JP5445348B2 - 蛍光分光光度計 - Google Patents

Description

本発明は、試料に特定の波長の光を励起光として照射し、励起された試料から発せられる光量を測定する蛍光分光光度計に関する。

蛍光分光光度計は、試料に励起光を照射して励起状態にし、励起状態から基底状態に戻る際に発せられる蛍光を測定することによって、試料の分析を行う装置である。

ここで、一般的な蛍光分光光度計について図１を用いて説明する（特許文献１）。蛍光分光光度計は、光源１、励起側分光器２、試料セル３、出射側分光器４、検出器５を有する。光源１から発せられた光は励起側分光器２によって分光され、所望の波長λ_Exを有する単色光のみが試料セル３に照射される。波長λ_Exの光により試料セル３内の試料は励起し、蛍光を発する。出射側分光器４及び検出器５は、このようにして試料から発せられた蛍光を検出するものであり、出射側分光器４の波長は蛍光波長λ_Emに設定されている。また、試料の発する蛍光の強度は試料セル３の透過光と比べると微弱であるため、出射側分光器４は透過光が入らないよう、照射光の光路から外れた位置に配置されている。検出器５の検出結果は出力部６に出力され、グラフ化などが行われる。

励起側分光器２及び出射側分光器４は、それぞれ、回折格子２１、４１と回折格子駆動機構２２、４２を備える。回折格子駆動機構２２、４２により回折格子２１、４１を駆動し、所定の傾斜角度にすることで、励起側分光器２、出射側分光器４の設定波長を所望の波長に設定する。励起光の波長λ_Exと試料から発せられる蛍光の波長λ_Emは通常異なるため、励起側分光器２と出射側分光器４では、異なる波長が設定されている。

特開2008-286562号公報

蛍光分光光度計では、測定試料の最適励起波長や最適蛍光波長を設定して試料分析を行う必要がある。しかし、未知の試料に対して、最適な励起波長、蛍光波長を設定することは困難である。

一般に、試料の吸光波長がその試料の励起波長として適切となる場合が多い。本発明はこの点に着目して上記の問題を解決しようとしたものであり、励起波長等が未知の試料に対しても適用可能な蛍光分光光度計を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために成された本発明の第一の態様に係る蛍光分光光度計は、
光源と、
試料セルと、
前記光源からの光を分光し、所望の波長の光を前記試料セルに照射する励起側分光系と、
前記励起側分光計から前記試料セルに入射し、該試料セルを透過した透過光の光路上から外れた位置に配置された、前記試料セルからの出射光を分光する出射側分光系と、
前記出射側分光系からの出射光のうち前記励起側分光系から前記試料セルに照射された光と同一波長の出射光を検出可能である光検出器と、
前記励起側分光系と前記出射側分光系の設定波長を同一に維持しつつ所定の波長範囲で連続的に変化させる制御手段と、
前記励起側分光系及び前記出射側分光系の設定波長ごとの前記光検出器の検出結果から、スペクトルデータを取得するスペクトルデータ取得手段と、
を有することを特徴とする。

上記課題を解決するために成された本発明の第二の態様に係る液体クロマトグラフ装置は、
第一の態様に係る蛍光分光光度計と分離カラムとを備え、
前記分離カラムで分離された試料を移動相とともに前記試料セルに流し、
前記スペクトルデータ取得手段は、設定波長毎のスペクトルの時間変化データを取得することを特徴とする。

一般に、物質中の電子は特定の波長の光を照射されると励起状態に遷移するが、このとき照射光のエネルギーを吸収する。吸光分析法はこの原理を利用したものであり、試料が吸収した光の量（吸収強度）を測定することによって試料分析を行う。通常の吸光光度計では、蛍光分光光度計とは異なり、試料セルを透過した透過光の強度を光検出器で検出する。検出器で検出された透過光の強度を照射光の強度と比較し、試料を透過したことによって減少した光強度を基に吸光度を算出し、試料分析を行う。

本発明に係る蛍光分光光度計では、出射側分光系は、励起側分光系から試料セルに入射し、該試料セルを透過した透過光の光路上から外れた位置に配置されているため、試料セルを透過した光は励起側分光系に入射しない。また、出射側分光系は励起側分光系と同一の波長に設定されている。励起波長と蛍光波長は通常異なる波長であるため、分光器の設定波長が励起波長であった場合でも、励起により生じる蛍光は本発明の光検出器では検出されない。本発明の励起側分光系に入射するのは、照射光が試料と衝突することによって生じる散乱光（レイリー散乱光）である。

試料が照射光に対して吸光特性を持つ場合、透過光と同様、レイリー散乱光も減衰する。従って、本発明に係る分光光度計で照射光が励起波長を有する場合、光検出器で検出されるレイリー散乱光量は減少する。本発明に係る分光光度計では、励起側分光系と出射側分光系の設定波長を同一に維持しつつ波長走査を行うため、光検出器で検出される光量が減少するときの分光器の設定波長が当該試料の吸光波長となり、未知の試料の吸光特性を測定することが可能になる。

前述のように、本発明は、試料の吸光波長がその試料の励起波長として適切となる場合が多い点に着目したものである。即ち、本発明によって未知の試料の吸光特性が判明すれば、適切な励起波長の推測も可能になる。

また、本発明に係る蛍光分光光度計を液体クロマトグラフ装置に組み込んだ装置では、吸光波長特性の時間変化を測定することが可能になる。

従来の蛍光分光光度計の概略構成図。 本発明の実施例１に係る分光光度計の概略構成図。 本発明の実施例１に係る分光光度計で出力されたスペクトル図。 本発明の実施例２に係る分光光度計を用いた液体クロマトグラフ装置の概略構成図。 本発明の実施例２に係る分光光度計で出力された３次元スペクトル図。 本発明の実施例２に係る分光光度計と、一般的な吸光分光光度計におけるカフェインのスペクトル図。

本発明の実施形態について図２〜６を用いて説明する。

図２は本発明の実施例１に係る蛍光分光光度計の概略構成を示す図である。従来の蛍光分光光度計（図１参照）と同一部分については同一符号を付し、説明を省略する。

本実施例に係る蛍光分光光度計の構成は従来の蛍光分光光度計とほぼ同様であるが、励起側回折格子駆動機構２２と出射側回折格子駆動機構４２の回転角度が制御部７によって連動して制御され、同一波長λkを維持したまま連続的な波長走査が行うことができる。以下、波長λ１〜λｍの範囲で波長走査を実行して、その波長範囲に亘る吸光特性を測定する場合について説明する。

励起側分光器２と出射側分光器４の設定波長がλ１になるよう、制御部７は回折格子駆動機構２２、４２を制御して回折格子２１、４１の角度を設定する。励起波長が未知の試料Ａを試料セル３に注入し、光源１を点灯して波長λ１の励起光を試料Ａに照射する。試料Ａからの反射光が出射側分光器４に入射し、波長λ１のレイリー散乱光のみが検出器５で検出される。なお、散乱光は蛍光より強度が強いため、検出器５の増幅率を下げて使用している。

制御部７は、回折格子駆動機構２２、４２を連動させて制御し、回折格子２１、４１の角度を所定の角度Δθずつ僅かに変化させ、最終的に設定波長をλｍとする。検出器５は各波長ごとの検出結果を出力部６に出力し、試料Ａの吸光特性が出力される。

本実施例１の出力部６により出力された試料の吸光特性の一例を図３に示す。これによると、波長λiの光を照射されたときにレイリー散乱光が減衰していることが分かる。このことから、試料Ａは波長λiの光に対して励起することが予測されるため、試料Ａの特定や試料Ａに対する蛍光度測定などを行うことができる。ここで、図３の縦軸は検出器５が検出した検出値であるため、吸光波長λiのときにマイナス方向のピークが出現しているが、出力部６で検出値の極性を反転させて表示すれば、一般的な蛍光分光光度計や吸光分光光度計のクロマトグラフのようにプラス方向のピークを得ることもできる。

図４は、本発明の実施例２に係る蛍光分光光度計を用いた液体クロマトグラフ装置の概略構成を示す図である。実施例１の分光光度計（図２参照）と同一部分については同一符号を付し、説明を省略する。

本実施例に係る蛍光分光光度計の構成は実施例１のものとほぼ同様であるが、試料セル３の代わりにフローセル１１が使用されている。フローセル１１には液体クロマトグラフ装置８の分離カラム８１からの流路が接続されている。以下、分離カラム８で分離され、順次導入される試料Ｂに対し、実施例１と同様、波長λ１〜λｍの範囲の波長走査を実行して、その波長範囲に亘る吸光特性を測定する場合について説明する。

送液装置８２によって試料Ｂは移動相に乗って分離カラム８１に導入され、分離カラム８１を通過する間に時間方向に分離されて溶出し、順次フローセル１１に導入される。制御部７は励起側分光器２と出射側分光器４を連動させ、波長λ１〜λｍの範囲で設定波長を同一に維持したまま波長走査を行う。フローセル１１には分離カラム８１で分離された試料Ｂが順次導入されるため、波長走査は試料Ｂの溶出が終わるまで何度も繰り返される。検出器５は、順次導入される試料Ｂに対する波長走査の結果を検出して出力部６に出力し、出力部６は試料Ｂの吸光特性の時間変化を、信号強度Ａ、波長λk、時間Ｔを軸とした３次元のクロマトグラフとして出力する。

図５は、出力部６により得られた３次元クロマトグラフの一例である。この例では、検出器５で検出された検出値の極性が出力部６によって反転され、吸光時の信号強度が通常の吸光分光光度計や蛍光分光光度計で得られるクロマトグラフのようにプラス方向のピークとして示されている。このクロマトグラフから、試料Ｂの中に含まれていた成分ｂは検出開始からＴｐ秒後に溶出し、波長λｊの光を吸収することが分かる。即ち、試料Ｂに含まれる成分ｂの励起波長がλｊであることが分かる。

上記実施例１、２では励起波長や吸光波長が未知の試料に対して波長走査を行ったが、本発明に係る分光光度計は励起波長や吸光波長が既知の試料に対し、吸光光度計のように使用し、試料の定量分析等を行うこともできる。但し、検出するのは試料を透過した光ではなく、試料によって散乱されたレイリー散乱光である。

本発明に係る蛍光分光光度計では、出射側分光器の波長設定を変更するだけで、蛍光検出と吸光度検出の両方を行うことができる。つまり、カフェインのように蛍光を発しない物質も、励起によって蛍光を発する一般的な物質も、同一の分光光度計で分析を行うことができる点で有効である。

図６は、本発明の実施例２に係る蛍光分光光度計のフローセル１１にカフェインを含む試料を液体クロマトグラフの分離カラムから導入した場合の検出値と、通常の吸光分光光度計のフローセルに同様にカフェインを含む試料を導入した場合の信号強度を重ね合わせたものである。いずれの分光光度計でも、吸光波長（試料セルに入射する側の分光器の設定波長）は２７２ｎｍに設定されており、測定条件等は全く同一である。

通常の吸光分光光度計では、検出器が照射光路の延長上に配置されているため、検出器で検出されるのは試料セルを透過した透過光である。従って、カフェインがフローセルを通過する時点で吸光度のピークが認められる。本発明の実施例２に係る蛍光分光光度計では、透過光ではなくレイリー散乱光が検出されており、カフェインが通過する時点でレイリー散乱光の減衰が認められる。この結果から、本発明に係る蛍光分光光度計を吸光分光光度計のように使用できることが分かる。

なお、本発明は上記に限定されるものではなく、発明の趣旨の範囲で変更が許容される。

１…光源
２…励起側分光器
３…試料セル
４…出射側分光器
５…検出器
６…出力部
７…制御部
８…液体クロマトグラフ装置
１１…フローセル
２１…励起側回折格子
２２…励起側回折格子駆動機構
４１…出射側回折格子
４２…出射側回折格子駆動機構
８１…分離カラム
８２…送液装置

Claims (3)

1. 光源と、
   試料セルと、
   前記光源からの光を分光し、所望の波長の光を前記試料セルに照射する励起側分光系と、
   前記励起側分光系から前記試料セルに入射し、該試料セルを透過した透過光の光路上から外れた位置に配置された、前記試料セルからの出射光を分光する出射側分光系と、
   前記出射側分光系からの出射光のうち前記励起側分光系から前記試料セルに照射された光と同一波長の出射光を検出可能な光検出器と、
   前記励起側分光系と前記出射側分光系の設定波長を同一に維持しつつ所定の波長範囲で連続的に変化させる制御手段と、
   前記励起側分光系及び前記出射側分光系の設定波長ごとの前記光検出器の検出結果から、スペクトルデータを取得するスペクトルデータ取得手段と、
   を有する蛍光分光光度計。
2. 請求項１に記載の蛍光分光光度計と分離カラムとを備え、
   前記分離カラムで分離された試料を移動相とともに前記試料セルに流し、
   前記スペクトルデータ取得手段は、設定波長毎のスペクトルの時間変化データを取得することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
3. 光源と、
   試料セルと、
   前記光源からの光を分光し、所望の波長の光を前記試料セルに照射する励起側分光系と、
   前記励起側分光系から前記試料セルに入射し、該試料セルを透過した透過光の光路上から外れた位置に配置された、前記試料セルからの出射光を分光する出射側分光系と、
   前記出射側分光系からの出射光を検出可能な光検出器と、
   を備える蛍光分光光度計において励起波長を検出する方法であって、
   前記励起側分光系と前記出射側分光系の設定波長を同一に維持しつつ所定の波長範囲で連続的に変化させ、
   前記励起側分光系及び前記出射側分光系の設定波長ごとの前記光検出器の検出結果から、スペクトルデータを取得し、
   取得された前記スペクトルデータから試料の励起波長を検出する方法。

Images