JP5388320B2 - 精製された抗原特異的抗体を用いる、肺炎連鎖球菌の迅速な検出のための方法および材料 - Google Patents
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Description
肺炎連鎖球菌(「S. pneumoniae」)は、肺炎型疾患、および気管支炎などの他の下気道感染症、さらには感染性中耳炎および副鼻腔炎を含む上気道感染症、ならびに菌血症および髄膜炎を含む播種性侵襲性感染症の主な原因菌の一つである。診断および治療が適切に行われないと、肺炎連鎖球菌の肺炎性感染は、心膜炎、膿胸、電撃性紫斑病、心内膜炎、または少なくとも1種類の関節炎のいずれかを招くことがあり、いずれの場合も肺炎連鎖球菌が原因菌である。このような肺炎性感染はしばしば菌血症または髄膜炎の引き金ともなる。それにもかかわらず今日まで、肺炎連鎖球菌に起因する肺炎の診断および治療はある程度経験的に行われていることが多い。
本発明によれば、ウサギに産生させた肺炎連鎖球菌のC多糖抗原に対する抗体を、約10%未満の蛋白質含有量を有する単離および精製したC多糖抗原によってアフィニティー精製する。
一般的には、本明細書で記載される肺炎連鎖球菌に関するICTアッセイ法は、当技術分野で開示されている任意の既知の使い捨て式ICT装置で行われるように設計および構成することができる。好ましくはそれは、そのすべてがスミスクライン・ダイアグノスティクス社(Smith-Kline Diagnostics, Inc.)に譲渡され、ヒト呼吸器系疾患の診断を含む広範な分野の使用に関してビナックス社(Binax, Inc.)(これには本出願の譲渡の権利が与えられている)に独占的にライセンスされている、同時係属出願であるハワード・チャンドラー(Howard Chandler)の米国特許出願第07/706,639号、またはその一部継続出願の一つに開示された種類のICT装置を用いて実施されるように設計され、実施される。
肺炎連鎖球菌R6株(ATCC番号39938)を、20mMヘペス(Hepes)緩衝液を加えた肺炎連鎖球菌用培地中で増殖させた。培地の1リットル当たりの組成は以下の通りである:
カゼイン膵液消化物 17.0g.
グルコース 10.0g.
NaCl 5.0g.
大豆粉のパパイン消化物 3.0g.
酵母抽出物 3.0g.
K2HPO4 2.5g.
HEPES 20mM
この培地のはじめのpHは26℃で7.2±0.2であった。これに15psiおよび121℃で15分間オートクレーブ処理を行い、取り出して冷ました。
実施例1の通りに増殖、処理および保存を行った細胞を室温で解凍し、0.2%アジ化ナトリウムを加えたpH 7.2のリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)中に緩衝液1.2mlに対して湿潤細胞1gの割合で懸濁化し、室温に2日間おいた。
ウサギ抗肺炎連鎖球菌R6株抗体のアフィニティー精製を行うため、精製された肺炎連鎖球菌R6株C多糖抗原をクロマトグラフィーカラムにカップリングさせるために、BSA-ヒドラジン結合物を選択した。このカップリング機能を実現するために、類似の機能を有する他の既知の材料を選択して結合させてもよい。
アルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co.)から入手した二塩酸ヒドラジンを水に溶かして0.5M溶液を作製した。乾燥NaOHでpHを5.2に調整し、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)製の乾燥ウシ血清アルブミン(「BSA」)を添加してBSAの最終濃度を25mg/mlとした。BSAを完全に溶解した後、N-(ジメチルアミノプロピル)-N1-エチルカルボジイミド塩酸塩(Fluka Chemical Co.製)を最終濃度が2.5mg/mlとなるように添加した。この反応混合物を連続攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。その翌日に水に対して4℃で十分に透析した。結合物の濃度はベックマン(Beckman)DU 640分光光度計を用いて280nmで測定した(BSA濃度として)。
抗原の乾燥調製物1.1mg/mlを蒸留水に溶解した。希塩酸を用いて溶液のpHを5.0〜6.0に調整した。BSA:ヒドラジン結合物の濃度23mg/mlの水溶液を希塩酸で処理し、そのpHを4.0〜5.0の範囲にし、この溶液を約1:6.65の容積比(重量比で約3:1)となるように抗原溶液にゆっくりと添加した。3分間攪拌した後、約100〜200mclの蒸留水に溶解したN-(ジメチルアミノプロピル)-N1-エチルカルボジイミド塩酸塩(Fluka Chemical Co.製)を、C多糖抗原に対して重量比約1〜1.92となるように、N-エチルカルボジイミド塩酸塩中の反応混合物に添加した。
実施例3で得たリガンド溶液に希塩酸を添加してpHを7.0にした。免疫吸着ゲルの基質としてはイスコ社(Isco, Inc.)製のホルミルスフェリローズ(Formyl Spherilose)を選択した。C多糖抗原のリガンドとこの基質とのカップリングは、既知の手順、例えばスフェリローズの使用(Spherilose applications)、ISCO社使用説明書(ISCO Applications Bulletin)78、28〜35ページに記載された通りに行った。他の既知の基質およびカップリング手順で代用してもよい。
肺炎連鎖球菌R6株(ATCC番号39938)の加熱殺菌細胞全体に対するウサギ抗血清を乾燥NaClを混合して最終濃度を0.5Mとした。この混合物を8,500rpmで20分間遠心処理し、上清を原綿で濾過した。この濾液をアフィニティーカラムにかけた。非結合成分はpH 7.2の3倍強度のリン酸緩衝生理食塩水およびpH 7.2の標準強度のリン酸緩衝生理食塩水を用いてカラムから洗い流した。pH 2.5の0.2Mグリシン-HCl緩衝液を用いてカラムから抗体を溶出させた。ベックマン(Beckman)分光光度計を用いて280nmで溶出液を観測し、抗体を含む画分を氷水浴に入れたフラスコにプールした。プールした画分をpH 9.0の0.5M NaH2PO4水溶液で中和した。
A. 検査装置の調製:
検査結果および対照結果の両方の観察を可能にするウィンドウを備えた中折れ式の厚紙ハウジングを含む検査装置を、図1に示すように調製した。本装置は、試料を染み込ませた綿棒を右側から収容するための成形済みのプラスチック製綿棒用ウェルが内部に配置された陥凹部を有する(図中に1と記したもの)。続いて図1Aに示したオーバーラベルを装置の右側全体に被せる。このオーバーラベルには2つの穴が備わっており、下方のもの(図1AにBと表記)の中には液体が染み込んだ綿棒を挿入し、上方のもの(図1AにBと表記)は綿棒を穴Bに挿入した後にそれに向かって押し進めるためのものである。穴Aおよび穴Bを備えたオーバーラベルならびに綿棒の位置は、アッセイ中に綿棒が正しい位置に保たれ、吸収された液体の綿棒からの圧出が促されるようにうまく連携する。
図1Cは、あらかじめ組み立てられたストリップの構成を示す。これは、金粒子と上記の抗原特異的ウサギ抗肺炎連鎖球菌C多糖抗原抗体との結合物を染み込ませた吸着剤の結合物パッドを含む。結合物パッドはアールストローム1281(Ahlstrom 1281)(図示していない)のブリッジパッドにより、上記の通りに調製した抗原特異的ウサギ抗肺炎連鎖球菌C多糖抗原抗体のストリップを包埋することにより、結合物と反応させる試料のための捕捉ラインが設置されたニトロセルロースパッドと連結される。ニトロセルロースパッドには、パッドにヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(IgG)の縞を入れることにより、下流対照ラインも設置されている。ニトロセルロースパッドに続いて、ストリップの末端には液体溜めとしての役割を果たす吸着剤パッドがある。これらのパッドはすべて接着性ストリップによって裏打ちされた上で装置内に配置される。
販売される時点では、完成した検査ストリップを含む検査装置は組み立てられる。実際に、ダクロン繊維から作られた相応の数の綿棒、および試薬Aを滴下するために適合化された上端が備えられた「試薬A」の瓶とともに、数多くの装置が包装されている。「試薬A」は、pH 6.5の0.05Mクエン酸ナトリウム-リン酸ナトリウム緩衝液中にある2.0%Tween 20、0.05%アジ化ナトリウム、および0.5%ドデシル硫酸ナトリウムの溶液である。各キットには陽性対照および陰性対照も含まれる。
実際に、各装置を備えた綿棒を、綿棒の頭部を完全に浸漬するようにして液体試料に浸す。尿、血液、リンパ液などの液体生物試料中および液体環境試料中に存在する溶解していない固体、半固体およびコロイド用のフィルターとして作用させるための綿棒の使用は、1998年3月19日に出願され、ビナックス社(Binax, Inc.)に譲渡されている、ノーマン・ムーア(Norman Moore)およびビンセント・シー(Vincent Sy)による同時係属出願中の米国特許出願第09/044,677号の主題である。綿棒を装置の底部にある穴(図1Aの穴B)に挿入し、綿棒の先端が上部の穴(図1Aの穴A)から見えるように上向きにゆっくりと押す。試薬Aのバイアルを穴Bの上に垂直に置き、試薬Aを3滴ゆっくりと添加する。続いて直ちに接着剤ライナーを装置の右縁からはがし、装置を閉じてしっかりと密閉することにより、綿棒を綿棒用ウェル内の金結合物パッドに対して押しつける。15分間後には装置のウィンドウから結果を読み取ることができる。陰性試料、すなわち、同定可能な肺炎連鎖球菌C多糖抗原を含まない試料では、ウィンドウの上半分に対照ラインのみが認められるはずである。標的抗原を含む陽性試料の場合は2本のラインが認められると考えられ、このうち下方のものが患者(または試料)ラインである。弱い試料ラインだけでも試料中に標的抗原が存在することを示す。15分後にウィンドウ内に全くラインが出現しない場合、または試料ラインのみがウィンドウの下方に出現した場合には検査は無効であり、再度行う必要がある。
実施例5の記載通りに調製した装置および実施例6の第1段落に記載した通りのICT手順を用い、特徴づけられた一連の検体を用いて、3つの施設で臨床試験を行った。これらには、入院患者および外来患者から採取した273件の尿検体が含まれる。273例の患者のうち35例は血液培養結果が陽性であり、238例は血液培養結果が陰性であった(培養の方法はしばしば施設によって大きく異なることに注意が必要である)。血液培養の結果が陽性であった患者の尿試料は、血液採取および抗生物質の投与開始から24時間以内に採取されたものと考えられる。血液培養検査が陰性であった患者の238件の尿試料のうち、28件は菌血症患者から、4件は膿胸の患者から、53件は肺炎の患者から、153件は尿路感染症の患者から採取されたものであった。
下気道症状および敗血症症状を少なくとも1つ有するか、または別の理由で肺炎連鎖球菌肺炎であることが疑われた、入院および外来患者から採取した215件の尿試料を評価するために、7つの病院で検査を行った。そのうち6つは米国、1つはスペインの病院である。これらの検査では、実施例5に従って調製した装置を実施例6の手順で用い、その結果を、同一患者から採取した血液検体に対して行った血液培養の結果と比較した。参加施設の培養法の均一性は確認していない。
実施例5の通りに調製した装置、および実施例6の手順を用いて、約144種の微生物の試験を106〜109CFU/mLの濃度で行った。試験を行ったそれぞれの微生物は適切な寒天上で増殖させ、5 %CO2下にて37℃で一晩インキュベートした後にプレートを純度に関して検討し、十分に分離されている各微生物のコロニーを試験のために選択した。
健康小児および罹患小児を対象とする現時点では終了していない臨床試験が進行中である。予備的な短い結果では、実施例6に述べた通りに調製した装置および実施例7に述べた手順を用いて、副鼻腔炎と診断された3例の小児中の2例の尿から肺炎連鎖球菌が検出されたことが示されている。検査した小児の尿が陰性であった副鼻腔炎の症例には異なる原因因子がかかわっていたと考えられる。
髄膜炎の明らかな臨床徴候を呈している患者2例が入院した。うち1例は入院前に抗菌療法を受けており、他の例は受けていなかった。この各例から脳脊髄液を採取し、培養検査を行った。検査結果は陰性であり、血液培養の結果も同様であった。
Claims (30)
- 以下の段階を含む、肺炎連鎖球菌からの10%以下の蛋白質を含む、ホスホリルコリン基を欠く細胞壁C多糖抗原を入手するための方法:
(a)所望のサイズの試料を得るために必要な時間にわたって細菌を培養する段階、およびそこから湿潤細胞ペレットの形態にある細菌細胞を回収する段階;
(b)湿潤細胞ペレットを水酸化ナトリウムのアルカリ溶液中に懸濁化する段階、および混合する段階;
(c)強酸を用いてpHを酸性pHに調整する段階、および遠心処理する段階;
(d)段階(c)により上清を分離する段階、およびpHをほぼ中性に調整する段階;
(e)残存蛋白質を破壊するために、この生成物を広域プロテアーゼ酵素調製物によって消化する段階;
(f)弱アルカリ水溶液を用いてpHをアルカリ側に調整する段階;
(g)弱アルカリ溶液で平衡化したサイズ排除カラムにより、本質的に蛋白質を含まない糖質または多糖抗原を分離除去する段階;ならびに
(h)最初のピークに溶出した物質をプールする段階、およびpHをほぼ中性に調整する段階。
- 請求項1記載の方法によって得られる、10%以下の蛋白質を含む細胞壁C多糖抗原。
- 段階(b)のアルカリ溶液が湿潤細胞ペレット1g当たり20mlの0.1M水酸化ナトリウム水溶液を含む、請求項1記載の方法。
- 段階(c)においてpHが3.0に調整される、請求項1記載の方法。
- 段階(f)においてpHが10〜11の間に調整される、請求項1記載の方法。
- 段階(h)の後に凍結乾燥段階が行われる、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、肺炎連鎖球菌に対する粗抗体を精製するための方法:
(a)請求項1記載の方法により肺炎連鎖球菌から10%以下の蛋白質を含む細胞壁C多糖抗原を分離する段階;
(b)該抗原を2つの末端を有するスペーサー分子の一端と共有結合させ、該抗原とスペーサー分子との結合物を形成する段階;
(c)結合物を活性化されたクロマトグラフィーカラムとカップリングする段階;
(d)該粗抗体を段階(c)の該カラムによるアフィニティークロマトグラフィーにかけて、精製された抗原特異的抗体を入手する段階;
(e)該カラムから精製された抗原特異的抗体を溶出させる段階。
- 請求項7記載の方法によって得られる、肺炎連鎖球菌の細胞壁C多糖に対する精製された抗原特異的抗体。
- 請求項2記載の肺炎連鎖球菌における精製されたC多糖細胞壁抗原がスペーサー分子によって共有結合した、肺炎連鎖球菌に対する粗抗体のアフィニティー精製のためのクロマトグラフィーカラム。
- 以下の段階を含む、液体中の肺炎連鎖球菌またはその細胞壁C多糖抗原の存在をアッセイする方法:
(a)肺炎連鎖球菌から、請求項2記載の該細胞壁C多糖抗原を抽出する段階、
(b)該抗原をスペーサー分子とカップリングさせて結合物を形成させる段階、
(c)段階(b)による結合物をクロマトグラフィーアフィニティーカラムとカップリングする段階、
(d)段階(c)のクロマトグラフィーアフィニティーカラムを用いて肺炎連鎖球菌に対する粗抗体を精製し、精製された抗原特異的抗体を産生する段階、および
(e)段階(d)の精製抗体を用いて、液体中の肺炎連鎖球菌またはそのC多糖細胞壁抗原の有無を検出する段階。
- 段階(b)のスペーサー分子が蛋白質分子である、請求項10記載の方法。
- 段階(b)のスペーサー分子がヒドラジンとウシ血清アルブミンとの結合物である、請求項10記載の方法。
- 段階(e)の液体が哺乳動物由来の天然の液体である、請求項10記載の方法。
- 液体がヒト尿である、請求項13記載の方法。
- 液体が、肺炎型疾患の臨床徴候を呈している患者から採取された、請求項13記載の方法。
- 段階(e)がイムノアッセイ法である、請求項15記載の方法。
- 段階(e)が免疫クロマトグラフィー(「ICT」)アッセイ法である、請求項15記載の方法。
- 段階(d)による精製された抗原特異的抗体の一部が、該抗体が対応する抗原と反応した時に可視呈色を示すことが周知の標識物質と結合している、請求項17記載の方法。
- 標識物質が微細化された金である、請求項18記載の方法。
- 以下の段階を含む、肺炎連鎖球菌または該細菌のC多糖細胞壁抗原の検出のためのICTアッセイ法:
(a)該細菌またはその抗原を含むことが疑われる液体試料を、吸収性材料のストリップを含むICT装置と接触させる段階であって、該ストリップが、
(i)(1)抗体がその対応する抗原性結合パートナーと反応すると可視的色調変化を示す標識物質、および
(2)肺炎連鎖球菌のC多糖細胞壁抗原に対する精製された抗原特異的抗体であって、請求項9記載のクロマトグラフィーアフィニティーカラムを通すことによって精製された抗体
の結合物が包埋された第1の区域と、
(ii)色調変化を観察するためのウィンドウが備えられた区域である、非結合(unconjugated)形態にある同一の精製された抗原特異的抗体が結合した第2の区域とを有する段階;
(b)該試料を該検査ストリップに沿って該第1の区域へと水平方向に流れるようにする段階;
(c)該試料を、抗原特異的抗体と標識との該結合物とともに、該検査ストリップに沿って該第2の区域へと水平方向に流れるようにする段階;ならびに
(d)段階(a)の開始からほぼ15分以内に該ウィンドウを通して呈色ラインが該第2の区域に出現したか否かを観察し、それによって肺炎連鎖球菌またはその細胞壁C多糖抗原が試料中に存在することを示す段階。
- 肺炎連鎖球菌またはそのC多糖細胞壁抗原を含むことが疑われる液体が、哺乳動物由来の天然の液体である、請求項20記載の方法。
- 哺乳動物由来の天然の液体がヒト尿である、請求項21記載の方法。
- 哺乳動物由来の天然の液体が血液または血清である、請求項21記載の方法。
- 哺乳動物由来の天然の液体が脳脊髄液である、請求項21記載の方法。
- 抗体が対応する抗原性結合パートナーと反応する場合に可視的色調変化を示す標識物質が微細金属である、請求項22記載の方法。
- 標識物質が微細化された金である、請求項25記載の方法。
- 標識物質が微細化された金であり、かつ液体がヒト血液または血清である、請求項20記載の方法。
- 標識物質が微細化された金であり、かつ液体がヒト脳脊髄液である、請求項20記載の方法。
- 標識物質が微細化された金であり、かつ液体がヒト尿である、請求項20記載の方法。
- (i)(1)抗体がその対応する抗原性結合パートナーと反応する場合に可視的色調変化を示す標識物質、および(2)肺炎連鎖球菌のC多糖細胞壁抗原に対する精製された抗原特異的抗体であって、請求項9記載のクロマトグラフィーアフィニティーカラムを通すことによって精製された該抗体の結合物が包埋された第1の区域と、
(ii)色調変化を観察するためのウィンドウが備えられた区域である、非結合形態にある同一の精製された抗原特異的抗体が結合した第2の区域
とを有する吸収性材料のストリップを含む、肺炎連鎖球菌またはそのC多糖細胞壁抗原の検出のためのICT装置。
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