JP2020507065A - 複数の液滴のうち特定の液滴を分析および選択する方法および関係がある器具 - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の液滴（４）のうち特定の液滴を分析および選択する方法に関し、以下のステップ：− 複数の液滴（４）を提供するステップ、− 複数の液滴のうち液滴（４）について、少なくとも２つの光信号を測定するステップ（それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する液滴内の光強度の空間分布の代表である）、− 光信号から複数のパラメーターを計算するステップ、− 計算されたパラメーターに従って液滴に関する分類クラスを判定するステップ、− 前記液滴をその分類クラスに従って分類するステップ、を含み、複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含み、判定するステップに用いられる前記の少なくとも２つの計算されたパラメーターは、共局在パラメーターを含む。【選択図】 図１

Description

本発明は、複数の液滴のうち特定の液滴を分析および選択する方法に関する。

特に、当該プロセスは、特定の標的エレメントを含む液滴をスクリーニングおよび選択することを目的とする。例えば、特定の標的エレメントは、生物学的反応または化学的反応の産物であってよい。

当該方法は、マイクロ流体の液滴を選択するために用いられる。「マイクロ流体」によって、一般に、液滴または流体が循環する通路の寸法が、１ミリメートルよりも小さくて、例えば１μｍ〜１ｍｍに含まれることを意味する。

それぞれの液滴は、化学的または生物学的反応が生じるマイクロコンテナーとして考えられ得る。それらは、特定の合成、産物のスクリーニング、または診断のために用いられ得る。

多くのアッセイでは、アッセイの効率を高めるために、分析前に液滴を分類する必要がある。他のアッセイでは、特定の液滴内容物を集めるために、多くの化学的、物理的または生物学的反応後に液滴を分類する必要がある。

例えば、化学的または生物学的マイクロリアクターの多数の変異体の活性または特性を並行して試験するために、エマルションの液滴内にマイクロリアクターを分布させて、それから、それぞれのマイクロリアクターにおいて化学的または生物学的反応を実行することが知られている。それから、特に、重大な反応をもたらしているマイクロリアクターおよび反応条件を評価および単離するために、それらが含む産物に従って液滴を分離する必要がある。

重大な反応が生じている液滴を単離するために、重大な反応が生じている場合に活性である選択的蛍光マーカーを配置することが知られている。

それから、液滴は、手作業または自動分類機を用いて分類されて、例えば、マイクロ流体またはフローサイトメトリー技術を介して、反応したものを分離する。例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）は、液滴内の蛍光信号を測定する。そのような技術は、相対的に複雑で高価である。

しかしながら、特定のアッセイでは、より複雑な基準に基づいて液滴を区別することも重要である。例えば、生物学的物質の集合体を含む液滴を、同量の単一物質を含むが集合しない液滴から区別することが重要である。実際に、集合は、一部の試験において偽陽性の選択または偽陰性の拒否のリスクを提供し得る。

したがって、本発明の１つの目的は、既存のシステムよりも高い忠実性で特定の液滴を分析および選択するための方法を提供することである。

この目的のために、本発明の要旨は、複数の液滴のうち特定の液滴を分析および選択する方法であり、以下のステップ：
− 複数の液滴を提供するステップ、
− 複数の液滴のうちの液滴について、少なくとも２つの光信号を測定するステップ（それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する液滴内の光強度の空間分布の代表である）、
− 前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算するステップ、
− 少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って液滴について分類クラスを判定するステップ、
− 前記液滴をその分類クラスに従って分類するステップ、を含み、
ここで、複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含み、判定するステップに用いられる前記の少なくとも２つの計算されたパラメーターは、共局在パラメーターを含む。

本発明に係る複数の液滴のうち特定の液滴を分析および選択する方法は、以下の特徴（単数または複数）の１つまたは複数を、単独で、または任意の技術的にあり得る組み合わせに従って含んでよい：
− 共局在パラメーターは、前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号の最大強度（最大ピーク強度または積算信号、または、光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比として）に対応する位置を、前記の少なくとも２つの光信号のうち第二の光信号の最大強度に対応する位置と比較することによって計算されて；共局在パラメーターは、少なくとも２つの異なる蛍光チャンネルの最大信号強度の間の時間間隔を考慮して、液滴のサイズによって合理化され得る。したがって値は、０〜１（または０％〜１００％）内に制限されて、１（または１００％）の値は、２つの最大強度信号の完全な共局在である。
− 複数のパラメーターは、以下のパラメーター：
− 液滴幅、
− 光信号の積算、
− 光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比、
− 光信号に関する極大値の座標、
− 光信号に関する液滴内の極大値の数、
− 光信号の導関数の計算、および
− 光信号に関する第二の導関数の計算；
の少なくとも１つを含み、
− 前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号は、複数の極大値を含み、複数のパラメーターは、極大値を含む第二の光信号および第一の光信号の間で計算された多重ピーク共局在パラメーターを含み、多重ピーク共局在パラメーターは、以下のステップによって計算される：
− 第一の光信号のそれぞれの極大値について、第一の光信号の前記極大値の位置と第二の信号の極大値の位置を比較することによって、中間共局在パラメーターを計算するステップ、
− 中間共局在パラメーターを比較するステップ（多重ピーク共局在パラメーターは、最も低い中間共局在パラメーターである）；
− 液滴内の共局在パラメーターは、液滴幅によって標準化される；
− 測定のステップは、複数の液滴の少なくとも２つの液滴に関して行なわれて、複数のパラメーターは、２つの液滴間の間隔を含む；
− 判定するステップの間、少なくとも計算されたパラメーターは、予め決められた閾値と比較される；
− 測定するステップの間、少なくとも３つの光信号が測定されて、複数の共局在パラメーターは、光信号の最大値の位置を２つずつ比較することによって計算される；
− 前述した方法は、以下のステップを含む：
− 液滴の流れに適応したチャンネルを備える器具を提供するステップ（器具は、検出領域、および分類領域を備える）、
− 複数の液滴が、チャンネル内を循環するステップ、
− 検出領域内を流れる液滴に関して測定を行なうステップ；
− 測定するステップの間、液滴の写真をキャプチャーするステップ；
− 複数の液滴の少なくとも１つの液滴は、第一のエレメントを含み、第一のエレメントは、前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号と関係がある波長チャンネル内の蛍光であり、複数の液滴の少なくとも１つの液滴は、第二のエレメントを含み、第二のエレメントは、前記の少なくとも２つの光信号のうちの第二の光信号と関係がある第二の波長チャンネル内の蛍光である；
− 第一および第二のエレメントは、細胞、蛍光標識タンパク質、細胞標識化試薬、蛍光標識抗原、蛍光標識抗体、生物学的物質でコーティングされた粒子、核酸、ペプチドおよび化学薬物からなるエレメントの群内で選択される。

本発明はまた：
− 液滴について、少なくとも２つの光信号を測定するように適応された、検出アセンブリ（それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する液滴内の光強度の空間分布の代表である）、
− 前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算するための、計算機、
− 少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って液滴に関する分類クラスを判定するための、選択ユニット、
− 液滴をその分類クラスに従って分類するための、分類ユニット、
を備える、複数の液滴のうち特定の液滴を分析および選択するための器具に関し、
複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含み、前記の少なくとも２つの計算されたパラメーターは、共局在パラメーターを含む。

本発明に係る器具は、以下の機構を備えてよい：
− 検出アセンブリは、光源および少なくとも可視光感受性検出器を備える。

本発明は、一例としてのみ与えられて以下の図面を考慮してなされる以下の説明を読んだ際に、よりよく理解される。

本発明に係る器具の概略図である。 本発明に係る方法に関するステップを要約する概略である。 液滴の連続に関する光信号の測定の曲線の例である。 液滴の連続に関する２つの光信号の測定の曲線の例である。 液滴に関する２つの光信号の測定の曲線の例であり、共局在パラメーターの計算が図解される。 液滴に関する２つの光信号の測定の曲線の例であり、多重ピーク共局在パラメーターの計算が図解される。 バイオアッセイで用いられるサンプル液滴の略図である。 選択ゲートおよび２つのパラメーターに従った液滴を表わすドットプロットの例である。 可溶性蛍光標識抗原および蛍光標識抗体の共局在イベントを選択するための、９０％信頼区間よりも上に設定された、選択された共局在パラメーターに従った液滴を表わすドットプロットの例である。 共局在イベントを除くための、９０％信頼区間よりも下に設定された、選択された共局在パラメーターに従った液滴を表わすドットプロットの例である。 可溶性蛍光標識レポーター細胞および蛍光標識抗体の共局在イベントを選択するための、９０％信頼区間よりも上に設定された、選択された共局在パラメーターに従った液滴を表わすドットプロットおよび液滴信号の例である。 可溶性蛍光標識抗体産生細胞および蛍光標識抗体の共局在イベントを除くための、９０％信頼区間よりも下に設定された、選択された共局在パラメーターに従った液滴信号を表わすドットブロットおよび液滴信号の例である。 ９０％信頼区間よりも上に設定された抗体／レポーター細胞共局在パラメーターに従った液滴を表わす、および、９０％信頼よりも下にパラメーターを設定することによって抗体生産細胞／レポーター細胞の共局在を除く、ドットプロットおよび液滴信号の例である。

本発明に係る、複数の液滴４のうち特定の液滴を分析および選択するための器具１を図１に示す。

器具１は、液滴サプライ６、コントローラー８、液滴サポート１０、検出アセンブリ１２、計算機１４、選択ユニット１６、および、分類ユニット１８を備える。

有利に、器具は、マン・マシン・インターフェイスを有するモニター２０をさらに備える。

液滴サプライ６は、キャリア流体２２内に分散された複数の液滴４を提供することが意図される。

図１の実施態様において、複数の液滴４は、液滴４の連続である。

液滴４は、キャリア流体２２と非混和性の内部流体２４を含む。「非混和性」によって、一般に、内部流体２４の０．０１％未満が２５℃および雰囲気圧でキャリア流体２２内に溶解することができないことを意味する。例えば、内部流体２４は水溶液であり、外部流体２２はキャリアオイルである。

例えば、内部流体２４は、少なくとも生物学的物質および媒体を含み、それぞれの液滴４を形成する前に内部流体２２内にローディングされる。例えば、生物学的物質は、細胞である。

複数の液滴４のうちの液滴４の内容物は異なってよい。

有利に、複数の液滴４の少なくとも１つの液滴４は、第一のエレメント２６を含み、第一の波長チャンネルにおいて蛍光である。複数の液滴４の少なくとも１つの液滴４は、第二のエレメント２８を含み、第二の波長チャンネルにおいて蛍光である。それぞれの蛍光エレメント２６、２８は、励起スペクトルおよび発光スペクトルによって特徴付けられる。

励起最大値の波長チャンネルは、通常、少なくとも７０ｎｍ分離されている。

有利に、第一および第二のエレメント２６、２８は、細胞、蛍光標識タンパク質、細胞標識化試薬、蛍光標識抗原、蛍光標識抗体、生物学的物質でコーティングされた粒子、核酸、ペプチドおよび化学薬物からなるエレメントの群内で選択される。

粒子は、ソリッド粒子またはソフト粒子であってよい。例えば、粒子は、磁性粒子、コロイド状粒子、ヒドロゲルビーズ、ベシクル、リポソーム、液滴またはその他である。

第二のエレメントは、例えば、第一のエレメントに結合するように適合される。例えば、第一のエレメントは蛍光標識抗原であり、第二のエレメントは蛍光標識抗体である。

図１を参照して、液滴サポート１０は、マイクロ流体パターンが上に形成されるチップである。液滴サポート１０は、好ましくは、１つのピースの単一材料、特に、高分子材料、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、エポキシ、特にＮｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ（ＮＯＡ）によって販売されるような光重合性エポキシ、またはガラスで作られる。

図１に示されるように、液滴サポート１０は、少なくともワーキングチャンネル３０を備える。ワーキングチャンネル３０は、キャリア流体２２内に分散された複数の液滴４のサプライ６の上流に接続される。ワーキングチャンネル３０は、分類ユニット１８の少なくとも分類領域３２の中に下流で現れる。

ワーキングチャンネル３０は、連続する液滴４における光信号の測定のために適応される。

液滴サポート１０は、検出領域３４を規定して、サポート１０は、検出に用いられる波長チャンネルにおいて透明である。検出領域３４において、ワーキングチャンネルは、縦軸Ｘに沿って伸長している。

縦軸Ｘに対して相対的に横断する方向ＹおよびＺでのワーキングチャンネル３０の寸法は、連続の液滴４が検出領域３４内で１つずつ通過するように、液滴４の寸法に適応される。

コントローラー８は、ワーキングチャンネル３０内の複数の液滴４の流速をコントロールするように適応される。例えば、コントローラー８は、液滴サプライ６による液滴４およびキャリア流体の注入をコントロールするように液滴サプライ６に接続される。加えて、コントローラー８は、液滴４の間の間隔、検出領域３４を通過する液滴４の検出時間および頻度をコントロールするのを可能にする。

検出アセンブリ１２は、液滴について、少なくとも２つの光信号を測定するように適応されて、それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する液滴４内の光強度の空間分布の代表である。

例えば、検出アセンブリ１２は、少なくとも光源３６および少なくとも可視光感受性検出器３８を備える。例えば、可視光感受性検出器３８は、光電子増倍管である。

光源３６は、検出領域３４を照らすように適応される。例えば、光源３６は、全ての可視波長を励起する白色源である。

例えば、検出アセンブリ１２は、それぞれの光信号に関する光源３６を備える。有利に、光源３６は、複数の液滴の少なくとも１つの液滴４内にある可能性がある蛍光エレメント２６、２８の蛍光励起スペクトルに対応する特定の波長チャンネル内で光を非零強度で放射するように適応される。例えば、光源３６はレーザーである。例えば、特定の波長チャンネルは、第一のエレメント２６または第二のエレメント２８の蛍光を可能にする励起チャンネルである。

例えば、検出アセンブリ１２は、それぞれの光信号に関する可視光感受性検出器３８を備える。それぞれの可視光感受性検出器ｒ３８は、時間に従って検出領域３４内で放射される光信号の強度に対応する電圧測定を記録するように適応される。

有利に、それぞれの可視光感受性検出器３８は、複数の液滴４の少なくとも１つの液滴４内にある可能性があるエレメント２６、２８の蛍光発光スペクトルに対応する特定の波長チャンネルに感受性である。例えば、第一の光信号と関係がある波長チャンネルは、第一のエレメント２６の発光スペクトルを含み、第二の光信号と関係がある波長チャンネルは、第二のエレメント２８の発光スペクトルを含む。

例えば、検出アセンブリは、ワーキングチャンネル３０の縦軸Ｘに対して垂直な方向Ｙに沿って伸長している、検出ラインＤに沿って光信号の強度を光学的に測定することが可能である。

光信号の測定は、検出領域３４内を進行的に通過するときの液滴４の寸法に対してなされる。

キャリア流体２２および液滴４の流速が分かっている場合は、時間中にこの検出ラインＤ上で得られる光信号の測定は、検出ラインＤを横切る液滴４の空間的スキャンに対応する。

可視光感受性検出器３８は、それらのそれぞれの光信号を同時に同一の検出ラインＤ上で測定するように配列される。

異なる測定は、もっと後の説明において図３、図４、図５および図６を参照して説明される。

検出アセンブリ１２は、計算機１４に接続される。

計算機１４は、前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算するために適応される。例えば、計算機１４は、メモリおよびリアルタイムマイクロプロセッサを備える。

計算機１４は、規定された基準に従ってリアルタイムで信号を検索、計算、解釈するように適応される。

規定された基準はそれから、データ転送および計算の時間を減少させるために、計算機ユニット１４内へロードされる。

計算機１４は、データ分析および分類のスループットを増大させるように適応される。

メモリは、プロセッサによるパラメーターの計算を行なうために実行され得る複数のソフトウェアモジュールを備える。

複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含み、少なくとも２つの計算されたパラメーターは、共局在パラメーターを含む。

異なるパラメーターおよびそれらを計算するための方法は、もっと後の説明において説明される。

計算機は、検出アセンブリ１２および選択ユニット１６に接続される。

選択ユニット１６は、少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って液滴４に関する分類クラスを判定するために適応される。例えば、選択ユニット１６は、メモリおよびマイクロプロセッサを備える。

例えば、選択ユニット１６は、計算されたパラメーターを閾値と比較するために行なうように実行され得る複数のソフトウェアモジュールを備える。分類基準は、もっと後の説明において説明される。

選択ユニット１６は、計算機１４および分類ユニット１８に接続される。

分類ユニット１８は、異なる分類領域３２内の液滴４である場合に、液滴４をそれらの分類クラスに従って分類するために適応される。例えば、分類ユニット１８は、それぞれの分類クラスに関する異なる分類領域３２を含む。それぞれの分類領域３２は、ワーキングチャンネル３０に接続される。さらに、分類ユニット１８は、それぞれの分類領域３２内の液滴４を、液滴４の分類クラスに従って配向するための配向手段４０を備える。例えば、配向手段４０は、電極、または流れコントローラーを備える。

モニター２０は、グラフ上の測定の表示に適応されて、計算または分類基準に関するパラメーターを設定するのを可能にする。

例えば、モニター２０は、液滴４を２つの異なるパラメーターに従って表わすドットプロットを表示するように適応される。ドットプロットは図８に表わされる。

モニター２０は、コントローラー８、検出アセンブリ１２、計算機１４、選択ユニット１６および／または分類ユニット１８に接続される。

器具１を用いて複数の液滴４のうち特定の液滴４を分析および選択するための方法は、ここで図２を参照して説明される。

方法は、提供するステップ５０、測定するステップ５２、計算するステップ５４、判定するステップ５６、および、分類するステップ５８を含む。

提供するステップ５０の間、複数の液滴４は、サプライ６によってワーキングチャンネル３０の入口において提供される。

液滴４は、ワーキングチャンネル３０の中へ循環して、コントローラー８は、キャリア流体２２および液滴４の流速を制御する。

液滴４は、検出アセンブリ１２の前の検出領域３４内に連続的に到達する。

測定するステップ５２の間、検出領域３４内の液滴４は、検出アセンブリ１２によって照らされて、少なくとも２つの光信号は、液滴４が検出領域３４を通過している間に検出アセンブリ１２によって測定される。

それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する液滴内の光強度の空間分布の代表である。

計算するステップ５４の間、いくつかのパラメーターが、計算機１４によって、測定された光信号から計算される。

特に、計算するステップ５４の間、計算機１４は、前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算して、複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含む。

有利に、計算機１４は、以降に説明されるように、他のパラメーターをさらに計算する。

単独で得られるそれぞれの光信号に関して、計算機１４は：
− 液滴４の幅、
− 光信号に関する最大値の座標、
− 光信号に関する全体的最大値の座標、
− 光信号に関する極大値の座標、
− 光信号の導関数の計算、
− 光信号に関する第二の導関数の計算、
− 光信号に関する液滴４内の極大値の数、
− 光信号の積算、
− 光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比
を計算することができる。

さらに、液滴の連続に関し、単独で得られるそれぞれの光信号に関して、計算機１４は、２つの連続する液滴の間の距離を計算することができる。

図３を参照して、我々は、これらのパラメーターがどのように計算されるのかを説明する。図４および５を参照して、共局在パラメーターの計算が説明される。それから図６を参照して、多重ピーク共局在パラメーターの計算が説明される。

図３は、第一の波長チャンネルに対応する１つの光学チャンネルに関して検出ラインＤを通って連続的に通過している一連の連続する液滴４に関して得られる測定の例を示す。例えば、この信号は、第一の可視光感受性検出器３８上で測定される。

時間は横軸に表わされて、強度は縦軸に表わされる。

図３の例では、曲線６０は、第一の光信号に対応する。

例えば、第一の光信号は、緑色波長において測定される。波長は、例えば、第一のエレメント２６が、試験において用いられる標識ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）であるのと関係がある。例えば、ＣＨＯ細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色される。Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭは、生細胞によって消化されると緑色蛍光になることが知られている。蛍光の高いピークの存在は、液滴４内に生きたＣＨＯ細胞があることを示す。

曲線６０は、複数の連続した釣鐘曲線６２を含む連続的な信号である。

それぞれの釣鐘曲線６２は、検出領域３４内を通過している異なる液滴４から可視光感受性検出器３８によって集められた放射に対応する。例えば液滴４はキャリア位相２２とは異なる屈折率を有するので、それぞれの液滴４に関して観察される残留信号が存在する。代替では、液滴４の内部流体２４は、残留信号を加える自家蛍光媒体を含む。

予め決められた強度レベルＩ１で測定された釣鐘曲線６２の幅ｗ１は、関係がある液滴４の幅を示す。液滴の幅は、距離を標準化するために、さらなる計算のために用いられ得る。

釣鐘曲線６２間のベースライン６４は、２つの連続する液滴の間のキャリア位相２２によって、可視光感受性検出器３６によって集められた放射を表わす。それは、液滴４内で測定された信号よりも低い強度を有する。

２つの連続する釣鐘曲線６２の中心間の距離ｄは、Ｘ軸に沿った２つの連続する液滴４の間の間隔に対応する

図３では、一部の液滴４のみが、釣鐘曲線６２から区別可能な最大ピーク６８を示す。例では、これらの液滴４は、生きたＣＨＯ細胞を含む液滴４に対応する。

例えば、最大値の座標を決定するために、光信号は、計算機１４による補間関数によって近似される。それから、関数の第一の導関数が計算機によって計算される。関数の第二の導関数が計算機によって計算される。第二の導関数は、関数の曲率を示す。極大値は、第一の導関数がゼロであり第二の導関数が負である点である。

最大ピーク６８の座標は、計算機によって記憶される。

一部のアッセイでは、最大ピークの強度は、例えば、液滴内の関係があるエレメントの濃度を計算するために用いられ得る。最大ピークの位置は、図４、５および６を参照して以下に説明されるように、共局在パラメーターの決定のために用いられる。

計算機１４は、ノイズに起因する、誤った極大値検出を避けるためにいくつかのフィルターを備える。フィルターは、ピーク幅閾値、ピーク高閾値またはピーク可動域基準の値に基づく。これらの値は、事前に決定されていてよく、またはユーザーによって設定されてよい。

全体的最大値は、強度の関数としての最も高い最大値である。

さらに、この信号は連続的であるので、それぞれの釣鐘曲線６２に関してこの信号を積算することが可能である。例えば、信号は、図３に示される２つの閾値ライン７０、７２の間で積算される。例えば、閾値ライン７０、７２は、ユーザーによって手作業で、または、ソフトウェアモジュールによって自動的に、事前に決定される。それに替えて、またはそれに加えて、値は、モニター２０を介してユーザーによって手作業で変更され得る。

この積算値は、測定された強度を標準化するためにさらなる計算に用いられ得る。例えば、計算機は、光信号の最大値および前記光信号の積算値の間の比を計算することができる。

図３では、液滴７４は、２つの最大ピークを示す。例において、液滴７４は、２つの生きたＣＨＯ細胞を含む。それらの液滴４において、２つの最大座標が計算される。

多重ピークの検出およびそれらの座標および面積の計算は、粒子のような、ローディングがポアソン分布に依存性であるエレメントを検出するのに特に有利である。粒子は、例えば細胞である。一部の液滴４は粒子を含まず、一部の液滴４はたった１つの粒子を含み、それ以外は１よりも多い粒子を含む。チャンネルに関する最大ピークの数の決定は、液滴内の、この波長と関連する粒子の数を知るのを可能にする。それは、結果が粒子の数に依存するアッセイに関して特に興味深く有り得る。単一細胞のアッセイに関してこれらの液滴４を区別することが特に重要である。

図４は、第一の波長チャンネルおよび第二の波長チャンネルに対応する２つの光学チャンネルに関して検出ラインＤを通って連続的に通過している一連の連続する液滴４に関して得られた測定の別の例を示す。

それぞれの光信号は、異なる曲線８０、８２によって表される。例えば、連続的なラインによって表される曲線８０は、第一の可視光感受性検出器３８上で測定されて、第一のエレメント２６と関係がある第一の光信号に対応する。図４において点線で表わされる曲線８２は、第二の可視光感受性検出器３８上で測定されて、第二のエレメント２８と関係がある第二の光信号に対応する。それぞれの信号は、異なる蛍光チャンネルにおいて測定される。

計算機は、図３を参照して、それぞれの光信号、上記に説明されるパラメーターに関して計算することができる。

さらに、２つの光信号を比較することによって、計算機は、共局在パラメーターを計算する。計算は、図５を参照することによってより詳細に説明される。

図５は、２つの信号に関する１つの液滴に関する測定を、より詳細に図解する。

計算機は、液滴内のそれぞれの光信号に関する最大値８４、８６の座標を計算する。

それから計算機１４は、第一の光信号の最大強度に対応する位置と第二の光信号の最大強度に対応する位置の間の距離Δを計算する。この距離Δは、共局在パラメーターである。

距離Δが低ければ低いほど、光学波長と関係があるエレメント２６、２８は、より近くなる。

有利に、計算機は、液滴幅によって共局在パラメーターを標準化する。

標準化後、エレメント間の共局在が理想的であるならば、共局在パラメーターは１と等しい。標準化後、共局在が存在しないならば、共局在パラメーターは０と等しい。

共局在パラメーターは、２つのエレメント２６、２８間の結合を検出するのに有用である。実際に、例えば、蛍光抗原が液滴内で蛍光抗体に結合されているならば、抗原の信号および抗体の信号と関係がある共局在パラメーターは高い。

共局在パラメーターは、ドロップコード（Ｖ）または任意の他のパラメーター（液滴幅、第二の共局在パラメーター）の最大ピークの関数としてのドットプロット形式として表され得る。典型的な例が図９に示されて、信頼区間は１１７に規定される。一部の実施態様では、信頼区間は、２つのイベントの真の共局在の最も高い可能性１１９を標的化するために規定される。所定の例において、抗原（ピーク１）１２２、１２０および抗体（ピーク２）１２２、１２１の間の最小距離ｄで信号を有する液滴を正確に選択するために、信頼区間（標識抗原および標識分泌抗体を決定する）は、有利に９０％〜１００％に設定される。本発明の好ましい実施態様によれば、共局在パラメーター（Δ）は、９０％〜１００％の範囲の信頼区間を有することによって選択される。

図１０において説明される別の適用は、蛍光標識レポーター細胞１２２に結合する蛍光標識抗体１２３の共局在イベントの選択である。

一部の他の実施態様では、共局在パラメーターは、除外基準として用いられる。図１０に表わされる信頼区間は、２つのピークが共局在される可能性が９０％よりも下の液滴を特異的に選択するように設定される（１１８）。この特徴は、非特異的な結合イベントを除くために特に重要である。典型的な例は、蛍光抗体１２３、１２０が、蛍光標識抗体産生細胞１２４、１２１と共局在される場合を含む。

図１３において説明される一部の他の実施態様では、共局在パラメーターは、組み合わせて、または排除モードで用いられる。典型的な例は、目的の所定の液滴集団の偽陽性ヒットの排除および／または精選である。所定の例では、液滴は、２つの信号は共局在されたが、３番目のものが排除されなければならない場合に選択される。典型的な例は、蛍光抗体１２３、１２０が蛍光標識抗体産生細胞と共局在されるが、蛍光標識レポーター細胞１２６に対してはそうでない場合であり、したがって、これらの２つの共局在イベントは排除される。別の典型的なケースは、蛍光抗体１２３、１２０が蛍光標識レポーター細胞１２４、１２１と共局在されて、蛍光標識抗体産生１２６、１２７と共局在しないはずである場合である。

測定ステップの間の別の例では、少なくとも３つの光信号が測定されて、複数の共局在パラメーターが、光信号の最大値の位置を２つずつ比較することによって計算される。

図６は、第一の波長チャンネルおよび第二の波長チャンネルに対応する２つの光学チャンネルに関して検出ラインＤを通過している唯一の液滴４に関して得られた測定の別の例を示す。

この例は、第一の光信号と第二の光信号の間の多重ピーク共局在パラメーターの計算を説明するためのものであり、それらの１つは、複数の極大値を含む。

それぞれの光信号は、異なる曲線９０、９２で表される。例えば、連続的なラインで表される曲線９０は、第一の可視光感受性検出器３８上で測定されて、第一のエレメント２６と関係がある第一の光信号に対応する。図４において点線で表わされる曲線９２は、第二の可視光感受性検出器３８上で測定されて、第二のエレメント２８と関係がある第二の光信号に対応する。それぞれの信号は、異なる蛍光チャンネルにおいて測定される。

この例では、第一の光信号は３つの極大値９４、９６、９８を含み、第二の光信号は極大値１００を含む。

計算機は、第一の光信号に関する複数の極大値９４、９６、９８の座標および第二の光信号の極大値１００の座標を計算する。

計算機は、第一の光信号と第二の光信号の間の多重ピーク共局在パラメーターを、以下のステップにより計算する：
− 第一の光信号のそれぞれの極大値９４、９６、９８については、計算機は、第二の信号の極大値１００の位置を第一の光信号の前記極大値９４、９６、９８の位置と比較することによって、中間共局在パラメーターｄ１、ｄ２、ｄ３を計算する、
− それから、計算機１４は、中間共局在パラメーターｄ１、ｄ２、ｄ３を比較して、多重ピーク共局在パラメーターΔは、最も低い中間共局在パラメーターである。

例では、３つの中間共局在パラメーターｄ１、ｄ２、ｄ３が計算される。中央極大値９６は、第二の光信号の極大値１００に最も近いように見える。多重ピーク共局在パラメーターΔは、中央極大値９４と第二の光信号の極大値１００の間で計算された中間共局在パラメーターｄ２である。

有利に、計算するステップ５４の間、計算されたパラメーターは、判定するステップ５６のため、および／または、さらなる利用のために、メモリ内に保管される。

判定するステップ５６の間、選択ユニット１６は、少なくとも共局在パラメーターを含む少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って、液滴４に関する分類クラスを決定する。

分類クラスの数は、アッセイおよび分類ユニットの可能性に依存する。少なくとも２つの分類クラスが存在する。

例えば、分類クラスは、維持するための液滴４のクラスである。例えば、分類クラスは、排除するための液滴４のクラスである。例えば、分類クラスは、サンプル液滴のクラスであり；分類クラスは、ポジティブコントロール液滴４のクラスまたはネガティブコントロール液滴のクラスである。

有利に、判定するステップ５６の間、計算されたパラメーターは、選択基準または閾値と比較される。有利に、判定するステップの間、少なくとも計算されたパラメーターは、予め決められた閾値と比較される。それに替えて、またはそれに加えて、一部の閾値は、モニターを介してユーザーによって手作業で判定される。判定するステップ５６において用いられる基準は、アッセイに適用され得る。

例えば、２つのパラメーターに対する選択のために、ドットプロットがモニター２０のスクリーン上に表される。２つの特定のパラメーターに関する閾値を同時に固定するために、ユーザーは、図８に図解されるようにヒューマン・マシン・インターフェイスを介して関係があるドットプロット内の選択または排除された液滴４の周りに選択ゲートを引くことができる。

例えば、判定するステップ５６は、いくつかのステップを含み、それぞれの選択ステップは、異なる基準に基づく選択に対応する。計算機によって計算されたそれぞれのパラメーターは、選択のために用いられ得る。液滴の分類クラスは、アッセイのために計画されたそれぞれの選択ステップ後に帰せられる。

有利に、ユーザーは、モニター２０を介して選択ステップの数およびタイプを変更することができる。あるいは、選択ステップの数およびタイプは、アッセイのタイプに関して選択ユニット１６において記憶される。

有利に、計算するステップ５４および判定するステップ５６は、並行して行われ得る。例えば、計算機１４は、排除された液滴に対して計算を行なうのを止める。無駄な計算を避けることによって、方法がより迅速であるのを助ける。

あるいは、全ての計算ステップは、判定ステップの前に行なわれる。

選択基準の一部の例を以下に説明する。

例えば、ステップにおいて、選択ユニットは、液滴４の集団を、液滴４内の２つのエレメント２６、２８間の高い共局在を有する液滴４に制限する。この選択は、それぞれのエレメント２６、２８と関係がある２つの信号間の共局在パラメーターに基づく。この選択は、例えば、２つのエレメント２６、２８間で結合が生じた場合に液滴４を選択するのに有用である。

その代わりに、またはそれに加えて、選択ユニットは、選択された集団から、液滴内の２つのエレメント間の高い共局在を有する液滴４を拒否する。この選択は、例えば、２つのエレメント間に結合が存在する場合に液滴４を拒否するのに有用である。例えば、そのような拒否は、細胞の集合体を含む液滴４を排除するのに有用である。例えば、抗体が分泌細胞の表面に結合される場合、抗原に関する抗体特異性を分析することは困難である。

例えば、ステップにおいて、選択ユニット１６は、液滴４の集団を、正しい幅を有する液滴４に制限する。

例えば、ステップにおいて、選択ユニットは、液滴４の集団を、エレメントを含む液滴４に制限する。この選択は、関係がある信号に関する全体的最大ピークの強度値および光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比に基づく。例えば、光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比および関係がある信号に関する全体的最大ピークの強度値に関して、閾値ゲート内である液滴４は維持される。

それから、分類するステップ５８の間、分類ユニット１８は、液滴４をそれらの分類クラスに従って分類する。それぞれの液滴４は、その分類クラスと関係がある分類領域３２へ配向される。

それから、さらなる反応または分析のために、液滴４またはそれらの内容物を集めることが可能である。

さらに、有利に、光信号、計算されたそれぞれのパラメーター、および／または、それぞれの分類基準は記憶される。したがって、これらのデータをさらなる分析に用いることが可能である。

さらに、当該方法は、測定するステップの間に、液滴４の写真をキャプチャーするステップを有利に含む。例えば、写真は、分類された液滴４のスナップショットである。例えば、写真は、目的の液滴４の一次元プロットである。

適用のより具体的な例がここで、本発明の利点を説明するために記載される。

以下の例は、液滴４が、いくつかの基準に従って分類され得ることを説明する。例は、図７および８によって説明される。

このアッセイの目的は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞１１６の表面標的１１４に結合することのできる抗体１１２を産生することが可能な抗体産生細胞１１０を含む液滴４を特異的に回収することである。そのような液滴は、図７において模式的に表わされる。したがって、抗体１１２信号が標的１１２と共局在するがＢ細胞１１６とはしない場合に液滴４を回収することが必要であり、液滴は、ＣＨＯ細胞１１４およびＢ細胞１１０の両方を含む。

アッセイにおいて、ＣＨＯ細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭによって染色される。アッセイに用いられるＣＨＯ細胞は、それらの表面において標的抗原を含む。Ｂ細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ Ｖｉｏｌｅｔによって染色される。

アッセイの全ての液滴４は、スルホローダミンＢのような液滴染色、および標識抗体検出試薬、例えば、抗−マウスＩｇＧ Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む。

図７および８の例において、液滴４の連続は、複数のポジティブコントロール液滴、それから、複数のネガティブコントロール液滴、および最後に、複数のサンプル液滴を含む。

計算機１４は、ドロップコードを、それぞれの液滴４に、検出領域３４内をそれが通過する順番に応じて関連付ける。事前に定義されたドロップコードは、複数のサンプル液滴の液滴に対応する。

ポジティブコントロール液滴４は、ＣＨＯ細胞、および、標的に結合することが可能であると知られる抗体を含む。ネガティブコントロール液滴４は、水性培地を含むが、ＣＨＯ細胞もＢ細胞も含まない。

４つの光信号は、検出アセンブリによって同時に測定される。

説明の単純化のために、ＣＨＯ ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ染色と関係がある光信号を緑色信号と呼び、Ｂ細胞ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ ｖｉｏｌｅｔ染色と関係がある光信号を紫色信号と呼ぶ。ドロップコードと関係がある光信号は橙色信号と呼ばれる。抗体結合検出試薬と関係がある光信号は赤色信号と呼ばれる。

橙色信号から、計算機は、液滴４の幅を計算する。赤色信号から、計算機は、以降は結合最大値と呼ばれる極大値の座標を計算する。紫色信号から、計算機は、以降はＢ細胞最大値と呼ばれる極大値の座標を計算する。緑色信号から、計算機は、以降はＣＨＯ最大値と呼ばれる極大値の座標を計算する。

判定ステップの間、特定の閾値よりも高いまたは別の特定の閾値よりも低い液滴幅を示している全ての液滴は、選択ユニットによって拒否される。これらの基準により、信号は、不純物または液滴４に起因して、それらの寸法が維持されないため、スクリーニングおよび分析することが難しい。これらの液滴４および不純物は、エマルションの不安定性または複数の連続する液滴４の自発的な合体から生じ得る。

判定ステップの間、残りの液滴のうち、赤色信号に関して、抗体結合試薬に対応して、閾値よりも高い結合最大値に関する強度を示している全ての液滴は、維持するための分類クラスと関連し、その他は、分離するためのクラスと関係がある。例えば、閾値は、バックグラウンド蛍光およびポジティブコントロール液滴４に基づく任意単位において、０．１である。このステップの後に、ネガティブコントロール液滴４は、分離するためのクラス内であり、ポジティブコントロール液滴は、分類クラス内である。サンプル液滴４は、分類クラス内であってよく、または分離するためのクラス内であってよいが、分類クラス内にあるサンプル液滴４のみが、判定するステップの最後にポジティブとして選択され得る。この基準により、標的に特異的な抗体を含む全ての液滴は、分類クラス内に維持される。例では、この基準により、サンプル液滴４のたった０．１６％が、この分類クラス内に維持された。

紫色信号に関して、Ｂ細胞に対応して、選択ユニット１６は、特定の閾値よりも下の最大強度を示している全ての液滴を、分離するための別のクラスに関連付ける。補足して、または代替して、選択は、図８に表わされるドットプロットゲーティングによってなされる。ドットプロットは、Ｂ細胞最大値の強度およびドロップコードに従って液滴４を表わす。ゲートは、低いドロップコードおよび０．０１Ｖ〜５Ｖに含まれるＢ細胞最大強度を有する液滴４を含む。この基準により、Ｂ細胞を有さない液滴４は排除される。例えば、この選択後、液滴４の１７％が分類クラス内に維持される。

緑色信号に関して、生きたＣＨＯ細胞に対応して、特定の閾値よりも下の最大強度を示している、分類するためのクラス内の全ての液滴は、分離するための別のクラスと関連付けられる。ドットプロットは、ＣＨＯ細胞最大値の強度およびドロップコードに従って液滴４を表わす。ゲートは、サンプルシリーズに対応する低いドロップコードおよび０．０１Ｖ〜５Ｖを含むＣＨＯ細胞最大強度を有する液滴４を含む。この基準により、ＣＨＯ細胞を有さない液滴４は維持されない。例えば、この基準により、液滴４のたった７０％が、分類クラス内に残る。

代替して、または補足して、紫色信号および緑色信号に対する選択は、同時になされる。ＣＨＯ最大強度およびＢ細胞最大強度に従って全ての液滴を表わしているドットプロットは、モニター上に表示される。ゲーティングは、分類するためのクラス内に維持される全ての液滴４が、ＣＨＯ細胞およびＢ細胞の両方を有するようになされる。

その後に、ＣＨＯ細胞に対応する緑色信号と結合に対応する赤色信号との間の共局在パラメーターが、残りの液滴に関して計算される。さらに、Ｂ細胞に対応する紫色信号と結合に対応する赤色信号との間の共局在パラメーターが、残りの液滴に関して計算される。さらに、Ｂ細胞に対応する紫色信号とＣＨＯ細胞に対応する緑色信号との間の共局在パラメーターが、残っている液滴に関して計算される。

それから、判定するステップ５６の間、赤色信号とＣＨＯ細胞の間に高い共局在パラメーターを有する液滴４が、分類クラス内に維持される。

それから、検出試薬とＢ細胞の間に高い共局在パラメーターを有する液滴４が拒否される。

最後に、ＣＨＯ細胞とＢ細胞の間に高い共局在パラメーターを有する液滴４が拒否される。この例では、結合試薬と共局在しているＣＨＯ細胞が、Ｂ細胞とも共局在するならば、偽陽性であり得るので液滴４は排除される。実際に、Ｂ細胞は、標的に結合されないが結合剤によって検出される抗体を分泌し得る。

このことは、ＣＨＯ細胞の表面標的に結合することのできる抗体を産生することが可能なＢ細胞を有する液滴４を排他的に含む分類クラス内の液滴４の特定の集団を導く。

それから、液滴４は、それらの分類クラスに基づいて分類された。

選択のそれぞれのステップにおいて、排除された液滴は、異なる分類クラスと関連付けられてよい。それは、液滴４に対していくつかの分析を行なうのを可能にする。例えば、ポジティブコントロール液滴４は、その後の分析のために回収され得る。

本発明は、既存のシステムよりも高い忠実性で特定の液滴を分析および選択するための方法を提供する。実際に、液滴４を多数の基準に従って分類することが可能である。他のパラメーターと組み合わせた共局在パラメーターは、エレメントの空間的な相対位置を分析するのに有用であり、アッセイの結果に対して影響を有し得る。

別の実施態様では、複数の液滴４は、エマルションである。液滴４は、測定ステップが行なわれるマイクロ流体チャンバー内に保管される。検出アセンブリ１２は、波長チャンネルに関する光強度分布を測定するように、チャンバー内のそれぞれの液滴４を空間的にスキャンするように適用される。

Claims (15)

1. 複数の液滴（４）のうち特定の液滴を分析および選択する方法であって、
   以下のステップ：
   − 複数の液滴（４）を提供するステップ、
   − 複数の液滴のうち液滴（４）について、少なくとも２つの光信号を測定するステップ、それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する前記液滴（４）内の光強度の空間分布の代表である、
   − 前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算するステップ、
   − 少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って液滴について分類クラスを判定するステップ、
   − 前記液滴をその分類クラスに従って分類するステップ、
   を含み、
   ここで前記の複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーター（Δ）を含み、前記の判定するステップに用いられる前記の少なくとも２つの計算されたパラメーターは、前記共局在パラメーター（Δ）を含む、
   方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   共局在パラメーター（Δ）は、前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号の最大強度に対応する位置を、前記の少なくとも２つの光信号のうち第二の光信号の最大強度に対応する位置と比較することによって計算される、
   方法。
3. 請求項１および２のいずれかに記載の方法であって、
   前記共局在パラメーター（Δ）は、９０％〜１００％の範囲の信頼区間を有することによって選択される、
   方法。
4. 請求項１から３のいずれかに記載の方法であって、
   前記の複数のパラメーターは、以下のパラメーター：
   − 液滴（４）の幅、
   − 光信号の積算、
   − 光信号の最大値と前記光信号の積算値の間の比、
   − 光信号に関する極大値の座標、
   − 光信号に関する液滴内の極大値の数、
   − 光信号の導関数の計算、および
   − 光信号に関する第二の導関数の計算
   の少なくとも１つを含む、
   方法。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
   前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号は、複数の極大値を含み、
   前記の複数のパラメーターは、極大値を含む第二の光信号および前記の第一の光信号の間で計算された多重ピーク共局在パラメーターを含み、
   前記多重ピーク共局在パラメーターは、以下のステップ：
   − 第一の光信号のそれぞれの極大値について、第一の光信号の前記極大値の位置と第二の信号の極大値の位置を比較することによって、中間共局在パラメーターを計算するステップ、
   − 前記の中間共局在パラメーターを比較するステップ、前記多重ピーク共局在パラメーターは、最も低い中間共局在パラメーターである、
   によって計算される、
   方法。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、
   液滴（６）内の共局在パラメーターは、前記液滴幅によって標準化される、
   方法。
7. 請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、
   前記の測定するステップは、前記の複数の液滴（４）の少なくとも２つの液滴（４）に関して行なわれて、前記の複数のパラメーターは、前記の２つの液滴（４）の間の間隔を含む、
   方法。
8. 請求項１から７のいずれかに記載の方法であって、
   前記の判定するステップの間、少なくとも１つの計算されたパラメーターが、予め決められた閾値と比較される、
   方法。
9. 請求項１から８のいずれかに記載の方法であって、
   前記の測定するステップの間、少なくとも３つの光信号が測定されて、複数の共局在パラメーターが、前記の光信号の最大値の位置を２つずつ比較することによって計算される、
   方法。
10. 請求項１から９のいずれかに記載の方法であって、
    以下のステップ：
    − 液滴（４）の流れに適応したチャンネル（３０）を備える器具（１）を提供するステップ、前記器具（１）は、検出領域（３４）、および分類領域（３２）を備える、
    − 前記の複数の液滴（４）が、前記チャンネル（３０）内を循環するステップ、
    − 前記検出領域（３４）内を流れる液滴（４）に関して測定を行なうステップ、
    をさらに含む、
    方法。
11. 請求項１から１０のいずれかに記載の方法であって、
    前記の測定するステップの間、前記液滴（４）の写真をキャプチャーするステップを含む、
    方法。
12. 請求項１から１１のいずれかに記載の方法であって、
    前記の複数の液滴（４）の少なくとも１つの液滴（６）は、第一のエレメント（２６）を含み、前記の第一のエレメント（２６）は、前記の少なくとも２つの光信号のうち第一の光信号と関係がある波長チャンネル内の蛍光であり、
    前記の複数の液滴（４）の少なくとも１つの液滴（４）は、第二のエレメント（２８）を含み、前記の第二のエレメント（２８）は、前記の少なくとも２つの光信号のうちの第二の光信号と関係がある第二の波長チャンネル内の蛍光である、
    方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、
    前記の第一および第二のエレメント（２６、２８）は、細胞、蛍光標識タンパク質、細胞標識化試薬、蛍光標識抗原、蛍光標識抗体、生物学的物質でコーティングされた粒子、核酸、ペプチドおよび化学薬物からなるエレメントの群内で選択される、
    方法。
14. 複数の液滴（４）のうち特定の液滴（４）を分析および選択するための器具（１）であって、
    − 液滴（４）について少なくとも２つの光信号を測定するように適応された検出アセンブリ（１２）、それぞれの光信号は、関係がある波長チャンネルに関する前記液滴（４）内の光強度の空間分布の代表である、
    − 前記の少なくとも２つの光信号から複数のパラメーターを計算するための、計算機（１４）、
    − 少なくとも２つの計算されたパラメーターに従って前記液滴（４）に関する分類クラスを判定するための、選択ユニット（１６）、
    − 前記液滴（４）をその分類クラスに従って分類するための、分類ユニット（１８）、
    を備え、
    ここで前記の複数のパラメーターは、それぞれの光信号に関する最大値の座標および共局在パラメーターを含み、前記の少なくとも２つの計算されたパラメーターは、前記共局在パラメーターを含む、
    器具。
15. 請求項１４に記載の器具（１）であって、
    前記検出アセンブリは、光源（３６）および少なくとも可視光感受性検出器（３８）を備える、
    器具。