JP5427772B2

JP5427772B2 - 有効な成分としての、歯周炎の予防および治療のための熟地黄、三七根またはそれの抽出物の混合物を含む組成物

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Publication number: JP5427772B2
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Inventors: キム・ジュンクン; キム・セウォン; ベク・ドンホン; キム・ヒュングン
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Description

本発明は、熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）、三七根（Notoginseng Radix）またはそれの混合物からの抽出物を活性成分として含む、歯周炎の予防および治療のための組成物に関する。

歯周組織は、歯槽骨、歯肉および歯根膜に分けることができる。歯肉は歯の支持構造であり、歯肉炎に罹り得る。歯の支持構造に広がって、歯根膜（歯のセメント質と歯槽骨を結びつけ、歯根を骨内部に覆う）、および歯槽骨（歯の周辺の歯槽を形成する）を破壊する場合、炎症は歯周炎を引き起こす。

歯周病（歯肉炎および歯周炎を含む）は、細菌により生じる、歯の支持構造の炎症であって、出血、歯周ポケットの形成、および歯槽骨破壊を伴い、結果的に歯の喪失を引き起こす。そのような歯周炎は、細菌コロニーの形成、歯周組織への細菌の浸潤、および歯周組織の破壊のプロセスにおいて発生する。以下で詳しく説明する。すなわち、口腔の不潔な衛生条件下で形成された細菌性バイオフィルムが、出血および口臭を伴って、歯茎における炎症を引き起こし得る。この口腔状態が進行すると、歯および歯肉の間に間隙が生じて歯周ポケットが形成され、そしてそこで細菌が増殖して一気に歯周炎が発生する。悪化した場合、歯周炎は、たとえ弱い刺激（例えば、歯磨き）であっても歯茎の出血を引き起こし、そしてしばしば疼痛の発生を伴う急性炎症に発展する。この炎症は、骨形成機能を弱め、また骨吸収を高めることで歯槽骨が減少するので、結果的に歯の喪失を引き起こす。

歯周炎には、多くの原因がある。局所的原因として、歯垢および歯石が歯周ポケット内に蓄積した場合、それらは隣接の嫌気性グラム陰性細菌に生育地を与え、これは歯周ポケットの深部まで増殖する。増殖した嫌気性グラム陰性細菌の毒素および生成物は、直接歯周組織を破壊するか、または免疫系を刺激し、次いでそれは炎症を伴って歯周組織の破壊を引き起こす。破壊に対する防御機構として、多核白血球および免疫応答が全身的要因として作用する。

嫌気性グラム陰性細菌の代謝の結果、細菌毒素である硫化水素、アンモニアおよびアミン（これらは、歯周組織にとって有毒である）が分泌され、同時にエンドトキシンリポ多糖（細胞壁の構成成分である）が直接歯周組織を破壊するか、または免疫系を刺激する。刺激された、液性免疫および細胞性免疫の様々な作用によって、活性酸素、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ヒスタミン、およびサイトカイン（例えば、インターロイキン）の細胞外分泌が起こり、歯周組織炎に罹る。また、細菌および白血球から分泌されたコラゲナーゼがコラーゲン（歯周組織のマトリックスである）を分解して、歯肉が変性し、それが歯周病を引き起こす。

したがって、嫌気性グラム陰性細菌を死滅するか抑制し、細菌の毒生産物を除去し、または変性した歯周組織を回復させることが、歯周病の予防および治療にとっての鍵となる。

歯周病の治療において、口腔の衛生状態の改善、または非外科的療法もしくは外科的療法（歯周組織の再生を含み、例えばスケーリング、ルートプレーニング、歯肉掻爬術および新たなアタッチメントである）が用いられてきた。しかし、そのような外科的療法は、患者が歯科医院へ行く必要がある。また、該外科的療法は、歯周病の予防というよりは、ある一定の程度（多くの場合、慢性状態）まで進行した歯周病の場合の治療に用いられ、そして全身投与の抗生物質または局所投与の徐放剤を伴う。薬剤は、過剰量が不必要な部分にまで送達され得るので、その副作用を回避できない。実際に、抗生物質に耐性を有する歯周炎細菌が単離されたことが報告されている。

したがって、破壊または損なわれた歯周組織を回復させる活性を有する、歯周病の予防および治療のための、薬剤または組成物が求められている。

メルチャー（Melcher）によると、歯周組織の再生の結果生じるものは、歯周組織の再生に係わる細胞の起源によって変わる。例えば、その結果には、骨から生じる細胞が再生に係わっている場合には骨結合、結合組織（例えば、歯肉線維芽細胞）から生じる細胞が再生に係わっている場合には歯根吸収、また上皮組織が再生に係わっている場合には長い付着上皮の産生が含まれる。しかし、これらの結果は、理想的な、歯周組織の再生と異なる。対照的に、理想的な歯周組織の再生は、歯根膜細胞から生じる細胞が再生に係わっている場合に生じ得る（Melcher A.H. Journal of Periodontology, 47(5);256-260, 1976）。

簡潔に言えば、歯周組織の再生において、歯肉線維芽細胞の成長の影響を受けることなく、歯根膜細胞の成長を促進することが理想的である。

それらが活性化されている場合に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞［それは細菌毒素の刺激によって免疫系から分泌される、多様な種類のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６）の分泌を引き起こす］は、その表面にオステオプロテジェリン・リガンドを発現して破骨細胞形成を促進し、それにより骨破壊における決定的な働きをするという事実に基づき、本発明者の見解では、歯周病の治療において、サイトカイン放出を抑制して炎症および歯槽骨破壊を防ぎ（Kong Y.Y. et al., Nature 402, 304-309, 1999）、また細胞増殖および骨芽細胞の分化を促進し並びに破骨細胞の形成および活性を減少させて歯槽骨を保護し、そして歯肉線維芽細胞の細胞増殖に影響を与えずに歯根膜細胞の細胞増殖を効果的に増加させることが必要である。

本発明では、熟地黄、三七根の多様な生理活性に関する集中的で徹底的な調査が本発明者によって行われ、熟地黄、三七根またはそれの混合物からの抽出物が、炎症の原因であるサイトカイン放出を抑制して炎症を防ぎ、細胞増殖および骨芽細胞の分化を促進し並びに破骨細胞の形成および活性を減少させて歯槽骨を保護し、そして歯肉線維芽細胞の細胞増殖に影響を与えずに歯根膜細胞の細胞増殖を効果的に増加させる機能を有するという結果が得られ、したがってこれらは歯周病の予防および治療に有用であり得る。

したがって、歯周病に起因する炎症を抑制し、細胞増殖および骨芽細胞の分化を促進し、破骨細胞の形成および活性を減少して歯槽骨破壊を防ぎ、そして歯根膜細胞の細胞増殖を刺激するために用いる、熟地黄および三七根からの各抽出物の混合物を活性成分として含む、歯周病の治療および予防のための組成物を提供することが本発明の目的である。

上記の目的を達成するために、本発明は、熟地黄および三七人参からの各抽出物の一つ、各抽出物の混合物、または熟地黄および三七人参の混合物からの抽出物を活性成分として含む、歯周病の治療および予防のための医薬組成物を提供する。

本発明はまた、熟地黄および三七人参からの各抽出物の一つ、各抽出物の混合物、または熟地黄および三七人参の混合物からの抽出物を活性成分として含む、歯周病の治療および予防のための健康食品組成物も提供する。

歯槽骨を保護し、および歯根膜細胞の細胞増殖を促進し、並びにＴＮＦ−α放出を阻害する活性を有する本発明の抽出物は、歯周病の治療および予防に適用できる。

図１はＴＮＦ−α放出に関して、本発明の抽出物の阻害効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図２はＴＮＦ−α放出に関して、本発明の薬草混合抽出物（the herbal mixture extracts）の阻害効果を示す。

図３は骨芽細胞の増殖に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図４は骨芽細胞中のオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）発現に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図５は骨芽細胞中のＯＰＧ発現に関して、本発明の薬草混合抽出物の効果を示す。

図６は破骨細胞の形成に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図７は破骨細胞の形成に関して、本発明の薬草混合抽出物の効果を示す。

図８は破骨細胞の活性に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図９は破骨細胞の活性に関して、本発明の薬草混合抽出物の効果を示す。

図１０はヒト歯肉線維芽細胞の増殖に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図１１はヒト歯肉線維芽細胞の増殖に関して、本発明の薬草混合抽出物の効果を示す。

図１２はヒト歯根膜細胞の増殖に関して、本発明の抽出物の効果を、抽出物の混合比に基づいて示す。

図１３では歯周炎に羅患したラットの骨量減少に関して、本発明の薬草混合抽出物の阻害効果を示す、組織の化学的写真を提供する（ＡＣおよびＣＥＪは、それぞれ歯槽骨頂およびセメントエナメル境を示す）。

図１４は歯周炎に羅患したラットの骨量減少に関して、本発明の薬草混合抽出物の阻害効果を示す。

（最良の形態）
本明細書の以下では、本発明の形態を詳細に記載する。

本発明は、熟地黄および三七根からの抽出物の混合物を含む、歯周病の治療および予防のための組成物に関する。

本発明において、熟地黄：三七根が１：８の混合物を熱水による抽出に３回さらし、該溶液を濾過し、４０℃またはそれ以下の減圧下で濃縮して、歯周病の予防および治療に有用な抽出混合物を得た。

熟地黄はゴマノハグサ科に属する植物であり、それの乾燥させていない根または乾燥させた根は漢方医学において薬用物質として用いられる。特に、９ラウンドの蒸し加熱および乾燥の後に得られる根は、薬として優れた効能を有する。温かい性質があり、甘苦く感じる根は、血に栄養を与え、本質（essence）を補う働きをする。したがって漢方医学において根は、腰および膝の痛み、生理痛およびめまいの治療に適用される。また、それらは髪の脱色を防ぐ機能を有することも知られている。熟地黄は、４つの薬草の煎じ薬（decoction）の主な成分である。それは、体の弱い体質、のどの乾燥、およびのどの渇きが原因である発熱の治療に用いられる。韓国の民間療法では、薬草はポーク・スープ（pork soup）と一緒に食べて、慢性便秘症を治療する。

三七根［三七人参（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）］はウコギ科の多年生植物で、朝鮮人参（ginseng）よりも小さく、７枚の葉を有し、中国南部で幅広く栽培されている。その根は、小さなシャトル（shuttle）のように見える。該植物は、３つの茎を有しそれに７枚の葉が付いていること、そして朝鮮人参のように見えることから、三七人参ともいわれる。その根は、３〜８％のサポニン含有量を有し、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｇ１、およびＲｅ、並びにノトジンセノサイドＲ１、Ｒ２、ＦａおよびＦｃを大量、そしてジンセノサイドＲ２、ｂ２、ｄ、ｅおよびｃを少量、さらにジンセノサイドＲ０を微量に含む。それの精油は、数の上では朝鮮人参よりも小さく、またオレアノール酸を含む。根は、生薬として止血および強心剤に用いられており、また動物実験で測定されたように、心臓の動脈における血流を増加させ、心筋の酸素消費量を低下させ、並びに血中における脂質およびコレステロール量を減少させる機能を有することが発見された。優れた抗炎症活性、鎮痛性活性および止血性活性を有しているので、三七根は炎症性疾患（肝炎を含む）治療のみではなく、創傷への直接塗布または経口投与によって行う、外部または内部の大量出血の治療においても有用である。

熟地黄、三七根またはそれの混合物からの抽出物は、通常の方法（例えば、冷沈殿（cold precipitation）、熱沈殿（hot precipitation）、加熱など）を通じて製造することができる。熟地黄、三七根またはそれの混合物は、水、アルコールまたはそれの混合物で処理することが好ましい。三七根の８重量部を、熟地黄の重量部毎に用いることが好ましい。該アルコールは、メタノールまたはエタノールが好ましい。熟地黄、三七根またはそれの混合物を７０〜８０℃でメタノールまたはエタノール中に３〜５時間浸すと、より好ましい。この手順の反応は、抽出効率を増加し得る。濃縮は、２０〜４０℃の減圧条件下で行ってもよいが、これに限定されない。熟地黄または三七根からの各抽出物に関して、それらは１〜１６：１６〜１の重量比で互いに混合してもよい。

歯周病に伴う骨量減少、炎症および結合組織の破壊に関する、主なサイトカインの原因はインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子であることが知られている（D.T. Graves and D. Cochran, The contribution of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor to Periodontal Tissue Destruction, Journal of Periodontology, 74(3):391-401, 2003）。

腫瘍壊死因子の分泌−α（以後、本明細書で「ＴＮＦ−α」という）に対して、本発明の抽出物の効果に関する試験を行った。これについて、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１をリポ多糖（ＬＰＳ）および本発明の抽出物で処理し、続いて酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、細胞培地におけるＴＮＦ−α量を分析した。結果としてＴＮＦ−α分泌は、本発明の抽出物（０.１ｍｇ／ｍｌ）を処理したことによって著しく抑制されたことが分かった（図１および２）。このことから本発明の抽出物は、ＴＮＦ−α分泌に対する抑制剤として用いることができる。

歯槽骨の骨形成は、ＯＰＧ分泌の増加とともに増加することが知られている（M.A. Taubman, P. Valverde, X. Han and T. Kawai, Immune Response: The Key to Bone Resorption in Periodontal Disease, Journal of Periodontology, 76(11 Suppl):2033-41, 2005）。

骨芽細胞を本発明の抽出物で処理した場合、それらは抽出物の濃度が増加するにつれて、ますます増殖した（図３）。また、ヒト骨肉腫ＭＧ−６３を本発明の抽出物で処理した場合、ＯＰＧは用量依存的に分泌された（図４および５）。

破骨細胞は骨髄の単球／マクロファージ前駆体から生成され、単球前駆細胞は血液を循環し、骨内膜層で増殖し、互いに融合して多核細胞を形成する（Scheven, B.A.A. et al., Nature, 321: 79-81, 1986）。破骨細胞は、破骨細胞と他の骨組織細胞とを識別するための組織化学的酵素として通常用いる酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現によって特徴付ける（Minkin, C., Calcif. Tissue Int., 34: 285-290, 1982）。

本発明の抽出物で処理した、推定される（presumable）破骨細胞ＴＲＡＰ（＋）多核細胞は、抽出物の濃度が増加するにつれて、ＴＲＡＰ（＋）多核細胞の形成、および破骨細胞の活性が大いに抑制される結果となる。特に、熟地黄および三七人参の混合抽出物は、ＴＲＡＰ（＋）多核細胞の形成、および破骨細胞の活性に対して有位な阻害効果を有する（図６−９）。

総合すると、これらの結果は、本発明の抽出物がＴＮＦ−α分泌を抑制し、ＯＰＧ分泌および骨芽細胞の増殖を促進し、並びに推定できる破骨細胞ＴＲＡＰ（＋）多核細胞の形成および破骨細胞の活性を阻害する機能を有することを示す。したがって本発明の抽出物は、歯周病の予防および治療（例えば、歯肉炎および歯周炎）に用いることができる。

活性成分に加えて、本発明における、歯周病の治療および予防のための医薬組成物は、少なくとも一つの医薬的に許容される担体を含んでもよい。医薬的に許容される担体の例には、食塩水、滅菌水、リンガー溶液、緩衝生理食塩溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびそれの２またはそれ以上の混合物が含まれる。必要ならば、組成物はさらに、他のありふれた添加剤（例えば、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤）を含んでもよい。また、組成物は、注射製剤（例えば、水溶液、懸濁液および乳濁液、丸剤、カプセル剤、顆粒剤または錠剤）として製造するために、さらに希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤を含んでもよい。さらに、組成物は好ましくは、その成分または目的に応じて、当技術分野で知られた適当な方法（例えば、Remington's Pharmaceutical Science (latest edition), Mack Publishing Company, Easton PA に記載されている方法）により製造され得る。

本発明の医薬組成物の投与ルートは、特に制限されるわけではないが、使用目的に従って、組成物を経口的または非経口によるルート（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または局所的なルート）で投与してもよい。いずれの特定の患者に関しても、具体的な治療上の有効服用量は、様々な要素（患者の体重、年齢、性別、一般的な健康状態および食事、投与時間、投与ルート、組成物の排泄率、並びに病気の重症度を含む）に依存して変えてよい。組成物を、１日の服用量が約０.１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは０.１〜５００ｍｇ／ｋｇ）の範囲で投与してよい。１日の服用量は、単回投与または複数の分割投与で投与することができる。

効果的な、歯周病の治療および予防のために、医薬組成物は好ましくは経口剤として製剤化してもよい。経口剤は特に限定されないが、一般的な形態でよい。経口剤の例には、歯磨き粉、口腔洗浄薬および洗口剤が含まれる。剤形に依存して、経口剤は、その製剤化に必要な様々な基剤成分および添加剤を含んでもよい。成分および添加剤の種類および量は、当業者により容易に選択され得る。例えば、経口剤が歯磨き粉の場合、それは研磨材、湿潤剤、発泡剤、結合剤、甘味料、ｐＨ調整剤、防腐剤、医薬的に有効な成分、漂白剤、着色剤、溶剤などを含んでもよい。

本発明はまた、熟地黄、三七人参、またはそれの混合物からの抽出物を含む、歯周病の予防および治療のための、健康食品組成物も提供する。

熟地黄、三七人参またはそれの混合物からの抽出物は、通常の方法（例えば、冷沈殿（cold precipitation）、熱沈殿（hot precipitation）、加熱など）を通じて製造することができる。熟地黄、三七人参またはそれの混合物は、水、アルコールまたはそれの混合物で処理することが好ましい。三七人参の８重量部を、熟地黄の重量部毎に用いることが好ましい。該アルコールは、メタノールまたはエタノールが好ましい。熟地黄、三七人参またはそれの混合物を７０〜８０℃でメタノールまたはエタノール中に３〜５時間浸すと、より好ましい。この手順の反応は、抽出効率を増加し得る。濃縮は、２０〜４０℃の減圧条件下で行ってもよいが、これに限定されない。熟地黄または三七人参からの各抽出物に関して、それらは１〜１６：１６〜１の重量比で互いに混合してもよい。

歯周病を軽減するために、本発明の抽出物を健康食品に加えてもよい。食品添加物として、薬草混合抽出物は通常の方法により、単独でまたは他の食品成分と組み合わせで適当に用いてもよい。薬草混合抽出物の量は、その目的（予防、健康改善または治療療法）によって変えてもよい。一般に、食品または飲料の製造に用いる場合、本発明の抽出物は、物質の重量に基づいて１００重量％またはそれ未満の量で加えてもよく、５０重量％またはそれ未満の量が好ましい。抽出物を、習慣的に摂取することが意図される健康食品に適用する場合、その含有量は上記の範囲を下回ってもよい。しかし、抽出物は身体への安全性に関して何ら問題が無いので、その範囲を上回る量で用いることもできる。

抽出物を適用できる食品の種類について、特に制限は課されない。食品の例には、これらに限定されないが、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー、スナック、菓子類、ピザ、ラーメン、麺類、乳製品、スープ、飲料、飲み物、アルコール飲料、ビタミン錠剤などが含まれる。通常受け入れられる健康食品は全て、本発明の抽出物を含むことができる。

現在入手可能な茶のように、本発明の健康食品組成物はさらに、様々な香味剤または天然炭水化物を含んでもよい。そのような天然炭水化物の例には、単糖類（例えば、グルコースおよびフルクトース）、二糖類（例えば、マルトースおよびショ糖）、多糖類（例えば、デキストリンおよびシクロデキストリン）、および糖アルコール類（例えば、キシリトール、ソルビトールおよびエリスリトール）が含まれる。また、甘味料である、例えば天然甘味料（例えば、タウマチンおよびステビア抽出物）または人工甘味料（例えば、サッカリンおよびアスパルテーム）も、本発明の抽出物が適用される健康食品に加えてもよい。天然炭水化物は、本発明の組成物１００ｍｌに基づいて、約０.１〜２０ｇの量（約１〜１０ｇの量が好ましい）を用いてもよい。また、本発明の組成物は、様々な栄養、ビタミン、ミネラル（電解質）、香味料、着色剤、ペクチン酸またはその塩、アルギン酸またはその塩、有機酸、保護コロイド性増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、および炭酸飲料に用いられる炭酸化剤（carbonating agents）を含んでもよい。さらに、本発明の組成物は、天然果汁、フルーツジュースおよび野菜ジュースの製造のための果肉を含むことができる。これらの成分は、単独でまたは組み合わせで用いてもよい。これらの添加剤の割合は重要でないが、一般に、本発明の組成物の１００重量部毎に０.０５〜５０重量部の範囲で選択される。

本発明のより良い理解は以下の実施例を通じて得ることができ、それは例示のために説明されるのであって、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物の製造
実施例１−１：水を用いる、熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物の製造
熟地黄および三七人参を薬草小売店から購入した。不純物に関する、三七人参および熟地黄薬草の試験の後、混じりけがない薬草のみを選択して以下の実験で用いた。三七人参を細かく刻み、熟地黄を１〜２ｃｍの厚さに切った。三七人参：熟地黄（８：１）の混合物（２００ｇ）を３Ｌフラスコ中に入れ、続いて１００℃の流動条件下で８時間、蒸留水（２，０００ｍｌ）を用いて３回抽出した。プール（pool）した後、得られた溶液を濾過し、エバポレーターを用いて減圧下、４０℃またはそれ以下の温度で５００ｍｌに濃縮した。その後、遠心分離をし（３，０００ｒｐｍ、２０分）、実験に使用するために、上澄みを凍結乾燥して粉末にした（収率６２％）。

実施例１−２：エタノールを用いる、熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物の製造
実施例１−１と同じ手順で行ったが、ただし水の代わりにエタノールを用いた。

実施例１−３：７５％エタノールを用いる、熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物の製造
実施例１−１と同じ手順で行ったが、ただし水の代わりに水（２５％）およびエタノール（７５％）の混合物を用いた。

実施例２：三七人参からの抽出物の製造
三七人参（１００ｇ）を細かく微粉砕し、その粉末を２Ｌ抽出器中に入れ、蒸留水（１０重量部）を加え、続いて９５〜１００℃で８時間熱抽出した。得られた溶液を吸引漏斗により濾過し、遠心分離した（３，０００ｒｐｍ、２０分）。上澄みを濾過した後、濾液をバキューム・エバポレーターにより４０℃で濃縮し、実験で使用するために、凍結乾燥して粉末とした（収率３３％）。

実施例３：熟地黄からの抽出物の製造
熟地黄（１００ｇ）を２Ｌ抽出器中に入れ、蒸留水（１０重量部）を加え、続いて９５〜１００℃で８時間熱抽出した。得られた溶液を吸引漏斗により濾過し、バキューム・エバポレーターにより４０℃で濃縮し、使用するまで冷蔵庫に貯蔵した（収率４５％）。

実験例１：ＴＮＦ−α分泌の抑制
本発明の抽出物について、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１からのＴＮＦ−α放出に対する阻害活性を測定した。

ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）から購入し、実験に用いる前に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＵＳＡ）で培養した。細胞を５×１０^５細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに入れ、ＬＰＳで刺激して、ＴＮＦ−αを分泌させた。

実験集団に、熟地黄および三七人参からの各抽出物を組み合わせ（約０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で加え、それとともにＬＰＳを加えた。あるいは、実験集団を混合抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）とＬＰＳで処理した。処理から２４時間後、培養培地のＴＮＦ−α量をＥＬＩＳＡで解析し、その結果を図１および図２並びに表１にまとめた。

図１および表１で見られるように、熟地黄および三七人参の各抽出物を様々な組み合わせ（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で処理した細胞は、コントロールと比較して、ＴＮＦ−α放出が用量依存的に有意に抑制されることを観察した。

また、図２で見られるように、本発明の薬草混合抽出物の処理により、未処理のコントロールと比較して、ＴＮＦ−α分泌が用量依存的に有意に阻害されることを見出した。

したがって、本発明の抽出物はＴＮＦ−α分泌を効果的に阻害する。

実験例２：骨芽細胞増殖のアッセイ
本発明の抽出物について、骨芽細胞の増殖に対する効果を解析した。

用いた骨芽細胞は、マウス頭蓋冠ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５９３）細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）から購入したもので、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で補充したＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＵＳＡ）で培養した。

骨芽細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔き、５％ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。次いで、培養培地を新鮮な培地に交換し、それに熟地黄および三七人参からの各抽出物を組合せ（０〜１.６ｍｇ／ｍｌの量）で加え、さらに４８時間インキュベートした。続いて培養培地を吸引し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理し、血球計で計測した。この結果を図３でグラフにする。

図３で見られるように、本発明の抽出物の処理により、濃度に従って２０％まで細胞の細胞増殖が促進されたことを観察した。熟地黄および三七人参からの各抽出物の様々な組み合わせ（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で処理した細胞をコントロールと比較して、細胞数が増加したことを観察した。

実験例３：ＯＰＧ（オステオプロテジェリン）発現のアッセイ
ヒト骨肉腫ＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２７）を６０ｍｍの組織培養皿に集密度で培養し、熟地黄および三七人参からの各抽出物の様々な組み合わせ（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）または薬草混合抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）を含む、ＤＭＥＭ（２ｍｌ）中で２４時間インキュベートした。その後、培養培地のＯＰＧ量をＯＰＧ−ＥＬＩＳＡキット（オスコテック社）で解析した。この結果を図４および５に示す。

図４で見られるようにＯＰＧ発現について、骨芽細胞中に破骨細胞形成の阻害タンパク質は、細胞を熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物（０.１〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で処理した方が、各抽出物（０.１〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で処理したよりも促進されることを観察した。薬草混合抽出物を処理した群のＯＰＧ発現量は、個々の抽出物で処理した群のそれと比較して、用量依存的に３００％まで増加した。

また、図５で見られるように、熟地黄および三七人参からの混合抽出物の処理により、コントロールと比較して、ＯＰＧ発現を有意に増加させることが分かった。

実験例４：ＴＲＡＰ（＋）多核細胞形成阻害
生後７〜９週間の雄性マウスを頸椎脱臼により屠殺した後、大腿骨および脛骨を軟組織から無菌的に切除および除去した。次いで、腸骨を正反対の箇所で切り、髄腔の一方に２６Ｇ針を通して酵素溶液（１ｍｌ）［０.１％コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）、０.０５％トリプシンおよび０.５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含む］を注入することにより、骨髄を取り出した。骨髄を３０分間攪拌することにより骨髄細胞を得て、１０％ＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ中で２４時間前培養して、破骨細胞の前駆細胞である非接着細胞を得た。それらを２×１０^５細胞／ウェルの密度で蒔き、培養した。

培養した細胞のうち、接着細胞をＰＢＳで洗浄し、シトレートアセテートホルムアルデヒドで５分間固定し、続いてＴＲＡＰで染色し、緩衝酢酸溶液（ｐＨ５.０）［ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸ナトリウム、ファースト・ガーネットＧＢＣ緩衝液（Fast Garnet GBC buffer）および７ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ５）を含む］中、３７℃で１時間インキュベートした。３またはそれ以上の核を有するＴＲＡＰ（＋）多核細胞を、破骨細胞と見なした。

破骨細胞の分化を誘導するために、破骨細胞の前駆細胞が存在する骨髄を用いた。ＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞と見なし、次いでそれを個々の薬草抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）または薬草混合抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）の存在下で培養し、続いてＴＲＡＰ陽性多核細胞の数をモニターした。この結果を図６および７でグラフにする。図６および７で見られるように、本発明の抽出物で処理した群では、ＴＲＡＰ（＋）多核細胞数が有意に減少したことを観察した。これらの結果から、本発明の抽出物が破骨細胞形成の阻害に有用であることが示された。

実験例５：破骨細胞活性の阻害
破骨細胞の成長および活性をモニターするために、炭酸化リン酸カルシウムでコーティングされたプレート（ＯＡＡＳ、ＯＣＴ社）中で破骨細胞の前駆細胞を培養し、標識ＴＲＡＰ破骨細胞の活性および吸収（resorption）を観察した。

実験例４で分離し、培養した破骨細胞の前駆細胞から培養培地を除去した。ＯＡＡＳプレートを蒸留水で洗浄して接着細胞を除去し、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中で５分間インキュベートし、次いで蒸留水で洗浄してから、ＩｍａｇｅＰｒｏｐｌｕｓを用いて吸収領域を観察した。すなわち、骨組織の骨吸収によって分かる、破骨細胞の活性を調べるために、カルシウムおよびリン酸（これは、骨組織の無機質部分と同じような条件を作るという意図による）でコーティングされたプレート中、本発明の抽出物の存在下で、破骨細胞の前駆細胞を培養した。吸収領域の変化がモニターされ、それらの結果を図８および９で示す。

図８および９で見られるように、本発明の抽出物は、破骨細胞の前駆細胞培養をカルシウムリン酸コーティングされたプレートで観測した通り、破骨細胞の活性および吸収を有意に阻害することを観察した。

実験例６：歯肉線維芽細胞および歯根膜細胞の細胞増殖に対する効果
本発明の抽出物について、それらのヒト歯根膜細胞および歯肉線維芽細胞の細胞増殖に対する効果をアッセイした。

健康なヒトから歯科矯正の目的で引き抜かれた小臼歯の歯根膜をキュレットで無菌的に掻爬し（scrap）、培養皿中に置き、続いて１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で補充したＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＵＳＡ）中でインキュベートした。引き抜かれた小臼歯の歯茎（gum）の一部を分離して、歯肉線維芽細胞を得るのと同じ方法で培養した。培養物を成長させる間、外植片からの細胞増殖が顕微鏡で観察された。細胞コロニーの形成後、それぞれの組織標本をそこから除去し、単層（single layer）で成長させ、実験で用いるまで継代培養した。ヒト歯根膜細胞および歯肉線維芽細胞のそれぞれを２０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔き、５％ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間インキュベートし、その後細胞を個々の抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）または混合抽出物（０〜１.６ｍｇ／ｍｌ）で処理し、そしてさらに４８時間インキュベートした。培養培地を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡを加え、細胞を血球計で計測した。この結果を図１０、１１および１２でグラフにする。

図１０および１１で見られるように、個々の抽出物で処理するのと同じくらい少ないかそれよりも少ない量で、薬草混合抽出物を処理して、歯肉線維芽細胞の増殖が観察された。

図１２で見られるように、歯根膜細胞の細胞増殖は、熟地黄または三七人参からの個々の抽出物による処理と比べて、薬草混合抽出物による処理ではさらに４０％まで促進された。

したがって、本発明の抽出物は、歯肉線維芽細胞の細胞増殖に大きな影響を与えずに、歯周組織の再生において重要な役割を果たす歯根膜細胞の細胞増殖を効果的に促進させることができる。

実験例７：動物モデルにおける歯周病の治療効果
歯周病は、複雑な要因によって引き起こされる慢性疾患である。その要因の中で最も重大なのは、細菌寄与である。歯の表面に、細菌性バイオフィルム（それは、微生物が唾液タンパク質および食品と組み合わさった複合体）が付着する。歯周病の患者の多くは、免疫防御細胞（immune defense cells）の機能が不完全であり、細菌からの様々な産物に対して抵抗できず、重症な組織破壊に羅患する。

ラットモデル実験において、絹糸を歯にくくることにより、歯垢および歯石のおそれを自然に生じさせ、次いで炎症を起こし、結果的に歯槽骨の吸収を引き起こさせた。

ラットの臼歯を結紮糸で縛って歯周病を引き起こさせ、ラットに本発明の抽出物を投与した。上顎骨（歯を含む）を切除し、観察して、歯周病の予防および治療における抽出物の効果を調べた。

通常は、ラットにケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹部注入によって麻酔した後、下顎骨の第２臼歯を絹の結紮糸（４／０）で縛って、歯周病を引き起こさせた。

同時期に４週間、シャム（sham）およびネガティブコントロールには固形食品および水（５ｍｌ／ｋｇ）を経口投与し、一方で実験集団には本発明の抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ）も一緒に経口投与した。

経口投与の完了後、ＣＯ_２で麻酔し、ブアン固定液で２時間固定したラットから下顎骨を切除した。その後、５％硝酸で７２時間脱灰させ、ミネラル（カルシウムを含む）を除去して、組織切片に適した軟度まで組織を柔らかくした。引き続いて、歯を流水で１２時間洗浄し、７０％、８０％、９０％および１００％アルコールで脱水し（この順番で、各濃度につき２時間を３回）、続いてキシレンで置換した（各ラウンド２時間で、３ラウンド）。試料を、液体パラフィンの処理によって（各ラウンド２時間で、３ラウンド）、パラフィンに埋め込んだ。

パラフィンブロックの作成後、回転式ミクロトームでブロックを５μｍの薄さに切り、切片をスライドガラスに載せ、そしてスライドウォーマー（slide warmer）で乾燥することによって（４０±３℃）、検体を作成した。完全に乾燥したスライドを、キシレンでパラフィンを除去し、アルコールで脱水し、ヘマトキシリン−エオシンまたはトリクロームで染色した。その後、染色した組織をアルコールおよびキシレンに再び通すことによって被包し（encapsulate）、続いて６０℃のインキュベーター中で終夜乾燥した。それらを光学顕微鏡によって観察し、撮影した。

画像解析システム（Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏｐｌｕｓ；バージョン３.０）を用いて、歯槽骨頂（ＡＣ）およびセメントエナメル境（ＣＥＪ）間の距離を写真で分析した。熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物の阻害効果は、実験集団のＡＣおよびＣＥＪ間距離とシャムまたはネガティブコントロールのそれとを比較することにより、決定した。この結果を図１３および１４に示す。

シャムと比較して、歯周病が生じた後は水のみしか与えていなかったネガティブコントロールは、図１３および１４で見られるように、骨量減少が３倍増加したが、熟地黄および三七人参からの薬草混合抽出物を投与した群は２倍しか増加しなかった。

歯周病のラットで示されるように、本発明の抽出物は歯周病の治療および予防において有用である。

以下では、本発明の組成物の製剤実施例についての記載を与える。

製剤実施例１：医薬製造
１.粉末の製造
本発明の抽出物２ｇ
乳糖１ｇ
これらの成分を混合し、気密な袋（sac）に入れて、粉末の形態を製造した。
２.錠剤の製造
本発明の抽出物１００ｍｇ
コーンスターチ１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
これらの成分を混合し、錠剤を作る典型的な方法によって錠剤化した。
３.カプセルの製造
本発明の抽出物１００ｍｇ
コーンスターチ１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
これらの成分を混合し、カプセル剤を作る典型的な方法によってゼラチンカプセル剤に入れた。
４.口腔洗浄薬の製造
本発明の抽出物０.０１〜１.０ｇ
キシリトール５〜１０ｇ
エチルアルコール５〜１５ｇ
ソルビトール５〜１５ｇ
サッカリンナトリウム１０〜１００ｍｇ
モノフルオロリン酸ナトリウム５００〜１０００ｍｇ
ラウリル硫酸ナトリウム１００〜２００ｍｇ
ポリソルベート２０１００〜１０００ｍｇ
ペパーミント香料１０〜１００ｍｇ
安息香酸ナトリウム１０〜１００ｇ
純粋適当量
着色（color）適当量
総量１００ｇ
これらの成分を、歯周炎の予防および治療に有用な口腔洗浄薬を作る典型的な方法により混合した。

製造実施例２：食品の製造
本発明の抽出物を含む食品は、以下のように製造した。
１.調味料の製造
本発明の抽出物を２０〜９５重量％の量で含む、健康を改善させる調味料を製造した。
２.トマトケチャップおよびソースの製造
健康を改善させるトマトケチャップまたはソースは、本発明の抽出物を０.２〜１.０重量％の量で、普通のトマトケチャップまたはソースに加えることにより製造した。
３.小麦粉食品の製造
本発明の抽出物を０.５〜５.０重量％で含む小麦粉混合物（flour mixture）を、パン、ケーキ、クッキーおよび麺類を作るのに用いた。
４.スープおよびグレイビーソースの製造
本発明の抽出物を０.１〜５.０重量％の量で、普通のスープまたはグレイビーソースに加えて、加工された肉製品または麺類のための、健康を改善させるスープまたはグレイビーソースを製造した。
５.牛ひき肉の製造
本発明の抽出物を１０重量％の量で普通の牛ひき肉に加えて、健康を改善させる牛ひき肉を製造した。
６.乳製品の製造
本発明の抽出物を５〜１０重量％で含む牛乳を、様々な乳製品（例えば、バターおよびアイスクリーム）を製造するのに用いた。
７.禅食の製造
玄米、大麦、餅米、および殻皮付きの（unshelled）鳩麦を、典型的な方法を用いて予めゼラチン化し、乾燥し、焼いて、その後、６０メッシュの粒径の粉末にすりつぶした。黒大豆、黒ゴマおよび野生ゴマ（wild sesame）を典型的な方法によって蒸して（steamed）、乾燥し、焼いて、その後、６０メッシュの粒径の粉末にすりつぶした。本発明の抽出物を、バキューム濃縮器（vacuum concentrator）により減圧下で濃縮して、対流式オーブンで乾燥し、続いて６０メッシュの粒径の粉末にすりつぶした。穀類、種子、および本発明の抽出物から作った粉末を、以下の割合で製剤して、禅食を得た。
穀類（玄米を３０重量％、殻皮付きの（unshelled）鳩麦を１５重量％、大麦を２０重量％）、
種子（野生ゴマを７重量％、黒大豆を８重量％、黒ゴマを７重量％）、
本発明の抽出物の乾燥粉末（３重量％）、
霊芝（０.５重量％）、
キツネノテブクロ（０.５重量％）。

製造実施例３：飲料の製造
１.炭酸飲料の製造
５〜１０％の糖、０.０５〜０.３％のクエン酸、０.００５〜０.０２％のキャラメルおよび０.１〜１％のビタミンＣを含む混合物を、７９〜９４％の純水と混合してシロップを得て、次いでそれを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間無菌化した。無菌化したシロップを冷水と１：４の割合で混合し、続いて０.５〜０.８２％の炭酸ガスを注入して、本発明の抽出物を含む炭酸飲料を得た。
２.健康飲料の製造
液体フルクトース（０.５％）、オリゴ糖（２％）、糖（２％）、塩（０.５％）および水（７５％）を本発明の抽出物とともに均一に製剤し、その製剤を低温殺菌し、ビン（例えば、ガラスビン、ＰＥＴボトルなど）に入れた。
３.野菜ジュースの製造
本発明の抽出物（５ｇ）を、普通のトマトまたは人参ジュース（１，０００ｍｌ）に加えて、健康に良い野菜ジュースを得た。
４.フルーツジュースの製造
本発明の抽出物（１ｇ）を、普通のリンゴまたはブドウジュース（１，０００ｍｌ）に加えて、健康に良いフルーツジュースを得た。

Claims

熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）および三七人参（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）からの各抽出物の混合物、または熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）および三七人参（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）の混合物からの抽出物を活性成分として含み、
この時、前記抽出物において、熟地黄および三七人参は熟地黄：三七人参で１：２〜１：１６の重量比を有し、
前記熟地黄および三七人参の各抽出物の混合物、または熟地黄および三七人参の混合物からの抽出物を、水、アルコールまたはアルコールおよび水の混合物を抽出溶媒として用いて製造する、
歯周病の予防および治療のための医薬組成物。
前記の熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）および三七人参（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）の混合物が、熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）および三七人参（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）で１：８の重量比を有する、請求項１の医薬組成物。
該アルコールがメタノールまたはエタノールである、請求項１の医薬組成物。
該医薬組成物が腫瘍壊死因子の分泌抑制に働く、請求項１の医薬組成物。
該医薬組成物がオステオプロテジェリンの分泌促進に働く、請求項１の医薬組成物。
該歯周病が歯肉炎である、請求項１の医薬組成物。
該歯周病が歯周炎である、請求項１の医薬組成物。
該医薬組成物が経口組成物である、請求項１の医薬組成物。
該経口組成物が歯磨き粉、口腔洗浄薬、洗口剤およびそれの組み合わせからなる群より選択される、請求項８の医薬組成物。