JP5360939B2

JP5360939B2 - ニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする動脈硬化症治療剤

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Publication number: JP5360939B2
Application number: JP2012207818A
Authority: JP
Inventors: 俊晃玉置; 浩一郎土屋; 啓介石澤
Original assignee: University of Tokushima
Current assignee: University of Tokushima
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: JP2013082693A

Description

本発明は、ニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする新規な動脈硬化症治療剤に関する。本発明の動脈硬化症治療剤は、動脈硬化の進展に大きな影響を与えるマクロファージの動脈内への浸潤を抑制できるため、更に動脈硬化に関連する疾患の予防又は治療剤として有用なものである。

ニフェジピン（ＮＩＦ）は世界中で広く高血圧治療薬として使用されているカルシウム拮抗薬である。ニフェジピンは生体内でそのニトロ基がニトロソ基に変換されて、Ｃａチャネル拮抗作用をほとんど示さないニトロソ−ニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）となることが知られている（非特許文献１）。また、光照射下においても同様にニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）に変化することが知られている。この代謝物のニトロソ−ニフェジピンの薬理作用については、細胞膜保護作用があることが報告されている（特許文献１）。また、そのメカニズムは、ＮＯ−ＮＩＦの持つラジカルの強い消去能であり、その結果、酸化ストレスの抑制効果を示すことが明らかにされている（非特許文献２〜４）。

しかしながら、上記のようにＮＯ−ＮＩＦの抗酸化作用は知られているものの、マクロファージに対する作用や動脈硬化に対する効果は、まだ知られてはいなかった。

特開２００７−９１６６４号公報

マグネティック・レゾナンス・イン・メディシン（Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．）４２：６９１−６９４，１９９９ジャーナル・ファルマコロジカル・サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．）１０９，１４−１９（２００９）ジャーナル・メデイカル・インベスディゲイション（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５８：１１８−１２６，２０１１ケミカル・ファーマシュウテイカル・ブレタン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）５９（２）２０８−２１４（２０１１）

本発明は、新しい動脈硬化症治療剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、ニトロソニフェジピン誘導体に関して、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）存在下での血管リモデリングにおける研究を重ねた結果、これらのニトロソ化合物が、血管平滑筋細胞において、細胞膜を標的として酸化ストレスを抑制し、動脈硬化の進展を改善することを見出した。即ち、動脈硬化のモデルマウスとして、ＡｎｇＩＩ負荷モデルマウスを使用し、ニトロソニフェジピン誘導体としてＮＯ−ＮＩＦを使用して、その効果を検討したところ、次のような動脈硬化の抑制効果を見出した。
ａ）大動脈中膜肥厚および線維化を抑制した（図２）。
ｂ）大動脈における血管リモデリングに関与するｍＲＮＡ（ｐ２２^ｐｈｏｘ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０、ＭＣＰ−１、コラーゲンＩ）の発現上昇を抑制した（図６）。
ｃ)大動脈における活性酸素種（ＲＯＳ）および尿中８−ヒドロキシ−２‘−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）排泄量の増加を抑制した（図４と５）。
ｄ）大動脈におけるＩＣＡＭ−１発現の増加が抑制され、細胞増殖マーカー（Ｋｉ６７）を発現するＫｉ６７陽性細胞の数が抑制された（図７〜９）。
ｅ）血圧上昇を抑制した（図３）。

上記のｂ）の結果を詳細に説明すれば、次のことを示している。
１）動脈硬化の進展に大きな役割を担うと考えられるマクロファージの表面に存在するマーカーと考えられているＣＤ６８とＦ４／８０は、ＡｎｇＩＩの負荷により増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの同時投与により、コントロールの群と同程度のレベルに低下すること。
２）動脈硬化症部位にモノサイト・マクロファージを誘導すると考えられている蛋白質のＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ−１）は、ＡｎｇＩＩにより増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの同時投与により、コントロールの群と同程度のレベルに低下すること。
３）動脈硬化層で増加するコラーゲン１の発現も、上記１）と２）と同様の傾向を示し、ＡｎｇＩＩにより増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの同時投与により、コントロールの群と同程度のレベルに低下した。

更に、ＡｎｇＩＩの刺激により増殖した血管平滑筋細胞を用いてｉｎｖｉｔｒｏ評価試験を行ったところ、ＮＯ−ＮＩＦの作用機序は以下のとおりであることを見出した。
ｆ）血管平滑筋細胞の増殖と遊走は、ＮＯ−ＮＩＦの前処理により抑制された（図１０と１１）。
ｇ）ＡｎｇＩＩの刺激により増加したＡｋｔのリン酸化は、ＮＯ−ＮＩＦの前処理により抑制された（図１２）。
ｈ）ＡｎｇＩＩの刺激により増加した細胞内ＣａイオンとＰＫＣδのリン酸化は、ＮＯ−ＮＩＦの前処理を行っても抑制されなかった（図１４と１５）。
ｉ）ＡｎｇＩＩの刺激により増加した活性酸素種（ＲＯＳ）とＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、ＮＯ−ＮＩＦの前処理を行えば、ａｐｏｃｙｎｉｎと同程度の抑制効果を示した（図１６と１７）。
更に、ＮＯ−ＮＩＦが培養ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）と反応して、ＮＯ−ＮＩＦラジカルを生成するか否かを検討した。その結果、ＮＯ−ＮＩＦとＲＡＳＭＣを反応させると、長期間（１〜１８時間）、ＮＯ−ＮＩＦラジカルの存在が確認された。また、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＲＡＳＭＣ細胞の細胞膜の流動性が上昇した（図１８と１９）。

上記ｉｎｖｉｖｏ試験とｉｎｖｉｔｒｏ評価試験の結果から、図２０に示されるように、ＮＯ−ＮＩＦは血管平滑筋細胞における遊走及び増殖を抑制し、さらにその上流のＡｋｔ、ＥＧＦＲのリン酸化、ＲＯＳの産生を抑制している。一方、Ｃａの経路に対してはＮＯ−ＮＩＦは何の影響も与えないことが分かった。これらの結果から、ＮＯ−ＮＩＦは細胞膜においてＮＯ−ＮＩＦラジカルに変化し、このＮＯ−ＮＩＦラジカルがＲＯＳの増加を抑制することにより、その下流にある経路を抑制していることが示された。

即ち、上記の結果は、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、動脈硬化を進展させる原因であるマクロファージの動脈内への浸潤を抑制し、血管内皮細胞の炎症や損傷を改善して、血管平滑筋細胞の遊走や増殖を抑制できていることを示している。その様子が、大動脈におけるＲＯＳと尿中８−ＯＨｄＧの排泄量の抑制で表わされている。そして、全体としての病態改善の結果として、動脈硬化の病態である大動脈中膜肥厚および線維化を抑制できている。
以上のように、本発明者らは、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、マクロファージの動脈内への浸潤を抑制することにより、内皮障害を抑制し動脈硬化の病態である大動脈中膜肥厚および線維化を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）一般式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を表わす。］で示されるニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする動脈硬化症治療剤。
（２）一般式（Ｉ）におけるＲ^１が水素原子である、上記（１）に記載の動脈硬化症治療剤。
（３）ニトロソニフェジピン誘導体がニトロソ−ニフェジピンである、上記（１）に記載の動脈硬化症治療剤。
（４）動脈硬化症が大動脈中膜肥厚および線維化の病態である、上記（１）に記載の動脈硬化症治療剤。

（５）一般式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を表わす。］で示されるニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする、マクロファージの動脈内への浸潤抑制剤。
（６）一般式（Ｉ）におけるＲ^１が水素原子である、上記（５）に記載の浸潤抑制剤。
（７）ニトロソニフェジピン誘導体がニトロソ−ニフェジピンである、上記（５）に記載の浸潤抑制剤。

本発明のニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）は、動脈内へのマクロファージの浸潤を抑制し、それによって大動脈中膜の肥厚および線維化を抑制できる。このため、本発明のニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）は、動脈硬化症を予防及び／又は治療することが可能である。

ＡｎｇＩＩ負荷モデルマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ評価実験のプロトコールを表わした図である。ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩ負荷による大動脈の中膜肥厚と線維化が抑制できていることを示す図である。ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩ負荷による血圧の上昇が抑制できていることを示す図である。ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩ負荷による大動脈での活性酸素種（ＲＯＳ）の増加を抑制できていることを示す図である。ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩ負荷モデルマウスおける尿中の８−ヒドロキシ−２‘−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）排泄量の増加が抑制できていることを示す図である。ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩ負荷による大動脈での血管リモデリングに関わるｍＲＮＡの発現増加を抑制できていることを示す図である。ＡｎｇＩＩ負荷モデルマウスの大動脈における細胞増殖を増殖マーカーであるＫｉ６７の免疫染色によって確認した大動脈の断面図である。矢印はＫｉ６７陽性細胞を示している。図７の大動脈に見出されるＫｉ６７陽性細胞数を数値化した図である。ＡｎｇＩＩにより増加したＫｉ６７の陽性細胞はＮＯ−ＮＩＦの投与により有意に抑制することができた。即ち、ＮＯ−ＮＩＦは大動脈中膜において、ＡｎｇＩＩによる細胞増殖を抑制することが示された。ＡｎｇＩＩ負荷モデルマウスの大動脈におけるＩＣＡＭ−１発現をウエスタンブロッティングにより確認した図である。大動脈において、ＡｎｇＩＩにより増加したＩＣＡＭ−１蛋白の発現はＮＯ−ＮＩＦ投与により抑制された。ＡｎｇＩＩ刺激によって増加した血管平滑筋細胞の増殖がＮＯ−ＮＩＦの前処置によって濃度依存的に有意に抑制されたことを表す図である。ＡｎｇＩＩ刺激によって増加した血管平滑筋細胞の遊走がＮＯ−ＮＩＦの前処置によって濃度依存的に有意に抑制されたことを表す図である。血管平滑筋細胞において、ＡｎｇＩＩによる細胞の増殖・遊走に深く関与しているＡｋｔのリン酸化に対するＮＯ−ＮＩＦの影響について検討した結果を表した図である。ＡｎｇＩＩ刺激によって増加したＡｋｔのリン酸化はＮＯ−ＮＩＦの前処置によって有意に抑制されている。血管平滑筋細胞において、ＡｎｇＩＩによる細胞の増殖・遊走に深く関与しているＥＧＦＲのリン酸化に対するＮＯ−ＮＩＦの影響について検討した結果を表した図である。ＡｎｇＩＩ刺激によって増加したＥＧＦＲのリン酸化はＮＯ−ＮＩＦの前処置によって有意に抑制されている。血管平滑筋細胞において、ＡｎｇＩＩによるカルシウム濃度の上昇（Ｃａシグナリング）に対するＮＯ−ＮＩＦの影響について検討した結果を表す図である。上部の写真は、細胞内Ｃａイオンの遊離の程度をＦｌｕｏ−４ＡＭ染色によって表したものである。下部のグラフは、上部の写真を数値化したものである。即ち、ＡｎｇＩＩ刺激によって増加した細胞内ＣａイオンはＮＯ−ＮＩＦの前処置を行っても、ＡｎｇＩＩ拮抗剤（ＡＲＢ）であるＯｌｍｅｓａｒｔａｎの前処置を行った場合のような抑制を示さなかった。血管平滑筋細胞において、ＡｎｇＩＩによるＰＫＣδのリン酸化に対するＮＯ−ＮＩＦの影響についてウエスタンブロットによって検討を行った結果を表した図である。ＡｎｇＩＩ刺激によって増加したＰＫＣδのリン酸化は、ＮＯ−ＮＩＦの前処置によって変化しなかった。これにより、ＮＯ−ＮＩＦは、ＡｎｇＩＩによる細胞内Ｃａイオン濃度の上昇及びＰＫＣδのリン酸化を抑制しないことが示された。血管平滑筋細胞において、ＡｎｇＩＩ刺激によって増加した活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＮＯ−ＮＩＦ前処置によってＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ阻害剤であるＡｐｏｃｙｎｉｎを処置した場合と同程度にまで抑制された。このように、ＮＯ−ＮＩＦは、ＡｎｇＩＩによるＲＯＳの発生を抑制することが示された。血管平滑筋細胞において、ＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ活性をルシゲニン化学発光法により確認したところ、ＡｎｇＩＩ刺激によって増加したＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ活性は、ＮＯ−ＮＩＦの前処置によりＡｐｏｃｙｎｉｎを処置した場合と同程度にまで抑制された。このように、ＮＯ−ＮＩＦは、ＡｎｇＩＩによるＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ活性の亢進を抑制することが示された。ＮＯ−ＮＩＦがラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）と反応してＮＯ−ＮＩＦラジカルを生成するか否かをＥＰＲ法を用いて確認した結果を表した図である。ＮＯ−ＮＩＦをＲＡＳＭＣと反応後、１時間から１８時間の間でＮＯ−ＮＩＦラジカルの存在を示すピークが確認された。ＮＯ−ＮＩＦをＲＡＳＭＣと反応させた後、ＲＡＳＭＣから細胞膜のみ抽出し、その流動性を蛍光偏光解消法により測定した結果を表した図である。縦軸は蛍光異方性を、横軸は温度を示しており、グラフが下に傾くほど流動性が高いことを示している。ＮＯ−ＮＩＦの処置により、細胞膜の流動性が上昇していることが示された。本図は、細胞におけるＮＯ−ＮＩＦの作用機序を模式的に表した図である。即ち、ｉｎｖｉｔｒｏ試験の結果、ＮＯ−ＮＩＦは血管平滑筋細胞における遊走及び増殖を抑制したこと、更にその上流のＡｋｔ、ＥＧＦＲのリン酸化を抑制し、ＲＯＳの産生を抑制している。一方、ＮＯ−ＮＩＦは、Ｃａの経路に対しては何の影響も与えていないことが示された。これらのことから、ＮＯ−ＮＩＦは細胞膜においてＮＯ−ＮＩＦラジカルに変化し、このＮＯ−ＮＩＦラジカルがＲＯＳの増加を抑制することで、その下流にある経路を抑制していると考えられた。以上のことをまとめて記載したのが本図である。

本発明の「ニトロソニフェジピン誘導体」とは、一般式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を意味する。］
で示される１，４−ジヒドロピリジン化合物を表わすものである。

上記一般式（１）において、Ｒ^１基の低級アルキル基としては炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基またはイソプロピル基である。
Ｒ^２基の置換または非置換低級アルキル基における低級アルキル基としては炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、イソプロピル基またはイソブチル基である。またその置換基としては、炭素数１〜３個の直鎖アルコキシ基（例えばメトキシ基）、フリル基、または低級アルキル基および／またはフェニル低級アルキル基によりモノまたはジ置換されてたアミノ基（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルメチルアミノ）等が挙げられる。

一般式（Ｉ）の１，４−ジヒドロピリジン化合物の好ましい具体例は、ニトロソ−ニフェジピン（一般式（Ｉ）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−ＣＨ_３、Ｘ’：２−ＮＯ・）、ニトロソ−ニソルジピン（一般式（Ｉ）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、Ｘ’：２−ＮＯ・）ニトロソ−ニモジピン（一般式（Ｉ）中、Ｒ^１：−ＣＨ（ＣＨ_３）_２、Ｒ^３：−（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３、Ｘ’：３−ＮＯ・）、ニトロソ−ニカルジピン（一般式（Ｉ）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−（ＣＨ）_２Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）、Ｘ’：３−ＮＯ・およびニトロソ−ニトレンジピン（一般式（Ｉ）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^３：−ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｘ’：３−ＮＯ・）である。

本発明のニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）は、対応するニトロ置換フェニル−１，４−ジヒドロピリジン化合物を紫外線照射処理することにより容易に製造される〔ヤネッツら、バイオオルガニック・メディシナル・ケミストリィ（ＹａｎｅｚＣ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）２００４，１２（９）：２４５９−６８を参照〕。

本発明の動脈硬化症治療剤は、１，４−ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬と同様に経口製剤、非経口製剤（注射剤等）として用いることができ、それら製剤は、その有効成分のニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）を通常の医薬製剤と同様に処方することにより製造される。
そのような製剤の具体例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、静注、筋注などの注射剤、点滴静注剤等が挙げられ、それら製剤は通常用いられる医薬用担体を用いて調製される。
上記医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明のニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、通常のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。

シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。
注射剤は、通常、ニトロソニフェジピン誘導体（Ｉ）を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。更に、該化合物を注射用蒸留水又は植物油に懸濁した懸濁性注射剤の形であってもよく、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。

本発明の有効成分のニトロソニフェジピン誘導体の投与量は投与方法、患者の症状・年齢等によっても異なるが、対応する１，４−ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬と同程度の用量でよく、また血圧や心機能に対する作用がないことからより高用量で投与することもでき、通常大人で１日当たり数ｍｇ〜百数十ｍｇ、好ましくは２０ｍｇから６０ｍｇ程度で１日１回または数回に分けて投与することができる。

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

（実施例１）ニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）の合成
ニフェジピン（和光純薬製）をメタノールに溶解し、２５ｍＭニフェジピンメタノール溶液（５００ｍＬ）を調製する。この溶液にハロゲン光（ＫｏｄａｋＥｋｔａｇｒａｐｈｉｃＩＩＩＥＰｌｕｓｐｒｏｊｅｃｔｏｒ）を７時間照射する。それによって黄色のニフェジピン溶液は徐々に緑色に変色する。光照射後、メタノールをエバポレーターで減圧下除去し、析出する結晶を冷メタノールで洗浄する。得られる結晶をメタノールで再結晶して、ニトロソ−ニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）を得る。その生成物をＮＭＲスペクトル、元素分析により同定する。ＨＰＬＣにより測定した純度は＞９９．９％であった。

（実施例２）動脈硬化症のモデルマウスに対するＮＯ−ＮＩＦの作用
（１）実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性）を日本ＣＬＥＡから購入。
アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は株式会社ペプチド研究所社より購入。
使用する抗体は市販のものを使用。
（２）試験方法：
ａ）投与方法：
１０週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２群に分け、それぞれにＡｎｇＩＩを含有するオスモティックミニポンプ（アルゼット社）を皮下に留置して慢性投与する。ＡｎｇＩＩの投与量は、１．４４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで、投与期間は２週間である。同時に、ＮＯ−ＮＩＦを含有する溶液を評価群に腹腔内投与し、ＮＯ−ＮＩＦを含有しない溶液をコントロール群に腹腔内投与した。ＮＯ−ＮＩＦの投与量は、３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで、投与期間は２週間である。

ｂ）効果の測定：
１）血管リモデリング評価：
マウスを薬殺（ペンタバルビタール、腹腔内投与）し、胸部大動脈を採取し、４℃のパラホルムアルデヒド中に一夜浸漬して固定する。１０μｍの厚さの切片に切断し、マッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行なった。
２）血圧測定：
マウスの尾静脈の血圧をテイル・カッフ（Ｔａｉｌｃｕｆｆ）法により測定した。
３）活性酸素種（ＲＯＳ）測定：
活性酸素種の測定は、ＤＨＥ染色法を用いて実施した（ＭｏｌＥｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０)。採取された大動脈組織をＯＣＴ化合物中で凍結させ、切断して、ガラス・スライドに設置する。切片を暗室内でＰＢＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）中、ジヒドロエチジュウムで処理し、保湿容器中で室温下３０分静置する。切片にカバーグラスを掛けて、大動脈組織を蛍光顕微鏡を用いて観察、評価した。
４）尿中８−ＯＨｄＧ排泄量の測定：
尿中の８−ＯＨｄＧ排泄量は、１０および１２週令のマウスで測定された。尿サンプルは２４時間分が集められた。尿中の８−ＯＨｄＧの排泄量は、ＥＬＩＺＡ法（酵素結合の免疫吸着アッセイ・キット）を使用し、手順書（伏見製薬）に従い測定した。

５）血管リモデリング関与のｍＲＮＡの発現濃度の定量的測定：
大動脈組織から、ＲＮＡが採取され、先行文献（ＭｏｌＥｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０）に基いてｃＤＮＡが合成された。定量的リアルタイムＰＣＲを行い、プライマーとして次の表１のものを使用した。

６）大動脈中膜における細胞増殖抑制：
動脈硬化に際して生じる大動脈中膜の細胞増殖の変化を増殖マーカーＫｉ６７の免疫染色法により測定した。
７）大動脈における白血球の浸潤抑制：
血管に白血球が浸潤するための促進因子である接着因子（ＩＣＡＭ−１）の発現変化を測定するため、ウェスタンブロティング法により測定した。

（３）測定結果：
１）血管リモデリング評価：
図２に示されるように、ＡｎｇＩＩの慢性負荷により、大動脈の中膜が肥厚し線維化することが分かった。即ち、大動脈内の青い部分が繊維化した部分であり、その内側のピンクの部分が中膜の部分である。コントロールやＮＯ−ＮＩＦ投与群より、ＡｎｇＩＩのみを投与した群では、青い部分やピンクの部分が厚くなっていた。即ち、ＮＯ−ＮＩＦ投与により、ＡｎｇＩＩによる中膜肥厚と繊維化が抑制されたことを示している。
２）血圧評価：
図３に示されるように、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、ＡｎｇＩＩによる血圧上昇が抑制された。このことは、ＡｎｇＩＩによる、血管平滑筋の中膜肥厚と繊維化が抑制されたため（動脈硬化が抑制されたため）、血圧が上昇し難くなったと考えられる。
更には、ＮＯ−ＮＩＦが内皮細胞の機能も保護する作用があるため、内皮から遊離される血管弛緩因子（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅやプロスタグランジンＩ_２など）の濃度が維持される。その結果も反映して、血圧が上昇し難くなっていると考えられる。
３）活性酸素種（ＲＯＳ）の評価：
ジヒドロエチイジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）染色で、大動脈での活性酸素種の産生を見たが、図４の左図に示されるように、ＡｎｇＩＩの投与にも係らず、ＮＯ−ＮＩＦは活性酸素種の産生を抑制することが示された。
４）尿中８−ＯＨｄＧ排泄量の評価：
図４の右図に示されるように、全身の酸化ストレスのマーカーの一つである、尿中８−ＯＨｄＧは、ＡｎｇＩＩの投与にも係らず、ＮＯ−ＮＩＦの投与により排泄量増加が抑制された。

５）血管リモデリング関与のｍＲＮＡの発現濃度の評価：
図６に示されるように、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、大動脈において血管リモデリングに関わるｍＲＮＡ発現が抑制された。
即ち、ＡｎｇＩＩのみの投与では、ＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅの構成成分であるｐ２２ｐｈｏｘの発現は増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、コントロールと同程度に低下することが分かった。また、マクロファージの表面に存在するマーカーであるＣＤ６８とＦ４／８０は、動脈硬化の進展に大きな役割を担うと考えられている。そして、ＡｎｇＩＩの投与により増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの投与によりコントロールと同程度に低下することが示された。更に、動脈硬化症部位にモノサイト・マクロファージを誘導する蛋白のＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ−１）は、ＡｎｇＩＩ負荷や酸化ストレスにより、血管内皮細胞にて発現が増加することが知られている。本発明でも、ＡｎｇＩＩの負荷によりＭＣＰ−１が増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの同時投与により、コントロールと同程度に低下することが示された。同様に、動脈硬化層で増加するコラーゲン１の発現も、ＡｎｇＩＩの負荷により増加するが、ＮＯ−ＮＩＦの同時投与により、コントロールと同程度に低下することが示された。

６）大動脈中膜における細胞増殖抑制作用の評価：
ＡｎｇＩＩの投与により、増殖マーカーＫｉを発現する大動脈中膜の陽性細胞数は増大したが、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、大動脈中膜のＫｉ陽性細胞数は有意に抑制された。
７）大動脈における白血球の浸潤抑制作用の評価：
ＡｎｇＩＩの投与により、大動脈血管表面においてＩＣＡＭ−１の発現が増加した。しかし、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、大動脈表面でのＩＣＡＭ-１発現の増加が抑制された。

（実施例３）ＡｎｇＩＩ刺激により増加した培養ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）に対するＮＯ−ＮＩＦの作用
（１）実験材料：
・培養ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）：
雄性ＳＤラットの大動脈よりｅｘｐｌａｎｔ法にて培養ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を得た（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ.;２９３:１４５８-１４６５. ２００２）。ＲＡＳＭＣは１０% ＦＢＳを含んだＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて培養した。全ての実験は継代数５−９の細胞を用い、無血清ＤＭＥＭを４８時間処置した後に行った。
・細胞増殖、遊走等の測定キット、化学発光試薬、抗体、他使用した試薬類は市販のものを購入し用いた。

（２）試験方法：
１）細胞遊走能の測定
ボイデンチャンバー法にて測定した（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
Ｒｅｓ.;２７:４３３-４４０. ２００４）。ＮＯ−ＮＩＦにて６時間前処置し、ＡｎｇＩＩ添加３時間後に遊走細胞数を測定した。
２）細胞増殖能の測定
ＭＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにて購入）にて手順書の通り測定した。ＮＯ−ＮＩＦを6時間前処置し、ＡｎｇＩＩ添加４８時間後の生細胞数を測定した。
３）免疫沈降法
ＮＯ−ＮＩＦおよびＡｎｇＩＩにて刺激された細胞溶解液から、免疫沈降法を用いてＥＧＦＲ蛋白を特異的に分離・回収し、ウエスタンブロッティング法に用いた。
４）蛋白リン酸化測定
Ａｋｔ、ＥＧＦＲ、ＰＫＣ−δの各種蛋白のリン酸化および総蛋白量はウエスタンブロット法にてリン酸化特異的抗体を用いて検出した。
４）細胞内ＲＯＳ測定
ＲＡＳＭＣにおける細胞内ＲＯＳ測定にはＤＨＥ法を用いた。ＮＯ−ＮＩＦを６時間またはａｐｏｃｙｎｉｎを３０分間処置した後、ＤＨＥを５μＭ添加し、３７℃暗室下にて１５分間静置した。さらにＡｎｇＩＩにて１０分間刺激した後ＤＨＥの蛍光（励起波長５４５ｎｍ、放出波長６０５ｎｍ）を測定した。
５）ＮＡＤＰＨ
ｏｘｉｄａｓｅ活性測定
ルシゲニン化学発光法を用いＮＡＤＰＨ
ｏｘｉｄａｓｅ活性を測定した（ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＲｅｓ.;７１（２）:３３１-４１. ２００６）。ＮＯ-ＮＩＦを６時間またはａｐｏｃｙｎｉｎを３０分間処置した後、ＡｎｇＩＩで２時間刺激した場合の発光量を測定した。各測定値は蛋白濃度で補正した。
６）細胞内遊離Ｃａ^２+測定
細胞内遊離Ｃａ^２+測定はｆｌｕｏ-４ＡＭ（インビトロジェンより購入）を用い、手順書に従い行った。ＮＯ-ＮＩＦを6時間またはｏｌｍｅｓａｌｔａｎを３０分間前処置した後、ｆｌｕｏ-４ＡＭを処置した。ＡｎｇＩＩで刺激し、刺激前の蛍光強度、刺激後の最大蛍光強度をそれぞれＦｍｉｎ、Ｆｍａｘと定義した。Ｃａ^２＋イオノフォアであるｉｏｎｏｍｙｃｉｎ
を１０μＭ処置した時のＦｍａｘとＦｍｉｎの差を１００%とし、それぞれＦｍａｘとＦｍｉｎの差の減少率を算出した。
７）ＮＯ−ＮＩＦラジカルの生成
ＮＯ−ＮＩＦをＲＡＳＭＣに添加し、ＥＰＲ法を用いて先行論文（Ｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍ. Ｂｕｌｌ. ５９（２）
２０８−２１４（２０１１））に従い測定した。
８）細胞膜流動性測定
細胞膜の流動性は、１，６−ジフェニルヘキサ−１，３，５−トリエン（ＤＰＨ）を用い蛍光偏光解消法で測定した。１０μＭのＮＯ−ＮＩＦで６時間処置されたＲＡＳＭＣを１
ｍＬのホモジネートバッファー（ＨＢ）（０．２５Ｍショ糖バッファー（ｐＨ７．５）, １０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ
ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙl ｆｌｕｏｒｉｄｅ）に懸濁した。懸濁液をボールベアリングホモジナイザー（クリアランス１２μｍ）を用いてホモジナイズし、その細胞溶解液を１，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心した。沈殿を３００ｍＬのＨＢに再懸濁し、５００×ｇ、１０分間、４℃で遠心した。上清に、最終濃度４μＭのＤＰＨを加えて４０分間室温でインキュベーションした後、２．２ｍＬの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。３５℃から４０℃のＤＰＨの蛍光異方性は自動蛍光偏光解消装置ＦＰ−７１５（ＪＡＳＣＯ,
Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。励起波長は３６０ｎｍ、蛍光波長は４３０ｎｍとした。定常状態の蛍光異方性（γ）はγ＝（ＩＶＶ−ＩＶＨＧ）／（ＩＶＶ＋２ＩＶＨＧ）で算出した。（※ＩＶＶとＩＶＨは垂直方向の蛍光強度、それぞれ垂直（ＩＶＶ）と水平（ＩＶＨ）の偏光で励起した時の蛍光強度。Ｇは装置固有の補正値。）

（３）測定結果：
ＮＯ−ＮＩＦは、ｉｎｖｉｔｒｏ試験の結果、図１０〜図１９に示されるように、血管平滑筋細胞における遊走及び増殖を抑制したこと、更にその上流のＡｋｔ及びＥＧＦＲのリン酸化を抑制し、ＲＯＳの産生を抑制していることが示された。一方、ＮＯ−ＮＩＦは、Ｃａの経路に対しては何の影響も与えていないことが示された。これらのことから、ＮＯ−ＮＩＦは、図２０に示されるように、細胞膜上でＮＯ−ＮＩＦラジカルに変化し、このＮＯ−ＮＩＦラジカルがＲＯＳの増加を抑制することで、その下流にある経路を抑制していることが示された。この作用機序により、ＮＯ−ＮＩＦは動脈血管の平滑筋中膜の肥厚と線維化を抑制し、動脈硬化の諸症状を改善することができると考えられる。

本発明の動脈硬化症治療剤は、動脈内にマクロファージの浸潤を抑制し、動脈血管の平滑筋中膜の肥厚と線維化を抑制することができる。これにより、動脈硬化の諸症状を改善することができる。これらのことから、ニトロソニフェジピン誘導体を母核化合物とする、これまでになかった新規な動脈硬化症治療剤を提供することができるようになった。

Claims

ニトロソニフェジピンを有効成分とする動脈硬化症治療剤
動脈硬化症が大動脈中膜肥厚および線維化の病態である、請求項１に記載の動脈硬化症治療剤。