JP6138260B2 - 細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法 - Google Patents
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Description
〔構成〕
本実施形態の細胞の分離回収膜(以下、適宜、単に「分離回収膜」という)は、支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する疎水性高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備えるものである。まず、これらの構造や機能について説明し、次いで、これらの結合の様子について図面を参照しながら説明する。
分離回収膜に備えられる支持体は、後記する高分子部位等を固定するものである。このような支持体はどのようなものであってもよいが、疎水性高分子部位等を化学的に固定できるものであることが好ましい。具体的には、支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んで構成されていることが好ましい。このような材料を用いることで、高分子部位等を固定するための表面処理が特に容易であり、また、表面処理のために加圧したときの耐久性に優れるという利点がある。
前記支持体に固定される高分子部位は、温度により構造が変化するものである。具体的には、例えば、室温では分子構造が維持されているものの、室温よりも高い所定温度以上では分子構造が崩れるものである。このような構造変化により、詳細は後記するが、高分子部位に結合された細胞吸着部位を後記する親水性部位の中に埋没させることができ、分離回収膜から標的細胞を脱離させ易くなる。
細胞吸着部位は、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能なものである。従って、細胞吸着部位は、分離回収の対象となる標的細胞に応じて適宜決定して用いればよい。中でも、細胞吸着部位として、標的細胞を抗原とする抗体を用いることが好ましい。抗体を用いることで、生体組織である細胞に対して、生物反応である抗原抗体反応を利用することができ、特異的に標的細胞を吸着できるとともに、脱吸着の制御がより容易になる。
親水性部位は、分離回収膜の外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触(例えば含浸)させたときに、前記被処理液が接触する部位である。高分子部位及び細胞吸着部位以外の部位に、外表面に露出するように親水性部位が設けられることで、細胞の非特異的な吸着をよりいっそう抑制することができる。
次に、本実施形態の分離回収膜における構成及び作用について、図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
図1は、本実施形態の分離回収膜10の斜視図である。分離回収膜10は、マクロの視点で観察すると、支持体1の表面に薄膜2が形成されている。この薄膜2には、前記の高分子部位や細胞吸着部位、親水性部位等が含まれている。
次に、本実施形態の分離回収膜の製造方法について説明する。本実施形態の分離回収膜の製造方法は特に制限されないものの、例えば以下の方法により製造することができる。なお、以下の説明では、分離回収膜の製造方法の一例として、親水性部位が高分子部位に結合した分離回収膜を製造する場合を挙げて、図2(a)を参照しながら説明する。
次に、本実施形態の分離回収膜の用途について、図面を参照しながら説明する。本実施形態の分離回収膜は、どのような用途にも適用可能であるが、例えば、細胞の培養シート等のバイオデバイスや、細胞の培養装置等に好適である。以下、本実施形態の分離回収膜の好適な用途として、これら二つを例に挙げて説明する。
図4は、本実施形態の分離回収膜を用いて構成される培養シート50の上面図である。本実施形態の細胞の培養シート50(以下、適宜、単に「培養シート50」という)は、前記の分離回収膜10と同様の構成を有するものである。細胞培養シート50は、厚さ0.5μmのポリスチレンを主成分とする支持体1と、この薄膜に立設され、ポリスチレンを主成分とする複数の柱状微細突起2A(以下、単に「突起2A」という)とを備えている。突起2Aは円柱状であり、その直径は500nm、高さは1μmである。それぞれの突起2Aは1μmの周期(ピッチ)で配列している。また、本実施形態の培養シート50においては、はじめに円柱状に突起2Aが形成されたあと十字形状に突起2Aが除去され、十字形状の隙間51が形成されている。
本実施形態の細胞の培養装置100(以下、適宜、単に「培養装置100」という)は、前記の分離回収膜10を備えるものである。そして、この培養装置100により、被処理液に含まれる標的細胞の分離回収が行われる。以下、培養装置100の具体的な装置構成と、培養装置100を用いた細胞の分離回収方法について説明する。
<実施例1〜3>
(PEG修飾ポリリジンの調製)
まず、1−エチル−3−カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びカルボン酸末端のポリエチレングリコール(前記式(1)においてx=3)を純水に溶解させ、この溶液を4℃に冷却、撹拌しながら、ポリリジン(種々の分子量が混在)を加えた。そして、常温で2時間撹拌し、ポリリジン(高分子部位)の側鎖にポリエチレングリコール(親水性部位)が結合したPEG修飾ポリリジンを得た。
実施例1〜3のポリリジンを、それぞれ、表面にアミノ基処理を施した樹脂プレート(ポリスチレン製の支持体)上に以下の手順に従って共有結合させた。1mol%のポリリジン水溶液に、1−エチル−3−カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を加え、各プレートを浸漬した。その後、室温で2時間反応させた。これにより、ポリリジンを結合させた支持体を得た。その後、純水で各プレートを3回洗浄した。
実施例1〜3のポリリジンを結合させた3種のプレートを、炭酸緩衝液で希釈した2%グルタルアルデヒドに浸漬し、37℃で2時間静置した。反応後の各プレートをリン酸緩衝液(PBS)で3回洗浄した。そして、濃度0.1wt%のプロテインA水溶液(pH7.4のPBS緩衝液を使用)を調整し、このプロテインA溶液に各プレートを浸漬し、プロテインAをポリリジンに結合させた。
続いて、以下の手順に従い、各プレートに固定されたプロテインA(抗原)に対し、抗体CD40を結合させた。抗体CD40はチャイニーズハムスター卵巣細胞に特異的に結合可能な抗体である。まず、各プレートを洗浄バッファ(200μl)で3回洗浄した後、免疫グロブリンG(IgG)を50μlずつ加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。これにより、プロテインAにIgGが結合した。その後、4℃に保ちながら洗浄バッファ(200μl)を用いて、各プレートを3回洗浄した。その後、抗体CD40の溶液に各プレートを浸漬し、抗体CD40をIgGに結合させた。以上の操作により、実施例1〜3の分離回収膜を作製した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)及び間葉系幹細胞(MSC)を1対1で含む緩衝水溶液を、実施例1〜3の分離回収膜にそれぞれ4℃で滴下し、インキュベートした。分離回収膜の抗体CD40には、MSCは吸着せず、CHO細胞が特異的に吸着する。その後、緩衝水溶液で各プレートを3回洗浄することで、非特異的に吸着したMSCを洗い流した。洗い流されたMSCは回収し、フローサイトメータにより、細胞数を確認した。なお、フローサイトメータにおけるCHO細胞とMSC細胞との区別は、MSC細胞をFITC標識抗CD105抗体で蛍光標識することで行った。
(細胞の選択率)=(分離回収膜で回収した細胞の数)/(回収前の細胞の数)×100[%] ・・・式(1)
B細胞及びMSCを1対1で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は実施例1と同様にして選択率を評価した。なお、分離回収膜の抗体CD40には、MSCは吸着せず、B細胞が特異的に吸着する。
血中循環腫瘍細胞(CTC)及びMSCを1対1で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は実施例1と同様にして選択率を評価した。なお、分離回収膜の抗体CD40には、MSCは吸着せず、CTCが特異的に吸着する。
「カルボン酸末端のポリエチレングリコール」を用いなかったこと(即ち、親水性部位を含まないこと)、及び、ポリリジン(親水性部位を含まないポリリジン)の数平均分子量を7kDaとしたこと以外は実施例1と同様にして、比較例1の分離回収膜を作製した。そして、この分離回収膜について、実施例1と同様にして選択率の評価を行った。
実施例1と同様の方法により、図4及び図5に示す培養シートを作製した。作製した培養シートを、培養液を浸したガラスシャーレに入れ、培養シート上で、正常ヒト表皮角化細胞を培養した。この培養には、クラボウ社製のHuMedia−KB2が培地として使用され、培養温度が37℃であり、5%の二酸化炭素の流下で行われた。
2 薄膜
2a 高分子部位
2b 細胞吸着部位
2c 親水性部位
50 培養シート
100 培養装置
102b 含浸装置
104 加熱装置
105 細胞回収装置
105a 細胞回収液
Claims (7)
- 支持体と、
前記支持体に共有結合し、ポリリジンにより構成される高分子部位と、
前記高分子部位の末端に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
前記高分子部位を構成するポリリジンの側鎖に共有結合し、ポリエチレングリコールにより構成される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっていることを特徴とする、細胞の分離回収膜。 - 前記高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることを特徴とする、請求項1に記載の細胞の分離回収膜。
- 前記細胞吸着部位は、前記標的細胞を抗原とする抗体であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の細胞の分離回収膜。
- 前記支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んでいることを特徴とする、請求項1又は2に記載の細胞の分離回収膜。
- 支持体と、
前記支持体に共有結合し、ポリリジンにより構成される高分子部位と、
前記高分子部位の末端に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
前記高分子部位を構成するポリリジンの側鎖に共有結合し、ポリエチレングリコールにより構成される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜を含むことを特徴とする、細胞の培養シート。 - 支持体と、
前記支持体に共有結合し、ポリリジンにより構成される高分子部位と、
前記高分子部位の末端に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
前記高分子部位を構成するポリリジンの側鎖に共有結合し、ポリエチレングリコールにより構成される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜を具備することを特徴とする、細胞の培養装置。 - 支持体と、前記支持体に共有結合し、ポリリジンにより構成される高分子部位と、前記高分子部位の末端に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、前記高分子部位を構成するポリリジンの側鎖に共有結合し、ポリエチレングリコールにより構成される親水性部位と、を備え、前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜と、
前記細胞の分離回収膜を前記被処理液に接触させる接触装置と、
前記細胞の分離回収膜を加熱又は冷却する加熱冷却装置と、
前記細胞の分離回収膜に吸着した前記標的細胞を回収する細胞回収装置と、を具備する細胞の培養装置を用いて行われ、
前記細胞の分離回収膜を、前記接触装置によって前記標的細胞を含む被処理液に接触させて、前記被処理液中の標的細胞を前記細胞吸着部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、
前記分離回収膜接触ステップにおいて接触させた細胞の分離回収膜を、前記被処理液外において前記加熱冷却装置により加熱又は冷却する加熱冷却ステップと、
前記加熱冷却ステップにおいて加熱又は冷却された細胞の分離回収膜の表面に膜処理液が供給され、供給された膜処理液を前記細胞回収装置により回収して、前記細胞吸着部位に吸着した前記標的細胞を回収する標的細胞回収ステップと、を含むことを特徴とする、細胞の分離回収方法。
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