。
本発明でいう抗体タンパクとは、抗原−抗体反応を起し
うる水溶性タンパクの総称であり、その分子中に抗原認
識部位(Fabと略)と疎水性末端部位(FCと略)を
有している。
うる水溶性タンパクの総称であり、その分子中に抗原認
識部位(Fabと略)と疎水性末端部位(FCと略)を
有している。
かかる抗体タンパクの具体例としては、免疫グロブリン
G(ICIGと略称) 、 I(JE 、 I(J)f
及びこれらの抗体、絨毛性性腺刺激ホルモン()−I
CG >抗体、ガン胎児性抗原(CEA)抗体等があげ
られる。
G(ICIGと略称) 、 I(JE 、 I(J)f
及びこれらの抗体、絨毛性性腺刺激ホルモン()−I
CG >抗体、ガン胎児性抗原(CEA)抗体等があげ
られる。
これらの抗体タンパクの固定化に市たっては、Fab部
分を変性しないようにすることが肝要であるが、前述の
如〈従来の化学反応による固定化の場合Fab部分も反
応に関与して抗体タンパクの活性低下を1Gいていた。
分を変性しないようにすることが肝要であるが、前述の
如〈従来の化学反応による固定化の場合Fab部分も反
応に関与して抗体タンパクの活性低下を1Gいていた。
本発明においては抗体タンパクは、後述のポリ(オレフ
ィン−無水マレイン酸)単分子膜の酸無水物基(これは
水面下に規則的に並んでいるものと考えられる)に水中
からアミン基を介して、例えば反応等による固定化を起
すものと考えられ、従来の化学反応固定法に比べ位置特
異的に固定化が進行する。また、該単分子膜の圧縮圧力
の制御により、膜中にとりこまれる抗体タンパク量の制
御も容易に行える。また、そのような抗体タンパクは色
素やケイ光ラベル化剤又は酵素等で修Stノだ後に本発
明に用いることもてきる。
ィン−無水マレイン酸)単分子膜の酸無水物基(これは
水面下に規則的に並んでいるものと考えられる)に水中
からアミン基を介して、例えば反応等による固定化を起
すものと考えられ、従来の化学反応固定法に比べ位置特
異的に固定化が進行する。また、該単分子膜の圧縮圧力
の制御により、膜中にとりこまれる抗体タンパク量の制
御も容易に行える。また、そのような抗体タンパクは色
素やケイ光ラベル化剤又は酵素等で修Stノだ後に本発
明に用いることもてきる。
上記の抗体タンパクを固定化するための単分子−膜とし
ては、水不溶性でかつ単分子膜を形成しうる下記のくり
返し中位を有するポリ(オレフィン−無水マレイン酸)
が用いられる。
ては、水不溶性でかつ単分子膜を形成しうる下記のくり
返し中位を有するポリ(オレフィン−無水マレイン酸)
が用いられる。
♂
(但し、式中Rは炭素原子数8〜20の炭化水素基を表
わし、nは2〜10.000の整数を表わす)前記の共
重合体は、ベンビンやクロロホルム等の有機溶媒に溶解
させ、0.5〜1.5ミリモル/りの溶液となしたのら
、これを蒸溜水又は多価金属塩(例えば、塩化バリウム
、塩化カドミウム、塩化アルミニウム)を含む、pH6
,5〜7.5の水溶液表面上に展開覆ることにより、単
分子膜となしうる。次いで、該単分子膜を、その表面圧
りか1〜3omN(ミリN)/mになるように圧、縮し
たのち、そのままの圧縮条件で膜面下の水相に前記の抗
体タンパクを注入する。所定時間(通常、30分〜1時
間)、該免疫タンパクと水面上の単分子膜とを接触させ
てあくことにより、タンパクと該単分子膜との複合化が
完了する。この時点で抗体タンパクとポリマー単分子膜
との複合体膜を、表面圧力30〜50mN/mにて再び
圧縮したのち、固体基板上にラングミュア・プロジェッ
ト法又は水平付着法(詳細は新実験化学講座第18巻第
439頁参照)により一層又は複数層積層する。
わし、nは2〜10.000の整数を表わす)前記の共
重合体は、ベンビンやクロロホルム等の有機溶媒に溶解
させ、0.5〜1.5ミリモル/りの溶液となしたのら
、これを蒸溜水又は多価金属塩(例えば、塩化バリウム
、塩化カドミウム、塩化アルミニウム)を含む、pH6
,5〜7.5の水溶液表面上に展開覆ることにより、単
分子膜となしうる。次いで、該単分子膜を、その表面圧
りか1〜3omN(ミリN)/mになるように圧、縮し
たのち、そのままの圧縮条件で膜面下の水相に前記の抗
体タンパクを注入する。所定時間(通常、30分〜1時
間)、該免疫タンパクと水面上の単分子膜とを接触させ
てあくことにより、タンパクと該単分子膜との複合化が
完了する。この時点で抗体タンパクとポリマー単分子膜
との複合体膜を、表面圧力30〜50mN/mにて再び
圧縮したのち、固体基板上にラングミュア・プロジェッ
ト法又は水平付着法(詳細は新実験化学講座第18巻第
439頁参照)により一層又は複数層積層する。
その際の抗体タンパクの固体基板上への固定化量は、積
層時の水面展開膜の基板への転移比及びUv−吸収スペ
クトル強度より算出される。
層時の水面展開膜の基板への転移比及びUv−吸収スペ
クトル強度より算出される。
かくして得られた基板上の複合体は、抗体タンパクの抗
原−抗体反応活性を酵素免疫診断法(EIA)により求
めた結果、すぐれた活性を示すものであった。
原−抗体反応活性を酵素免疫診断法(EIA)により求
めた結果、すぐれた活性を示すものであった。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。
実施例1
ポリ(オフタデセン−1−無水マレイン酸)(以下[P
A−18]と略す>4m(Jを25dの蒸沼クロロホル
ムに溶解し、562 cm2の水槽表面積を有する表面
圧−面積曲線(以下π−八凹曲線略す)測定用水槽に張
った塩化バリウム3X10−5M、炭酸水素カリウム4
X 10−4 Mの混合水溶液上に、ウルトラマイク
ロピペットを用いて、上記溶液250μmを徐々に滴下
した。それぞれ1 、10.20又は30mN/mの表
面圧まで仕切板を移動させることにより圧縮した後、水
流からヒトIgG水溶液を濃度0、O2mMdになるま
で注入するという四種の実験を行った。1時間静置した
処、いずれの場合も表面圧の増加が認められ(表−1参
照)、ヒト卸Gの吸着が示唆された。
A−18]と略す>4m(Jを25dの蒸沼クロロホル
ムに溶解し、562 cm2の水槽表面積を有する表面
圧−面積曲線(以下π−八凹曲線略す)測定用水槽に張
った塩化バリウム3X10−5M、炭酸水素カリウム4
X 10−4 Mの混合水溶液上に、ウルトラマイク
ロピペットを用いて、上記溶液250μmを徐々に滴下
した。それぞれ1 、10.20又は30mN/mの表
面圧まで仕切板を移動させることにより圧縮した後、水
流からヒトIgG水溶液を濃度0、O2mMdになるま
で注入するという四種の実験を行った。1時間静置した
処、いずれの場合も表面圧の増加が認められ(表−1参
照)、ヒト卸Gの吸着が示唆された。
表−1
実施例2
実施例1と同様にして水面上に展開したPA−18を3
0mN/mの表面圧下で圧縮しながら水中からヒトIg
G水溶液を12度0.1m(J/厩になるように注入し
た後、1時間静置した。この水面展開膜を疎水化処理(
シランカップリング処理)を施した石英板上に水平付着
法によって1層転写した。
0mN/mの表面圧下で圧縮しながら水中からヒトIg
G水溶液を12度0.1m(J/厩になるように注入し
た後、1時間静置した。この水面展開膜を疎水化処理(
シランカップリング処理)を施した石英板上に水平付着
法によって1層転写した。
次いで、この転写膜にベルオキシターゼff!識抗ヒト
IIG抗体(20μm/rnll>液を作用させた後、
オルトフェニレンジアミン−過酸化水素混合溶液中に浸
漬した処、呈色(褐色)が認められ、転写膜中のヒトI
(IGの抗原活性が保持されていることがわかった。
IIG抗体(20μm/rnll>液を作用させた後、
オルトフェニレンジアミン−過酸化水素混合溶液中に浸
漬した処、呈色(褐色)が認められ、転写膜中のヒトI
(IGの抗原活性が保持されていることがわかった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、水相面上に展開された水不溶性ポリ(オレフィン−
無水マレイン酸)単分子膜に当該水相中に溶解した水溶
性抗体タンパクを接触させることにより当該水相界面で
抗体タンパク−単分子膜複合体を形成させ、それを固体
基板上に積層することを特徴とする抗体タンパクの固定
化方法。 2、当該ポリ(オレフィン−無水マレイン酸)がポリ(
オクタデセン−無水マレイン酸〉である特許請求の範囲
第1項記載の抗体タンパクの固定化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18201586A JPS6338164A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 抗体タンパクの固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18201586A JPS6338164A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 抗体タンパクの固定化方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6338164A true JPS6338164A (ja) | 1988-02-18 |
JPH0473749B2 JPH0473749B2 (ja) | 1992-11-24 |
Family
ID=16110843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18201586A Granted JPS6338164A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 抗体タンパクの固定化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6338164A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007225574A (ja) * | 2006-02-27 | 2007-09-06 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 固相担体の製造方法 |
JP2009522547A (ja) * | 2005-12-29 | 2009-06-11 | コーニング インコーポレイテッド | 検体アッセイのための支持体及びその製造方法及び使用方法 |
-
1986
- 1986-08-04 JP JP18201586A patent/JPS6338164A/ja active Granted
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009522547A (ja) * | 2005-12-29 | 2009-06-11 | コーニング インコーポレイテッド | 検体アッセイのための支持体及びその製造方法及び使用方法 |
JP4903224B2 (ja) * | 2005-12-29 | 2012-03-28 | コーニング インコーポレイテッド | 検体アッセイのための支持体及びその製造方法及び使用方法 |
JP2007225574A (ja) * | 2006-02-27 | 2007-09-06 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 固相担体の製造方法 |
JP4706502B2 (ja) * | 2006-02-27 | 2011-06-22 | 住友ベークライト株式会社 | 固相担体の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0473749B2 (ja) | 1992-11-24 |
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