JP5330504B2 - データ品質評価および制御機能を備える高スループットフローサイトメータ - Google Patents

Description

本願は、２００８年５月１５日出願の米国仮特許出願第６１／１２７，９００号の優先権を主張するものであり、同出願の全体を引用によって本願に援用する。

フローサイトメトリ（flow cytometry）を利用する多くの場合、特に環境モニタ、臨床試験、創薬分野のように大量の試料を繰り返し処理して解析しなければならないか、あるいは、医学的用途のために希少細胞の純化された細胞集団を得る場合のように長期間にわたる分取作業を実行しなければならず、後者については「非特許文献１」、「非特許文献２」、「非特許文献３」、「非特許文献４」、「非特許文献５」、「非特許文献６」、「非特許文献７」、「非特許文献８」等に記載されている。このような意味で、複雑なフローシステムが高スループットで、「放置したまま」動作できることが非常に望ましいが、それには以下のような特異な工程管理と技術的な課題が伴う。（ｉ）連続解析のために、多数の試料を用意し、並べておくこと、（ｉｉ）長期間の動作中に機器の構成要素の配列と適正な機能を保守し、試料間で一貫した測定が行われ、あるいは希少な下位個体群の損失を防止すること、（ｉｉｉ）特に臨床設定では、入手元も品質も大きく異なる試料を解析すること、（ｉｖ）フローシステムの機能に影響を与え、変則的な測定の原因となる事象を認識し、これに対応すること。

フローシステムが、自己監視機能を有し、例えば、試料管の詰まり、照明光線の位置ずれ、試料の劣化等、収集データの品質と完全性または分離された細胞集団の純度を損なう可能性のある状況に対応して、自動是正措置をとることができれば、フローシステムを高スループットで、無人のまま運転させることが望ましいであろう。

米国特許第３，８２６，３６４号明細書 米国特許第３，７１０，９３３号明細書 米国特許第７，０１２，６８９号明細書 米国特許第５，４６４，５８１号明細書 米国特許第４，９８８，６１９号明細書 米国特許第５，０７６，４７２号明細書 米国特許第５，６２７，０４０号明細書 米国特許第６，０１４，９０４号明細書 米国特許第５，７９５，７２７号明細書 米国特許第６，１７８，３８２号明細書 米国特許第７，１５７，２７４号明細書 米国特許第７，０６８，８７４号明細書

イブラヒムとファン・デン・エング（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｎｇｈ）、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０６：１９−３９（２００７） ジョンソン他、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：１３３−１３９（２００７） 杉山他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．，１０ Ｓｕｐｐｌ ４：１７９−１８５（２００８） ヤーノシー（Ｊａｎｏｓｓｙ）とシャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒ Ｂ，７４Ｂ（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６−Ｓ１０（２００８） クルツィック（Ｋｒｕｔｚｉｋ）他、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：１３２−１４２（２００８） ツェツェパンスキー（Ｓｚｅｚｅｐａｎｓｋｉ）他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，４４：７７５−７９６（２００６） ルッテン他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ，６４：１６−２６（２００５） カンパナ（Ｃａｍｐａｎａ）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ４７−Ｓ５７（２００４） ロビンソン他（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００７） Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ） Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（同上） オーエンズ他（編集者）、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ．１９９４） オーメロッド（編集者）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００） クーン、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９１） ライリー他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｔｒｙ（医学書院医学出版、１９９３） スチュワートとニコルソン（編集者）Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２０００） マーフィ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２００１） シャピオ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２００３） ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）他、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９８） ワトソン、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，８：６４６−６４９（１９８７） ボディ他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４４；１９５−２０９（２００１） ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ．２００７） マーフィ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６：３０２−３０９（１９８５） ロークン（Ｌｏｋｅｎ）他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１１：４５３−４５９（１９９０） フ（Ｆｕ）他、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２６：３６５−３７３（１９９３） フランケル他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２３：２９０−３０２（１９９６） バーレージ（Ｂａｒｌａｇｅ）他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９：８１−９０（１９９９） ヴェルワー（Ｖｅｒｗｅｒ）他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１４：８６２−８７５（１９９３） ウィルキンズ他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４４：２１０−２１７（２００１） ボーディガイマー（Ｂｏｅｄｉｇｈｅｉｍｅｒ）他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，７３：４２１−４２９（２００８） ロ他、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，７３：３２１−３３２（２００８） 猪熊他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７９：２６２７−２６３３（２００７） アルバーツ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｇａｒｌａｎｄ，２００２） ネルソンとコックス、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，２００４） ボナ他、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，４３：４０４（１９７２） ヒュー（Ｈｕｈ）他、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍｅａｓ．，２６：Ｒ７３−９８（２００５） アテヤ（Ａｔｅｙａ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３９１：１４８５−１４９８（２００８）

本発明は、１つまたは複数の試料からマルチパラメータデータを高い信頼性、高いスループットおよび／または無人で収集するためのフローシステムと方法を提供する。

１つの態様において、本発明には、高い信頼性でマルチパラメータデータを取得し、粒子を分取および／または計数するためのフローシステムが含まれ、このフローシステムはその要素として、（ａ）その中ではある試料の粒子が共通の試料経路に沿って移動するように制約される移動流体カラムを備える流体工学系と、（ｂ）共通の試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から複数の信号を収集する検出系であって、複数の信号の各々には１つの信号値が割り当てられ、各粒子のマルチパラメータデータ点を形成し、一連の異なる時間間隔において、予め決められた１つまたは複数のサブセットのそのようなマルチパラメータデータ点を収集して、そのような時間間隔の各々のデータプロファイルを形成する検出システムと、（ｃ）流体工学系と検出系に動作的に関連付けられ、連続するデータプロファイルの中の収集されたデータのパターン変化を評価して、１つまたは複数の是正措置をとる制御系と、を含む。好ましくは、制御系はそのような変化を検出し、評価するのに、現行データプロファイルのデータプロファイル特徴を、（ｉ）使用者が設定した所定の限界、または（ｉｉ）所定の過去データプロファイルの数値と比較する。このようなデータプロファイル特徴が所定の限界を通過または超過したか、あるいは過去データプロファイル特徴の数値との差が所定の量より大きい場合は必ず、制御系が１つまたは複数の是正措置をとる。好ましい流体工学系では、試料液が移動流体カラムの中に、好ましくは移動流体カラムと同軸的に配置された試料管によって導入され、試料の粒子が移動流体カラムの中央付近に放出される。１つの実施形態において、測定されたデータプロファイル特徴は、ある時間間隔中に集録された粒子の数である。好ましい実施形態において、是正措置には、マルチパラメータデータ点を分類するためにゲートを自動的に調整し、例えばある試料中の希少な下位個体群の細胞の損失を防止するように分取の決定を行うことが含まれる。

他の態様によれば、本発明は、生体細胞を含む粒子を計数または分取する方法が提供され、この方法は、（ａ）試料を、その中で試料の粒子が共通の試料経路に沿って移動するような流体カラム内に導入する試料管またはインレットを用意するステップと、（ｂ）共通の試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から複数の信号を収集するステップであって、複数の信号の各々には１つの信号値が割り当てられて、各粒子のマルチパラメータデータ点を形成し、検出系が所定の互いに素な複数のサブセットの中のそのようなマルチパラメータデータ点を計数して、データプロファイルを形成するステップと、（ｃ）現行データプロファイルの相対的信号値を所定の過去データプロファイルの信号値と比較するステップと、（ｄ）そのような相対的信号値の差が所定の量より大きい場合は必ず是正措置を自動的にとるステップと、を含む。

本発明は、長期間動作、あるいは品質が大きく異なる試料を処理しなければならないフローサイトメトリシステムにおいて、データの収集および粒子の分取と計数に伴う問題を克服する。特に、乱流や、気泡その他の閉塞による流速の変化等の流体工学的問題と、試料の凝集、集塊等の試料品質の問題その他があるため、これを避けるために、ほとんど常にオペレータが注意していなければならない。本発明によれば、データは自動的に監視され、異なる時点での測定結果の違いが生物学的または実験的に想定されないものであるか否か、および是正措置をとるべきか否かを判定することができる。本発明の１つの好ましい実施形態によれば、このような監視と評価は、分析中の試料の生体細胞について行われる。本発明の別の実施形態によれば、データ中のいくつかの変化指標を監視して、これらを使用者が選択した許容範囲限界と比較することによって、流体工学的挙動パターンを認識する方法を用いて、データセットをリアルタイムで分析し、異常なデータ値が検出されたときは必ず、是正措置をとり、是正措置には、流体工学系の選択部分をパージすること、影響を受けたデータ値にアノテーションを付加すること、オペレータに通知すること、多試料分析中にある試料をスキップすること、分取および／または計数ゲートを調整すること、等が含まれる。

データ点の一成分の大きさの平均値および第一，第二の標準偏差を、それが監視された時間および時間間隔に関して示す図である。 フローシステムの流体工学系内の閉塞に応答して、図１Ａの関数がどのように変化するかを示す図である。 本発明によるフローシステムの動作を示すフローチャートである。 二次元データの散布図と、散布図中のデータ点の分布状況の定量的変化を監視するために、経時的に事象が計数されて比較される収集領域のグリッドと、を示す図である。 二次元データの散布図と、散布図中のデータ点の分布状況の定量的変化を監視するために、経時的に事象が計数されて比較される収集領域のグリッドと、を示す図である。 二次元データの散布図と、散布図中のデータ点の分布状況の定量的変化を監視するために、経時的に事象が計数されて比較される収集領域のグリッドと、を示す図である。 二次元データ点の散布図と、経時的に散布図中のデータ点の分散状況の変化を監視するための、二次元データ点の所定の相互に素の複数のサブセット（a plurality of predetermined disjoint subsets of two-dimensional data points）の一実施形態と、を示す図である。 二次元データ点の散布図と、経時的に散布図中のデータ点の分散状況の変化を監視するための、二次元データ点の所定の相互に素の複数のサブセット（a plurality of predetermined disjoint subsets of two-dimensional data points）の一実施形態と、を示す図である。 ２つの異なる収集間隔中に選択領域において蓄積されたデータ点の数の変化を示す棒グラフである。 フローサイトメータシステムの異なる態様を概略的に示す図である。 フローサイトメータシステムの異なる態様を概略的に示す図である。 フローサイトメータシステムの異なる態様を概略的に示す図である。 本発明の一実施形態のグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットである。 別の使用者設定から得られたデータを示す、図２Ａの実施形態のグラフィカルユーザインタフェースの別のスクリーンショットである。

本発明の実施に当たっては、特にことわりがない限り、フローサイトメトリ、細胞および分子生物学、免疫測定法、顕微鏡検査、画像解析、分析化学分野の、当業界で周知の従来の技術を使用してもよい。このような従来の技術としては、これらに限定されないが、生体細胞標識、生体細胞免疫染色、蛍光信号の検出、画像解析、光源および光信号検出用構成要素の選択その他がある。このような従来の技術と説明は、「非特許文献９」、「非特許文献１０」、「非特許文献１１」、「非特許文献１２」、「非特許文献１３」、「非特許文献１４」、「非特許文献１５」、「非特許文献１６」、「非特許文献１７」、「非特許文献１８」、「非特許文献１９」等の標準研究所マニュアルに記載されており、これらの文献の全文を、あらゆる目的のために引用によって本願に援用する。

１つの態様において、本発明のフローシステムは収集データのパターン変化を監視し、その変化が所定の限界を超えた場合には１つまたは複数の是正措置をとることによって、マルチパラメータデータ点を高い信頼性で収集することができる。これらの是正措置は、下表に示した機能の１つまたは複数を含んでいてもよい。

是正措置の例

本発明の１つの態様において、図１Ａに示されるようにマルチパラメータデータが別々の時間間隔で収集され、図中、このようなマルチパラメータデータの１つの成分のみの大きさ、例えば、前方散乱の強度が経時的にプロットされている。（一般に、マルチパラメータデータ点には、両方の散乱信号の強度、および、例えば１から８またはそれ以上の、複数の分離した蛍光信号に関する信号値が含まれる。）この図において、その中のデータが時間間隔中に収集される所定のサブセットは、上下の境界、それぞれ（１３）と（１５）によって画定され、データプロファイルは単純に、上下の境界（１３）と（１５）の範囲内に含まれる大きさの信号成分を有する粒子の数であり、そのデータプロファイルの特徴は、カウントされた粒子の１成分の平均値となる。通常の動作条件下では、成分の各数値は、平均値（１０）（計算によるデータプロファイル特徴と同じ場合も、異なる場合もある）、例えば第一（１２）と第二（１４）の標準偏差を有する分布の中に入る。これらのうちのどの数量も、システムにより監視される特徴としても使用できる。図１Ａに示されるように、異なる時間間隔（１６）の各々において、マルチパラメータデータ点は、マルチパラメータデータ空間またはその部分空間の所定のサブセット、例えば、二次元空間への投影（これは図１Ａ−１Ｂには示されず、１成分の大きさだけが示されている）から収集される。好ましくは、時間間隔（１６）はフローシステムの動作期間内で均一に離間され、より好ましくは規則的に、すなわち時間間隔同士の間の時間が等しくなるように離間される。時間間隔の長さは、事象または粒子が検出される速度によって異なる。データ点を低速で収集するには、データプロファイルまたはそれに基づく測定値の有意な変化を判断する上で統計的に有意な数のデータ点を収集するのに、より長い時間を要する。同様に、高速に収集する場合は、時間間隔を短縮できる。毎秒数千から毎秒何万という単位までの一般的なデータ点収集速度の場合、時間間隔の長さは、好ましくは１から２０秒の範囲である。図１Ａでは、時間間隔（１６）が分離されて描かれているが、好ましくは、時間間隔は連続し、時間間隔と時間間隔（１６）の間に「むだ時間」がないようにする。

１回の動作で複数の試料が解析される規則的な時間間隔による評価の代わりに、またはこれを補足するものとして、例えば、各試料の解析開始時に別の試料間評価を行ってもよい。例えば、マイクロタイタプレートの異なるウェルに収納された複数の試料から得られる試料が全て同じ細胞型を有すると予想される場合、対応するクラスタゲートに対し、最初にその有無または濃度もしくは数量を問い合わせることができる。

フローシステムの動作中、試料管の閉塞が発生するかもしれず、これによって試料経路が照明光線から外れる。このような異常な動作の結果は、図１Ｂのように表すことができ、図中、時間間隔（１８）で信号値が下降する。本発明の１つの実施形態によれば、このような下降は、時間間隔Ｔ_４のデータ点の特徴（２０）が判断され（あるいは、より完全には、時間間隔Ｔ_４のデータプロファイルの特徴が判断され）、(例えば）時間間隔Ｔ_３のデータ点について判断された特徴（２２）と比較されたときに、システムにより検出される。（あるいは、特徴値は上下の境界（１３）と（１５）によって示される限界値（本明細書では「所定の限界」という）と比較されてもよい。）（特徴値を計算し、その限界値と比較することによって間接的に）信号値の変化を認識すると、システムはある是正措置（２６）または一連の是正措置を開始して、システムを前の動作状態に戻そうとし、例えば、平均信号値を過去に測定されたレベルまたは所定のレベル内に戻す。このようなデータの変化が検出されたら、データプロファイルの所定の特徴が正常な動作に対応する数値に戻るまで、マルチパラメータデータ点をより高い周期（２４）で監視してもよい。当然のことながら、監視時間間隔（１６）が連続する好ましい実施形態においては、これは不要である。

上記のような動作の制御は、図１Ｃに示されるようなフローチャートで表すことができる。一般に、動作は、監視対象とするデータのサブセット、マルチパラメータデータ点を各種サブセットの中で収集する時間間隔の頻度と長さ、判断するデータプロファイル特徴、特徴の数値または特徴の数値の変化に関する許容範囲を、使用者が選択すること（５０）から始まる。これらの数値は、フローシステムに関連付けられたシステムソフトウェアを使って入力される。フローシステムの動作中、連続する時間間隔の各々において、選択された各サブセットにおいてデータ点を収集し、データプロファイルの特徴を計算する（５２）。次に、現在の時間間隔での特徴の数値を、前回の時間間隔での特徴、あるいは使用者が選択した許容範囲限度と比較する（５４）。この数値が前回の特徴を所定の量だけ超過した場合、あるいは数値が所定の限度を超えた場合に、是正措置をとる（５６）。是正措置実行後、新しいデータから再びデータプロファイルの特徴を判断し、その数値を再度、過去の数値または絶対的許容範囲限度と比較する（５８）。新たに判断されたデータプロファイル特徴の数値が容認可能な境界内になければ、是正措置を繰り返すか、別の是正措置を実行する。新規に判断されたデータプロファイル特徴の数値が適正な境界内にあれば、フローシステムの動作を継続し、次の時間間隔で新しいデータセットを収集、解析する。この工程を所定の数の時間間隔について継続し、その後、より決定的な措置、例えば、システム停止、アラーム作動、オペレータの通知等を行う。

マルチパラメータデータは、粒子がフローシステムの１つまたは複数の検出ステーションを通過するのに応答して測定される信号に対応する数値の集合からなる。このような数値の集合は、多次元データ空間の中の点と考えることができる。本発明の１つの態様において、マルチパラメータデータ点はまた、そのデータ点を構成する信号値の集合が収集された時間を含んでいてもよい。時間の数値は事象率のモニタに使用でき、事象率とは、動作中に粒子が検出ステーションで検出される比率である。事象率の変化は、本発明の所定のサブセットと一緒にモニタしてもよく、「非特許文献２０」により教示されているように、流体工学系内の問題に相関させてもよい。

本発明の他の実施形態において、マルチパラメータデータ点の１成分として、試料液（または、粒子に隣接するストリーム）の中の自由蛍光の数値が含まれていてもよい。このような数値は、別にモニタしてもよい。この数値は、フローシステムの通常の蛍光検出系で測定することによって得られる。１つの実施形態において、このような測定は、フローシステムの中の、収集した蛍光を適当なＰＭＴに向ける共焦点検出系またはその他の検出装置を通じて行うことができる。この数量は通常、先行技術のフローシステムでは測定されないが、その強度は移動流体カラム内の試料ストリームの状態に関する情報を提供でき、例えば、それが粒子検出のために適正に配向されているか否か、または試料ストリームが流体工学系内のデブリまたはその他の要因によって偏向されているか否か等を示す。したがって、本発明の１つの態様において、試料ストリームの自由蛍光の強度の測定を利用して、その試料ストリームが偏向されているか否か、あるいは閉塞によってその流速が低下しているかが評価される。蛍光全体または、蛍光の中の１つまたは複数の波長範囲をモニタしてもよい。試料に塗布した蛍光標識が洗い流されない場合、モニタされる自由蛍光は蛍光標識の発光帯に対応してもよい。

本発明の１つの態様において、使用者は、データをモニタする目的のためにカウントすべきマルチパラメータデータ点を定める所定の限度または範囲を選択する。この所定のデータ点サブセットは、実験または臨床での運用において細胞または粒子を分取または計数するために用いられるゲートと同じでも、違ってもよい。このような限度または範囲の数値は先験的に入力されても、あるいは１つまたは複数の予備的試料から得たデータに基づいて入力されてもよい。１つの態様において、所定の限度は、２つまたはそれ以上の所定のサブセットにおいてカウントされたマルチパラメータデータ点の比率の使用者が指定する変化率として選択され、これは使用者が指定する、マルチパラメータデータ空間の相互に素の領域または重複する領域であってもよい。実施形態の例を、二次元データ点に関して図１Ｄから図１Ｆに示す。図中、データは２つのクラスタ（１００）、（１０２）を含む点のプロットと示される。図１Ｅにおいて、データ空間はグリッド（１０４）に分割して示され、グリッドの各セル（「グリッドセル（ｇｒｉｄ ｃｅｌｌ）」として「生体細胞（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌ）」と区別する）、例えば、セルＢ６（１０６）またはいずれかのセルサブセットが、データプロファイルを形成するための所定のサブセットとしての役割を果たす。データプロファイルは、所定のセットの集合を構成するセルまたはセルサブセットの各々におけるマルチパラメータデータ点の相対数である。試料管の閉塞により、粒子の共通試料経路が偏向されて、時間間隔２（図１Ｆの時間２）で収集された各粒子が時間間隔１（時間１）で収集された各粒子が受けた照明の一部分しか受けなかった場合、そのデータ点を定義する信号値、例えば、異なる色の蛍光強度は、矢印（１０８）と（１１０）によって示されるようにシフトするかもしれない。このようなシフトの結果、グリッド（１０４）のセル間のマルチパラメータデータ点は、時間１で収集されたそのようなデータ点と時間２で収集されたそのようなデータ点に関して再分布される。このような比較を行うための時間間隔は通常、使用者によって決定され、好ましくは、機器の状態がより高い信頼性で示されるように事象のサンプルを収集できる、十分な長さとする。あるいは、マルチパラメータデータ点の分布の変化は、（時間間隔ではなく）所定の数の事象を定期的に分析することによってモニタしてもよい。他の実施形態において、所定のサブセットは、マルチパラメータデータ空間の所定の数の互いに素の領域のパターンとして、自動的に選択されてもよい。このようなパターンは、直線状や放射状のように規則的であっても、または不規則的であるが均一に離間されていてもよい。例えば、このようなサブセットは、図１ＥのセルＡ１，Ａ２…Ｅ６のように、データ空間全体をカバーするグリッドセルの全てを含んでいてもよい。このようなサブセットは、等しい容積の領域の直線的に離間されたアレイであってもよく、その全容積はデータ空間の全容積のうちの所定のパーセンテージである。例えば、サブセットの集合は、チェス盤状に配置された図１Ｅのグリッドの１つおきのセルであってもよく、したがって、全体のデータ空間の５０％をカバーしてもよい。このような実施形態では、その領域の数は２から１００、または２から３６、または２から９であってもよく、サブセットの集合により包囲されるデータ空間のパーセンテージは１パーセントから５０パーセント、または１パーセントから１０パーセント、または１パーセントから５パーセントであってもよい。あるいは、選択されたクラスタ、例えば、図１Ｅの領域Ｂ２，Ｂ３，Ｃ２，Ｃ３，Ｄ２，Ｄ３をカバーする最低数の領域を選択してもよい。隣接するグリッドセルの中で収集されるデータ点の数をモニタすることは、例えば、試料ストリームの偏向によって引き起こされるような信号レベルの全体的低下を検出するのに特に有益であり、これは、１つのグリッドセル内のデータ点の数が減少するのに伴い、隣接する１つまたは複数のグリッドセル内のデータ点の数が増大するからである。

図１Ｇは他の実施形態を示しており、マルチパラメータデータ点の分布が３つの相互に素の所定の集合Ｉ（１１４），ＩＩ（１１６），ＩＩＩ（１１８）の中でモニタされる。所定の集合Ｉ（１１４）とＩＩ（１１６）は、それぞれ実質的にクラスタ（１００）と（１０２）を包囲する。所定の集合ＩＩＩ（１１８）は単純に、データ空間のうち集合ＩとＩＩの外の領域である。したがって、３つのサブセットの容積の合計（または、この図では面積の合計）は、データ空間全体と等しい。図１Ｈは、データ点の分布に起こりうる変化を示しており、クラスタ（１００）はデータ空間の左下にシフトし（１２２）、クラスタ（１０２）はデータ空間の左下にシフトしており（１２０）、これは、例えば、試料管の閉塞によって粒子経路が偏向し、検出ステーションの中のレーザ焦点から外れたことによるかもしれない。図１Ｉは、クラスタ（１００），（１０２）の位置がシフトする前後の２つの異なる時間間隔で、３つの所定の集合において収集されたマルチパラメータデータ点の変化を示す棒グラフである。このようなカウントの数値または相対値が使用者の定めた量だけ変化した場合は必ず、機器が自動的に是正措置、例えば、データ収集および／または分取の停止、試料管のパージ、試料の供給とデータ収集の再開等を実行する。

前述のように、本発明の特徴は、連続する時間間隔におけるデータ空間の所定のサブセット内でのデータ点の収集と、各時間間隔に関するデータプロファイルの生成である。ある時間間隔中にこのようなデータを収集した後、データプロファイルを生成し、そのデータプロファイルの特徴を、以前に収集されたデータプロファイルの特徴と比較する。一般に、過去のデータプロファイルは直前の時間間隔に対応する。１つの態様において、データプロファイルは、所定のサブセットの各々の境界内でカウントされたデータ点に対応する数のリストである。データプロファイルの特徴は、データプロファイルそのものであっても、あるいは、そこから導き出された、そのデータプロファイルに含まれる情報を表す１つまたは複数の数であってもよい。例えば、ある時間間隔中に異なる所定のサブセット内で計数された粒子の合計または平均が特徴であってもよい。別の例において、所定のサブセットは、データ点のクラスタに関して画定された領域(例えば、図１Ｇの領域Ｉ（１１４）または領域ＩＩ（１１６））であってもよい。このようなサブセットの特徴は、その境界内のデータ点の重力中心であってもよく、これは図１Ｆの場合、順序対（ordered pair of numbers）である。このようなサブセットを定義するのに使用される次元の数は、図のように１または２または、それ以上であってもよく、一般的な実装では、最大２０の測定次元と、これらの測定次元の数学的導関数を含むことができる。

I．フローシステム
本発明のフローシステムはさまざまに設計でき、例えば、ｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒソータ、ソーティング機能を持たないフローサイトメトリックアナライザ、マイクロ流体工学に基づくアナライザおよびソータ等であってもよい。一般に、フローシステムは、その構成要素として、流体工学系、検出系、流体工学系と検出系の動作を制御、調整する制御系を備える。本発明のフローシステムは、流体内に浮遊する粒子の特性を測定するものであり、したがって流体工学系の目的は、試料中の粒子を検出系で質問できる位置に搬送するか、あるいは、これを通過させるための経路と動力を提供することである。流体工学系はさまざまに設計でき、ロボットによるピペットベースの流体搬送から、管、マニホルドその他の専用流体経路、バルブおよび、圧力、重力、ポンプ等の流体移動装置までに渡る。流体工学系の態様の例を図１Ｊ−ＩＬに示す。１つの態様において、流体工学系はシース液の移動カラムを生成するためのフローチャンバまたはキュベットを有し、移動カラムの中には試料液が挿入され、シースと試料の同軸流が発生されるようにし、これによって試料内の粒子は共線的経路に沿って移動するように制約される。検出系は検出ステーション、すなわちフローシステムの中で、照明装置、光検出器等が動作的に配置される箇所を通過する粒子からの信号を問い合わせ、検出するための装置である。１つの態様において、フローシステムの検出系は、照明機器を備え、これは通常、１つまたは複数のレーザ、前方光散乱検出器、側方光散乱検出器、顕微鏡の共焦点面内の共通流路の中の粒子からの信号を検出するように方向付けられた共焦点顕微鏡である。１つの実施形態において、顕微鏡で収集された信号は光電子倍増管（ＰＭＴ）で検出され、その後、電子的、デジタル的にフィルタ処理されて、不要な信号、すなわちノイズが除去される。制御系は、マイクロプロセッサおよび関連する電子機器、ソフトウェア、流体工学系と検出系の各種構成要素を制御し、フローシステムの機能を実行するためのユーザインタフェースである。

１つの態様において、本発明のフローシステムは、シース流（sheath flows）によって試料の流体力学的絞り込みを行うための系を備える。このような系は、ソーティング機能を有していてもよく、これは各種設計のフローチャンバ（あるいは、フローセルまたはフローキュベットとも呼ばれる）またはノズルを採用してもよい。フローセルは、マルチパラメータデータ点を収集するための１つまたは複数の検出ステーションを有していてもよく、同様に、ノズルを使用するシステムの場合、１つまたは複数の検出ステーションは、出現する噴流やストリームに沿って配置されてもよい。好ましくは、マルチパラメータデータは、フローシステムの１つまたは複数の検出ステーションを通過する同じ粒子から収集される複数の光信号、特に蛍光または散乱光信号から得られる。図１Ｊは、本発明の１つの態様による代表的なフローシステムを概略的に描いている。試料は、システムプロセッサまたは制御系（１６２）により制御される試料分離装置（１７６）に動作的に関連付けられた試料分離管（１７８）により、マルチウェルプレート（１８４）から得てもよい。試料は、試料ライン（１８０）を通じて試料インレットまたは管（１５２）に運ばれ、これは（この特定の実施形態において）試料を流体カラムの中に導入し、流体カラムには、試料内の粒子を共通の試料経路（１５４）に沿って移動するように流体力学的に制約するシース流（１５５）が含まれる。貯留容器（１７４）からのシース液は、取入管（１７０）によってフローセル（１５０）の中に入る。試料中の粒子は、生体細胞および／またはビーズであってもよく、１つまたは複数の検出ステーション（１５６）を通過し、ここで、信号が複数の検出器、例えば図においては検出器（１５８）によって検出されて、マルチパラメータデータ点を構成する信号値に変換され、これがシステムプロセッサ（１６２）または、システムプロセッサ（１６２）に動作的に接続された補助コンピュータまたは記憶装置の中に保存される。検出ステーション（１５６）を通過すると、試料は出口（１６４）を通ってフローセル（１５０）から出て、廃棄物容器（１６６）に入る。フローシステムはまた、フローセル（１５０）内の流体経路の方向を変更し、または洗浄剤をフローセル（１５０）に導入するため、またはその両方のために、流体パージング系を備えていてもよい。流体パージング系は、シース液と同じでもよく、また洗浄剤でもよい流体の貯蔵容器（１７２）に動作的に接続された管（１６８）を備えていてもよい。流体が管（１６８）から流れる方向はどの方向でもよく、システムプロセッサ（１６２）によって制御される。パージング系はまた、システムプロセッサ（１６２）により制御され、管（１５２）を通る流体の流れを逆転させ、パージ液貯蔵容器または廃棄物容器へと方向付けることができるバルブ（１８２）を有していてもよい。本発明の１つの態様において、前述のフローシステムは、自動的に複数の試料を処理するのに使用され、連続するデータプロファイルの特徴が所定の量以上に変化した場合にとられる是正措置としては、データ収集の中断、試料管のバージ、現在の試料ウェルからの試料移動の再開（あるいは、現在の試料ウェルをスキップして次の試料ウェルに移動）、データ収集の再開であってもよい。

図１Ｋは、ｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒ方式のソーティング機能を備えるフローサイトメータの流体工学系の構成要素を概略的に示す。シースタンクまたは貯蔵容器（５０）は加圧され（５２）、シース液がノズル（５４）へと駆動される。同様に、試料管（５６）内の試料液も加圧され（５８）、試料液が試料管（６０）を通じてノズル（５４）へと駆動される。シース液圧と試料液圧は試料管から試料が細く流れるように選択され、この細い流れにより試料液内の粒子はノズル（５４）と感知領域（６２）の中を直線的に移動するように制約される。パージング動作は、このようなシステムの中で、シース液と試料液の圧力差を調整し、試料液を逆流させ、シース液を試料管（５６）に入れ、これを通過させるようにすることによって実行される。ｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒ方式の装置に一般的な別のパージング系は、フローノズル内をノズル外に関して負圧にし、空気がノズル開口部から吸い込まれるようにする。この相対圧力の急激な逆転によって、ノズルオリフィスまたはその他の内面に累積しうる粒子を除去するのに一般的に使用される、連続する反対の空気流とシース流が発生する。

図１Ｌは、ｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒソーティングシステムの構成要素を概略的に示している。試料ストリーム（６９）の中の粒子は、ノズル（７０）のオリフィスを通って噴流（７２）を形成し、検出ステーション（７３）においてこの噴流をレーザ光線（７１）が通過して、粒子を照明し、複数の信号を発生させ、この信号が処理されてマルチパラメータデータ点が生成される。複数の信号値に基づいて、小滴（７４）が噴流（７２）から離れる前に、正または負に荷電されるか、中性のままとされる。小滴（７４）は帯電偏向板（７６）の間を通過し、それによって帯電小滴（７８）は各々の収集容器へと向かわせられる。１つの収集方式では、フローシステムは、関心対象の全粒子を、その信号に基づいて、検出ステーション（７３）を通過するときに特定し、関心対象の粒子が小滴として噴流（７２）を離れる瞬間に、噴流（７２）を荷電されるか、中性のままとなるようにし、同じ電荷を有する関心対象の粒子の全てが、同じ収集容器に収集される。時として、複数の粒子が近接し合った状態で検出ステーション（７３）を通過し、それらの信号がフローシステムによって区別されないことがある。このような同時通過事象は好ましくなく、一般に、こうした粒子を含む小滴（７７等）は拒絶される。この同時通過事象の発生率とその変化は、本発明に関連してモニタするのに有益な特徴である。同時通過事象の発生率は、試料液中の粒子の濃度に比例する。同時通過事象の発生率の変化は、粒子が試料液中に沈殿しているかもしれないこと、または粒子がその他試料液中で集塊または凝集していることを示す。同時通過率の変化は、フローシステムにより、１つの小滴内の２つの粒子の予想される信号値（ここでは、「同時通過信号値」という）を包含するように選択された所定のサブセットの中に入るデータ点の数の増大として登録されてもよい。

前述のように、本発明のフローシステムには、さまざまな流体力学系、フローセル、検出系およびパージ系を使用できる。本発明のフローシステムのこれらの要素は、当業界で馴染み深く、「特許文献１」、「特許文献２」、「特許文献３」、「特許文献４」、「特許文献５」に記載されており、これらの特許を引用によって本願に援用する。

是正措置はしばしば、フローシステムの流体工学系をパージするステップを含む。特定のフローシステム内のパージの詳細は、何通りもあってよいが、一般に、パージは、流体工学系の中の流体または試薬の方向を変化させ、セルデブリ等、システムの機能に影響を与える異物を排除する。１つの態様において、図１Ｊまたは１Ｋに概略を示すフローシステムの場合、パージは、キュベット（１５５）に流れるシース液の量を試料液の量に関して増大させ、試料管（１５２）の中の流の方向を逆転させ、シース流をインレット（１７０）から試料管（１５２）を通って、バルブ（１８２）の方向に流れるようにするステップを含む。各動作の長さと反復頻度は、設計上の選択の問題であり、個々の試料、例えば、集塊や凝集が発生しやすい試料等に合わせて調整できる。別の態様において、図１Ｊに示されるフローシステムの場合、空気またはガスをキュベット（１５５）のポートの中へと送り込み、流体ガスインタフェースと気泡の形成により、キュベット（１５５）内部のクリーニングを行うようにする機能を利用できる。通常の流れは、例えば、別の試薬、たとえばアルコールを利用して空気またはガスを除去した後に再開される。また別の態様では、パージは、特殊な洗浄剤を流体力学系の中に導入し、不要なデブリを排除するステップを含んでいてもよく、この方法は、例えばグロス他の「特許文献６」によって開示されており、同特許を引用によって本願に援用する。このような洗浄剤としては、強力な酸化性溶液、たとえばＮａＯＨとＮａＯＣｌの混合物またはＫＯＨとＫＯＣｌの混合物および、弱酸、例えば、０．０１Ｍ酢酸または０．１Ｍ Ｎ−トリクロロ酢酸等がある。本明細書において、パージステップは、上記の手順を単独または組み合わせて含んでいてもよい。

ＩＩ．マルチパラメータデータ点集合の解析
本発明によれば、マルチパラメータデータ点のさまざまな特徴がモニタされ、是正措置をトリガすべきフローシステム動作の変化が検出される。このような特徴としては、所定の領域またはデータ空間の集合において収集されたデータ点の数、または複数のこのような所定の領域間の収集データ点数の比率等であってもよい。１つの実施形態において、このような所定の領域は、関連するデータ空間をカバーするグリッドセル（または、このようなセルのサブセット）である。別の態様において、上記の特徴は、データ点のクラスタに関連付けられるパラメータ、例えば、重力中心、ガウス近似のパラメータ等であってもよい。本発明による解析のためのマルチパラメータデータ点の異なる特徴を選択し、適用する際の指針として使用できる多くの参考文献があり、例えば、「非特許文献２１」、「非特許文献２２」等がある。他の実施形態においては、濃度等の明確な特徴を有する特定の粒子をセル試料に加えてもよい。このような粒子は、データ空間の中で正確に定義することができ、その特徴の変化は、流体工学的変化の非常に高感度の検出手段として使用できるため、本発明による是正措置のトリガに使用してもよい。

Ａ．粒子サブセットを定義するゲート
本発明のフローシステムの重要な要素は、解析および／または分取中の粒子のサブセットを定義するためのゲートの定義と使用である。粒子がフローシステムの検出ステーションを通過する際、複数の信号、例えば、前方光散乱、側方光散乱、各種蛍光標識からの発光等が発生される。これらの信号はそれぞれ、数値に変換された、その粒子に関するマルチパラメータデータ点を形成する。マルチパラメータデータ点には、その粒子が検出ステーション内の別の基準点に入り、またはこれを通過した時間が含まれていてもよい。ゲートは、多次元空間内の、マルチパラメータデータ点を含む領域である。一般に、関心対象の粒子のサブセット、例えば、血液試料中のＣＤ４＋リンパ球に対応するゲートは、使用者により、そのフローシステムに動作的に関連付けられるソフトウェアを利用して決定される。ゲートにより、使用者は従来どおりの方法で、粒子のサブセットを計数、分離またはその他の操作のために選択することができる。一般に、フローシステム内の信号処理には、複数の種類のゲーティングが含まれる。いわゆる「閾値」ゲートは一般に、１つの光学的パラメータ、たとえば前方散乱光等についてのみ行われ、多次元データ空間内の開放領域を画定する。これは通常、関心対象の粒子が発生する信号を処理するように設計された検出系の電子機器の処理機能を上回る、試料内のデブリ等の項目によって発生する高頻度の低レベル信号を除去するために使用される。「ウィンドウ」ゲートは通常、例えば、信号値の上下の境界を定めることにより、多次元データ空間における閉鎖領域を画定するもので、一般には、カウント、分取、排除等が行われる粒子またはセルの種類に対応する。ウィンドウゲート（本明細書では単に「ゲート」ともいう）は、リアルタイムで実行されてもよく、この場合、フローシステムはゲート内のマルチパラメータデータ点に対応する信号を有する粒子に作用し、あるいはオフラインで実行されてもよく、この場合、マルチパラメータデータ点がデータ記録装置内に記録された後、例えば、対応する粒子がフローシステムから出た時点よりずっと後であってもよい。閾値およびウィンドウゲートの使用は、粒子またはセルソータの用途においては不可欠である。１つの態様において、このようなソータの目的は、特定の粒子またはセルの種類を分離することである。閾値およびウィンドウゲートは、分取（sorted）されるべき粒子またはセルと、分取されないものを特定するために必要である。この場合のゲートはリアルタイムゲートでなければならず、これは、分取の決定（sorting decision）が、粒子またはセルが検出地点と分取決定地点、例えばｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒソータの小滴分離地点等の間で移動する間に行われなければならないからである。各粒子またはセルは完全に処理されてから、次の粒子またはセルが処理できるようにする必要があるため、処理に利用できる時間は実際には移動時間より短い。第二または第三の粒子またはセルが、例えば試料中のセルの濃度が高すぎるため、またはセルまたは粒子の集塊によって早く到着しすぎると、これは通常、不明なものとして標識され、好ましくない同時通過事象とみなされる。

本発明で特に興味深い点は、ゲートが他のゲートに関して定義されることであり、本明細書では「テザー付ゲート」と呼ばれ、これについては「非特許文献２３」に記載されている。すなわち、第一のゲート（「アンカ」ゲートと呼ぶ）は、使用者により、例えば二次元プロット上のデータ点のクラスタを包囲する多角形を手作業で定義すること等、さまざま方法で定義できる。第二のゲートもまた、例えば第一の多角形により包囲されるものとは別のデータ点の母集団を包囲し、第一の多角形により包囲される粒子と比較して希少な粒子の母集団に対応する第二の多角形が定義されてもよい。例えば、希少な粒子は、その表面に固有のレセプタ、例えば幹細胞のＣＤ３４レセプタを有する希少な細胞であってもよく、対応するマルチパラメータデータ点には、その数値が常にゼロ以外である成分が含まれるかもしれず、アンカゲートの粒子は、同じ成分について全てゼロの数値を有するかもしれない。テザー付ゲートは、データ空間の中でアンカゲートの位置に関する位置を有し、アンカゲートが移動するとテザー付ゲートも移動して、アンカゲートに対するその相対的位置を維持する。本発明の１つの態様において、テザー付ゲートで定義された希少細胞母集団（「第二の細胞亜集団」）は、長期間にわたる分取作業を通じた分取によって分離されるかもしれず、フローシステムの異常な挙動は、アンカゲート内のマルチパラメータデータ点の変化によって検出されるかもしれない（アンカゲート内のデータ点は、「第一の細胞亜集団」に対応する）。より高頻度のマルチパラメータデータ点がアンカゲート内で発生するため、母集団の中の統計的に有意義な変化をより早期に検出する可能性が高くなり、したがって、テザー付ゲートの希少細胞の分取による損失または汚染を早期に警告することができる。好ましくは、「希少細胞」または「希少細胞亜集団」という用語は、試料中、細胞の全母集団に占める割合が２０パーセント未満のみの細胞亜集団を意味し、より好ましくは、これらは細胞の全母集団の１０パーセント未満であり、さらに好ましくは、これらは全母集団の５パーセント未満であり、さらにもっと好ましくは、これらは全母集団の２パーセント未満である。

Ｂ．クラスタを特定し、ゲートを確立、調整するための方式
ごく一般的に、関心対象の粒子は多次元データ空間のマルチパラメータデータ点の認識可能なクラスタまたはグループに対応するため、マルチパラメータデータ中のクラスタを特定し、クラスタ間の違いを特定し、あるクラスタに対応するゲートを確立するためのさまざまな技術が開発されてきた。このような技術の代表例は、ビエール（Ｂｉｅｒｒｅ）他の「特許文献７」、ロック（Ｌｏｃｋ）の「特許文献８」、ビエール他の「特許文献９」、ローデラ（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ）他の「特許文献１０」、「非特許文献２３」、「非特許文献２４」、「非特許文献２５」、「非特許文献２６」、「非特許文献２７」、「非特許文献２８」、「非特許文献２９」、「非特許文献２１」、「非特許文献３０」、「非特許文献３２」その他に記載されている。前述のように、データプロファイルは、試料中の粒子の１つまたは複数の亜集合に対応するデータクラスタに関連付けられ、またはこれに基づくゲート（本明細書では「クラスタゲート」という）を有していてもよい。このようなゲートは、ほとんどの市販のフローサイトメータにおいて利用可能な機器用ソフトウェア、例えば、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（先に引用）を用いて容易に確立できる。一般に、このようなソフトウェアでは、楕円等の標準的なゲート形状および容量を選択でき、ゲートのサイズ決定または位置付けには多くの選択肢があり、例えばそれが選択されたクラスタの全データ点のあるパーセンテージを包囲するか否か、クラスタデータ点の「重力中心」に関して位置付けられるか否か等を選択できる。好ましくは、クラスタゲートはデータ点の重力中心に配置される。１つの実施形態において、クラスタゲートの形状は楕円形または多角形である。あるソフトウェア、たとえばＤｉｖａの“ｓｎａｐ−ｔｏ”ゲート機能はさらに、データ点の過去の収集集合をオフラインで解析する機能を有し、この場合、異なる集合の中のクラスタを同定し、もともと特定されたクラスタゲートを再配置して、比較することができる。このようなソフトウェアを本発明に関連して使用することができ、その場合、オフラインで使用する代わりに、再配置機能をリアルタイムで利用し、関心対象のクラスタがフローシステムの動作中に、システムの異常な動作、たとえば流体工学系の詰まり等によって「移動」するような状況において、分取と計数の決定を下す。

ＩＩＩ．是正措置
前述のように、本発明により検出された収集データのパターン変化は、是正措置の実行をトリガし、不良データの蓄積と希少細胞の喪失または汚染、すなわち流体工学系または照明系の動作が異常のときに収集されるマルチパラメータデータ点を回避することができる。データ収集における異常を引き起こす状況のほとんどは、以下の大まかな分類の１つまたはいくつかに含まれる。（ａ）試料容器の底への沈殿等による、試料中の細胞の集塊または凝集、（ｂ）試料中の細胞の劣化、例えば、浸透圧衝撃による崩壊等、（ｃ）物理的動作パラメータ、例えば温度、振動の程度の予想外の変化、（ｄ）標識の化学的劣化、たとえば結合部分の劣化または染料の脱色、（ｅ）流体工学系の閉塞。フローシステムの中には、連続して収集されたマルチパラメータデータ点のパターン解析結果に基づき、自動是正措置をとるためのさまざまなシナリオをプログラムすることができる。下表にシナリオの例を示すが、当業者であれば、この例が全てではなく、特に専門的用途、例えば精子等の特別な形状を有する細胞または粒子の分取および／または解析、細胞集合の分取および／または解析等については、別のシナリオも考えられることが分かるであろう。

本発明の１つの態様において、本発明の方法によって、上記およびその他の是正措置を特に希少細胞亜集合について行ってもよく、この方法は次のステップを含む。（ａ）その中で試料の粒子が共通の試料経路に沿って移動するような、移動流体カラムを設置するステップ、（ｂ）共通の試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から複数の信号を収集するステップであって、複数の信号の各々に１つの信号値が与えられ、各粒子に関するマルチパラメータデータ点を形成し、検出系が連続する時間間隔中に複数の所定のサブセット中のマルチパラメータデータ点を計数し、その時間間隔の各々のデータプロファイル特徴を有するデータプロファイルを形成するステップ、（ｃ）ある時間間隔のデータプロファイル特徴が所定の限度を超えたときに必ず、前述のような１つまたは複数の是正措置を実行させるステップ。特に興味深い点として、上記の方法の実施形態では、複数の所定のサブセットはクラスタゲートを有し、クラスタゲートの位置は、試料中の関心対象の細胞亜集合に対応する前記マルチパラメータデータ点のクラスタを包囲する。１つの態様において、選択されるデータプロファイル特徴は、クラスタゲートで計数されるマルチパラメータデータ点の数であってもよく、是正策としては、関心対象のクラスタの位置を継続的に追跡するために、クラスタゲートを新しい位置に移動させる反復的ステップであってもよい。より詳しくは、現行データプロファイル特徴（すなわち、現行時間間隔内で計数されたマルチパラメータデータ点の数）が新しい時間間隔内の対応する数より、所定のパーセンテージだけ少ない場合、フローシステムの制御系はクラスタゲートの新しい位置を計算し、新しい位置でクラスタゲートが再びそのクラスタを包囲するようにする。このような方法は、オペレータがついている状態で、選択されたクラスタの細胞が継続的に分取されるような長期間にわたる分取作業にとって、特に有益であり、機器は交換されるが、クラスタはデータ空間内で移動または移行する。このようなゲート調整を行うための所定のパーセンテージ変化量としては、例えば１０パーセント、５パーセントまたは２パーセントである。前述のように、この方法は、クラスタゲートを関心対象の希少細胞亜集団を包囲するテザー付ゲートを伴うアンカゲートとして使用することにより、無人による希少細胞亜集団の分取に利用してもよい。

ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータにより生成されたマルチパラメータデータ点をモニタするためのシステム
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓａｍｐｌｅ（ＨＴＳ）ローダ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を装備したものを使って、４８の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の試料の解析を実行した。この試料は、引用によって本願に援用する「非特許文献３２」に記載されているように、ペプチド抗原混液、スーパー抗原、多クローン性マイトゲンを含むさまざまな試薬で刺激し、その後、２つの４色混液で染色して、反応するＴ細胞の周波数と免疫表現性パターンを探索した。試料は、定常的な手作業での監視を行わずに取得され、データ収集には各種の流体工学的および／または標本関連の不良が発生した。ソフトウェアは、事象率（すなわち、マルチパラメータデータ点収集率）の変化または測定信号値の空間（すなわち、データ空間）のすべてをカバーするグリッドセル内で収集されたマルチパラメータデータ点の分布の変化のいずれかを比較することによって、マルチパラメータデータ点の収集をモニタするように作製された。このソフトウェアでは、マルチパラメータデータ点、収集またはサンプリング時間および、モニタ開始時間等、その他の所定のパラメータセットを規定するためのユーザインタフェースが設けられた。ユーザインタフェースの２つのスクリーンショットを図２Ａ，２Ｂに示す。図２Ａにおいて、ユーザインタフェースを含むスクリーン（２００）には、データの２つのグラフィカルディスプレイ（２０２），（２０４）と、使用者が特定の実施形態による是正措置をトリガするためのパラメータ範囲を規定する数値を入力するためのパネルまたはダイアログボックス（２２０）と、データファイルを列挙するパネル（２１６）と、データ収集の状態と履歴を列挙するパネル（２１８）が含まれる。例えば、収集データ点のパターンが変化した時間を表示する、是正措置の時間と種類を表示する、マルチパラメータデータ点を表示する、異常な流体工学的状況で収集されたものとしてフラグを立てる、等である。データディスプレイ（２０２）は、時間に対するマルチパラメータデータ点の１つのパラメータのプロットであり、これによって粒子検出事象率が視覚的に把握できる。（この場合、１つのパラメータは、フィコエリトリンで標識された抗ＣＤ６９抗体、すなわち“ＣＤ６９ＰＥ”で標識された細胞の蛍光強度である。）（２０６）で示されるように、事象率が突然低下した場合、これは試料ラインまたは管が閉塞していることを示しているかもしれず、是正措置が必要となる。データディスプレイ（２０４）は、グリッドセル（２１０）の中で分散するマルチパラメータデータ点の３つの主要クラスタ（２０８），（２１２），（２１４）を示す二次元プロットである。グリッド（２１０）のセルにおけるデータ点の相対数の変化（すなわち、システムのデータプロファイル）からは、事象率の変化の他に、流体工学系の状態とフローシステムの光学的アラインメントの別の測定値も得られる。ユーザインタフェース（２００）により、使用者はさらに、変化を検出するためにデータパターンを比較するための収集時間間隔の長さを規定する数値をボックス（２２２）に入力することができる。ボックス（２２４），（２２６）には、モニタ開始時間と、時間間隔内の平均事象率を計算するための数値がそれぞれ入力される。

図２Ｂは、図２Ａとほとんど同じスクリーン（２２７）であるが、パネルまたはダイアログボックス（２２８）が、是正措置をトリガすべきグリッドセル（２１０）内のデータ点の分布の変化を規定する数値を使用者が入力するためのディスプレイボックスとして選択されている点が異なる。図２Ｂにおいて、データディスプレイ（２０４）は、データディスプレイ（２０２）に示された、時間間隔（２３０）での収集データを示す。明らかに、このデータディスプレイでは、３つのクラスタ（２３２），（２３４），(２３６)の全てにおいてマルチパラメータデータ点の密度が図２Ａの同じディスプレイに示されたものよりはるかに低い。このような変化は、３つのクラスタ全部について均一であるかもしれないか、あるいは主としてクラスタの１つのサブセットのみに影響を与えるかもしれない。いずれにしても、これらの変化を是正措置のトリガに使用してもよい。

図２Ａ，２Ｂのユーザインタフェースの例と機器のシステムを制御するための関連ソフトウェアは、当業者にとって周知の従来の言語と技術を用いてプログラムされる。

本発明の実施形態を用いた上記の例では、以下の設定（表I）を使用した。

このルールは、約２０００のフローデータファイルに適用し、この中の１８５０はｗｗｗ．ＦＩＣＣＳ．ｏｒｇで入手可能な大型Ｃａｌｉｂｕｒ／ＨＴＳデータセットから取得し、８０のルーティンファイルは、カルーセルロード方式を用いたＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩによる溶解全血アッセイの通常の機器検証中に取得した。メールの効率は、全てのファイル視覚検査し、これらを「良好データファイル」と「不良データファイル」に分類して判断し、その後、その中のどれがエラーフラッグを生成したかをソフトウェアによって注記した。ファイルの多くが不均一な流速を示したが(例えば、図２Ａで表示されたデータを参照すると、ｔ＝〜６５０（２０６）で事象率が大きく減少している）、これは、事象率変化に伴う散乱または蛍光点のプロットでは認識可能な問題を提示しなかった。このようなファイルは、上記のルールがほとんど常にその変化を検出したために「フラグ付」として分類され、これらの用途においては事象率そのものが重要な測定値ではないために、「良好データ」（以下のコラム３）として分類される。

発明者らによるルールとメトリクスの最も効率的な要素をよりよく特徴付けるために、手作業で検査されたフラグ付きファイルを通じて検出されたエラーの種類の分布を調べた。ファイルは、散乱および／または蛍光データが低下している明らかに欠陥のあるファイル、事象率は欠陥があるが、蛍光データは損なわれていないフラグ付ファイル、明確なデータの欠陥がないフラグ付ファイルに分類された。ファイルの各クラスのパーセンテージを示し、これによって関連するデータが示される（複数のエラーが発生しているファイルがあることが分かる）。第一のファイルクラスは、「真のエラー検出」と示され、中間と第三のクラスは「偽エラー検出」とした。

定義
一般に、本明細書にて使用する用語で、特に別に定義されていないものは、本発明に関する分野、例えば、分析化学、生体科学、分子生物学、細胞生物学、顕微鏡測定、画像解析等における従来の用法に対応する意味を有し、例えば、「非特許文献９」、「非特許文献３３」、「非特許文献３４」、「非特許文献１７」、「非特許文献１８」、「非特許文献１２」、「非特許文献１３」等に記載の協定に示されているとおりである。

「フローシステム」とは、（ｉ）粒子に関するマルチパラメータデータを収集する１つまたは複数の検出ステーションによって、またはこれを通過して、流体ストリーム内の共線的経路（collinear path）で移動するように粒子を制約することができ、また（ｉｉ）収集されたマルチパラメータデータに基づいてこの粒子を計数または分取できる、機器または装置を意味する。フローシステムは、さまざまな形態で、さまざまな方式によってこのような機能を実行するものであり、引用によって本願に援用される「非特許文献１８」、「非特許文献３５」、「非特許文献３６」、「非特許文献３７」、「特許文献１１」、「特許文献１２」等に記載されている。フローシステムは流体工学系を備えていてもよく、これは成分を有し、試料液のストリームがシース液のストリームの中に挿入され、試料液中の粒子が共線的経路で移動するように制約され、これがキュベット、検出ステーションとして機能するその他のチャンバまたはノズルその他の機能部の中で行われ、ｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒ噴流を作り、その後電気的に操作される。フローシステムはまた、粒子が共通の経路に沿って移動するように制約するための小型チャネルを有するマイクロ流体工学装置を有する。フローシステムに関して、「パージ」とは、クリーニング、あるいは停止と再開、あるいは試料の流れを一時的に逆転またはその他妨害して、閉塞等による異常な流れのパターンを取り除くことを意味する。

「粒子」は、流体内に浮遊させることができ、好ましくは光学または電気的測定が可能な特徴、例えば大きさ、色、形状、蛍光等に基づいて、流体内で検出されることができる物体を意味する。粒子には、「高分子微粒子」、ビーズその他の非生物(non-living)粒子だけでなく、哺乳動物細胞、微生物、バクテリア、例えば核、染色体、小胞、ミトコンドリア等の細胞成分、高分子微粒子カプセル形成を含む生物細胞の集塊または胚様体その他の生物細胞のどちらも含まれる。

上記の教示は、本発明を説明するためのものであり、その詳細によって本発明の請求範囲を限定しない。本発明の好ましい実施形態について説明したが、当業者にとっては、本発明から逸脱することなく、そこに各種の変更や改変を加えられることは明らかであり、付属の特許請求範囲に、本発明の精神と範囲の中に入るすべての変更と改変を含めるものとする。

Claims (23)

1. １つまたは複数の試料からマルチパラメータデータを高い信頼性で取得し、粒子を分取、計数するためのフローシステムであって、
   移動流体カラムを備え、その中ではある試料の粒子が共通の試料経路に沿って移動する流体工学系と、
   前記共通の試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から１つまたは複数の信号を収集する検出系であって、各信号には１つの信号値が割り当てられて、各粒子のマルチパラメータデータ点を形成し、一連の異なる時間間隔において、予め決められた１つまたは複数のサブセットのそのようなマルチパラメータデータ点を収集して、そのような時間間隔の各々のデータプロファイルを形成する検出系と、
   前記流体工学系と前記検出系に動作的に関連付けられた制御系であって、現行データプロファイルのデータプロファイル特徴を判断し、前記データプロファイル特徴を、所定の過去データプロファイルの特徴または所定の限度と比較し、前記データプロファイル特徴が前記所定の限度を超過し、または前記所定の過去データプロファイルの前記データプロファイル特徴と異なる場合に、是正措置をとる制御系と、
   を備えることを特徴とするフローシステム。
2. 前記１つまたは複数の信号は、前記粒子からの複数の信号であり、前記粒子は生体細胞であることを特徴とする請求項１に記載のフローシステム。
3. 前記１つまたは複数の所定のサブセットは、前記試料中の第一の細胞亜集団の前記マルチパラメータデータ点を包囲するクラスタゲートを有し、前記クラスタゲートはある位置を有することを特徴とする請求項２に記載のフローシステム。
4. 前記１つまたは複数の所定のサブセットの前記データプロファイルは、前記時間間隔中に前記クラスタゲート内で計数された前記第一の細胞亜集団に対応する前記マルチパラメータデータ点の数を含むことを特徴とする請求項３に記載のフローシステム。
5. 前記是正措置は、前記データプロファイルの前記数が前記所定の限度を超えたときは必ず、前記クラスタゲートの前記位置を再決定することを含むことを特徴とする請求項４に記載のフローシステム。
6. 前記クラスタゲートは、希少細胞集団を含むテザー付ゲートを有し、前記クラスタゲートの前記位置が再決定されたときは必ず、前記テザー付ゲートの位置も再決定されることを特徴とする請求項５に記載のフローシステム。
7. 前記テザー付ゲートの前記希少細胞は分取されていることを特徴とする請求項６に記載のフローシステム。
8. 前記１つまたは複数の所定のサブセットは、前記マルチパラメータデータ点の全部を包囲するデータスペースをカバーするグリッドの複数のグリッドセルを含み、前記データプロファイルは、各数が前記時間間隔中に前記複数の前記グリッドセルのうちの１つにおいて計数されたマルチパラメータデータ点に対応する順序数セットであることを特徴とする請求項２に記載のフローシステム。
9. 前記データプロファイル特徴は、前記順序数セットの前記数の合計であることを特徴とする請求項８に記載のフローシステム。
10. 前記流体工学系は、前記生体細胞を含む前記試料を試料ストリームとして前記移動流体カラムの中に挿入する試料管を有することを特徴とする請求項２に記載のフローシステム。
11. 前記制御系の前記是正措置は、以下を１または複数サイクル実行することを含むことを特徴とする請求項１０に記載のフローシステム。
    （ａ）前記検出システムによる前記信号の収集を中断する。
    （ｂ）前記流体工学系により前記試料管をパージする。
    （ｃ）前記検出系による前記信号の収集を再開する。
12. 前記試料管は、前記試料をシース流の中に挿入することにより、前記試料中の粒子が制約されて前記試料ストリーム内で共線的に移動するように、前記流体カラムが形成されることを特徴とする請求項１０に記載のフローシステム。
13. 前記マルチパラメータデータ点は、前記試料ストリームの自由蛍光の数値を含み、前記マルチパラメータデータ点の前記自由蛍光成分が前記所定の限度以下であるときは必ず、前記制御系は前記是正措置を実行することを特徴とする請求項１２に記載のフローシステム。
14. 複数の試料からなるセットから前記試料を選択するための試料選択系をさらに備え、前記複数の試料の各々は、別の容器内にあることを特徴とする請求項１０に記載のフローシステム。
15. 前記制御系の前記是正措置は、（ａ）前記試料を廃棄し、前記試料セットの異なる容器から別の試料を選択すること、または（ｂ）現行試料に対応する前記マルチパラメータデータ点を削除して、前記現行試料容器から別の試料を取得し、この試料を解析すること、を含むことを特徴とする請求項１４に記載のフローシステム。
16. 前記制御系の前記是正措置は、前記特徴データプロファイルが前記所定の限度を超えている期間中に、前記マルチパラメータデータ点にアノテーションを付与することを含むことを特徴とする請求項２に記載のフローシステム。
17. 高い信頼性でマルチパラメータデータを取得し、粒子の分取と計数を行うフローシステムであって、
    試料を試料ストリームとしての移動流体カラム内に挿入するための試料管を備え、前記移動流体カラムの中では、試料の粒子が共通の試料経路に沿って移動し、前記試料ストリームが自由蛍光を含むような流体工学系と、
    前記共通試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から１つまたは複数の信号を収集する検出系であって、各信号には１つの信号値が与えられ、各粒子のマルチパラメータデータ点を形成し、各マルチパラメータデータ点は、各粒子に隣接する前記試料ストリーム内の自由蛍光に関する信号値を有し、連続する異なる時間間隔中に、１つまたは複数の所定のサブセットの中のこのようなマルチパラメータデータ点を収集して、前記時間間隔の各々のデータプロファイルを形成する検出系と、
    前記流体工学系と前記検出系に動作的に関連付けられた制御系であって、前記現行データプロファイルのデータプロファイル特徴を、所定の過去データプロファイルの特徴か、所定の限度と比較し、前記データプロファイル特徴が前記所定の限度を超えたか、前記所定の過去データプロファイルの前記データプロファイル特徴と異なる場合は常に、前記制御系が是正措置を実行する制御系と、
    を備えることを特徴とするフローシステム。
18. 前記マルチパラメータデータ点の前記自由蛍光成分が、前記所定の限度以下であることは必ず、前記制御系が、前記是正措置を実行することを特徴とする請求項１７に記載のフローシステム。
19. フローシステム内で高い信頼性でデータを取得し、分取する方法であって、
    その中で試料が共通の試料経路に沿って移動する移動流体カラムを設置するステップと、
    前記共通の試料経路に沿って１つまたは複数の検出ステーションを通過する各粒子から複数の信号を収集するステップであって、前記複数の信号の各々には信号値が与えられ、各粒子のマルチパラメータデータ点が形成され、前記検出系が連続する時間間隔中に複数の所定のサブセットの中のこのようなマルチパラメータデータ点を計数して、前記時間間隔の各々に関するデータプロファイル特徴を有するデータプロファイルを形成するステップと、
    ある時間間隔の前記データプロファイル特徴が所定の限度を超えたときに必ず、１つまたは複数の是正措置を実行するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
20. 前記粒子は生体細胞であり、前記複数の所定のサブセットは、（ａ）前記パラメータデータ点の全部を包囲するデータ空間またはその部分空間をカバーするグリッドの複数のグリッドセル、または（ｂ）前記データ空間またはその部分空間内の少なくとも１つのクラスタゲートのいずれかであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 前記生体細胞は、前記移動流体カラムの中に試料管によって導入され、１つまたは複数の是正措置を実行する前記ステップは、以下のステップを１または複数サイクル実行することを含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
    前記信号の収集を中断する。
    前記試料管をパージする。
    前記信号の収集を再開する。
22. 前記複数の所定のサブセットは、前記クラスタゲートを含み、前記クラスタゲートは、前記マルチパラメータデータ点のクラスタを包囲する位置を有し、前記データプロファイル特徴は、前記クラスタゲート内で計数されたマルチパラメータデータ点の数であり、前記１つまたは複数の是正措置を実行するステップは、前記現行時間間隔中に計数された前記マルチパラメータデータ点の数が前の時間間隔のその数より、所定のパーセンテージだけ少ないときには必ず、前記クラスタゲートの前記位置を新しい位置に移動して、前記新しい位置において、前記クラスタゲートが再び前記クラスタを包囲するようにするステップを含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
23. （ａ）前記複数の所定のサブセットは、前記クラスタゲートを含み、前記クラスタゲートは、前記マルチパラメータデータ点の数のクラスタを包囲する位置とテザー付ゲートを有し、前記テザー付ゲートは、希少細胞亜集団を包囲し、（ｂ）前記データプロファイル特徴は、前記クラスタゲート内で計数されたマルチパラメータデータ点の数であり、（ｃ）前記１つまたは複数の是正措置を実行する前記ステップは、前記現行時間間隔中に計数された前記マルチパラメータデータ点の数が前の時間間隔のその数より、所定のパーセンテージだけ少ないときには必ず、前記クラスタゲートの前記位置を新しい位置に移動して、前記新しい位置において、前記クラスタゲートが再び前記クラスタを包囲し、前記テザー付ゲートが再び前記希少細胞集団を包囲するようにするステップを含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。

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