JP5339339B2 - 新規微生物およびその利用 - Google Patents
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また、一般家庭、商店、事業所ならびに工場などから排出された油脂類や油以外の廃棄物がもたらす環境破壊もまた問題視され、近年では、焼却や化学的処理に代わる方法として、環境に優しい処理法として自然環境に生育している微生物を利用するバイオレメディエーションによる環境浄化法が検討されている。
さらに、鉱物油や動植物油などの各種油類を分解できる新規なハロモナス属(Halomonas sp.)に属する微生物が提案され(特許文献5)、また、エンジンオイルなどの油や油脂類を炭素源が存在しなくても分解することが可能なアシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumanni)により、好気性条件下で油と接触させる油の分解方法(特許文献6)が提案されている。このように、炭化水素と油脂類を共に分解することができる微生物が提案されてきた。
(1)炭化水素、脂肪酸エステルおよびアルカノールアミンの分解能を有するアシネトバクター Ud-4(受託番号 NITE P−604)からなるアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物に係るものである。
(2)本発明の上記(1)に記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物は、下記の菌学的性質を有する。
(a)形態的、培地上の特徴
細胞の形態:短桿状(短径0.5−0.8μm、長径1.0−2.0μm)
運動性:陰性
菌体系状:短桿菌
コロニーの色調:白色
コロニーの形態:円形
コロニーの透明度:不透明
コロニーの表面:滑らか
(b)生理学的性質
グラム染色:陰性
硝酸塩還元:陰性
インドール産生:陰性
グルコース(酸):陰性
アルギニンヒドロラーゼ:陰性
ウレアーゼ:陰性
エスクリン:陰性
ゼラチン液化:陽性
p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド:陰性
オキシダーゼ:陰性
(c)同化・吸収特性
グルコース:陰性
L−アラビノース:陰性
D−マンノース:陰性
D−マンニトール:陰性
N−アセチル−D−グルコサミン:陰性
マルトース:陰性
グルコン酸カリウム:陰性
n−カプリン酸:陽性
アジピン酸:陰性
dL−マレイン酸:陽性
クエン酸ナトリウム:陰性
酢酸フェニル:陰性
(3)本発明の微生物は、16SrDNAが、配列表に記載の部分塩基配列を有する上記(1)または(2)に記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物である。
本発明の上記微生物は、平成20年7月1日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託されたUd-4菌株(受託番号:NITE P−604)が挙げられる。本発明の微生物は、アシネトバクタ サイクロトレーランス(Acinetobacter psychrotolerans)に属する微生物である。
すなわち、本発明は、上記の(1)から(3)のいずれかに記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物を含有することを特徴とする炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミンの処理剤に係るものである。
(5)また、本発明は、上記(4)に記載の処理剤を、炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質と接触させることにより該物質中に存在する炭化水素、脂肪酸またはアルカノールアミンを分解処理することができる処理方法に係るものである。
(6)上記(5)に記載の処理方法を、炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミンを含有する土壌、廃棄物、海洋流出重油、排水、または動植物残渣に適用することができる。
(7)さらに、上記(5)または(6)に記載の処理方法により、本願発明の微生物は食塩または食塩を含む塩の存在下に炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質の処理が行の存在下に増殖可能であるため、海洋などの塩分を含有する環境での炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質の分解処理ができる。
Ud-4を培養してそのコロニーを寒天プレートからかきとり、滅菌DDWで懸濁後、熱水処理(100℃、5分)によりDNAを抽出した。そのDNAを鋳型とし、ほとんどの真正細菌の16S rDNA中に見られる塩基配列の遺伝子増幅用のPCRプライマーである、 27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)と1525r(5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)を使用し、MJ Mini Thermal Cycler(BIO-RAD)を用いてPCRを行い、16S-rDNAのほぼ全領域(約1、500bp)を増幅させた。得られたPCR産物をQIA quick PCR purification kit(Qiagen)を用いて精製し、Dye Terminator法によってシークエンスを行った。得られた塩基配列を塩基配列1として、または図12に、示す。この塩基配列に基づいてBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)を用いて検索し、既知のバクテリアの塩基配列との相同性を調べて種の同定を行った。また、解析結果をもとにMEGA Ver.4.0(Molecular Evolutionary Genetics
Analysis and Sequence Alignment)を用いて系統樹の作成を行った。16SrDNAの塩基配列に基づく系統樹を図3に示す。塩基配列から見ると、本発明のUd-4はAcinetobacter psychrotoleransに99%の高い相同性を示したが、本菌種は正式に登録された菌種ではなく、同種に最も近縁の種で有ると考えられる。二番目に高い相同性を示した菌種はAcinetobacter calcoaceticusで90.8%であった。
Ud-4菌株は、平成20年7月1日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に受領番号 NITE AP−604として寄託されている。
さらにまた本発明の微生物にはアシネトバクター サイクロトレーランス(Acinetobacter psychrotolerans)に類縁する菌であって炭化水素、高級脂肪酸エステルおよびアルカノールアミン分解能を有するものを含むものである。
(1)生態及び生体に安全であるとともに、鉱物油や動植物油などの各種油およびアルカノールアミンを分解できる新規な微生物を提供することができる。
この微生物は食塩の有無に関わらず生育できるため、陸上及び海洋の別を問わず、油類の生物学的処理に利用できる微生物を提供することができる。
(2)炭化水素類、高級脂肪酸エステル類、およびアルカノールアミンと水、土壌または各種の廃棄物との混在状態でも効率的に分解できる微生物を提供することができる。
(3)本発明の微生物は、塩類、例えば、NaClの共存下においてもその炭化水素類などの分解能を発揮することができ、タンカーの事故による海の重油汚染に対して対応が可能である。
(3)本発明の微生物を用いて、海洋及び陸上における油や廃油含有物およびアルカノールアミン類を分解処理することにより環境浄化を行う方法ならびに当該方法に利用できる処理剤を提供することができる。
本発明のアシネトバクター属に属する微生物を、本明細書中の記載においては、具体的に、「Ud-4」または「NITE AP−604」と称することがある。本発明のUd-4のハローアッセイを行ったところ、5種類の食用油(キャノーラ油、オリーブオイル、ごま油、大豆油、ラード)と切削油、アルカノールアミンで透明なハローが確認された。ハローが確認されるまでの期間は、切削油よりも食用油の方が早く、食用油では約5日後からハローが見え始め、切削油では約7日目以降からハローが見え始めた。また、切削油では、LB培地よりも、M9培地での方が大きいハローが観察された。このことから、Ud-4は工業用油よりも、食用油の方が分解しやすいのではないかと考えられた。Ud-4の増殖について調べた結果、LB培地とNSW培地ではキャノーラ油の存在の有無による増殖には差は見られなかった。しかし、M9培地では、培地のみでは増殖が低かったが、キャノーラ油の入った培地では、菌はよく増殖していた。このことから、Ud-4は油脂類を唯一の炭素源として資化できることが示唆された。
本発明の微生物を、LB寒天培地(1%NaCl、0.5%yeast extract、1% tryptone)中で25℃、2日間生育して観察した結果、その(1)形態学的性質、(2)生理学的性質、および(3)同化・吸収特性は上述したとおりのものが得られた。
(培地)
微生物の培養には次の三種類の培地を使用した。
(1)栄養分の多いLB ( Luria-Bertani ) 培地( NaCl 10.0g、Yeast Extract 5.0g、Tryptone 10.0g / L )、
(2)炭素源を含まないM9( M9 Minimal )培地( Na2HPO4 6.8g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1.0g、1M MgSO4 2ml、1M CaCl2 0.1ml / L)、
(3)塩分濃度が海水に近いNSW( Natural Sea Water )培地( 人工海水800ml、NH4NO3 1.0g、K2HPO4 0.02g、Yeast Extract 0.5g / L (pH 7.8) )。
1%(w/v)各種油を加えた各種液体培地6mlに菌体を接種し、振盪培養開始から一定時間毎に、下水処理法に従いn-へキサン抽出法で食用油の抽出を行った。まず、25℃、120rpmの振盪で一定時間培養した試料6mlを分液ロートに移し、それにpH指示薬としてメチルオレンジを3滴加え、溶液のpHが3〜4となって赤色に変化するようにさらに6N-HClを5滴加えた。次に、n-へキサンを約20ml加え、レシプロシェカー(SR-2s;TAITEC)を用いて250rpmで5分間激しく振盪し、水層とヘキサン層が明らかに分離するまで静置した。静置後、水層は新たな分液ロートに移し、それにn-へキサンを約20ml加え、同様の操作をもう一度繰り返し、再抽出を行った。2つの分液ロートに残っているヘキサン層を、ナス型フラスコに移し、無水硫酸ナトリウム(Wako)を適量加えて脱水し、それをろ過して、別のナス型フラスコに移した。そして、ロータリーエバポレーター(Ren-ivn;IWAKI)で、試料がおよそ2mlになるまで30℃で揮発させた。次に、それをサンプル瓶に移し、ヒーターで加熱してn-へキサンを十分に揮発させた後、デシケーター内で放冷してから、重量を測定した。既知のサンプル瓶との重量の差から、抽出した油の重量を算出し、さらに、分解菌を接種した試料と接種していない試料から抽出された油の重量差から、分解率の算出を行った。
0.5%(w/v)重油を加えた各種液体培地6mlに菌体を接種し、振盪培養開始から一定時間毎に、クロロホルム抽出で重油の抽出を行った。まず、試料6mlを分液ロートに移し、それにクロロホルムを約20ml加え、レシプロシェカー(SR-2s;TAITEC)を用いて250rpmで5分間激しく振盪し、水層とクロロホルム層が明らかに分離するまで静置した。静置後、クロロホルム層はナス型フラスコに移し、分液ロートには新たにクロロホルム約20mlを加え、同様の操作をもう一度繰り返し、再抽出を行った。再抽出を行って得たクロロホルムをナス型フラスコに移し、クロロホルム層に重油の色が見られなくなるまで同様に抽出を行った。重油を抽出したクロロホルム層が透明になったら、クロロホルム層を1つのナス型フラスコに移し、無水硫酸ナトリウム(Wako)を適量加えて脱水し、それをろ過して、別のナス型フラスコに移した。そして、ロータリーエバポレーター(Ren-ivn;IWAKI)で、試料がおよそ2mlになるまで30℃で揮発させた。次に、それをサンプル瓶に移し、ヒーターで加熱してクロロホルムを十分に揮発させた後、デシケーター内で放冷してから、重量を測定した。既知のサンプル瓶との重量の差から、抽出した油の重量を算出し、さらに、分解菌を接種した試料と接種していない試料から抽出された油の重量差から、分解率の算出を行った。
上記食用油の分解率の測定方法と同様に行った。
以下に記載の組成を有する廃油2.5mL(0.25%)を土壌1kgに、LB培地を20mL添加した後、定常状態にまで菌を増殖させた50mLの培養液を均一に添加して試験土壌とした。廃油の分析には、テキサス州試験法1005に準じてメタノール・ペンタンで抽出することにより、揮発成分の分析誤差を抑えた。廃油を分析した結果、C6-C12の区画が12.2%、C12-C28の区画が75.50%、C12-C44の区画が12.3%、TPHs100%が得られた。
Claims (7)
- 炭化水素、脂肪酸エステルおよびアルカノールアミンの分解能を有するアシネトバクター Ud-4(受託番号 NITE P−604)からなるアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物。
- 下記の菌学的性質を有する請求項1に記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物。
(1)形態的、培地上の特徴
細胞の形態:短桿状(短径0.5−0.8μm、長径1.0−2.0μm)
運動性:陰性
菌体系状:短桿菌
コロニーの色調:白色
コロニーの形態:円形
コロニーの透明度:不透明
コロニーの表面:滑らか
(2)生理学的性質
グラム染色:陰性
硝酸塩還元:陰性
インドール産生:陰性
グルコース(酸):陰性
アルギニンジヒドロラーゼ:陰性
ウレアーゼ:陰性
エスクリン:陰性
ゼラチン液化:陽性
p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド:陰性
オキシダーゼ:陰性
(3)同化・吸収特性
グルコース:陰性
L−アラビノース:陰性
D−マンノース:陰性
D−マンニトール:陰性
N−アセチル−D−グルコサミン:陰性
マルトース:陰性
グルコン酸カリウム:陰性
n−カプリン酸:陽性
アジピン酸:陰性
dL−マレイン酸:陽性
クエン酸ナトリウム:陰性
酢酸フェニル:陰性 - 16SrDNAが、配列表に記載の部分塩基配列を有する請求項1または2に記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物。
- 請求項1から3のいずれかに記載のアシネトバクター サイクロトレーランスに属する微生物を含有することを特徴とする炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミンの処理剤。
- 請求項4に記載の処理剤を、炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質と接触させることを特徴とする該物質中に存在する炭化水素、脂肪酸またはアルカノールアミンの処理方法。
- 炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質が土壌、廃棄物、海洋流出重油、排水、または動植物残渣である請求項5に記載の処理方法。
- 食塩の存在下に炭化水素、脂肪酸エステルまたはアルカノールアミン含有物質の処理が行われる請求項5または6に記載の処理方法。
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