JP4616360B2 - 粒子分析装置 - Google Patents

Description

この発明は、粒子分析装置に関し、主に血液や尿に含まれる細胞や有形成分の分析に用いられる。

この発明に関連する従来技術としては、次のようなものが知られている。反応セル内において生ずる化学発光の強度を光検出器によって検出するようにした化学発光検出装置において、前記反応セルの近傍に温度センサを設け、この温度センサによって得られた温度に基づいて前記化学発光の強度を補正するようにしたことを特徴とする化学発光検出装置（例えば、特許文献１参照）。発光試薬等の最終反応検出試薬を用いて化学反応検出を行うために、最終反応検出試薬液温度を測定する温度測定手段と、測定した最終反応検出試薬液温度に基づいて最終検出値に対し補正を行う補正手段とを具備してなることを特徴とする自動分析装置（例えば、特許文献２参照）。

特開平６−２０１５８５号公報 特開２００１−７４７４９号公報

試料中の細胞、血球等の粒子を分析する粒子分析装置の一例として、シースフロー方式を用いたフローサイトメータが用いられる。この方式では、ノズルから吐出された粒子含有液の周囲にシース液を流して試料液を形成することにより、シースフローセル内で粒子含有液を流体力学的に細く絞ることができる。そこで光学的測定を行うことにより、試料液中の粒子の計測や分析を行う。なお、「シースフロー」とは、オリフィスを層流状態で流れるシース液の中央部で粒子含有液をほぼ粒子の外径まで絞り、粒子を一列に整列させてオリフィスを通過させる流れ（試料液流）を言う。フローサイトメータに血液等の試料を染色液や溶血剤や反応試薬などで調製した試料液を流して、種々の細胞を分析することが行われている。

上記の光学的測定においては、試料液に光を照射し、その照射光によって試料液中の粒子から発生する光を受光素子で受光して電気信号に変換する。そして、その電気信号を増幅部で増幅した上で、その電気信号に基づいて粒子の分析を行うようにしている。しかしながら、試料液の温度が変化すると、粒子から発生する光の強度が変化して分析結果に悪影響を及ぼす。そのため、保温器などを用いて試料液を所定温度に厳密に管理しなければならないという問題点がある。この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、粒子含有液の温度を検出し、検出温度を受けて補正することにより、試料液の厳密な温度管理が不要な血球計数装置を提供するものである。

この発明は、血液を含む試料液を受入れて試料液流を形成するフローセルと、フローセル中の試料液流に光を照射する光源と、試料液中の血球からの光情報を検出して電気信号に変換する受光素子と、受光素子で得られた電気信号を増幅するアンプと、試料液の温度を検出する温度センサと、温度センサで検出された試料液の温度に基づいて、アンプで増幅された電気信号を補正する補正部と、補正部で補正された電気信号を処理して分析する分析部と、少なくとも網赤血球測定モードおよび白血球測定モードを設定するための測定モード設定部と、を備えた血球計数装置を提供するものである。ここで、試料液中の粒子からの光情報は、血球が光源からの照射光によって励起されて発する蛍光の情報を含み、補正部は、少なくとも網赤血球測定モードが設定された場合と白血球測定モードが設定された場合とで、蛍光の情報に基づく電気信号の補正内容を切り替える。

この発明によれば、粒子含有液の厳密な温度管理が不要な血球計数装置を提供することができる。

以下、図面に示す実施例に基づいてこの発明を詳述する。なお、各図面の共通の要素には共通の番号および記号を付している。ここでは、この発明の粒子分析装置の一例としてフローサイトメータを用いて説明している。これによってこの発明が限定されるものではない。

フローサイトメータの光学系
図1はこの発明の実施例に係るフローサイトメータ（ここでは血球計数装置に用いられているフローサイトメータ）の光学系を示す斜視図である。同図においてレーザダイオード２１から出射されたビームはコリメートレンズ２２を介してシースフローセル１を照射する。シースフローセル１を通過する血球から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介してフォトダイオード２６に入射する。

一方、シースフローセル１を通過する血球から発せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介してフォトマルチプライアチューブ２９に入射し、側方蛍光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ３６とピンホール板３０を介してフォトマルチプライアチューブ３１に入射する。フォトダイオード２６から出力される前方散乱光信号と、フォトマルチプライアチューブ２９から出力される側方散乱光信号と、フォトマルチプライアチューブ３１から出力される側方蛍光信号は、信号処理部３５に入力される。

フローサイトメータの流体系と測定・洗浄工程
図２は図１に示すフローサイトメータの流体系を示す系統図である。各部はチューブで接続されている。バルブは、通常は閉じられている。同図において、先ず洗浄工程においては、バルブ４１，５０が開かれ、シース液を収容したシース液チャンバー４２からシース液が圧力装置４３から印加される圧力Ｐによって送出され、バルブ４１と定量シリンジ４４とノズル６とを介して廃液チャンバー４５へ排出されると共に、バルブ５０とシースフローセル１とを介して廃液チャンバー４５に排出され、所定時間後にバルブ４１，５０が閉じられる。これによって、定量シリンジ４４，ノズル６，シースフローセル１およびその経路がシース液により洗浄される。

次に、測定工程においては、バルブ４６，４７が開かれ、血液含有液（粒子含有液）を試薬で反応させて収容する反応チャンバー４８から粒子含有液が吸引装置４９の負圧により吸引され、バルブ４６とノズル６間の経路が粒子含有液で満たされると、バルブ４６，４７が閉じられる。次に、バルブ５０が開かれると、シース液がシース液チャンバー４２から圧力装置４３の圧力によりシースフローセル１へ送出され、廃液チャンバー４５に排出される。

次に、バルブ４１が開かれると、圧力装置４３からの圧力Ｐは定量シリンジ４４を介してノズル６の先端へも伝達され、ノズル６の先端においてノズル外部のシース液の圧力とノズル内部の試粒子含有液の圧力とが平衡する。従って、この状態で定量シリンジ４４のピストン４４ｂがモータ４４ａにより吐出方向に駆動されると、バルブ４６とノズル６間に存在する粒子含有液はノズル６から容易に吐出され、シース液によって細く絞られて試料液となってシースフローセル１を通過し、廃液チャンバー４５へ排出される。この期間に試料液の光学的測定が行われる。そして、定量シリンジ４４のピストン４４ｂの駆動が終了すると、測定工程を終了する。

次に、モータ４４ａが逆転してピストン４４ｂが吸引方向に引き戻され、定量シリンジ４４は初期状態に復帰するが、この間にはバルブ４１，５０は開かれたままであるので、前述の洗浄工程が行われ、次の測定工程に備えられることになる。従って、他の反応チャンバー５１，５２，５３に収容された他の粒子含有液についてもバルブ５４，５５，５６を開閉して前述と同様の工程を順次実行することにより測定を行うことができる。なお、バルブ５７は廃液チャンバー４５から廃液を排出するバルブであり、必要に応じて開閉される。

フローサイトメータの光学情報処理
図３は、図１の信号処理部３５の構成を主に示すブロック図である。図３に示すように、信号処理部３５は分析部６０と流体駆動部６９と制御部７０と増幅部９０から構成される。分析部６０は、設定条件格納部６２、データ格納部６３、分布図作成部６４、抽出部６５、分画領域決定部６６、演算部６７から構成される。増幅部９０は、Ａ／Ｄ変換部７１、アンプ３２、３３，３４から構成される。Ａ／Ｄ変換部７１はアンプ３２，３３，３４で増幅された信号、つまり、電気信号に変換されて増幅された光学情報をＡ／Ｄ変換して、分析部６０へ入力する。

入力部６１は各種の数値や領域などの条件を予め設定するために、例えば、キーボードやマウスにより構成される。設定条件格納部６２は設定された各種条件を格納する。データ格納部６３はＡ／Ｄ変換された光学情報を格納する。分布図作成部６４はデータ格納部６３に格納された光学情報、つまり前方散乱光強度（Ｆｓｃ），側方散乱光強度（Ｓｓｃ），側方蛍光強度（Ｓｆｌ）の内いずれか２つのパラメータを用いて２次元分布図を作成する。抽出部６５は分布図作成部６４で作成された分布図から座標や領域を抽出する。

分画領域決定部６６は分布図作成部６４で作成される分布図において各粒子の分画領域を決定する。演算部６７は分画領域内の粒子数の計数を行う。そして、演算部６７の演算結果は分布図作成部６４で作成された分布図と共に表示部６８に表示される。流体系駆動部６９は図２に示すバルブ４１，４６，４７，５０，５４，５５，５６，５７およびモータ４４ａを駆動する。また、分析部６０と制御部７０はＣＰＵ，ＲＯＭ，ＲＡＭ等から一体構成される。

各測定モードによる血球測定
入力部６１において、検体ごとに「有核赤血球測定モード」，「白血球、好塩基球測定モード」、「白血球４分類測定モード」、「網赤血球測定モード」の４種類の測定モードのうちいずれかが設定される。設定に対応して、図示しない血液定量部にて定量された血液と、希釈液、染色液、溶血剤などの試薬とが、図２に示す反応チャンバー４８，５１，５２，５３の内の対応するチャンバーに収容されて所定の処理が施される。このように調製された血液含有液は、次のようにして順次測定される。

「有核赤血球測定モード」では、血液１８μＬがストマトライザーＮＲ溶血剤（シスメックス（株）製）８８２μＬとともに反応チャンバー４８に運ばれる。そしてストマトライザーＮＲ染色液（シスメックス（株）製）１８μＬが添加される。この状態で約７秒間反応させることで、赤血球が溶血し、白血球・有核赤血球が染色される。この処理が施された粒子含有液は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方蛍光（Ｓｆｌ）と前方散乱光（Ｆｓｃ）とを二次元分布図にした例が図４である。有核赤血球が赤血球および白血球から分画されて測定される。

「白血球、好塩基球測定モード」では、血液１８μＬがストマトライザーＦＢ（II）（シスメックス（株）製）８８２μＬとともに図２に示す反応チャンバー５１に運ばれる。この状態で約１４秒間反応させることで、赤血球が溶血し、好塩基球以外の白血球が裸核化・収縮される。この処理が施された粒子含有液は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方散乱光（Ｓｓｃ）と前方散乱光（Ｆｓｃ）とを二次元分布図にした例が図５である。好塩基球とその他の白血球（リンパ球＋単球＋好中球＋好酸球）が分画されて測定される。

「白血球４分類測定モード」では、血液１８μＬがストマトライザー４ＤＬ（シスメックス（株）製）８８２μＬとともに図２に示す反応チャンバー５２に運ばれる。そしてストマトライザー４ＤＳ（シスメックス（株）製）１８μＬが添加される。この状態で約２２秒間反応させることで、赤血球が溶血し、白血球が染色される。この処理がされた粒子含有液は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方散乱光（Ｓｓｃ）と側方蛍光（Ｓｆｌ）とを二次元分布図にした例が図６である。白血球がリンパ球、単球、好中球＋好塩基球、好酸球とに分画されて測定される。

「網赤血球測定モード」では、血液４．５μＬがレットサーチ（II）希釈液（シスメックス（株）製）８９５．５μＬとともに図２に示す反応チャンバー５３に運ばれる。そしてレットサーチ（II）染色液（シスメックス（株）製）１８μＬが添加される。この状態で３１秒間反応させることで、網赤血球等が染色される。この処理がされた粒子含有液は定量シリンジ４４によって、ノズル６から吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側方蛍光（Ｓｆｌ）と前方散乱光（Ｆｓｃ）とを二次元分布図にした例が図７である。網赤血球が成熟赤血球と血小板とから分画されて測定される。

シースフローセルの温度センサ
図８はシースフローセル１を示す断面図であり、シースフローセル１は、整流部１１と、加速部１２と、オリフィス部１３とからなる。整流部１１は円筒状の貫通孔を有し、加速部１２はオリフィス部１３に向かって径が徐々に小さくなる円錐状の貫通孔を有する。シースフローセル１のオリフィス部１３は図９のように粒子測定用の光Ｌを照射し、通過する粒子の前方散乱光Ｆｓｃ、側方散乱光Ｓｓｃ、および側方蛍光Ｓｆｌ を精度よく得るために、断面が正方形の透明な角筒で構成される。

図８に示すようにシースフローセル１は固定具５に固定されると共に、ノズル６は先端が整流部１１と加速部１２との境界に達するようにシースフローセル１に挿入され、整流部１１と同軸になるように固定具５に固定されている。一方、シースフローセル１のオリフィス部１３の出口には、流路７ａを有するセンサ設置部材７が接続されている。センサ設置部材７には温度センサ８とニップル９が設けられ、オリフィス部１３から流路７ａに導入された試料液が温度センサ８に接触した後に、ニップル９から排出されるようになっている。ここでは、温度センサ８としてサーミスタ（芝浦電子（株）製のＰＢ３Ｍ−３５−ＴＩ型）を用いている。

そこで、図８に示すように、固定具５の流入口５ａから流入したシース液は整流部１１で整流され、加速部１２で加速される。ノズル６に矢印Ｂ方向から流入した粒子含有液は、ノズル６の先端からオリフィス部１３に向って噴射されると、加速されたシース液に包まれ試料液となってオリフィス部１３を通過する。試料液にビームＬが照射され、試料液中の粒子から生じる光が、図１に示すようにフォトダイオード２６、フォトマルチプライアチューブ２９，３１により検出される。

オリフィス部１３を通過した試料液はセンサ設置部材７において温度センサ８によりその液温が検出され、ニップル９から矢印Ｃ方向に排出される。温度センサ８は、この実施例のように、試料液中に露出するようにシースフローセル１の出口に設置されてもよいし、シースフローセル1の入口や近傍に設けられてもよい。言い換えると、温度センサ８は、検出する試料液の温度がオリフィス部１３を通過する試料液の温度と実質的に同じ温度である位置に取り付けられていればよい。

なお、この実施例のように、シース液の量が粒子含有液の量に比べて十分多い場合には、粒子含有液の温度として試料液（粒子含有液とシース液の混合液）またはシース液の温度を用いることができる。シース液以外の液体でも同様のことが言える。すなわち、この発明において、粒子含有液の温度とは、セル内の液体の温度のことをいい、試料液の温度であってもよいし、粒子含有液とともに用いられる液体（例えばシース液）の温度であってもよい。そして、粒子含有液の温度は、セル内の液体の温度と実質的に同じ温度であれば、セルの外で検出されてもよい。

測定値の温度補正
図１０は、図３の要部詳細図であり、Ａ／Ｄ変換部７１は、１０ビットのＡ／Ｄコンバータ８１，８２，８３，８４と１２ビットのＤ／Ａコンバータ８０，８５とを備える。Ａ／Ｄコンバータ８１，８２，８３は、それぞれアンプ３２，３３，３４の出力をＡ／Ｄ変換して制御部７０へ入力する。温度センサ８、つまりサーミスタへは制御部７０から抵抗Ｒを介して直流電圧が印加され、温度センサ８の端子電圧（温度検出電圧）はＡ／Ｄコンバータ８４によりＡ／Ｄ変換されて制御部７０へ入力される。

Ａ／Ｄコンバータ８３には、ローレベル・リファレンス電圧ＲＬとして０．５Ｖの一定電圧が制御部７０からＤ／Ａコンバータ８０を介して入力され、ハイレベル・リファレンス電圧ＲＨとして制御電圧が制御部７０から入力される。なお、Ａ／Ｄコンバータ８１，８２，８４についても、それぞれ一定のローレベルおよびハイレベル・リファレンス電圧（図示しない）が制御部７０から入力される。

図１１は温度センサ８で検出される温度に対する側方蛍光の測定値の補正曲線（実測値）を示し、温度（℃）に対する制御電圧（１２ビットデジタル値）の関係を表している。曲線（ａ）は測定対象が網赤血球の場合であり、曲線（ｂ）は白血球または有核赤血球の場合である。図１１において、横軸をｘ、縦軸をｙとして、温度２３℃を原点（０℃）とすると、曲線（ａ），（ｂ）はそれぞれ次式で近似される。

ｙ＝４．４８３８ｘ²−６４．８１５ｘ＋３０３１…（Ａ）
ｙ＝５．７１６９ｘ²−８８．９１９ｘ＋３０３１…（Ｂ）
そして、式（Ａ），（Ｂ）は共に制御部７０の格納部７０ａに予め格納される。そこで、前述の「網赤血球測定モード」において、側方蛍光（ｓｆ１）を測定する場合には、温度センサ８によって検出された試料液の温度がＡ／Ｄコンバータ８４を介して制御部７０に入力される。

制御部７０の演算部７０ｂにおいて、式（Ａ）に基づいて、対応する制御電圧（１２ビットデジタル値）が演算され、Ｄ／Ａコンバータ８５へ入力される。Ｄ／Ａコンバータ８５はその制御電圧をアナログ電圧に変換し、ハイレベル・リファレンス電圧ＲＨとしてＡ／Ｄコンバータ８３へ入力する。Ａ／Ｄコンバータ８３はアンプ３４のアナログ出力電圧をデジタル値に変換して分析部６０に入力する。ここで、Ａ／Ｄコンバータ８３においては、ハイレベル・リファレンス電圧ＲＨとローレベル・リファレンス電圧ＲＬとの間の値の入力アナログ電圧が１０ビットのデジタル値に変換されて出力される。従って、Ａ／Ｄコンバータ８３のアナログ入力対デジタル出力の比、つまり増幅度Ａは、ＲＨとＲＬとの差（ＲＨ−ＲＬ）によって決定される。

なお、ローレベル・リファレンス電圧ＲＬは０．５Ｖで一定であるので、増幅度Ａはハイレベル・リファレンス電圧ＲＨ、つまり式（Ａ）で決定された制御電圧により制御され、温度センサ８の検出温度により側方蛍光の測定値（ｓｆ１）が補正されることになる。また、前述の「有核赤血球測定モード」および「白血球４分類測定モード」において、側方蛍光（ｓｆ１）を測定する場合には、式（Ｂ）を用いて、同様に側方蛍光の測定値（ｓｆ１）が温度センサ８の検出温度に基づいて補正される。

このようにして、試料液の温度によって変動する側方蛍光の測定値が適正に補正されるので、フローサイトメータは常に精度の高い分析を行うことができる。なお、この実施例においては、蛍光についてのみ補正を行ったが、前方散乱光や側方散乱光について補正を行ってもよい。また、この実施例においては、受光素子で得られた電気信号を増幅することによって補正を行ったが、温度センサの出力を受けて、分析部で得られた分析結果を補正するようにしてもよい。なお、この実施例ではフローサイトメータを用いて説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、粒子含有液をセルに入れ、粒子のブラウン運動の速度から粒径を算出する粒子分析装置などにも適用可能である。

この発明に係るフローサイトメータの構成を示す斜視図である。 この発明に係るフローサイトメータの流体系を示す系統図である。 この発明に係るフローサイトメータの信号処理部を主に示すブロック図である。 この発明の実施例における分布図を示す例である。 この発明の実施例における分布図を示す例である。 この発明の実施例における分布図を示す例である。 この発明の実施例における分布図を示す例である。 この発明に係るシースフローセルの縦断面図である。 この発明に係るシースフローセルの横断面図である。 図３の要部詳細図である。 この発明に係る温度と制御電圧との関係を示すグラフである。

符号の説明

１ シースフローセル
５ 固定具
５ａ 流入口
６ ノズル
７ センサ設置部財
７ａ 流路
８ 温度センサ
９ ニップル
１１ 整流部
１２ 加速部
１３ オリフィス部
２１ レーザダイオード
２２ コリメートレンズ
２４ 集光レンズ
２５ ピンホール板
２６ フォトダイオード
２７ 集光レンズ
２８ ダイクロイックミラー
２９ フォトマルチプライアチューブ
３０ ピンホール板
３１ フォトマルチプライアチューブ
３２ アンプ
３３ アンプ
３４ アンプ
３５ 信号処理部
３６ フィルタ
４１ バルブ
４２ シース液チャンバー
４３ 圧力装置
４４ 定量シリンジ
４４ａ モータ
４４ｂ ピストン
４５ 廃液チャンバー
４６ バルブ
４７ バルブ
４９ 吸引装置
５０ バルブ
５１ 反応チャンバー
５２ 反応チャンバー
５３ 反応チャンバー
５４ バルブ
５５ バルブ
５６ バルブ
５７ バルブ

Claims (5)

1. 血液を含む試料液を受入れて試料液流を形成するフローセルと、
   フローセル中の試料液流に光を照射する光源と、
   試料液中の血球からの光情報を検出して電気信号に変換する受光素子と、
   受光素子で得られた電気信号を増幅するアンプと、
   試料液の温度を検出する温度センサと、
   温度センサで検出された試料液の温度に基づいて、アンプで増幅された電気信号を補正する補正部と、
   補正部で補正された電気信号を処理して分析する分析部と、
   少なくとも網赤血球測定モードおよび白血球測定モードを設定するための測定モード設定部と、を備え、
   試料液中の血球からの光情報は、血球が光源からの照射光によって励起されて発する蛍光の情報を含み、
   補正部は、少なくとも網赤血球測定モードが設定された場合と白血球測定モードが設定された場合とで、蛍光の情報に基づく電気信号の補正内容を切り替える、血球計数装置。
2. 測定モード設定部は、さらに有核赤血球測定モードを設定可能である、請求項１に記載の血球計数装置。
3. 白血球測定モードは、試料液中の白血球を分類するモードである、請求項１に記載の血球計数装置。
4. 補正部は、アンプで増幅された電気信号が入力されるA/D変換部と、
   温度センサで検出された試料液の温度に基づいて、A/D変換部の入出力比を制御する制
   御部と、を備える請求項１〜３の何れか１項に記載の血球計数装置。
5. 制御部は、温度センサで検出された試料液の温度に基づいて、A/D変換部の入出力比を
   制御するための関係式を予め格納したメモリを備える、請求項４に記載の血球計数装置。

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