JP5324456B2 - 化学物質の消化管吸収を評価するための安定的細胞株および方法 - Google Patents
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Description
ヒト大腸腺癌に由来するCaco−2細胞は腸吸収試験で広く用いられているモデルである。Caco−2細胞は成長し分化すると形態学的には腸細胞と同様であり、小腸刷子縁にある酵素の多くを発現し、従って小腸の環境および機能に酷似している。Caco−2細胞は腸吸収研究に対しさらに利益を提供し、P−gp(Hunter Jら(1993)J.Biol.Chem.268:14991〜7)、MRPタンパク質(Hirohashi Tら(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.292:265〜70;Gutmann Hら(1999)Pharm.Res.(NY)16:402〜7)、およびBCRP(Xia CQら(2005)Drug Metab.Dispos.33:637〜43)など少なくとも三つの排出輸送体タンパク質を発現する。
薬剤吸収研究のためには、薬剤排出輸送タンパク質が吸収障害に及ぼす作用を評価するのが望ましい。これは輸送体、とりわけP−gpの発現または活性を抑制することによって達成可能である。一般に、シクロスポリンAなどの化学物質がP−gpの活性阻害に用いられる。輸送体の化学的抑制は、それらの化学物質が他の細胞タンパク質および機能をも抑制し、したがって吸収実験の結果をゆがめかねない点で不都合である。最近、Caco−2細胞におけるP−gpの発現がRNAi技術により低下することが示され(Watanabe Tら(2005)Pharm.Res.22:1287〜93)、Caco−2細胞における多剤耐性遺伝子1(MDR1)の発現がRNAi技術により低下することが示された(Cellius Tら(2004)Biochem.Biophys.Res.Comm.324:365〜71)。RNAiによるP−gp発現抑制が、P−gpによる輸送化合物の細胞内蓄積を促進し、同化合物に対する感受性を回復させた(Wu Hら(2003)CancerRes.63:1515〜19)。Caco−2細胞におけるP−gpの遺伝的下方制御は化学抑制剤の使用に比べれば進歩であるが、本モデルにおける薬剤吸収研究は、P−gp発現のノックダウンのみではMRPやBCRPなどの現存輸送体の薬剤排出および吸収障害への寄与を説明できない点において不利である。さらに、生体外で合成され細胞内に直接トランスフェクションされるshRNAは、遺伝子発現を一時的にのみ低下させ、発現は核酸導入から数日後に回復する。さらに、生体外で合成されるshRNAは多くの場合容易にトランスフェクションされる細胞に限定され、数代にわたる細胞継体培養後における遺伝子発現抑制の安定性についてはほとんど知られていない。
主要化合物の腸吸収を正確に評価し予想するためには、あらゆる排出輸送タンパク質の相対的寄与率を明らかにし制御するのが望ましい。同様に、そのような輸送タンパク質の発現および/または機能をより永続的に遺伝子制御するためには、安定的細胞株を産生、利用するのが望ましい。本発明はこれらの長年の課題に取り組むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献1】 米国特許第5872014号
【特許文献2】 国際公開第WO2006/021894
【非特許文献】
【非特許文献1】 Artursson,P.et a1.,"Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelia1(Caco−2)cells,"Biochem.Biophys.Res.Commun.,1991,175(3),880−885
【非特許文献2】 Baker,B.F.et a1.,"Novel mechanisms for antisense−mediated regulation of gene expression,"Biochim.Biophys.Acta.,1999,1489,3−18
【非特許文献3】 Balimane,P.V.et a1.,"Current industrial practices of assessing permeability and P−glycoprotein interaction,"AAPS J.,2006,8,E1−E13
【非特許文献4】 Bernstein,E.et a1.,"Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference,"Nature,2001,409(6818),363−366
【非特許文献5】 Borst,P,et a1.,"A family of drug transporters:the multidrug resistance−associated proteins,"J.Natl.Cancer Inst.,2000,92、1295−1302
【非特許文献6】 Brummelkamp,T.R.et a1.,Science,2002,296,550−553
【非特許文献7】 Celius,T.et a1.,"Stable suppression of MDR1 gene expression and function by RNAi in Caco−2 cells,"Biochem.Biophys.Res.Comm.,2004,324,365−371
【非特許文献8】 Cline,M.J.,"Perspectives for gene therapy:inserting new genetic information into mammalian cells by physical techniques and viral vectors,"Pharmac.Ther.,1985,29,69−92
【非特許文献9】 Cotten,M.et a1.,"Ribozyme mediated destruction of RNA in vivo,"EMBO J.,1989,8(12),3861−3866
【非特許文献10】 Denhardt,D.T.,"Mechanism of action of antisense RNA.Sometime inhibition of transcription,processing,transport,or translation,"Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,
70−76
【非特許文献11】 Doyle,L.A.et a1.,"A multidrug resistance transporter from human MCF−7 breast cancer cells,"Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1998,95(26),15665−15670
【非特許文献12】 GenBank Accession No.NM_004827
【非特許文献13】 Germann,U.A.,"P−glycoprotein−−a mediator of multi drug resistance in tumour cells,"Eur.J.Cancer,1996,32A,927−944
【非特許文献14】 Grishok,A.et a1.,"Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small tempora1 RNAs that contro1 C.elegans developmenta1 timing,"Ce11,2001,106,23−24
【非特許文献15】 Gutmann,H.et a1.,"Evidence for different ABC−transporters in Caco−2 cells modulating drug uptake,"Pharm.Res.(NY),1999,16,402−407
【非特許文献16】 Hirohashi,T.et a1.,"Function and expression of multidrug resistance−associated protein family in human colon adenocarcinonma cells(Caco−2),"J.Pharmaco1.Exp.Ther.,2000,292,265−270
【非特許文献17】 Hunter,J.et a1.,"Functional expression of P−glycoprotein in apical membranes of human intestinal Caco−2 cells.Kinetics of vinblastine secretion and interaction with modulators,"J.Bio1.Chem.,1993,268(20),14991−14997
【非特許文献18】 Hutvagner,G.et a1.,"A cellular function for the RNA−interference enzyme Dicer in the maturation of the let−7 small temporal RNA,"Science,2001,293,834−838
【非特許文献19】 J.Polli and C.Serabjit−Singh,in"Pharmaceutica1 Profiling in Drug Discovery for Lead Selection,"R.T.Borchardt et a1.,eds.,pp.235−255,Am.Assoc.Pharm.Scientists,Arlington,VA,2004
【非特許文献20】 Jain,K.K.,"RNAi and siRNA," Pharmacogenomics,2004,5(3),239−242
【非特許文献21】 Ketting,R.F.et a1.,"Dicer functions in RNA interference and in synthesis of sma11 RNA involved in developmental timing in C.elegans,"Genes Dev.,2001,15(20),2654−2659
【非特許文献22】 Lagos−Quintana M.et al,"Identification of novel genes codin for small expressed RNAs Science,2001,294(5543),853−858
【非特許文献23】 Lee,V.H.,"Mucosal drug delivery,"J.Natl.Cancer Inst.Monogr.,2001,29,41−44
【非特許文献24】 McManus,M.T.et a1.,Gene silencing using micro−RNA designed hairpins,"RNA,2002,8(6),842−850
【非特許文献25】 Miyagashi,M.et a1.,"U6 promoter−driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression inmammalian cells,"Nat.Biotech.,
2002,20( 5),49−500
【非特許文献26】 Mizuno,N.et a1.,"Impact of drug transporter studies on drug discovery and development,"Pharmacological Rev.,2003,55(3),425−461
【非特許文献27】 Neilsen,P.E.,"Applications of peptide nucleic acids,"Curr.Opin.Biotech.,1999,10,71−75
【非特許文献28】 Nellen,W.et a1.,"What makes an mRNA anti−sense−itive?"Trends Biochem.Sci.,1993,18(11),419−423
【非特許文献29】 Paddison,P.J.et a1.,"Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence−specific silencing in mammalian cells,"Genes and Dev.,2002,16(8),948−958
【非特許文献30】 Pasquinelli,A.E.,"MicroRNAs:deviants no longer,"Trends Gen.,2002,18(4),171−173
【非特許文献31】 Paul,C.P.et a1.,"Effective expression of small interfering RNA in human cells,"Nat.Biotechno1.,2002,20(5),505−508
【非特許文献32】 Staud,F.et a1.,"Breast cancer resistance protein(BCRP)/ABCG2,"Int.J.Biochem.Ce11 Biol.,2005,37(4),720−725
【非特許文献33】 Stephens,R.H.et a1.,"Kinetic profiling of P−glycoprotein−mediated drug efflux in rat and human intestinal epithelia,"J.Pharmaco1.Exp.Ther.,2001,296(2),584−591
【非特許文献34】 Sui,G.et a1.,"A DNA vector−based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99(8),5515−5520
【非特許文献35】 Troutman,M.T.,"Novel experimental parameters to quantify the modulation of absorptive and secretory transport of compounds by P−glycoprotein in cell culture models of intestinal epithelium,"Pharm.Res.,2003,20(8),1210−1224
【非特許文献36】 Tuschl,T.,"Expanding sma11 RNA interference,"Nat.Biotechno1.,2002,20(5),446−448
【非特許文献37】 U.S.Food and Drug Adminstration(FDA),"Drug Development and Drug Interactions,"May 1,2006,retrieved online at URL http://www.fda.gov/cder/drug/drugInteractions/default.htm
【非特許文献38】 Usman,N.et a1.,"Hammerhead ribozyme engineering,"Curr.Opin.Struct.Bio1.,1996,6(4),527−533
【非特許文献39】 Van Asperen,J.et a1.,"The pharmacological role of P−glycoprotein in the intestinal epithelium,"Pharmacol.Res.,1998,37(6),429−435
【非特許文献40】 Van Breemen,R.B.et a1.,"Caco−2 cell permeability assays to measure drug absorption,"Expert Opin.Drug Metab.Toxico1.,2005,1(12),175−185
【非特許文献41】 Varga,L.V.et a1.,"Antisense strategies:functions and applications in immunology,"Immun.Lett.,1999,69(2),217−224
【非特許文献42】 Wagner,R.W.,"The state of the art in antisense research,"Nat.Medicine,1995,1,1116−1118
【非特許文献43】 Wakasugi,H.et al.,"Effect of clarithromycin on renal excretion of digoxin:interaction with P−glycoprotein,"Clin.Pharmaco1.Ther.,1998,64,123−128
【非特許文献44】 Wang,Q.et a1.,"Evaluation of the MDR−MDCK ce1l line as a permeability screen for the blood−brain barrier,"Int.J.Pharmaceutics,2005,288(2),349−359
【非特許文献45】 Watanabe,T.et a1.,"Construction of a functional transporter analysis system using MDR1 knockdown Caco−2 cells,"Pharm.Res.,2005,22(8),1287−1293
【非特許文献46】 Waterhouse,P.M.et a1.,"Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(23),13959−13964
【非特許文献47】 Watson,C.J.et a1.,"Functional modeling of tight junctions in intestinal ce11 monolayers using polyethylene glycol oligomers,"Am.J.Physiol.Cell Physiol.,2001,281,C388−C397
【非特許文献48】 Weinstein,K.et a1.in"Pharmaceutica1 Profiling in Drug Discovery for Lead Selection,"R.T.Borchardt et a1.,eds.,pp.217−234,Am.Assoc.Pharm.Scientists,Arlington,VA,2004
【非特許文献49】 Westpha1,K.et a1.,"Oral bioavailability of digoxin is enhanced by talinolo1:evidence for involvement of intestina1 P−glycoprotein,"Clin.Pharmacol.Ther.,2000,68,6−12
【非特許文献50】 Woolf,T.M.,"The stability,toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos,"Nucleic Acids Res.,1990,18(7),1763−1769
【非特許文献51】 Wright,S.et a1.,"Molecular and cellular physiology of renal organic cation and anion transport,"Phsyio1.Rev.,2004,84(3),987−1049
【非特許文献52】 Wu,H.et a1.,"Small interfering RNA−induced suppression of MDR1(P−glycoprotein)restores sensitivity to multidrug−resistant cancer cells,"Cancer Res.,2003,63(7),1515−1519
【非特許文献53】 Xia,C.Q.et a1.,"Expression,localization,and functional characteristics of breast cancer resistance protein in Caco−2 cells,"Drug Metab.Dispos.,2005,33(5),637−643
【非特許文献54】 Yu,J−Y.et al.,"RNA interference by expression of short−interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells,"Proc.Nat1.Acad.Sci,2002,99(9),6047−6052
【非特許文献55】 Zeng,Y.et a1.,"Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells,"Mo1.Ce11,2002,9(6),1327−1333
【非特許文献56】 Zhang,L.et a1.,"Scientific perspectives on drug transporters and their role in drug interactions,"Molecular Pharmaceutics,2006,3,62−69
【非特許文献57】 Stage Alexander et al.,"Stable and complete overcoming of MDR1/P−g1ycoprotein−mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference."Cancer Gene Therapy Nov.2004,vol.11,no.11,November(2004−11),699−706
【非特許文献58】 Lee et al.,"siRNA−Getting the messageout"European Journal of Pharmaceutical Sciences,Elsevier,Amsterdam
,NL,vol.27,no.5,1 Apri1,2006(2006−04−01),401−410
【非特許文献59】 Morris Kevin et al.,"Lentivirus−mediated RNA interference therapy for human immunodeficiency virus type 1 infection."Human Gene Therapy May 2006,vol.17,no5,May 2006(2006−05),479−486
【非特許文献60】 Wiznerowicz Maciej et al.,"Tuning silence:conditional systems for RNA interference."Nature Methods Sep.2006,vol.3,no.9,September.2006(2006−09),682−688
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
肝細胞と脳毛細血管内皮細胞は上皮細胞と、密着結合および膜輸送タンパク質の非対称的発現など、特定の特徴を共有している。多くの上皮細胞は、身体外部で培養した場合にもこの非対称的方向性を保持する。これにはコラーゲンコーティングされたプラスチック製品の使用や一つ若しくはそれ以上の異化誘導性タンパク質またはホルモンの細胞培地への追加など、特別のインビトロ培養条件が必要とされることがある。他の特殊化した培養条件が当業者に知られており、用意に実践される。
たとえば配列ID番号:6〜8など、膜排出輸送タンパク質の全核酸配列などの核酸配列情報が利用できることにより、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の作成が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 38A DNA Synthesizerまたは同様の装置で採用されたホスホラミダイト法によって作成可能である。生じた構築物は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など本分野で周知の方法に従って精製可能である。こうして作成された合成DNA分子を続いてクローン化し、適切なベクター中で増幅することができる。
通常、トランスジェニック宿主細胞産生キットには一つ若しくはそれ以上の適切なベクターおよび当該ベクターを用いたトランスジェニック細胞産生に関する説明が含まれる。キットにはさらに別の成分が一つ若しくはそれ以上含まれ、2〜3例を挙げると細胞培養用培地、細胞の形質転換用試薬、遺伝子発現または調節のためのトランスジェニック細胞試験用試薬などである。
細胞株。本明細書に記載した実験においては親細胞株C2BBel(ATCCアクセス番号CRL−2102)を用いて候補となる薬剤分子の吸収ポテンシャルを評価した。C2BBel細胞株は1988年に希釈を制限することによって前記Caco−2細胞株から抽出された。前記クローンは形態的均質性およびビリンの頂部局在に基づいて選択した。C2BBel細胞は、形態的にヒト大腸のものに匹敵する頂部刷子縁(BB)を伴った極性単層を形成する。単離されたBBsには微絨毛タンパク質ビリン、フィンブリン、スクラーゼ−イソマルターゼ、BBミオシン−1、および末端網タンパク質であるフォドリンおよびミオシンIIが含まれる。前記細胞はヒト腸細胞のものと同様の相当レベルのBBミオシン−1を発現する。これらの細胞はクローン性であり、BB発現に関しては親Caco−2細胞株よりもはるかに均質であるが、微絨毛の長さ、微絨毛の凝集、特定のBBタンパク質の発現レベルに関しては依然不均一である。
Papp=(dCr/dt) x Vr/(A x Cd0)
回収率=100 x ((Vr x Crfinal) + (Vd x Cdfinal))/(Vd x Cd0))
ここで、dCr/dtは時間に対するレシーバー部分における蓄積濃度、VrはCm3で表したレシーバー部分の量、VdはCm3で表したドナー部分の量、Aは細胞単層の面積(12ウェルTranswellに対し1.13cm2)、Cd0は0時間における投与溶液の濃度、Crfinalは培養時間終了時の蓄積レシーバー濃度、Cdfinalは培養時間終了時のドナーの濃度である。
干渉核酸配列をMISSION(商標)shRNAヒト腫瘍抑制レンチウイルス形質導入粒子(Sigma−Aldrich、ミズーリ州St.Louis)にサブクローンした。メーカーのプロトコルに基づき、干渉配列(配列ID番号1、2、3、4、または5)を有するレンチウイルスを用いてC2BBel細胞の形質導入を行った。要約すれば、C2BBel細胞を96ウェルプレートに播種し(細胞培地(90%DMEM+10%FBS)中に一ウェル当たり細胞1.6 x 104個)、形質導入前に37℃で24時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を0.5、1.0、または5.0MOI(multiplicity of infection:感染の多重度)でウェルに加え、細胞と共に37℃で24時間インキュベートした。この培養後に非結合のレンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から48時間後、ピューロマイシン10μg/mLを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後3〜4日ごとに交換した。MOI 1.0で生成された5つのピューロマイシン耐性分離株が個々の細胞クローンとして作成され、shRNA/P−gpクローン#83、84、85、86、および87(これらのクローンはそれぞれ配列ID番号1、2、3、4、または5を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する)が生じた。5つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。shRNA/P−gpクローン#83および85は2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801 University Blvd.,バージニア州Manassas、20110−2209)に登録され、それぞれアクセス番号PTA−8752及びPTA−8753が割り当てられた。
ノックダウン細胞(shRNA/P−gpクローン#83、84、85、86、および87)におけるP−gpの遺伝子発現を、P−gp mRNA量、タンパク量、およびタンパク質機能活性を観察することにより究明した。RT−PCRを用いてP−gp mRNAの発現を測定した。P−gp mRNAに特異的なプライマーを用いて総細胞RNAを採取、増幅した。続いてRT−PCR産物を2%アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。5つのshRNA/P−gpクローン細胞のうち4つにおいて、P−gp mRNA量は対照のC2BBel細胞に比べ大幅に少なかった(図2、上部パネル)。同時にβアクチンが陽性対照として増幅され、その発現は干渉shRNAによる影響を受けなかった(図2、下部パネル)。
本実施例に関しては、C2BBel細胞におけるMRP2の遺伝子発現を、ウイルスによる形質導入後のMRP2 mRNA量と細胞のタンパク質含有量の両方を観察することにより測定した。mRNA量を検査するため、総細胞RNAを採取し、MRP2遺伝子に特異的なプライマー(配列ID番号11および12)を用いてRT−PCRにより増幅した。続いて、2%アガロースゲルを用いた電気泳動で分離後、RT−PCR産物を分析した。
MRP2のノックダウン発現を標的とするため、干渉RNAをコードする核酸インサート(配列ID番号17、18、19、20、または21)を含むレンチウイルスを用いてC2BBel細胞の形質導入を行った。これらの実験から、測定可能なMRP2ノックダウンを達成するためには、MRP2を標的としたshRNA(shRNA/MRP2)の方がBCRPを標的としたshRNA(shRNA/BCRP)およびP−gpを標的としたshRNA(shRNA/P−gp)よりも高いMOIsおよびレンチウイルスによる長い培養時間を必要とすることが示された。MOIs(感染の多重度)を0.5から10まで試行の結果、RT−PCR分析により、高効率のMRP2ノックダウンのためにはMOI 10が最適であることが示された。形質導入実験において、shRNA/MRP2ウイルス粒子の培養時間も2日に延長した。他の実験条件は全て実施例2に記載したものと同様であった。
1.1 ノックダウン・クローン細胞におけるMRP2 mRNAの発現
図6は、shRNA/MRP2配列(それぞれ、配列ID番号17、18、19、20、または21)によるウイルス形質導入後のC2BBel細胞におけるMRP2 mRNAの発現を示している。実施例7に記載したように、ベクター対照(VC)細胞は非干渉核酸配列(配列ID番号27)をコードするレンチウイルスによって形質導入された細胞から作成した。方法は実施例1に記載した。継体数2〜5の細胞からの総細胞RNAを5〜7日間成長させた後に単離した。同時に行ったRT−PCRの結果から、shRNA/MRP2クローン#3、4、および7におけるMRP2 mRNAの発現抑制が示された(図6)。MRP2 mRNAバンド強度のβアクチンmRNAバンド強度に対する比に基づいたRT−PCRの分析結果(表6参照)から、MRP2 mRNA発現が遺伝子MRP2ノックダウンにより15%から19%に低下したことが示された。
shRNA/MRP2クローン細胞およびベクター対照細胞からのMRP2タンパク質の細胞溶解量を、実施例2に記載したようにウエスタンブロット法によって測定した。図7で見られるように、ウエスタンブロット法はshRNA/MRP2クローン#4、5、6、および7におけるベクター対照(VC)細胞に比べたMRP2タンパク質の低下を示していた。RT−PCRおよびウエスタンブロット法の結果に基づき、配列ID番号21に対応する核酸インサートを含んだレンチウイルスによって形質導入されたC2BBel細胞(shRNA/MRP2クローン#7)は、試験を行った5つの干渉配列中最大のMRP2ノックダウンを示した。
1. BCRPノックダウン細胞におけるBCRP mRNA発現の分子生物学的性質
ノックダウン細胞におけるBCRPの遺伝子発現をBCRP mRNA量、タンパク量、およびタンパク質機能活性を観察することによって測定した。親細胞株C2BBel(ATCCアクセス番号CRL−2102)を用いて、干渉RNAをコードするレンチウイルスによる細胞の形質導入によるBCRP発現の遺伝的抑制を評価した。
輸送アッセイのため、5つのshRNA/BCRPノックダウンクローン細胞をそれぞれトランスウェルに3週間播種した。BCRP基質であるE3S(エストロン−3−硫酸)を透過性アッセイに用い、shRNA/BCRPクローン細胞におけるBCRP機能を評価した。クローン798、799、800、および802を9継体後に評価した。クローン801は幾分速く成長することが判明したため、他のクローンが成長する間に、輸送アッセイ前に13回継体が行われた。双方向性輸送実験は実施例1に記載したと同様であり、10μMジゴキシン、10μMプロプラノロール、および10μMアテノロールに加えて10μM E3Sを含んだ実施例1のQC溶液を用いて2時間にわたって実施した。結果は、E3Sに対するPappの排出比が対照細胞に比べ有意に低下(0.91から14.42)することを示しており、BCRP活性がshRNA/BCRPクローン細胞において抑制されたことを示唆するものである(表7)。クローン#801のBCRP機能抑制(96.43%)がE3S輸送で最大であった。
MRP2、P−gp、およびBCRPはC2BBel細胞の表面にある非常に重要な輸送体である。これらの輸送体の発現および機能をshRNA/BCRPクローン細胞において研究した。
BCRPノックダウンがP−gpおよびMRP2の発現に及ぼす作用を調べるため、クローン#801細胞におけるmRNA値およびタンパク値をさらに調べ、クローン#799細胞と比較した(図13および14参照)。結果から、P−gp mRNA値はクローン#801細胞の方が#799細胞および対照細胞よりも高いように思われた。それとは対照的に、MRP2 mRNA値は20継体を経たクローン#801細胞では低下していた(図13)。
P−gp mRNA発現プロフィールの結果に基づき、shRNA/BCRPクローン細胞におけるP−gp機能を、12ウェルTranswell(登録商標)輸送プレートに入れた21日齢単層によるジゴキシン排出比を測定することによって検討した。実験条件は実施例1に記載したものと同じであった。前記アッセイは各クローンを9回継体培養した後に実施した。ジゴキシン排出比はクローン#799、800、801、および親細胞単層に対しそれぞれ72.67、64.47、および54.26であり、BCRP−ノックダウン細胞の単層によるこのP−gp特異的基質の排出の方が高いことを示している。結果を表9に示す。結果から、P−gp機能がshRNA/BCRP−クローン#799、800、および801で強化されていることが暗示される。
レンチウイルス形質導入によって産生された様々なBCRPノックダウンクローンの成長速度をモニターしながら、あるクローン#801がインビトロで約15回継体後に加速度的に成長し始めたことに気付いた。親C2BBel細胞が薬剤輸送アッセイに適した単分子層を形成するには約3週間を要するため、クローン#801が成熟し薬剤輸送アッセイに適したバリア性を親細胞株および/またはベクター対照細胞株よりも早く形成するか否かを検討した。
まず、この細胞株に関し、Transwells(登録商標)に入れた後の様々な段階でTEERを測定した(表12)。結果からTEER値が6日後に900 Ohm/cm2を超えることが示され、Transwell(登録商標)容器上に緻密な細胞単層が急速に発現することが示唆された。
既述のように、20細胞継体後にshRNA/BCRPクローン#801は他の4つのクローンに比べ、成長は速く、はるかに高いTEER値を示すことが判明した。また、RT−PCRの結果から、P−gp mRNAおよびタンパク質の発現が対照細胞におけるよりも盛んであることが示唆された(表9)。したがって、shRNA/BCRPクローン#801細胞単層でP−gpの基質であるジゴキシンの輸送を行い(表13参照)、P−gp mRNA値の見掛けの上昇が排出輸送体機能の上昇に反映されるか否かを調べた。E3S、受動的吸収参照化合物、およびTEERの輸送についても同時に調べた。
BCRPノックダウンが他の輸送体遺伝子に及ぼす作用の安定性を調べるため、タンパク質値に加えP−gpおよびMRP2のmRNA値を細胞継体10〜20のshRNA/BCRPクローン#801細胞において測定した。それらの結果から、細胞継体20においてP−gp mRNAの発現が増え、MRP2が低下したことが示唆された(図13および14参照)。
以下の予言的実施例は、動物の消化管内における対象薬剤の処理に関与する輸送体のアイデンティティを明らかにするための実験的アプローチを提供する。この実験的アプローチは、(1)単一(形質導入)輸送体を発現する細胞株(MDCKなど)、(b)選択的にノックダウンされた輸送体を伴うC2BBel細胞、および(c)化学的輸送体抑制剤の組合せから成る。同時に、これらのツールは薬剤輸送プロセスに関与する輸送体のアイデンティティの決定を高い確度で促進する。
場合によっては、親C2BBel細胞は、培地組成、成長速度、および細胞におけるレンチウイルス遺伝子産物の存在によって引起される他の潜在的効果における相違により、ノックダウン細胞株の輸送機能の研究に関し適切な陽性対照とは成り得ないかもしれない。shRNAクローン細胞を用いて実験を行う場合、ノックダウン結果の正確な解釈を可能とし、観察される反応の特異性の保証を提供するためには、適切な対照が実験デザインの重要な要素である。Sigma−Aldrich(ミズーリ州St.Louis)から得られる配列ID番号27を含むMISSION(登録商標)非標的shRNA対照ベクターは、RISCおよびRNAi経路を活性化する有用な陰性対照であるが、ヒト遺伝子は標的としない。
実施例2に記載したように、C2BBel細胞を配列ID番号27を含んだshRNAレンチウイルスベクターで形質転換した。感染の多重度(MOI)の最適度を知るために、三つのMOIs(0.5、1.0、および5.0)を用いて細胞の形質導入を行った。実施例3または5に記載したように、遺伝子ノックダウン細胞における同じアッセイのため、分子および機能的アッセイを実施した。ノックダウン細胞の検討に用いたものと同じRT−PCRおよびウエスタンブロットを用いて、shRNAベクター対照細胞におけるBCRP、MRP2、およびP−gpの発現を検討した。結果は、ベクター対照細胞が依然輸送体mRNAを発現することを示している(表17)。
表18に示した輸送アッセイを行う前に、ベクター対照細胞株およびC2BBel細胞株を12ウェルTranswell(登録商標)プレート上で21日間培養した。アッセイは実施例1に記載した条件の下に行った。それらの結果から、ベクター対照細胞はTranswell(登録商標)容器上でインビトロ薬剤輸送アッセイに適したバリア特性を有する単層を形成すること、また当該細胞はジゴキシン、P−gp基質、およびBCRP基質であるエストロン−3−硫酸に対する排出活性を発現することが示唆される(表18)。
Claims (5)
- 配列ID番号1の核酸配列を有するレトロウイルスベクターによって安定に形質転換される細胞であって、前記核酸配列は、宿主細胞ゲノムに組み入れられるものであり、且つP−糖タンパク質の発現を抑制するための核酸分子をコードするものである、細胞。
- 請求項1記載の細胞において、当該細胞はCaco−2又はC2BBel細胞である、細胞。
- 請求項1又は2記載の細胞において、当該細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)のアクセッション番号PTA−8752として寄託された細胞に対応するものである、細胞。
- 請求項1、2、又は3記載の細胞を有する細胞培養物。
- 動物における消化管吸収に関する化合物をスクリーニングするインビトロ方法であって、
請求項1、2、又は3記載の細胞を試験化合物に接触させる工程と、
前記試験化合物の経細胞輸送を測定する工程と、
前記経細胞輸送の測定値と、無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値とを比較する工程と
を有し、
前記基準値と比較した前記測定値は前記動物の身体における当該化合物の消化管吸収を予測させるものである、方法。
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