CN106011123B - 真菌疏水蛋白hgfi在胰蛋白酶固定化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及真菌疏水蛋白HGFI在胰蛋白酶固定化中的应用，其首次利用真菌疏水蛋白中的特定蛋白实现对胰蛋白酶的固定，其中，充分利用了疏水蛋白HGFI高效的自组装成膜和固定化能力，并通过静态吸附的方法利用真菌疏水蛋白HGFI对聚苯乙烯材料表面进行修饰，并进一步通过静电作用力将胰蛋白酶固定到HGFI修饰的聚苯乙烯表面，利用HGFI的生物源性和高表面活性改善聚苯乙烯的疏水性和生物相容性，最终改善了胰蛋白酶在疏水载体表面的催化活性，延长了胰蛋白酶的使用寿命，增加了胰蛋白酶的使用次数。提高了胰蛋白酶在科研和工业中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及真菌疏水蛋白HGFI在胰蛋白酶固化中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
胰蛋白酶是从动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶，由于它能够特异性切割肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基端，所以已经被广泛应用在了科学研究和工业生产中。鉴于胰蛋白酶的不稳定性问题，为了改善其稳定性，提高其使用效率，需对胰蛋白酶进行固定化处理。
目前，胰蛋白酶固定化的策略主要包括包埋法、共价交联法和物理吸附法三种。与其它两种方法相比，物理吸附法具有操作简单、省时省力且容易对酶量进行控制的优点；同时，该方法能够更好的保留胰蛋白酶的天然结构和催化活性，并且也使得底物更易于靠近胰蛋白酶的活性位点。另外，物理吸附法能够避免化学法在固定胰蛋白酶过程中产生的不利化学反应物对酶稳定性的影响，从而进一步提高了胰蛋白酶的利用效率。然而在物理吸附法中，保障胰蛋白酶能够稳定并且长时间得在支持物表面保持高的酶活是胰蛋白酶固定化的关键，那么寻找合适的固定化载体就尤为重要。
真菌疏水蛋白是由丝状真菌在生长特定时期产生的一类具有特殊理化性质的分泌型小分子量蛋白质。它可以在两相界面处自我装配，吸附于介质表面，形成一层约10纳米厚的两性蛋白膜，改变介质表面的亲水性或疏水性，是一种新型、天然、纳米级膜表面活性材料。国际上，真菌疏水蛋白在医学上的应用主要集中在以下几个方面：蛋白(酶)、核酸和细胞的固定化、生物传感器电极的修饰、生物活性包被材料。真菌疏水蛋白具有非常稳定的自我装配特性，而且无细胞毒性，也无强免疫原性，这使得它们在生物材料的表面包被应用中成为热点，例如在外科手术器械包被和内科移植等领域均有广阔的应用前景。真菌疏水蛋白膜可以增加疏水性材料表面的可湿性，进而提高疏水表面的生物适应性；真菌疏水蛋白膜也可以防止体内非特异性的蛋白结合和细菌粘附；另一方面，真菌疏水蛋白被覆层可以增强如纤维原细胞等的粘附，在组织工程方面也有应用前景。
现有技术中，在对胰蛋白酶进行固定化处理时均无法采用真菌疏水蛋白。也没有公开任何使用真菌疏水蛋白对胰蛋白酶进行固定化处理的技术。是否可以采用真菌疏水蛋白利用物理吸附法实现胰蛋白酶的固定化处理是目前没有解决的技术问题。
HGFI是从食用真菌灰树花中发现的真菌疏水蛋白。经研究发现该蛋白具有稳定的自组装成膜和固定化能力，能够对聚苯乙烯、聚已内酯和硅化玻璃等疏水材料表面起到很好的修饰作用，改善它们的疏水性，进而提高疏水材料的组织相容性。其作为真菌疏水蛋白的一种，同样没有被用于胰蛋白酶的固定化处理中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中在对胰蛋白酶进行固定化处理时均无法采用真菌疏水蛋白。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
真菌疏水蛋白HGFI在胰蛋白酶固定化处理中的应用。
利用静态吸附法，使用真菌疏水蛋白HGFI对聚苯乙烯表面进行修饰。
所述真菌疏水蛋白HGFI水溶液的浓度为100μg/mL。
取100μL真菌疏水蛋白HGFI水溶液滴到聚苯乙烯表面，室温下静置过夜，对其进行修饰。
所述胰蛋白酶溶液为胰蛋白PBS溶液。
配制浓度为1mg/mL的胰蛋白PBS溶液，吸取100uL胰蛋白PBS溶液滴到经真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯表面，在室温下静置至少30分钟；
吸去残余液体，用PBS溶液洗涤聚苯乙烯表面即可。
洗涤次数至少为三次，之后吹干表面于4℃储存备用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明首次发现了可以利用真菌疏水蛋白中的特定蛋白实现对胰蛋白酶的固定，充分利用了疏水蛋白HGFI高效的自组装成膜和固定化能力，并通过静态吸附的方法利用真菌疏水蛋白HGFI对聚苯乙烯表面进行修饰，并进一步通过静电作用力将胰蛋白酶固定到HGFI修饰的聚苯乙烯表面，利用HGFI的生物源性和高表面活性改善聚苯乙烯的疏水性和生物相容性，最终改善了胰蛋白酶在疏水载体表面的催化活性，延长了胰蛋白酶的使用寿命，增加了胰蛋白酶的使用次数。提高了胰蛋白酶在科研和工业中的应用。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1(a)是未修饰聚苯乙烯的水接触角测定图；
图1(b)是水冲洗真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯的水接触角测定图；
图1(c)是SDS冲洗真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯水接触角测定图；
图2是HGFI自组装成膜能力的X射线光电子能谱图测定图；
图3(a)、图3(b)、图3(c)依次是未修饰聚苯乙烯、真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯、真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯对胰蛋白酶固定化的相差显微镜测定图；
图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)依次是胰蛋白酶在未修饰的聚苯乙烯上3小时、胰蛋白酶在未修饰的聚苯乙烯上3天、胰蛋白酶在真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯上3小时、胰蛋白酶在真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯上3个月的荧光显微镜测定图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明请求保护的内容进行说明。
实施例1
(1)配制浓度为1mg/mL的胰蛋白PBS溶液；
(2)配制浓度为100μg/mL的真菌疏水蛋白HGFI水溶液；
(3)取100μL真菌疏水蛋白HGFI水溶液滴到聚苯乙烯表面，室温下静置过夜，对其进行修饰，得到经真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯；
(4)吸取100uL胰蛋白PBS溶液滴到经真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯表面，在室温下静置30分钟；
(5)吸去残余液体，用PBS溶液洗涤聚苯乙烯表面即可。
测试例1：真菌疏水蛋白HGFI对聚苯乙烯表面亲疏水性改变的检测
(1)配制100μg/mL的真菌疏水蛋白HGFI水溶液；
(2)准备未修饰聚苯乙烯、水冲洗HGFI修饰的聚苯乙烯、SDS冲洗HGFI修饰的聚苯乙烯待用，用移液器各取100μL真菌疏水蛋白HGFI水溶液滴在聚苯乙烯表面，在室温下静置过夜；
(3)吸去残余的蛋白溶液，用去离子水洗涤三次，用氮气将聚苯乙烯表面吹干；
(4)将5μL的超纯水迅速滴在待测聚苯乙烯表面，进行接触角测量，并同时快速拍照。
本发明对依次为未修饰聚苯乙烯、水冲洗真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯、SDS冲洗真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯水接触角进行测定，测试结果见图1(a)、图1(b)、图1(c)，从上述测定可知：真菌疏水蛋白HGFI能够在疏水的聚苯乙烯表面自组装成稳定的蛋白膜，从而改善其表面的疏水性。
测试例2：真菌疏水蛋白HGFI在聚苯乙烯表面自组装成膜能力的测定
(1)配制100μg/mL的真菌疏水蛋白HGFI水溶液；
(2)吸取100μL真菌疏水蛋白HGFI水溶液滴在聚苯乙烯的表面，在室温下静置过夜；
(3)吸去残余的蛋白溶液，用去离子水洗涤聚苯乙烯表面三次，在用氮气吹干表面。进行X射线光电子能谱分析，测试结果见图2，可知：真菌疏水蛋白HGFI能够在聚苯乙烯表面自组装成致密的蛋白膜从而改变聚苯乙烯表面的元素组成。
测试例3：真菌疏水蛋白HGFI修饰后的聚苯乙烯对胰蛋白酶固定化能力的测定
(1)配制1mg/mL的胰蛋白PBS溶液；
(2)吸取100μL胰蛋白PBS溶液滴在真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯的表面，在室温下静置30分钟；
(3)吸去残余的溶液，用PBS洗涤聚苯乙烯表面三次，在用氮气吹干表面，4℃储藏备用。
图3(a)、图3(b)、图3(c)依次为未饰聚苯乙烯、HGFI修饰的聚苯乙烯、HGFI修饰后聚苯乙烯固定化胰蛋白酶的相差显微镜观测图从相差显微镜观测可以看到，未经修饰的聚苯乙烯表面非常平整、光滑见图3(a)，而经过真菌疏水蛋白HGFI修饰以后聚苯乙烯表面出现了一层蛋白膜，这是由于HGFI在其表面自组装形成的，见图3(b)；并且大量的胰酶能吸附到这层蛋白膜上实现其固定化见图3(c)。
测试例4：固定化胰酶催化活性的测定实验
(1)配制0.5mg/mL FITC标记的酪蛋白溶液；
(2)吸取200μL滴在以固定好胰蛋白酶的聚苯乙烯上，在37℃避光缓慢摇动2小时；
(3)吸取50μL上述反应液于一个空离心管中，加入100μL5％的三氯乙酸，混匀后37℃放置10分钟；
(4)将上述离心管置于离心机中8000g离心5分钟；
(5)吸取一定量离心后的上清液在荧光显微镜下进行观察。
观察结果见图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)所示，可知：与未修饰的聚苯乙烯相比，胰酶在真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯表面上保持了长时间并且高效的催化活性。由于胰酶能以FITC标记的蛋白酪为底物将其切割成小片段，在加入三氟乙酸离心后可能留在上清液中，而未被切割FITC标记的蛋白酪在离心后会沉淀下去。所以胰酶的活性越高在上清液中得到的小片段越多，在荧光显微镜下观察到的荧光强度越大。当胰酶在未修饰的聚苯乙烯表面上固定3小时，其对FITC标记的蛋白酪有一定的催化活性，所以能够检测到一定量的荧光存在。但是当胰酶在未修饰的聚苯乙烯表面上固定3天后，没有检测到荧光信号，证明其酶活性已经完全丧失。当胰酶在疏水蛋白修饰的聚苯乙烯表面进行固定化时，在固定化3小时时，能够检测到荧光信号远强于未修饰聚苯乙烯对胰酶的固定化，并且在固定化3个月还能保持很好的活性。说明与未修饰的聚苯乙烯相比，胰酶在真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯表面上保持了长时间并且高效的催化活性。
虽然本发明已经通过上述具体实施例对其进行了详细阐述，但是，本专业普通技术人员应该明白，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变化，均属于本发明所要保护的范围。
Claims (6)
1.真菌疏水蛋白HGFI在胰蛋白酶固定化处理中的应用，其特征在于，利用静态吸附法，使用真菌疏水蛋白HGFI对聚苯乙烯表面进行修饰。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌疏水蛋白HGFI水溶液的浓度为100μg/mL。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，取100μL真菌疏水蛋白HGFI水溶液滴到聚苯乙烯表面，室温下静置过夜，对其进行修饰。
4.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，将胰蛋白酶溶于PBS溶液中制备胰蛋白PBS溶液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，配制浓度为1mg/mL的胰蛋白PBS溶液，吸取100uL胰蛋白PBS溶液滴到经真菌疏水蛋白HGFI修饰的聚苯乙烯表面，在室温下静置至少30分钟；
吸去残余液体，用PBS溶液洗涤聚苯乙烯表面即可。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，洗涤次数至少为三次，之后吹干表面于4℃储存备用。
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