CN110312926B - 分析多个液滴并从中选择特定液滴的方法和相关装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对多个液滴(4)进行分析并从中选择特定液滴的方法，包括以下步骤：——提供多个液滴(4)，——对于多个液滴中的液滴(4)，测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的液滴中的光强度空间分布，——从光信号计算多个参数，——根据计算参数来确定液滴的分选类别，——根据分选类别对液滴进行分选，其中，多个参数包括每个光信号的最大值的坐标和共定位参数，并且用于确定步骤的至少两个计算参数包括共定位参数。

Description

分析多个液滴并从中选择特定液滴的方法和相关装置
技术领域
本发明涉及一种对多个液滴进行分析并从中选择特定液滴的方法。
特别地，该过程旨在筛选和选择包含特定目标元素的液滴。例如，特定目标元素可以是生物反应或化学反应的产物。
背景技术
该方法用于选择微流体液滴。“微流体”通常是指液滴或流体在其中循环的通路尺寸小于1毫米，并且，例如，在1μm至1mm之间。
每个液滴可以视为发生化学反应或生物反应的微容器。这些液滴可以用于特定合成、产品筛选或诊断。
在许多测定中，需要在分析之前对液滴进行分选以提高测定效率。在其它测定中，需要在许多化学、物理或生物反应之后对液滴进行分选以收集特定液滴成分。
例如，为了并行测试化学或生物微反应器中大量变体的活性或性质，已知将微反应器分布在乳液液滴中，然后在每个微反应器中进行化学或生物反应。然后，必须根据液滴所包含的产物分离液滴，尤其是评估和隔离会导致显著反应的反应条件和微反应器。
为了隔离已经发生显著反应的液滴，已知在发生显著反应时放置选择性的活性荧光标记。
然后，手动或使用自动分选机对液滴进行分选，以分离例如通过微流体或流式细胞术反应的那些液滴。例如，荧光活化细胞分选仪(FACS)测量液滴内的荧光信号。这种技术相对复杂且昂贵。
然而，在特定测定中，基于更复杂的标准区分液滴也是重要的。例如，重要的是将含有生物实体聚集体的液滴与含有等量未聚集单实体的液滴区分开。实际上，在某些测试中，聚集体可能造成假阳性选择或假阴性排除的风险。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种比现有系统保真度更高的特定液滴的分析和选择方法。
为此目的，本发明的主题是一种对多个液滴进行分析并从中选择特定液滴的方法，包括以下步骤：
——提供多个液滴，
——对于多个液滴中的一个液滴，测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的液滴中的光强度空间分布，
——从所述至少两个光信号计算多个参数，
——根据至少两个计算参数来确定液滴的分选类别，
——根据液滴的分选类别对液滴进行分选，
其中，多个参数包括每个光信号的最大值坐标和共定位参数，并且用于确定步骤的所述至少两个计算参数包括共定位参数。
根据本发明的分析多个液滴并从中选择特定液滴的方法可以包括一个或多个下述特征，单独地或根据任何技术可能的组合：
——通过将对应于所述至少两个光信号中第一光信号的最大强度(作为最大峰值强度或者光信号的最大值与光信号的积分值之间的积分信号或比率)的位置与对应于所述至少两个光信号中第二光信号的最大强度的位置进行比较来计算共定位参数；考虑到至少两个不同荧光信道的最大信号强度之间的时间间隔，可以通过液滴的尺寸使共定位参数合理化。因此，该值界定在0到1之间(或0％到100％之间)，其中，值为1(或100％)是两个最大强度信号的完美共定位。
——多个参数包括至少一个下述参数：
——液滴宽度，
——光信号的积分，
——光信号的最大值与光信号的积分值之比，
——光信号的局部最大值的坐标，
——液滴中光信号的局部最大值的数量，
——光信号的导数的计算，以及
——光信号的二阶导数的计算；
——至少两个光信号中的第一光信号包括多个局部最大值，多个参数包括在包括局部最大值的第一光信号与第二光信号之间计算的多峰共定位参数，多峰共定位参数通过以下步骤计算：
——对于第一光信号的每个局部最大值，通过将第二信号的局部最大值的位置与第一光信号的局部最大值的位置进行比较来计算中间共定位参数，
——比较中间共定位参数，多峰共定位参数是最小中间共定位参数；
——液滴中的共定位参数通过液滴宽度归一化；
——对多个液滴中的至少两个液滴执行测量步骤，并且多个参数包括两个液滴之间的间隔；
——在确定步骤中，将至少一个计算参数与预定阈值进行比较；
——在测量步骤中，测量至少三个光信号，并且其中，通过两两比较光信号的最大值的位置来计算多个共定位参数；
——如前所述的方法包括以下步骤：
——提供一种装置，该装置包括适用于液滴流的通道，并且包括检测区和分选区，
——在通道中循环多个液滴，
——对在检测区中流动的液滴进行测量；
——在测量步骤期间执行捕获液滴图像的步骤；
——多个液滴中的至少一个液滴包含第一元素，第一元素在与至少两个光信号中的第一光信号相关的波长信道中是荧光的，并且其中，多个液滴中的至少一个液滴包含第二元素，第二元素在与所述至少两个光信号中的第二光信号相关的第二波长信道中是荧光的；
——第一和第二元素选自由细胞、荧光标记蛋白质、细胞标记试剂、荧光标记抗原、荧光标记抗体、生物实体涂覆颗粒、核酸、肽和化学药物组成的组。
本发明还涉及一种对多个液滴进行分析并从中选择特定液滴的装置，包括：
——检测组件，适于对液滴测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的液滴中的光强度空间分布，
——计算器，用于从所述至少两个光信号计算多个参数，
——选择单元，用于根据至少两个计算参数确定液滴的分选类别，
——分选单元，用于根据液滴的分选类别对液滴进行分选，其中，多个参数包括每个光信号的最大值的坐标和共定位参数，并且所述至少两个计算参数包括共定位参数。
根据本发明的装置可包括以下特征：
——检测组件包括光源和至少一个可见光敏检测器。
附图说明
通过阅读仅作为示例给出的以下描述并结合以下附图，可以更好地理解本发明，在附图中：
——图1是根据本发明的装置的示意图；
——图2是概述根据本发明的方法的步骤的示意图，
——图3是用于连续液滴的光信号的测量曲线实例；
——图4是用于连续液滴的两个光信号的测量曲线实例；
——图5是用于液滴的两个光信号的测量曲线实例，其中示出了共定位参数计算，
——图6是用于液滴的两个光信号的测量曲线实例，其中示出了多峰共定位参数计算，
——图7是生物测定中使用的样本液滴的示意图，
——图8是基于两个参数和选择门的液滴的点图实例，
——图9是基于高于90％置信区间的选定共定位参数组的液滴的点图实例，用于选择可溶性荧光标记抗原和荧光标记抗体的共定位事件，
——图10是基于低于90％置信区间的选定共定位参数组的液滴的点图实例，用于排除共定位事件，
——图11是基于高于90％置信区间的选定共定位参数组的液滴的点图和液滴信号的实例，用于选择可溶性荧光标记报告细胞和荧光标记抗体的共定位事件，
——图12是基于低于90％置信区间的选定共定位参数组的液滴信号的点图和液滴信号的实例，用于排除可溶性荧光标记抗体产生细胞和荧光标记抗体的共定位事件，
——图13是基于高于90％置信区间的抗体/报告细胞共定位参数组，并通过将参数设置为低于90％置信排除抗体产生细胞/报告细胞共定位的液滴的点图和液滴信号的实例。
具体实施方式
图1示出根据本发明的用于分析多个液滴4并从中选择特定液滴的装置1。
装置1包括液滴供应6、控制器8、液滴支撑件10、检测组件12、计算器14、选择单元16和分选单元18。
有利地，该装置还包括具有人机界面的监视器20。
液滴供应6旨在提供分散在载液22中的多个液滴4。
在图1的实施例中，多个液滴4是连续液滴4。
液滴4包含与载液22不混溶的内部流体24。“不混溶”通常是指少于0.01％的内部流体24能够在25℃和环境压力下溶解在载液22中。例如，内部流体24是水溶液，外部流体22是载体油。
例如，内部流体24包含至少一个生物实体和介质，这些生物实体和介质在形成每个液滴4之前装载在内部流体22中。例如，生物实体是细胞。
多个液滴4中液滴4的成分可以不同。
有利地，多个液滴4中的至少一个液滴4包含第一元素26，其在第一波长信道中是荧光的。多个液滴4中的至少一个液滴4包含第二元素28，其在第二波长信道中是荧光的。每个荧光元素26、28的特征在于激发光谱和发射光谱。
激发最大值的波长信道通常相隔至少70nm。
有利地，第一和第二元素26、28选自由细胞、荧光标记蛋白质、细胞标记试剂、荧光标记抗原、荧光标记抗体、生物实体涂覆颗粒、核酸、肽和化学药物组成的组。
颗粒可以是固体颗粒或软颗粒。例如，颗粒是磁性颗粒、胶体颗粒、水凝胶珠、囊泡、脂质体、液滴等。
第二元素，例如，适于与第一元素结合。例如，第一元素是荧光标记抗原，第二元素是荧光标记抗体。
参见图1，液滴支撑件10是晶片(chip)，上面形成有微流体图案。液滴支撑件10优选由一个单材料件制成，尤其是聚合材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环氧树脂，尤其是可光聚合环氧树脂，例如Norland OpticalAdhesives(NOA)销售的环氧树脂，或玻璃。
如图1所示，液滴支撑件10包括至少一个工作通道30。工作通道30在上游连接至分散在载液22中的多个液滴4的供应6。工作通道30在下游浸入分选单元18的至少分选区32中。
工作通道30适于测量连续液滴4中的光信号。
液滴支撑件10限定检测区34，其中，支撑件10在用于检测的波长信道中是透明的。在检测区34中，工作通道沿纵向轴线X延伸。
工作通道30在横向于纵向轴线X的方向Y和Z上的尺寸适应液滴4的尺寸，从而使连续的液滴4在检测区34中一个接一个地通过。
控制器8适于控制工作通道30内的多个液滴4的流速。例如，控制器8连接至液滴供应6，以控制液滴供应6注入液滴4和载液。此外，控制器8允许控制液滴4之间的间隔、检测时间和液滴4通过检测区34的频率。
检测组件12适于对于液滴测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的液滴4中的光强度空间分布。
例如，检测组件12包括至少一个光源36和至少一个可见光敏检测器38。例如，可见光敏检测器38是光电倍增管。
光源36适于照射检测区34。例如，光源36是激发每个可见波长的白光源。
例如，检测组件12包括用于每个光信号的光源36。有利地，光源36适于在特定波长信道中发射具有非零强度的光，该特定波长信道对应于可能存在于多个液滴中的至少一个液滴4内的荧光元素26、28的荧光激发光谱。例如，光源36是激光器。例如，该特定波长信道是允许第一元素26或第二元素28的荧光的激发信道。
例如，检测组件12包括用于每个光信号的可见光敏检测器38。每个可见光敏检测器38适于根据时间记录与在检测区34中发射的光信号的强度相对应的电压测量。
有利地，每个可见光敏检测器38对与可能存在于多个液滴4中的至少一个液滴4内的元素26、28的荧光发射光谱对应的特定波长信道敏感。例如，与第一光信号相关联的波长信道包括第一元素26的发射光谱，与第二光信号相关联的波长信道包括第二元素28的发射光谱。
例如，检测组件能够沿检测线D光学地测量光信号强度，检测线D沿垂直于工作通道30的纵向轴线X的方向Y延伸。
当液滴4逐渐通过检测区34时，对液滴4的尺寸进行光信号测量。
在已知载液22和液滴4的流速的情况下，在所述时间段内在检测线D上获得的光信号的测量与穿过检测线D的液滴4的空间扫描相对应。
多个可见光敏感检测器38布置为在同一检测线D上同时测量相应的光信号。
不同的测量将在后面的说明中参考图3、4、5和6进行描述。
检测组件12连接至计算器14。
计算器14适于根据所述至少两个光信号计算多个参数。例如，计算器14包括存储器和实时微处理器。
计算器14适于根据定义的标准实时检索、计算、解释信号。
定义的标准随后被加载至计算器单元14中，以减少数据传输和计算的时间。
计算器14适于增加数据分析和分选的吞吐量。
存储器包括多个软件模块，可以执行这些软件模块以由处理器进行参数的计算。
多个参数包括每个光信号的最大值的坐标和共定位参数，并且所述至少两个计算参数包括所述共定位参数。
不同的参数和参数计算方法将在后面的说明中进行描述。
计算器连接至检测组件12和选择单元16。
选择单元16适于根据至少两个计算参数来确定液滴4的分选类别。例如，选择单元16包括存储器和微处理器。
例如，选择单元16包括多个软件模块，可以执行这些软件模块以将计算参数与阈值进行比较。分选标准将在后面的说明中进行描述。
选择单元16连接至计算器14和分选单元18。
分选单元18适于在液滴4位于不同的分选区32中时，根据液滴4的分选类别对液滴4进行分选。例如，分选单元18包括用于每个分选类别的不同分选区32。每个分选区32连接至工作通道30。此外，分选单元18包括定向装置40，用于根据液滴4的分选类别定向每个分选区32中的液滴4。例如，定向装置40包括电极或流控制器。
监视器20适于在图表上显示测量并允许设置用于计算的参数或分选标准。
例如，监视器20适于根据两个不同参数显示液滴4的点图。点图如图8所示。
监视器20连接至控制器8、检测组件12、计算器14、选择单元16和/或分选单元18。
现在将参考图2描述使用装置1分析多个液滴4并从中选择特定液滴4的方法。
该方法包括提供步骤50、测量步骤52、计算步骤54、确定步骤56和分选步骤58。
在提供步骤50中，通过供应6在工作通道30的入口处提供多个液滴4。
液滴4循环进入工作通道30，控制器8控制载液22和液滴4的流速。
液滴4连续地到达检测组件12前方的检测区34内。
在测量步骤52中，检测区34内的液滴4由检测组件12照射，并且当液滴4通过检测区34时，至少两个光信号由检测组件12测量。
每个光信号表示用于相关波长信道的液滴中的光强度空间分布。
在计算步骤54中，由计算器14根据测量的光信号计算若干参数。
特别地，在计算步骤54中，计算器14根据至少两个光信号计算多个参数，其中，多个参数包括每个光信号的最大值的坐标和共定位参数。
有利地，如下所述，计算器14还计算其他参数。
对于单独的每个光信号，计算器14可以计算：
——液滴4的宽度，
——光信号的最大值的坐标，
——光信号的全局最大值的坐标，
——光信号的局部最大值的坐标，
——光信号的导数的计算，
——光信号的二阶导数的计算，
——液滴4中光信号的局部最大值的数量，
——光信号的积分，
——光信号的最大值与光信号的积分值之比。
此外，对于连续液滴中每个单独的光信号，计算器14可以计算两个连续液滴之间的距离。
下面将参考图3说明如何计算这些参数。参考图4和5说明如何计算共定位参数。然后参考图6说明如何计算多峰共定位参数。
图3示出从连续通过一个光学信道的检测线D的一系列连续液滴4获取的测量实例，该光学信道对应于第一波长信道。例如，该信号在第一可见光敏检测器38上测量。
时间用横坐标表示，强度用纵坐标表示。
在图3的实例中，曲线60对应于第一光信号。
例如，第一光信号以绿色波长测量。该波长与例如第一元素26相关，第一元素26是测试中使用的标记的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。例如，CHO细胞用钙黄绿素AM染色。已知钙黄绿素AM在被活细胞消化时变成绿色荧光。荧光高峰的存在表明液滴4中存在活的CHO细胞。
曲线60是包括多个连续钟形曲线62的连续信号。
每个钟形曲线62对应于可见光敏检测器38从通过检测区34的不同液滴4收集的发射。例如，每个液滴4中观察到残留信号，这是因为液滴4具有与载流相(carrier phase)22不同的折射率。替代地，液滴4的内部流体24包含添加残留信号的自发荧光介质。
在预定强度水平I1处测量的钟形曲线62的宽度w1表示相关液滴4的宽度。液滴的宽度可用于进一步计算以使距离归一化。
钟形曲线62之间的基线64表示由可见光敏检测器36收集的两个连续液滴之间的载流相22的发射。该发射的强度比在液滴4中测量的信号强度低。
两个连续钟形曲线62的中心之间的距离d对应于沿X轴的两个连续液滴4之间的间隔。
在图3中，仅一些液滴4具有不同于钟形曲线62的最大峰值68。在该实例中，这些液滴4对应于含有活CHO细胞的液滴4。
例如，为了确定最大值的坐标，计算器14通过插值函数来近似得出光信号。然后，用计算器计算函数的一阶导数。用计算器计算函数的二阶导数。二阶导数表示函数的曲率。局部最大值是一阶导数为零而二阶导数为负的点。
最大峰值68的坐标由计算器存储。
在一些测定中，最大峰值强度可以例如用于计算液滴中相关元素的浓度。如下文中参考图4-6所述，最大峰值的位置用于确定共定位参数。
计算器14包括若干过滤器以避免由噪声引起的错误局部最大值检测。过滤器基于峰宽阈值、峰高阈值或峰间偏移标准。这些值可以由用户预先确定或设定。
全局最大值是强度函数的最高最大值。
此外，由于该信号是连续的，可以针对每个钟形曲线62对该信号进行积分。例如，在图3所示的两个阈值线70、72之间对信号进行积分。例如，阈值线70、72由用户手动预先确定或由软件模块自动预先确定。替代地或额外地，该值可以由用户通过监视器20手动改变。
该积分值可以用于进一步计算以使测量强度归一化。例如，计算器可以计算光信号的最大值与光信号的积分值之比。
在图3中，液滴74呈现两个最大峰值。在该实例中，液滴74包含两个活CHO细胞。在这些液滴4中，计算两个最大坐标。
多峰的检测及其坐标和面积的计算对于检测负载取决于泊松分布的元素(例如颗粒)是特别有利的。例如，颗粒是细胞。一些液滴4不包含颗粒，一些液滴4仅包含一个颗粒，而其它液滴4可以包含一个以上颗粒。确定信道的最大峰值的数量允许知道液滴中与该波长相关的颗粒数。对于取决于颗粒数的测定来说，这可能是尤其感兴趣的。这对于将这些液滴4与单细胞测定进行区分来说尤其重要。
图4示出从连续通过两个光学信道的检测线D的一系列连续液滴4获取的测量的另一实例，这两个光学信道对应于第一波长信道和第二波长信道。
每个光信号用不同的曲线80、82表示。例如，用实线表示的曲线80在第一可见光敏检测器38上测量，并且对应于与第一元素26相关的第一光信号。图4中用虚线表示的曲线82在第二可见光敏检测器38上测量，并且对应于与第二元素28相关的第二光信号。每个信号在不同的荧光信道中测量。
计算器可以针对每个光信号计算上面参考图3描述的参数。
此外，通过比较两个光信号，计算器计算共定位参数。该计算将结合图5更详细地进行说明。
图5更详细地示出了用于两个信号的一个液滴的测量。
计算器计算液滴中每个光信号的最大值84、86的坐标。
然后，计算器14计算对应于第一光信号的最大强度的位置与对应于第二光信号的最大强度的位置之间的距离Δ。该距离Δ是共定位参数。
距离Δ越小，与光波长相关的元素26、28越接近。
有利地，计算器通过液滴宽度使共定位参数归一化。
归一化之后，如果元素之间的共定位是理想的，则共定位参数等于1。归一化后，如果没有共定位，则共定位参数等于0。
共定位参数可以用于检测两个元素26、28之间的结合。实际上，例如，如果荧光抗原与液滴中的荧光抗体结合，则与抗原的信号和抗体的信号相关的共定位参数会高。
共定位参数可以表示为点图形式，作为滴码(V)的最大峰值或任意其它参数(液滴宽度、第二共定位参数)的函数。典型的例子如图9所示，其中，置信区间定义为117。在一些实施例中，定义置信区间以瞄准两个事件的真实共定位的最高概率119。在给出的实例中，置信区间(确定标记抗原和标记分泌抗体)有利地设定在90％-100％之间，以精确选择包含抗原(峰1)122、120和抗体(峰2)122、121之间具有最小距离d的信号的液滴。根据本发明的优选实施例，共定位参数(Δ)通过具有90％-100％的置信区间来选择。
图10中描述的另一应用是选择与荧光标记报告细胞122结合的荧光标记抗体123的共定位事件。
在其它一些实施例中，共定位参数用作排除标准。图10中的置信区间被设定为具体地选择两个峰值共定位118的概率低于90％的液滴。该特征对于排除非特定结合事件尤为重要。典型实例包括荧光抗体123、120与荧光标记抗体产生细胞124、121共定位的情况。
在图13中描述的其它一些实施例中，共定位参数以组合或排除模式使用。典型示例是排除假阳性命中(hit)和/或精确选择感兴趣的给定液滴种群。在给定实例中，如果两个信号共定位但需要排除第三信号，则选择液滴。典型的情况是，荧光抗体123、120与荧光标记抗体产生细胞共定位，但不在荧光标记报告细胞126上共定位，因此排除了这两种共定位事件。另一典型情况是荧光抗体123、120与荧光标记报告细胞124、121共定位，但不应与荧光标记抗体产生126、127共定位。
在另一实例中，在测量步骤中，测量至少三个光信号，并且通过两两比较光信号的最大值的位置来计算多个共定位参数。
图6示出针对通过两个光学信道的检测线D的独特液滴4获取的测量的另一实例，所述两个光学信道对应于第一波长信道和第二波长信道。
该实例用于说明第一光信号和第二光信号之间的多峰共定位参数的计算，其中一个光信号包括多个局部最大值。
每个光信号用不同的曲线90、92表示。例如，用实线表示的曲线90在第一可见光敏检测器38上测量得到，并且对应于与第一元素26相关的第一光信号。图4中用虚线表示的曲线92在第二可见光敏检测器38上测量得到，并且对应于与第二元素28相关的第二光信号。每个信号在不同的荧光信道中测量。
在该实例中，第一光信号包括三个局部最大值94、96、98，第二光信号包括局部最大值100。
计算器计算第一光信号的多个局部最大值94、96、98的坐标和第二光信号的局部最大值100的坐标。
计算器通过以下步骤计算第一光信号和第二光信号之间的多峰共定位参数：
——对于第一光信号的每个局部最大值94、96、98，计算器通过比较第二信号的局部最大值100的位置与第一光信号的局部最大值94、96、98的位置，计算中间共定位参数d1、d2、d3，
——然后，计算器14比较中间共定位参数d1、d2、d3，多峰共定位参数Δ是最低中间共定位参数。
在该实例中，计算三个中间共定位参数d1、d2、d3。中心局部最大值96最接近第二光信号的局部最大值100。多峰共定位参数Δ是在中心局部最大值94和第二光信号的局部最大值100之间计算的中间共定位参数d2。
有利地，在计算步骤54中，将计算得到的参数存储在存储器中，以用于确定步骤56和/或进一步利用。
在确定步骤56中，选择单元16根据包括至少共定位参数在内的至少两个计算参数确定液滴4的分选类别。
分选类别的数量取决于测定和分选单元的可能性。至少有两个分选类别。
例如，分选类别是保留液滴4类别。例如，分选类别是排除液滴4类别。例如，分选类别是样本液滴类别；分选类别是阳性对照液滴4类别或阴性对照液滴类别。
有利地，在确定步骤56中，将计算得到的参数与选择标准或阈值进行比较。有利地，在确定步骤中，将至少一个计算参数与预定阈值进行比较。替代地或额外地，一些阈值由用户通过监视器手动确定。确定步骤56中使用的标准可以适应测定。
例如，对于两个参数的选择，在监视器20的屏幕上示出点图。为了同时固定两个特定参数的阈值，用户可以通过如图8所示的人机界面在相关点图中围绕选定或排除的液滴4绘制选择门(door)。
例如，确定步骤56包括若干步骤，每个选择步骤对应于基于不同标准进行的选择。由计算器计算的每个参数均可以用于选择。在计划用于测定的每个选择步骤之后归结液滴的分选类别。
有利地，用户可以通过监视器20改变选择步骤的数量和类型。替代地，选择步骤的数量和类型可以存储在选择单元16中以用于某种类型的测定。
有利地，计算步骤54和确定步骤56可以并行执行。例如，计算器14将停止对排除的液滴执行计算。这样，通过避免无用计算，有助于使方法更快速。
替代地，在确定步骤之前执行所有计算步骤。
下文中将描述选择标准的一些实例。
例如，在一个步骤中，选择单元将液滴4的种群限制为液滴4中的两个元素26、28之间具有高共定位的液滴4。该选择基于与相应元素26、28相关的两个信号之间的共定位参数。例如，这种选择对于选择两个元素26、28之间发生结合的液滴4来说是有用的。
替代地或额外地，选择单元拒绝其中液滴中两个元素之间具有高共定位的液滴4的选定种群。例如，这种选择对于拒绝两个元素之间发生结合的液滴4来说是有用的。例如，这种拒绝对于排除含有细胞聚集体的液滴4是有用的。例如，如果抗体结合在分泌细胞的表面上，将难以分析抗原的抗体特异性。
例如，在一个步骤中，选择单元16将液滴4种群限制为具有正确宽度的液滴4。
例如，在一个步骤中，选择单元将液滴4种群限制为含有正确元素的液滴4。该选择基于相关信号的全局最大峰值强度值和光信号的最大值与所述光信号的积分值之比。例如，保持相关信号的全局最大峰值强度值和光信号的最大值与所述光信号的积分值之比在阈值门内的液滴4。
然后，在分选步骤58中，分选单元18根据液滴4的分选类别对液滴4进行分选。每个液滴4定向至与其分选类别相关联的分选区32。
然后，可以收集液滴4或其成分用于进一步反应或分析。
此外，有利地，存储光信号、每个计算参数和/或每个分选标准。因此，可以将这些数据用于进一步分析。
此外，该方法有利地包括在测量步骤期间捕获液滴4的图像的步骤。例如，该图像是分选的液滴4的快照。例如，该图像是感兴趣的液滴4的一维图。
现在将描述更具体的应用实例以说明本发明的优点。
以下实例说明，可以根据若干标准对液滴4进行分选。实例如图7和8所示。
该测定的目的是回收具有抗体产生细胞110的特定液滴4，抗体产生细胞110能够产生可以与CHO(中国仓鼠卵巢)细胞116的表面靶114结合的抗体112。这种液滴在图7中示意性地示出。因此，需要回收下述液滴4：抗体112信号与靶112共定位但不与B细胞116共定位，液滴同时包含CHO细胞114和B细胞110。
在该测定中，CHO细胞用钙黄绿素AM染色。用于测定的CHO细胞表面具有靶抗原。B细胞用钙黄绿素AM紫染色。
测定中的每个液滴4包括液滴染色剂，例如磺酰罗丹明B，以及标记的抗体检测试剂，例如抗小鼠IgG Fc AlexaFluor647。
在图7和8的实例中，连续液滴4包括多个阳性对照液滴，然后是多个阴性对照液滴，最后是多个样本液滴。
计算器14根据液滴4在检测区34中经过的顺序，将滴码与每个液滴4相关联。预定滴码与多个样本液滴中的液滴相对应。
阳性对照液滴4包含CHO细胞和已知能与靶结合的抗体。阴性对照液滴4包含水介质，但不包含CHO细胞或B细胞。
检测组件同时测量四个光信号。
为了简化说明，与CHO钙黄绿素AM染色相关的光信号称为绿信号，与B细胞钙黄绿素AM紫染色相关的光信号称为紫信号。与滴码相关联的光信号称为橙信号。与抗体结合检测试剂相关的光信号称为红信号。
计算器从橙信号计算液滴4宽度。计算器从红信号计算局部最大值的坐标，下文中称为结合最大值。计算器从紫信号计算局部最大值的坐标，下文中称为B细胞最大值。计算器从绿信号计算局部最大值的坐标，下文中称为CHO最大值。
在确定步骤中，选择单元拒绝呈现出比特定阈值高或比另一特定阈值低的液滴宽度的每个液滴。根据这些标准，不再保留因杂质或液滴4的尺寸而难以筛选和分析的信号。这些液滴4和杂质可能是乳液不稳定性或多个连续液滴4自发聚结导致的。
在确定步骤中，在剩余液滴中，对于对应于抗体结合试剂的红信号，呈现出高于阈值的结合最大值强度的每个液滴与保留分选类别相关联，其它液滴与分离类别相关联。例如，该阈值在基于背景荧光和阳性对照液滴4的任意单位中为0.1。在该步骤之后，阴性对照液滴4在分离类别中，并且阳性对照液滴在分选类别中。样本液滴4可以在分选类别中或分离类别中，但在确定步骤结束时，只有处于分选类别的样本液滴4可以选择为阳性。利用该标准，含有特定于靶的抗体的每个液滴保留在分选类别中。在一个实例中，利用该标准，仅有0.16％的样本液滴4保持在该分选类别中。
对于对应于B细胞的色信号，选择单元16将呈现特定阈值下的最大强度的每个液滴与另一分离类别相关联。作为补充或替代，通过如图8所示的点图门选来进行选择。点图表示根据B细胞最大值强度和滴码的液滴4。门包括具有低滴码并且B细胞最大强度在0.01V-5V之间的液滴4。利用该标准，排除没有B细胞的液滴4。例如，在该选择之后，仅17％的液滴4保留在分选类别中。
对于对应于活CHO细胞的色信号，分选类别中呈现出特定阈值下的最大强度的每个液滴与另一分离类别相关联。点图表示根据CHO细胞最大值强度和滴码的液滴4。门包括具有对应于样本系列的低滴码并且CHO细胞最大强度在0.01V-5V之间的液滴4。利用该标准，不保留没有CHO细胞的液滴4。例如，通过该选择，仅70％的液滴4保留在分选类别中。
作为替代或补充，基于紫信号和色信号的选择是同时进行的。示出根据CHO最大强度和B细胞最大强度的每个液滴的点图显示在监视器上。进行门选(gating)以使保留在分选类别中的每个液滴4具有CHO细胞和B细胞。
之后，对于剩余液滴，计算对应于CHO细胞的绿信号和对应于结合的红信号之间的共定位参数。进一步地，对于剩余液滴，计算对应于B细胞的紫信号和对应于结合的红信号之间的共定位参数。进一步地，对于剩余液滴，计算对应于B细胞的紫信号和对应于CHO细胞的绿信号之间的共定位参数。
然后，在确定步骤56中，将在红信号和CHO细胞之间具有高共定位参数的液滴4保留在分选类别中。
然后，拒绝在检测试剂和B细胞之间具有高共定位参数的液滴4。
最后，拒绝在CHO细胞和B细胞之间具有高共定位参数的液滴4。在该实例中，如果与结合试剂共定位的CHO细胞也与B细胞共定位，则排除液滴4，因为该液滴可能是假阳性。实际上，B细胞可能具有不与靶结合但可以由结合剂检测到的分泌抗体。
这导致分选类别中特定种群的液滴4仅包括具有如下B细胞的液滴4，即，能够产生可以与CHO细胞的表面靶结合的抗体的B细胞。
然后，基于液滴的分选类别对液滴4进行分选。
在每个选择步骤中，排除的液滴可以与不同的分选类别相关联。这允许对液滴4进行多次分析。例如，可以回收阳性对照液滴4用于之后的分析。
本发明提供了一种比现有系统保真度更高用于分析和选择特定液滴的方法。实际上，可以根据多个标准对液滴4进行分选。与其它参数组合的共定位参数可以用于分析元素的空间相对位置，其可以影响测定结果。
在另一实施例中，多个液滴4是乳液。液滴4储存在微流体室中，在微流体室中执行测量步骤。检测组件12适于对腔室中的每个液滴4进行空间扫描，以测量波长信道的光强度分布。

Claims (14)

1.一种对多个液滴(4)进行分析并从中选择特定液滴的方法，包括以下步骤：
-提供多个液滴(4)，所述多个液滴(4)中的至少一个液滴(4)包含第一元素(26)和第二元素(28)，
-对于所述多个液滴中的液滴(4)，测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的所述液滴(4)中的光强度空间分布，所述至少两个光信号中的第一光信号与第一元素(26)相关，所述至少两个光信号中的第二光信号与第二元素(28)相关，
-从所述至少两个光信号计算多个参数，
-根据至少两个计算得到的参数来确定液滴的分选类别，
-根据所述液滴的分选类别对所述液滴进行分选，
其中，所述多个参数包括每个光信号的最大强度的坐标和共定位参数Δ，并且用于确定步骤的所述至少两个计算得到的参数包括所述共定位参数Δ，并且
其中，通过计算对应于所述至少两个光信号中第一光信号的最大强度的位置与对应于所述至少两个光信号中第二光信号的最大强度的位置之间的距离来计算所述共定位参数Δ。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述共定位参数Δ通过具有90％-100％的置信区间来选择。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中，所述多个参数包括至少一个下述参数：
-液滴(4)的宽度，
-光信号的积分，
-光信号的最大值与所述光信号的积分值之比，
-光信号的局部最大值的坐标，
-液滴中光信号的局部最大值的数量，
-光信号的导数的计算，以及
-光信号的二阶导数的计算。
4.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，所述至少两个光信号中的第一光信号包括多个局部最大值，所述多个参数包括多峰共定位参数，该多峰共定位参数在包括局部最大值的第一光信号与第二光信号之间计算得到，所述多峰共定位参数通过以下步骤计算：
-对于所述第一光信号的每个局部最大值，通过计算所述第二光信号的局部最大值的位置与所述第一光信号的局部最大值的位置之间的距离来计算中间共定位参数，
-比较所述中间共定位参数，所述多峰共定位参数是最小中间共定位参数。
5.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，液滴(4)中的共定位参数通过液滴宽度归一化。
6.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，对所述多个液滴(4)中的至少两个液滴(4)执行测量步骤，并且所述多个参数包括所述两个液滴(4)之间的间隔。
7.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，在确定步骤中，将至少一个计算得到的参数与预定阈值进行比较。
8.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，在测量步骤中，测量至少三个光信号，并且其中，通过两两比较所述光信号的最大值的位置来计算多个共定位参数。
9.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，进一步包括以下步骤：
-提供一种装置(1)，所述装置(1)包括能够用于液滴(4)的流的通道(30)，并且包括检测区(34)和分选区(32)，
-在所述通道(30)中循环所述多个液滴(4)，
-对在所述检测区(34)中流动的液滴(4)进行测量。
10.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，包括在测量步骤期间捕获所述液滴(4)的图像的步骤。
11.根据权利要求1-2中任意一项权利要求所述的方法，其中，所述第一元素(26)在与所述至少两个光信号中的第一光信号相关的波长信道中是荧光的，并且其中，所述第二元素(28)在与所述至少两个光信号中的第二光信号相关的第二波长信道中是荧光的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一和第二元素(26、28)选自由细胞、荧光标记蛋白质、细胞标记试剂、荧光标记抗原、荧光标记抗体、生物实体涂覆颗粒、核酸、肽和化学药物组成的元素组。
13.一种对多个液滴(4)进行分析并从中选择特定液滴(4)的装置(1)，所述多个液滴(4)中的至少一个液滴(4)包含第一元素(26)和第二元素(28)，所述装置(1)包括：
-检测组件(12)，能够对液滴(4)测量至少两个光信号，每个光信号表示用于相关波长信道的所述液滴(4)中的光强度空间分布，所述至少两个光信号中的第一光信号与第一元素(26)相关，所述至少两个光信号中的第二光信号与第二元素(28)相关，
-计算器(14)，用于从所述至少两个光信号计算多个参数，
-选择单元(16)，用于根据至少两个计算得到的参数来确定所述液滴(4)的分选类别，
-分选单元(18)，用于根据所述液滴(4)的分选类别对所述液滴(4)进行分选，
其中，所述多个参数包括每个光信号的最大强度的坐标和共定位参数，并且所述至少两个计算得到的参数包括所述共定位参数，并且
其中，通过计算对应于所述至少两个光信号中第一光信号的最大强度的位置与对应于所述至少两个光信号中第二光信号的最大强度的位置之间的距离来计算所述共定位参数。
14.根据权利要求13所述的装置(1)，其中，所述检测组件包括光源(36)和至少一个可见光敏检测器(38)。
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