ES2354602T3 - Líneas celulares estables y métodos para evaluar la absorción gastrointestinal de productos químicos. - Google Patents

Abstract

Una célula huésped transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

Description

CAMPO

Generalmente, la invención se refiere al campo de la farmacología. Más específicamente, la invención presenta líneas celulares estables, kits y métodos para predecir la absorción de productos químicos tales como fármacos, complementos nutritivos y productos químicos ambientales tras la administración a 5 animales o seres humanos.

ANTECEDENTES

Se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos en toda la memoria descriptiva. Cada una de estas publicaciones citadas se incorpora como referencia al presente documento, en su totalidad y para todos los fines. 10

La absorción de fármacos es la suma total de los efectos de diversos mecanismos mediante los cuales los fármacos pasan desde el punto de entrada hacia el torrente sanguíneo. La tasa y eficacia de absorción de fármacos afecta a la tasa y el grado en que un fármaco alcanza su sitio de acción pretendido. La absorción gastrointestinal de fármacos administrados por vía oral es, en parte, una función de la permeabilidad de la mucosa en el tracto gastrointestinal, particularmente en los intestinos, y también, en 15 parte, una función de la tasa de tránsito a través de los diversos órganos del tracto gastrointestinal ya que la tasa de tránsito establece la duración de tiempo en que el fármaco se ubica en un sitio de absorción.

Puede producirse la absorción intestinal de fármacos a través de diferentes vías. Muchos fármacos administrados por vía oral se absorben mediante difusión transcelular pasiva a través de la membrana celular de los enterocitos (Van Asperen J et al. (1998) Pharm. Res. 37: 429-35) o mediante difusión paracelular 20 pasiva a través de las uniones estrechas en el epitelio intestinal (Watson CJ et al. (2001) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281: C388-C397). La absorción epitelial de fármacos también está mediada por proteínas transportadoras de membrana (Lee VH (2001) J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 29: 41-4). Tales proteínas transportadoras también pueden servir como impedimento para la absorción de fármacos.

Se han descrito diversos transportadores de flujo de salida (o eflujo), incluyendo miembros de la 25 familia de proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MRP) (Borst P et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92: 1295-1302), glicoproteína P (P-gp) (Germann UA (1996) Eur. J. Cancer 32A: 927-44) y proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) (Staud F et al. (2005) Int. J. Biochem. Cell Biol. 374: 720-5; Doyle LA et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9526: 15665-70), entre otros. Se cree que tales proteínas transportadoras de flujo de salida son responsables principalmente de la absorción baja o variable de 30 fármacos administrados por vía oral (Stephens RH et al. (2001) J. Pharmacol. Exp. Ther. 296: 584-91).

Por tanto, la absorción de fármacos y los factores que lo facilitan o impiden son consideraciones importantes en el diseño de fármacos y en la evaluación de compuestos líderes como agentes terapéuticos potenciales. Varios modelos están disponibles para valorar la absorción en el intestino. Estos modelos incluyen el ensayo de permeabilidad en membranas artificiales paralelas (PAMPA), recirculación intestinal in 35 situ y perfusión de paso único, cámaras de Ussing y líneas celulares, incluyendo células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) y células Caco-2 (Balimane PV et al. (2006) AAPS J. 8: E1-13).

Las células Caco-2, que se derivaron de un adenocarcinoma de colon humano, son un modelo ampliamente usado para estudios de absorción intestinal. Cuando se hacen crecer y se permite que se diferencien, las células Caco-2 son morfológicamente similares a los enterocitos y expresan muchas de las 40 enzimas presentes en el borde en cepillo de la mucosa del intestino delgado, y por tanto se parecen mucho al entorno y las funciones del intestino delgado. Las células Caco-2 proporcionan una ventaja adicional para estudios de absorción intestinal porque expresan al menos tres proteínas transportadoras de flujo de salida del fármaco, incluyendo P-gp (Hunter J et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 14991-7), proteínas MRP (Hirohashi T et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292: 265-70; Gutmann H et al. (1999) Pharm. Res. (NY) 16: 402-7), y 45 BCRP (Xia CQ et al. (2005) Drug Metab. Dispos. 33: 637-43).

Para estudios de absorción de fármacos, es deseable evaluar las contribuciones de las proteínas transportadoras de flujo de salida de fármaco a la alteración de la absorción. Esto puede lograrse inhibiendo la expresión o actividad de los transportadores, particularmente P-gp. En general, se usan productos químicos tales como ciclosporina A para bloquear la actividad de P-gp. La inhibición química de 50 transportadores presenta una desventaja en la medida en que tales productos químicos también inhiben otras proteínas y funciones celulares, y por tanto pueden sesgar los resultados de experimentos de absorción. Recientemente, se mostró que la expresión de P-gp en células Caco-2 se reducía usando tecnología de ARNi (Watanabe T et al. (2005) Pharm. Res. 22: 1287-93), y se mostró que la expresión del gen resistente a múltiples fármacos 1 (MDR1) en células Caco-2 se reducía usando tecnología de ARNi (Celius T et al. (2004) 55 Biochem. Biophys. Res. Comm. 324: 365-71). La inhibición de la expresión de P-gp mediante ARNi potenció

la acumulación intracelular de y restauró la sensibilidad a compuestos transportados por P-gp (Wu H et al. (2003) Cancer Res. 63: 1515-19). Aunque la regulación por disminución genéticamente de P-gp en células Caco-2 representa una mejora con respecto al uso de inhibidores químicos, estudios de absorción de fármacos en este modelo están desfavorecidos porque el silenciamiento de la expresión de P-gp sola no tiene en cuenta las contribuciones de transportadores existentes tales como MRP y BCRP al flujo de salida de 5 fármacos y la alteración de la absorción. Además, el ARNhc sintetizado in vitro y transfectado directamente en células reduce la expresión génica sólo transitoriamente, y se restaura la expresión unos pocos días después de la transfección. Además, el ARNhc sintetizado in vitro también se limita a menudo a células que se transfectan fácilmente, y se sabe muy poco sobre la estabilidad de la inhibición de la expresión génica tras varios pases celulares. 10

Para evaluar y predecir con precisión la absorción intestinal de compuestos líderes, se desea que las contribuciones relativas de todas y cada una de las proteínas transportadoras de flujo de salida se tengan en cuenta y se controlen. De manera similar, es deseable producir y utilizar líneas celulares estables para controlar genéticamente la expresión y/o función de tales proteínas transportadoras de manera más permanente. La presente invención trata estas necesidades que se sentían hace largo tiempo. 15

SUMARIO

La invención presenta moléculas de ácido nucleico aisladas para inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, comprendiendo la molécula de ácido nucleico la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26 o variantes alélicas de ellas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de cadena sencilla, doble o triple. En algunos 20 aspectos preferidos, las moléculas de ácido nucleico son ARN.

También se proporcionan vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, o variantes alélicas de las mismas. En los vectores, la molécula de ácido 25 nucleico puede unirse operativamente a uno o más elementos reguladores tales como un promotor inducible o constitutivo. Los vectores pueden ser vectores virales, y en algunas realizaciones preferidas son vectores lentivirales.

También se proporcionan células huésped transformadas con tales vectores mediante esta invención. Se prefiere que tales células huésped elegidas para su transformación con los vectores expresen 30 al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana de tal manera que la transformación dará como resultado la inhibición de la expresión de la proteína. La proteína transportadora de flujo de salida de membrana puede ser cualquier proteína de este tipo. Los ejemplos de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana incluyen glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. Las células huésped pueden ser células epiteliales, y son 35 preferiblemente células epiteliales intestinales, y son más preferiblemente células epiteliales intestinales humanas. Los ejemplos de células adecuadas incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 y células T-84. También se proporcionan cultivos de células huésped.

También se presentan métodos para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal tal como un ser humano que comprende inhibir de manera estable la expresión de al menos una 40 proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción 45 gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. Las mediciones en relación con los valores de referencia son indicativas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal. Los ejemplos de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana incluyen glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. 50

En tales métodos, la inhibición puede comprender transformar de manera estable la célula con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la al menos una proteína transportadora de el flujo de salida de membrana. Los ejemplos de células adecuadas incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 y células T-84. Las moléculas de ácido nucleico interferentes son las que tienen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, y variantes alélicas o variantes modificadas de manera 55 conservativa de ellas. Un ejemplo no limitativo de transformación estable implica el uso de vectores virales, y preferiblemente lentivirales, que comprenden la molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, una única molécula de ácido nucleico puede inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

También se presentan métodos para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal tal como un ser humano que comprende inhibir de manera estable la expresión de una primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, inhibir de manera estable la expresión de una segunda proteína 5 transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, poner en contacto las células primera y segunda con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera y segunda, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular 10 de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además inhibir de manera estable la expresión de una tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una tercera célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, poner en 15 contacto las células primera, segunda y tercera con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera, segunda y tercera, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. Para cada comparación, las mediciones indican la contribución relativa de la 20 primera, segunda y tercera proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana al transporte transcelular del compuesto de prueba, y las mediciones en relación con los valores de referencia son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal. Las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. 25

En tales métodos, la inhibición de la primera, segunda, y/o tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana puede comprender transformar la célula con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Los ejemplos de células adecuadas incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 y células T-84. Las moléculas de ácido nucleico interferentes son las que tienen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 30 23, 24, 25 ó 26, y variantes alélicas o variantes modificadas de manera conservativa de las mismas. Un ejemplo no limitativo de inhibición estable implica el uso de vectores virales, y preferiblemente lentivirales, que comprenden la molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, una única molécula de ácido nucleico puede inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

La invención también proporciona métodos para inhibir la expresión de una proteína transportadora 35 de flujo de salida de membrana. Los métodos comprenden transformar de manera estable una célula con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y expresar dicha molécula de ácido nucleico en la célula, en la que la expresión de la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Se prefieren vectores lentivirales. De 40 ese modo, la proteína transportadora de flujo de salida de membrana es una de glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama, y la secuencia de ácido nucleico comprende una de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, o variantes alélicas o variantes modificadas de manera conservativa de las mismas. Un ejemplo no limitativo de transformación estable implica el uso de vectores virales, y preferiblemente lentivirales, que comprenden la 45 molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, una única molécula de ácido nucleico puede inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

Se proporcionan kits para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en animales mediante la invención. En algunas realizaciones, tales kits pueden comprender, en uno o más recipientes, una célula transformada de manera estable con al menos una molécula de ácido nucleico para inhibir la 50 expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana e instrucciones para usar el kit en un método para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en animales. Los kits pueden comprender además células adicionales transformadas de manera estable con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana adicional. De nuevo, las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana es una de glicoproteína P, 55 proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. Los ejemplos de células adecuadas incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 y células T-84. Las moléculas de ácido nucleico son las que tienen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, y variantes alélicas o variantes modificadas de manera conservativa de las mismas.

La invención también presenta métodos para identificar compuestos que inhiben la actividad de 60 flujo de salida de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Tales métodos, en algunas

realizaciones, comprenden inhibir de manera estable la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula, poner en contacto la primera célula con un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, poner en contacto una segunda célula que expresa la proteína transportadora de flujo de salida de membrana con un compuesto de prueba y un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, determinar la actividad de flujo de salida de la 5 proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula, y en la segunda célula en presencia y ausencia del compuesto de prueba, y comparar las actividades de flujo de salida determinadas, en los que una disminución en la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba en relación con la actividad de flujo de salida en ausencia del compuesto de prueba, y una identidad al menos parcial de la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba con la actividad de flujo de 10 salida en la primera célula indica que el compuesto de prueba inhibe específicamente la proteína transportadora de flujo de salida de membrana.

En tales métodos, la inhibición estable de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula puede comprender transformar la célula con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 15 Las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. Las moléculas de ácido nucleico son las que tienen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, y variantes alélicas o variantes modificadas de manera conservativa de las mismas. Los ejemplos de células que pueden servir como la primera y/o segunda célula incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 y células 20 T-84. Un ejemplo no limitativo de inhibición estable implica el uso de vectores virales, y preferiblemente lentivirales, que comprenden la molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, una única molécula de ácido nucleico puede inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

Puede usarse cualquier sustrato conocido de la proteína transportadora de flujo de salida de 25 membrana de interés en los métodos. Los ejemplos de tales sustratos incluyen digoxina para la glicoproteína P, vinblastina o dinitrofenil-S-glutatión para la proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2, y mitoxantrona o estrona-3-sulfato para la proteína de resistencia al cáncer de mama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra que disminuyó significativamente la función de P-gp en células transducidas 30 con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5 (ARNhc/P-gp 83, 84, 85, 86 u 87, respectivamente) tal como se describe en el presente documento, determinado mediante fluorescencia con calceína intracelular. Se trataron células del clon ARNhc/P-gp (KD) en paralelo con ciclosporina A (CsA) (KD+CsA), un inhibidor de P-gp establecido. Se usó CsA como control positivo (C2BBe1 + CsA), y se usaron células C2BBe1 no transducidas, sin silenciamiento (Un-KD) como control negativo para mostrar la retención inicial 35 de calceína.

La figura 2 muestra el análisis de electroforesis en gel de ARNm de P-gp humana amplificado mediante RT-PCR a partir de células del clon ARNhc/P-gp y células control. Las células C2BBe1 no transducidas (células C2BBE1 sin silenciamiento) y MDR1/MDCK, mostradas en los carriles marcados como 1 y 2, respectivamente, muestran prominentemente una banda de 208 pares de bases (pb) correspondiente a 40 P-gp (panel superior). Por el contrario, las células transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5 (ARNhc/P-gp 83, 84, 85, 86 u 87, respectivamente) muestran la expresión significativamente reducida de ARNm de P-gp. -actina se muestra como control positivo (panel inferior). M1 = marcador de ADN de 100 pb.

La figura 3 muestra la razón de flujo de salida de digoxina en células del clon ARNhc/P-gp. La 45 razón de flujo de salida (Papp B-A:A-B) se reduce significativamente en células transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5 (ARNhc/P-gp 83, 84, 85, 86 u 87, respectivamente) en relación con células C2BBe1 no transformadas (Un-KD).

La figura 4 muestra un análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la expresión de la proteína P-gp en células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5 50 (ARNhc/P-gp 83, 84, 85, 86 u 87, respectivamente). Las células transducidas demostraron una expresión de proteína P-gp significativamente reducida en relación con células C2BBe1 no transducidas (C) corridas en paralelo. Se usó P-gp expresada en microsomas de células de insectos como control positivo (P-gp). Se usó extracto de células MDCK, que no expresa P-gp humana, como control negativo (M). -actina se sometió a inmunotransferencia como un patrón para la normalización de la cantidad de proteínas transferidas a la 55 membrana de inmunotransferencia.

La figura 5 muestra la inhibición en porcentaje calculada de la expresión de la proteína P-gp en células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5 (ARNhc/P-gp 83, 84,

85, 86 u 87, respectivamente), en relación con células C2BBe1 no transducidas, determinado mediante inmunotransferencia de tipo Western.

La figura 6 muestra la expresión de ARNm de MRP2 en células del clon ARNhc/MRP2 de C2BBe1 nº 3, 4, 5, 6 y 7 (transducidas con las SEQ ID NO 17, 18, 19, 20 y 21, respectivamente). Se transdujeron células control de vector (VC) con un vector de ARNhc control descrito en el ejemplo 7. Se aisló el ARN 5 celular total de células con pases que oscilaron desde 2 hasta 5 después de 5 a 7 días de crecimiento, se amplificó con cebadores específicos para MRP2 (las SEQ ID NO: 11 y 12), y se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa. Se incluyó -actina para tener en cuenta las eficacias variables de la extracción del ARN total a partir de los extractos celulares.

La figura 7 muestra el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de niveles de proteína 10 MRP2 en células del clon ARNhc/MRP2 de C2BBe1 nº 3, 4, 5, 6 y 7 (transducidas con las SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20 y 21, respectivamente). Se transdujeron células control de vector (VC) con un vector de ARNhc control descrito en el ejemplo 7. Se incluyó -actina para tener en cuenta las variaciones en la cantidad de proteína total aplicada al gel de electroforesis.

La figura 8 muestra expresión de ARNm de BCRP en células C2BBe1 transducidas con lentivirus 15 que contenían las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 ó 26 (ARNhc/BCRP 798, 799, 800, 801 u 802, respectivamente). Se cultivaron y se hicieron crecer células C2BBe1 transducidas, y se extrajo el ARN celular total. Se amplificó el ARN extraído mediante RT-PCR con cebadores específicos para BCRP (las SEQ ID NO: 13 y 14), y se resolvieron los productos mediante electroforesis en gel de agarosa. Los cinco insertos de ARNhc/BCRP redujeron significativamente la expresión de ARNm de BCRP en relación con células C2BBe1 20 transducidas con un lentivirus de control que contenía ARNhc no interferente (VC). También se valoró la producción de ARNm de -actina para tener en cuenta las eficacias variables de la extracción de ARN total a partir de los extractos celulares.

La figura 9 muestra niveles relativos de expresión de ARNm de BCRP en células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 ó 26 (ARNhc/BCRP 798, 799, 800, 25 801 u 802, respectivamente). Se cultivaron y se hicieron crecer células C2BBe1 transducidas, y se extrajo el ARN celular total. Se llevó a cabo RT-PCR, y se resolvieron los productos mediante electroforesis en gel de agarosa (figura 8). Se compararon los niveles de expresión de ARNm de BCRP con el nivel de expresión de ARNm de BCRP en células C2BBe1 transducidas con un lentivirus de control que contenía ARNhc no interferentes (VC) para determinar el grado de inhibición de la expresión de ARNm de BCRP provocada por 30 los ARNhc interferentes. Se ilustran los resultados como inhibición en porcentaje de la expresión de ARNm de BCRP.

La figura 10 muestra la expresión de la proteína BCRP en células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 ó 26 (ARNhc/BCRP 798, 799, 800, 801 u 802, respectivamente). El análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicó una disminución sustancial en la 35 cantidad de proteína BCRP presente en células del clon ARNhc/BCRP nº 798, 799, 800, 801 y 802 (pase celular 15 a 16) en comparación con células C2BBe1 transducidas con un lentivirus de control que contenía ARNhc no interferente (VC). Se incluyó la -actina para tener en cuenta las variaciones en la cantidad de proteína total aplicada al gel de electroforesis.

La figura 11 muestra el inhibición en porcentaje de la expresión de proteína BCRP en células del 40 clon ARNhc/BCRP nº 798, 799, 800, 801 y 802 (tal como se muestra en la figura 10). Se usó la razón de densidades ópticas para las bandas de P-gp y beta-actina mostradas en la figura 10 para determinar la inhibición en porcentaje de la expresión de proteína BCRP en células del clon ARNhc/BCRP en relación con niveles de expresión en células C2BBe1 transducidas con un lentivirus de control que contenía ARNhc no interferente. 45

La figura 12 muestra la expresión de ARNm de BCRP en la línea celular del clon ARNhc/BCRP nº 801 de los pases celulares 5 a 20 tal como se mide mediante RT-PCR. La expresión de ARNm de BCRP disminuyó desde el pase 5 hasta el pase 20. Se separaron y se visualizaron los ARNm amplificados tal como se describe en el ejemplo 1. Se incluyó -actina para tener en cuenta las eficacias variables de la extracción de ARN total a partir de los extractos celulares. 50

La figura 13 muestra la expresión de ARNm de P-gp y ARNm de MRP2 en el clon ARNhc/BCRP 801 en los pases 10 y 20. Aumentó la expresión de ARNm de P-gp en el clon ARNhc/BCRP 801 en comparación con células control de vector (VC), C2BBe1 no transducidas (Wt) en ambos pases 10 y 20. A diferencia de P-gp, el ARNm de MRP2 mostró una expresión significativamente disminuida en células del clon nº 801 en comparación con las otras líneas celulares sometidas a prueba sólo en el pase 20. Se incluyó -55 actina para tener en cuenta las eficacias variables de la extracción de ARN total a partir de los extractos celulares.

La figura 14 muestra la inmunotransferencia de tipo Western correspondiente a la figura 13 para la expresión de proteínas BCRP, P-gp y MRP2 en la línea celular del clon ARNhc/BCRP nº 801 para los pases celulares 10 y 20. La banda de MRP2 está presente en el pase 10 del clon ARNhc/BCRP 801, pero no en el pase 20. Se incluyó la -actina para tener en cuenta las variaciones en la cantidad de proteína total aplicada al gel de electroforesis. 5

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se usan diversos términos en relación con los métodos y otros aspectos de la presente invención en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones. A tales términos ha de proporcionárseles sus significados habituales en la técnica a la que se refiere la invención, a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con la definición 10 proporcionada en el presente documento. Aunque puede usarse en la práctica cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento para someter a prueba la presente invención, se describen en el presente documento los materiales y métodos preferidos.

Se usan las siguientes abreviaturas en toda la memoria descriptiva. Papp: coeficiente de permeabilidad; PappA-B: coeficiente de permeabilidad en la dirección apical (A) a basolateral (B); PappB-A: 15 coeficiente de permeabilidad en la dirección basolateral (B) a apical (A); ER: razón de flujo de salida, razón PappB-A/PappA-B; P-gp: glicoproteína P; MDR1: proteína de resistencia a múltiples fármacos 1; BCRP: proteína de resistencia al cáncer de mama; MRP: proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos; MRP2: proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2; DMEM, medio de Eagle modificado por Dulbecco; FBS, suero bovino fetal; FTC: fumitremorgina C; CsA: ciclosporina A; MK571: inhibidor de MRP; 20 TEER, resistencia eléctrica transepitelial; KD: con silenciamiento; WT: línea celular original no modificada, de tipo natural; C2BBe1 WT: células C2BBe1 no modificadas; C2BBe1 Pgp-KD: células C2BBe1 en las que se ha suprimido la expresión de Pgp; C2BBe1 BCRP-KD: células C2BBe1 en las que se ha suprimido la expresión de BCRP; C2BBe1 MRP2-KD: células C2BBe1 en las que se ha suprimido la expresión de MRP2; MDCK: riñón canino Madin-Darby; MDR1-MDCK: línea celular MDCK transfectada con el gen MDR1 humano, 25 que se sobreexpresa; BCRP-MDCK: línea celular MDCK transfectada con el gen BCRP humano, que se sobreexpresa; MRP2-MDCK: línea celular MDCK transfectada con el gen MRP2 humano, que se sobreexpresa; nt, nucleótido.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un/o”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por 30 tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una combinación de dos o más células, y similares.

El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende abarcar variaciones de 20% o 10%, más preferiblemente 5%, incluso más preferiblemente 1%, y todavía más preferiblemente 0,1% con respecto al valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos 35 dados a conocer.

“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” desde el estado natural. Si se produce una molécula o composición en la naturaleza, se ha “aislado” si se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de manera natural en una planta o animal vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de 40 su estado natural está “aislado” según se emplea el término en el presente documento.

“Polinucleótido”, denominado de manera sinónima como “molécula de ácido nucleico”, se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Los “polinucleótidos” incluyen, sin limitación ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es 45 una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más normalmente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, “polinucleótido” se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye los ADN o los ARN que contienen una o más bases modificadas y los ADN o los ARN con esqueletos modificados por estabilidad o por otras razones. 50 Bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Puede realizarse una variedad de modificaciones en el ADN y el ARN; por tanto, “polinucleótido” abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente tal como se encuentran normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas del ADN y ARN características de virus y células. “Polinucleótido” también abarca cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, denominadas a menudo como 55 oligonucleótidos.

Un “vector” es un replicón, tal como plásmido, fago, cósmido o virus en el que puede insertarse operativamente otro segmento de ácido nucleico de modo que se produzca la replicación o expresión del

segmento.

Los términos “expresar”, “expresado”, o “expresión” de una molécula de ácido nucleico se refieren a la biosíntesis de un producto génico. El término abarca la transcripción de un gen en ARN. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, puede expresarse un gen regulador tal como un ácido nucleico antisentido o ácido nucleico interferente mediante transcripción como ARN antisentido o ARNi o ARNhc. El término 5 también abarca la traducción del ARN en uno o más polipéptidos, y abarca todas las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales que se producen de manera natural.

La expresión “unido operativamente” o “insertado operativamente” significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia codificante se colocan en una molécula de ácido nucleico en las posiciones apropiadas en relación con la secuencia codificante de modo que se permita la 10 expresión de la secuencia codificante. A modo de ejemplo, se une operativamente un promotor con una secuencia codificante cuando el promotor puede controlar la transcripción o expresión de esa secuencia codificante. Pueden unirse operativamente secuencias codificantes a promotores o secuencias reguladoras en una orientación de tipo sentido o antisentido. La expresión “unido operativamente” se aplica algunas veces a la disposición de otros elementos de control de la transcripción (por ejemplo, potenciadores) en un vector 15 de expresión.

Una región “heteróloga” de un constructo de ácido nucleico es un segmento (o segmentos) identificable(s) de la molécula de ácido nucleico dentro de una molécula más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica para un gen de mamífero, el gen habitualmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de 20 mamífero en el genoma del organismo de origen.

Una célula se ha “transformado” o “transducido” con ácidos nucleicos exógenos o heterólogos tales como ADN cuando se ha introducido tal ADN dentro de la célula. El ADN transformante puede integrarse (unirse covalentemente) o no en el genoma de la célula. Por ejemplo, en células procariotas, de levaduras y de mamíferos, puede mantenerse el ADN transformante en un elemento episómico tal como un plásmido. 25 Con respecto a células eucariotas, una célula transformada de manera estable, o “célula estable” es una en que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de tal manera que se hereda por células hijas a través de replicación cromosómica. Se demuestra esta estabilidad mediante la capacidad de la célula eucariota para establecer clones o líneas celulares que se componen de una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un “clon” es una población de células derivadas de una única célula o 30 ancestro común mediante mitosis. Una “línea celular” es un clon de una célula primaria que puede crecer de manera estable in vitro para muchas generaciones.

Tal como se usa en el presente documento, “compuesto de prueba” se refiere a cualquier molécula purificada, molécula sustancialmente purificada, moléculas que son uno o más componentes de una mezcla de compuestos, o una mezcla de un compuesto con cualquier otro material que puede analizarse usando los 35 métodos de la presente invención. Los compuestos de prueba pueden ser productos químicos orgánicos o inorgánicos, o biomoléculas, y todos los fragmentos, análogos, homólogos, conjugados y derivados de los mismos. Las “biomoléculas” incluyen proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, lípidos, monosacáridos, polisacáridos, y todos los fragmentos, análogos, homólogos, conjugados y derivados de los mismos. Los compuestos de prueba pueden ser de origen natural o sintético, y pueden aislarse o purificarse a partir de sus 40 fuentes que se producen de manera natural, o pueden sintetizarse de novo. Pueden definirse compuestos de prueba en cuanto a la estructura o composición, o pueden estar indefinidos. El compuesto puede ser un producto aislado de estructura desconocida, una mezcla de varios productos conocidos, o una composición indefinida que comprende uno o más compuestos. Los ejemplos de composiciones indefinidas incluyen extractos celulares y tisulares, medio de crecimiento en el que se han cultivado células procariotas, 45 eucariotas y arqueobacterianas, caldos de fermentación, bibliotecas de expresión de proteínas, y similares.

“Proteína transportadora de flujo de salida de membrana” se refiere a cualquier transportador proteico ubicado en una membrana celular. Tales proteínas transportadoras pueden tener como una de sus funciones biológicas la capacidad para mediar la retirada de compuestos del interior celular, denominado en el presente documento como “actividad de flujo de salida”. La actividad de flujo de salida puede dar como 50 resultado una amplia resistencia con especificidad de sustrato a agentes terapéuticos no relacionados de múltiples estructuras, es decir, resistencia a múltiples fármacos (MDR). La capacidad de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana para conferir MDR clínica ha generado un interés considerable en identificar los sustratos y/o inhibidores de tal proteína y revertir así la resistencia a fármacos innata o adquirida (N. Mizuno, et al. (2003) Pharmacological Rev. 55: 425-61). 55

Tal como se usa en el presente documento, el término “modular” significa cualquier cambio, mejora o inhibición en la cantidad, calidad o actividad de una biomolécula o ruta particular. “Inhibir” o “inhibición” o “interferir” significan reducir, disminuir, bloquear, prevenir, retardar, inactivar, desensibilizar, detener o regular por disminución la actividad biológica o expresión de una molécula, proteína o ruta de interés. En algunas

realizaciones preferidas de la invención, el nivel de la expresión o actividad biológica de una proteína o ruta de interés, por ejemplo, actividad de flujo de salida o expresión de proteínas de salida de membrana, se refiere a una disminución (inhibición o regulación por disminución) o aumento (regulación por incremento) superior a desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 99%, y más específicamente, de aproximadamente el 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 5 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más. La inhibición puede ser directa, es decir, opera en la propia molécula o ruta de interés, o indirecta, es decir, opera en una molécula o ruta que afecta a la molécula o ruta de interés.

“Silenciamiento” se refiere a una célula u organismo que tiene una expresión reducida de uno o 10 más genes. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, un silenciamiento presentará al menos aproximadamente una reducción del 20% en la expresión, presentará preferiblemente al menos aproximadamente una reducción del 50% en la expresión, y presentará más preferiblemente al menos aproximadamente una reducción del 75% en la expresión, aunque son posibles reducciones superiores, incluyendo al menos aproximadamente una reducción del 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 15 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más en la expresión.

Con respecto a los ácidos nucleicos, la expresión “identidad en porcentaje” se refiere al porcentaje de identidad de secuencia encontrado en una comparación de dos o más secuencias de ácido nucleico.

“Absorción gastrointestinal” se refiere a la captación de productos químicos, incluyendo biomoléculas y compuestos de prueba, en o través de tejidos que comprenden el tracto gastrointestinal. Por 20 ejemplo, absorción incluye, pero no se limita a, captación de compuestos desde el lado apical de una célula y la liberación de compuestos desde el lado basolateral de una célula. El tracto gastrointestinal comprende el estómago, intestino delgado e intestino grueso. “Sin absorción gastrointestinal” significa que se absorbe el 0% del compuesto. “Baja absorción gastrointestinal” significa que se absorbe más del 0%, pero menos del 25% de un compuesto. “Moderada absorción gastrointestinal” significa que se absorbe más del o igual al 25% pero 25 menos del 85% de un compuesto. “Alta absorción gastrointestinal” significa que se absorbe más del o igual al 85% de un compuesto.

Tal como se usa en el presente documento, “medir” o “determinar” se refiere a cualquier determinación cualitativa o cuantitativa.

“Transporte transcelular” se refiere al movimiento de un compuesto a través de una capa de 30 células epiteliales mediante el cual se mueve el compuesto a través de las células y no por los espacios entre las células tales como uniones estrechas. A modo de comparación, “transporte paracelular” se refiere al movimiento de un compuesto a través de una capa de células epiteliales mediante el cual se mueve el compuesto a través de las uniones estrechas entre células.

Las siguientes secciones exponen los procedimientos generales implicados en la práctica de la 35 presente invención. En la medida en que se mencionan materiales específicos, es meramente con el fin de ilustración, y no pretende limitar la invención. A menos que se especifique lo contrario, se usan procedimientos bioquímicos y de biología molecular generales, tales como los expuestos en Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1998; Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 40 Plainview, Nueva York, 1989; Kaufman et al., Eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Raton, 1995. PROTEIN EXPRESSION: A PRACTICAL APPROACH (SJ Higgins y B.D Hames, Eds.) Oxford University Press, Oxford, RU 1999; Charles Hardin et al. CLONING, GENE EXPRESSION, AND PROTEIN PURIFICATION: EXPERIMENTAL PROCEDURES AND PROCESS RATIONALE Oxford University Press, Inc. Nueva York, NY. 2001; y 45 MEMBRANE PROTEIN PROTOCOLS: EXPRESSION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION (METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Clifton, N.J.), V. 228.) Barry Steven Selinsky, Humana Press, Inc. Totowa, NJ. 2003.

Debe entenderse que esta invención no se limita a métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, naturalmente, variar. También ha de 50 entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir sólo realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa.

Las proteínas transportadoras de flujo de salida, particularmente las expresadas por células intestinales, pueden limitar la absorción de fármacos sustrato, y pueden mediar interacciones fármaco-fármaco que alteran, frecuentemente reduciendo, la disponibilidad o eficacia del fármaco. Por tanto, entender 55 el papel de los diversos transportadores de flujo salida en la absorción de fármacos es importante en el desarrollo de compuestos líderes. Hasta la fecha, el estudio de transportadores de flujo de salida se ha basado en gran medida en el uso de inhibidores químicos. Sin embargo, el uso de inhibidores químicos es

problemático ya que los inhibidores no son específicos y pueden afectar a otros procesos celulares desdibujando de ese modo la imagen general de la absorción de fármacos. Se ha descubierto según la presente invención que puede inhibirse de manera estable la expresión de las diversas proteínas transportadoras de flujo de salida a nivel genético usando células transformadas por virus. Se ha descubierto además que el silenciamiento dirigido de los diversos transportadores permite la identificación de los 5 transportadores particulares implicados en el transporte de fármacos con un alto grado de certeza. El enfoque de silenciamiento descrito en el presente documento proporciona un silenciamiento específico de secuencia, estable de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana inducido por la expresión endógena de ARNhc con vectores lentivirales. La invención es ventajosa con respecto a intentos de silenciamiento anteriores ya que la transformación con vectores lentivirales proporciona una inhibición estable, permanente 10 de la expresión génica, y proporciona la ventaja adicional de sortear la inhibición no específica de otras funciones celulares que se esperarían a partir de la inhibición química.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención presenta métodos para seleccionar compuestos de prueba para absorción gastrointestinal en animales, tal como se describe en las reivindicaciones. Los métodos comprenden modular, y preferiblemente inhibir, la expresión de al menos una proteína 15 transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. Los valores obtenidos mediante experimentos que miden el transporte transcelular 20 del compuesto indican el grado en el que es probable que se absorba el compuesto de prueba tras la administración al animal. Por tanto, los métodos son útiles como modelos in vitro, entre otras cosas.

Las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana, denominadas de manera sinónima en el presente documento como transportadores de fármacos o proteínas transportadoras de fármacos, se componen generalmente de una o más subunidades que abarcan la membrana plasmática de células de 25 mamíferos, incluyendo células epiteliales de mamíferos. Las células epiteliales de mamíferos son a menudo células polarizadas, lo que significa que su composición de membrana difiere entre la parte dirigida hacia el exterior o apical de la célula, y la parte dirigida hacia el interior o basolateral de la célula. Por apical o hacia el exterior, se entiende que tales partes de la célula están orientadas hacia un compartimento corporal conectado con el entorno exterior, tal como la luz del intestino o el revestimiento de las vías urinarias o las 30 vías biliares. Por basolateral o hacia el interior, se entiende que tales partes de la célula están orientadas hacia el interior del organismo, normalmente el riego sanguíneo del organismo. Las células epiteliales desempeñan un papel en la absorción y eliminación de nutrientes, fármacos y toxinas ambientales así como metabolitos derivados de compuestos en cada una de estas categorías. Las células epiteliales pueden hacerse crecer juntas en láminas en las que células vecinas se unen entre sí mediante uniones estrechas, 35 que son conexiones intercelulares que limitan la difusión de iones y moléculas más grandes entre células, denominado transporte paracelular.

Los hepatocitos del hígado y las células endoteliales de capilares cerebrales comparten determinadas características comunes con las células epiteliales, incluyendo la presencia de uniones estrechas y la expresión asimétrica de proteínas transportadoras de membrana. Muchas células epiteliales 40 mantienen esta orientación asimétrica incluso cuando se cultivan fuera del organismo. Esto puede requerir condiciones de cultivo in vitro especiales, tales como el uso de material de plástico recubierto con colágeno, o la adición de una o más proteínas u hormonas de inducción de diferenciación al medio del cultivo celular. Otras condiciones de cultivo especializado las conocen y practican fácilmente los expertos en la técnica.

Los transportadores de flujo de salida de membrana pueden estar distribuidos de manera 45 asimétrica en las células epiteliales. Esta distribución asimétrica puede conducir al transporte vectorial de compuestos que son sustratos para tales transportadores. El transporte vectorial significa que la tasa de transporte de un compuesto difiere significativamente dependiendo de si el compuesto se aplica a la superficie apical o basolateral de una capa de células epiteliales.

Pueden dividirse los transportadores de membrana de mamíferos en dos familias generales 50 basándose en sus relaciones de secuencia génica y modos de transporte de compuestos. La primera clase se denomina transportadores ABC. El término “ABC” se refiere a una característica estructural común de esta familia de transportadores, la presencia de un motivo estructural de casete (C) de unión (B) a adenosina trifosfato (A) (Adenosine triphosphate (A) binding (B) cassette (C)). Normalmente, estas proteínas transportadoras mueven productos químicos desde el interior de una célula o desde dentro de la bicapa 55 fosfolipídica de la membrana celular al exterior de la célula frente a un gradiente de concentración desfavorable usando la energía proporcionada por la escisión hidrolítica de adenosina trifosfato (ATP) para dar adenosina difosfato (ADP) e ion fosfato (Pi). Sin intención de limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se cree que, además de sus papeles como transportadores de fármacos, los miembros de la familia ABC desempeñan un papel en la excreción de sales biliares y fosfolípidos en la bilis así como en la 60

regulación del contenido en fosfolípidos y colesterol de las membranas celulares.

La segunda familia principal de transportadores presente en mamíferos se denomina familia SLC en la que la abreviatura “SLC” se refiere a las características principales de esta familia de “portadores unidos a solutos” (“Solute Linked Carriers”), concretamente que el transporte de fármacos al interior o exterior de una célula está vinculado al transporte de un soluto fisiológico, tal como ion sodio, protón o producto metabólico, o 5 bien en sentido opuesto, a través de intercambio de solutos, o bien en el mismo sentido, a través de transporte conjunto. A diferencia de la familia ABC de transportadores, la familia SLC generalmente no requiere energía derivada de la hidrólisis de ATP para funcionar. En su lugar, tales transportadores utilizan los gradientes de concentración de las moléculas o iones transportados conjuntamente y/o intercambiados como fuente de energía para transportar fármacos frente a un gradiente de concentración desfavorable. 10 También, a diferencia de los transportadores de la familia ABC, SLC median frecuentemente la captación del compuesto en las células. En algunos casos, tales como en células epiteliales de túbulo renal, los transportadores SLC y ABC están presentes en lados opuestos del epitelio polarizado y trabajan conjuntamente para suministrar compuestos desde la sangre hacia la orina frente a gradientes de concentración desfavorables (Wright S. et al. (2004) Physiol. Rev 84: 987-1049). 15

La tabla 1, a continuación, enumera miembros humanos de la familia de transportadores ABC y algunos de sus sustratos e inhibidores conocidos (Zhang L, et al. (2006) Molecular Pharmaceutics 3: 62-9). La lista de sustratos e inhibidores es con fines de ilustración, y no pretende ser exhaustiva.

Tabla 1. Proteínas transportadoras ABC y sustratos e inhibidores conocidos.

Gen del transportador

Nombres comunes Distribución tisular Sustratos Inhibidores

ABCB1

P-gp, MDR1 Intestino, hígado, riñón, cerebro, placenta, glándula suprarrenal, testículos Digoxina, fexofenadina, indinavir, vincristina, colchicina, topotecán, paclitaxel, loperamida Ritonavir, ciclosporina, verapamilo, eritromicina, ketoconazol, itraconazol, quinidina, elacridar (GF120918), azitromicina, valspodar (PSC833), LY335979

ABCB11

BSEP Hígado Vinblastina

ABCC1

MRP1 Intestino, hígado, riñón, cerebro Adefovir, indinavir

ABCC2

MRP2, CMOAT Intestino, riñón, hígado, cerebro Indinavir, cisplatino Ciclosporina

ABCC3

MRP3, CMOAT2 Intestino, hígado, riñón, placenta Etopósido, metotrexato, tenopósido

ABCC6

MRP6 Hígado, riñón Cisplatino, daunorubicina

ABCG2

BCRP Intestino, hígado, mama, placenta Duanorubicina, doxorubicina, topotecán, rosuvastatina, sulfasalazina Elacridar (GF 120918), fumitremorgina C, gefitinib

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El fármaco rifampicina y el complemento herbal hierba de San Juan son inductores establecidos de la expresión génica de ABCB1 aumentada. La familia de transportadores ABC media el transporte de

fármacos de una amplia variedad de clases terapéuticas, incluyendo fármacos antineoplásicos, tales como cisplatino y topotecán, fármacos antivirales, tales como indinavir y adefovir y el fármaco antihiperlipidémico, rosuvastatina. Hay una superposición considerable entre los sustratos para diferentes transportadores. Por ejemplo, indinavir es un sustrato para ABCB1, ABCC1 y ABCC2. De manera similar, topotecán es un sustrato para ABCB1 y ABCG2. Al menos en el caso de ABCB1, o P-gp tal como se hace referencia comúnmente, 5 varios fármacos de una amplia gama de clases terapéuticas pueden inhibir el transportador sin que sean sustratos del transportador. Ortólogos de estos transportadores humanos con grados variables de homología de secuencia génica existen en otras especies de mamífero, tales como ratas, ratones, perros y primates no humanos.

Los métodos inventivos son aplicables para analizar compuestos de prueba para su absorción 10 gastrointestinal en cualquier animal, preferiblemente son aplicables a mamíferos, incluyendo animales de compañía tales como perros, gatos, conejos, y son aplicables lo más preferiblemente a seres humanos. Como tal, pueden llevarse a cabo los métodos en cualquier célula que es representativa de un animal o grupo de animales de interés. Las células pueden ser líneas celulares establecidas, aisladas recientemente, o pueden ser líneas celulares producidas de novo. La célula expresa preferiblemente al menos una proteína 15 transportadora de flujo de salida de membrana, aunque en algunas realizaciones, la célula expresa 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de tales proteínas transportadoras. En algunos aspectos, puede modificarse la célula mediante ingeniería genética para expresar específicamente una proteína transportadora de flujo de salida de membrana particular, y puede modificarse mediante ingeniería genética para expresar específicamente dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana particulares. Además, pueden modificarse 20 mediante ingeniería genética tales células para expresar las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana particulares a una densidad particular, o, en células polarizadas, en una ubicación particular en la superficie celular, por ejemplo, en la superficie basal, en la superficie apical, tanto en las superficies basal como apical, o en ninguna de las superficies basal o apical. Se conocen en la técnica métodos para transformar células para que expresen un transgén de proteína de flujo de salida particular y se practican de 25 manera rutinaria, incluyendo los que se describen y se ponen como ejemplo en el presente documento. Las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana que son adecuadas para análisis usando los métodos reivindicados y las células descritas incluyen glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama. Tales transportadores pueden tener las SEQ ID NO: 6, 7 u 8, o variantes alélicas, homólogos y análogos de las mismas. 30

Preferiblemente, la célula se aísla de o alternativamente tiene las características de una célula aislada del tracto gastrointestinal del animal. Por ejemplo, la célula puede aislarse del estómago, el intestino delgado o el intestino grueso, incluyendo de cualquier subparte de estos órganos. En algunas realizaciones preferidas, las células son células intestinales, particularmente células epiteliales intestinales. En algunas realizaciones preferidas, las células son líneas celulares intestinales. En realizaciones sumamente preferidas, 35 las células son células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 o células T-84. Alternativamente, también podrían usarse células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), un tipo celular conocido por aproximarse a muchas de las características de las células epiteliales polarizadas del tracto gastrointestinal de animales, como una realización de la presente invención (Maksymowych, AB y Simpson LL, J. Biol. Chem. 273: 21950-57 (1998)). Ya se han usado células MDCK (MDR-MDCK) para valorar el transporte mediado por P-gp 40 humana de compuestos a través de la barrera hematoencefálica (Wang, Q. et al., Int. J. Pharmaceutics 288: 349-59 (2005)).

Puede producirse la modulación de la expresión de la al menos una de dichas proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana tal como se describe en las reivindicaciones. En realizaciones sumamente preferidas, se inhibe la expresión de las proteínas transportadoras. En algunos 45 aspectos, se efectúa la inhibición a nivel genético. Por ejemplo, en células modificadas mediante ingeniería genética específicamente para expresar un transgén que codifica para una proteína transportadora de flujo de salida particular, puede colocarse el transgén bajo el control de un promotor inducible. Los expertos en la técnica conocerán promotores inducibles adecuados para su uso en esta invención.

Pueden inhibirse los genes que codifican para las proteínas transportadoras de flujo de salida de 50 membrana glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama a través del uso de una variedad de otras técnicas de silenciamiento (silenciamiento de ARN) génico postranscripcional a través de los ácidos nucleicos tal como se reivindica. El silenciamiento de ARN implica el procesamiento de ARN bicatenario (ARNbc) en fragmentos de 21-28 nucleótidos pequeños mediante una enzima basada en ARNasa H (“Dicer” o “similar a Dicer”). Los productos de escisión, que son 55 ARNip (ARN de interferencia pequeño) o miARN (micro-ARN) se incorporan en complejos efectores proteicos que regulan la expresión génica de manera específica de la secuencia.

Interferencia por ARN (ARNi) es un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional mediado por ARN bicatenario (ARNbc), que es distinto de los enfoques basados en ribozimas y antisentido (véase Jain KK Pharmacogenomics (2004) 5: 239-42, para una revisión de ARNi y ARNip). La interferencia 60

por ARN es útil en un método para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en un animal tal como un ser humano, administrando al animal un ácido nucleico (por ejemplo, ARNbc) que hibrida en condiciones rigurosas con un gen que codifica para una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y atenúa la expresión del gen diana. La interferencia por ARN proporciona ARNhc o ARNip que comprende múltiples secuencias que seleccionan como diana una o más regiones del 5 gen diana de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Se cree que las moléculas de ARNbc (ARNhc o ARNip) dirigen la degradación específica de secuencia de ARNm en células de diversos tipos tras el primer procesamiento al que se someten mediante una enzima similar a ARNasa III denominada DICER (Bernstein E et al. (2001) Nature 409: 363-366) en moléculas de ARNbc más pequeñas compuestas por dos cadenas de 21 nt, teniendo cada una de ellas un grupo fosfato en 5’ y un hidroxilo en 3’, e incluye una 10 región de 19 nt precisamente complementaria a la otra cadena, de modo que hay una región dúplex de 19 nt flanqueada por proyecciones en 3’ de 2 nt. Por tanto, la ARNi está mediada por ARN de interferencia pequeños (ARNip), que normalmente comprenden una región bicatenaria de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud con proyecciones en 3’ de 1-2 nucleótidos en cada cadena, dando como resultado una longitud total de entre aproximadamente 21 y 23 nucleótidos. En células de mamíferos, el ARNbc más 15 largo que aproximadamente 30 nucleótidos induce normalmente la degradación de ARNm no específica a través de la respuesta de interferón. Sin embargo, la presencia del ARNip en células de mamíferos, en lugar de inducir la respuesta de interferón, da como resultado el silenciamiento génico específico de secuencia.

Los vectores virales o vectores de ADN codifican para ARN de horquilla corta (ARNhc) que se procesan en el citoplasma celular para dar ARN de interferencia pequeño (ARNip). En general, un ARN de 20 interferencia pequeño (ARNip) comprende un dúplex de ARN que es preferiblemente de aproximadamente 19 pares de bases de largo y opcionalmente comprende además una o dos proyecciones o bucles monocatenarios. Un ARNip puede comprender dos cadenas de ARN hibridadas juntas, o puede comprender alternativamente una cadena de ARN sencilla que incluye una parte de autohibridación. Los ARNip pueden incluir uno o más extremos de cadena libres, que pueden incluir grupos fosfato y/o hidroxilo. Los ARNip 25 incluyen normalmente una parte que hibrida en condiciones rigurosas con un transcrito diana. Una cadena del ARNip (o, la parte de autohibridación del ARNip) es precisamente complementaria a una región del transcrito diana, lo que significa que el ARNip hibrida con el transcrito diana sin un único apareamiento erróneo. En determinadas realizaciones de la invención en las que no se logra una complementariedad perfecta, generalmente se prefiere que cualquier apareamiento erróneo esté ubicado en o cerca de los extremos 30 terminales del ARNip.

Se ha mostrado que los ARNip regulan por disminución la expresión génica cuando se transfieren a células de mamíferos mediante métodos tales como transfección, electroporación, transfección mediada por liposomas catiónicos o microinyección, o cuando se expresan en células a través de cualquier variedad de enfoques basados en plásmidos. La interferencia por ARN usando ARNip se revisa en, por ejemplo, Tuschl T 35 (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-8; Yu J-Y et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 6047-52; Sui G et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA., 99: 5515-20; Paddison PJ et al. (2002) Genes and Dev. 16: 948-58; Brummelkamp TR et al. (2002) Science 296: 550-3, 2002; Miyagashi M et al. (2002) Nat. Biotech. 20: 497-500; y, Paul CP et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 505-8. Tal como se describe en estas y otras referencias, el ARNip puede consistir en dos cadenas de ácido nucleico individuales o de una cadena sencilla con una 40 región autocomplementaria que puede formar una estructura de horquilla (tallo-bucle). Una serie de variaciones en la estructura, longitud, número de apareamientos erróneos, tamaño del bucle, identidad de nucleótidos en proyecciones, etc., concuerdan con el silenciamiento génico desencadenado por ARNip eficaz. Aunque sin querer restringirse a ninguna teoría, se cree que el procesamiento intracelular (por ejemplo, mediante DICER) de una variedad de diferentes precursores da como resultado la producción de ARNip que 45 puede mediar eficazmente el silenciamiento génico. Generalmente se prefiere seleccionar exones como diana en lugar de intrones, y también puede ser preferible seleccionar secuencias complementarias a regiones dentro de la parte en 3’ del transcrito diana. Generalmente se prefiere seleccionar secuencias que contienen una razón aproximadamente equimolar de los diferentes nucleótidos y evitar tramos en los que se repite un único residuo múltiples veces. 50

Por tanto, los ARNip pueden comprender moléculas de ARN que tienen una región bicatenaria de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud con proyecciones en 3’ de 1-2 nucleótidos en cada cadena, dando como resultado una longitud total de entre aproximadamente 21 y 23 nucleótidos. Tal como se usa en el presente documento, los ARNip también incluyen diversas estructuras de ARN que pueden procesarse in vivo para generar tales moléculas. Tales estructuras incluyen cadenas de ARN que contienen dos elementos 55 complementarios que hibridan entre sí para formar un tallo, un bucle, y opcionalmente una proyección, preferiblemente una proyección en 3’. Preferiblemente, el tallo es de aproximadamente 19 pb de largo, el bucle es de aproximadamente 1-20, más preferiblemente de aproximadamente 4-10, y lo más preferiblemente de aproximadamente 6-8 nt de largo y/o la proyección es de aproximadamente 1-20, y más preferiblemente de aproximadamente 2-15 nt de largo. En determinadas realizaciones de la invención, el tallo es 60 mínimamente de 19 nucleótidos de longitud y puede ser de hasta aproximadamente 29 nucleótidos de longitud. Los bucles de 4 nucleótidos es más o menos probable que estén sometidos a restricciones estéricas

de lo que lo están los bucles más cortos y por tanto pueden preferirse. La proyección puede incluir un fosfato en 5’ y un hidroxilo en 3’. La proyección puede comprenden, pero no es necesario, una pluralidad de residuos U, por ejemplo, entre 1 y 5 residuos U. Los ARNip clásicos tal como se describieron anteriormente desencadenan la degradación de los ARNm a los que se dirigen, reduciendo también de ese modo la tasa de síntesis de proteínas. Además de los ARNip que actúan a través de la ruta clásica, determinados ARNip que 5 se unen al UTR en 3’ de un transcrito molde pueden inhibir la expresión de una proteína codificada por el transcrito molde mediante un mecanismo relacionado con pero diferenciado de la interferencia por ARN clásica, por ejemplo, reduciendo la traducción del transcrito en lugar de disminuir su estabilidad. Tales ARN se denominan micro-ARN (miARN) y son normalmente de entre aproximadamente 20 y 26 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 22 nt de longitud. Se cree que derivan de precursores más grandes conocidos como los 10 ARN temporales pequeños (ARNtp) o precursores de ARNm, que son normalmente de aproximadamente 70 nt de largo con un bucle de aproximadamente 4-15 nt (Grishok A et al. (2001) Cell 106: 23-4; Hutvagner G et al. (2001) Science 293: 834-8; Ketting RF et al. (2001) Genes Dev. 15: 2654-9). Se han identificado ARN endógenos de este tipo en varios organismos incluyendo mamíferos, lo que sugiere que este mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional puede estar extendido (Lagos-Quintana M et al. (2001) Science 294: 15 853-8, 2001; Pasquinelli AE (2002) Trends Gen. 18: 171-3). Se ha mostrado que los micro-ARN bloquean la traducción de transcritos diana que contienen sitios diana en células de mamíferos (Zeng Y et al. (2002) Mol. Cell 9: 1327-33).

Los ARNip tales como los ARNm que se producen de manera natural o artificiales (es decir, diseñados por seres humanos) que se unen dentro del UTR en 3’ (o en otra parte en un transcrito diana) e 20 inhiben la traducción pueden tolerar un mayor número de apareamientos erróneos en el dúplex ARNip/molde, y particularmente pueden tolerar apareamientos erróneos dentro de la región central del dúplex. De hecho, hay evidencia de que algunos apareamientos erróneos pueden ser deseables o pueden requerirse ya que los ARNtp que se producen de manera natural presentan frecuentemente tales apareamientos erróneos al igual que los ARNm que se ha mostrado que inhiben la traducción in vitro. Por ejemplo, cuando hibridan con el 25 transcrito diana tales ARNip incluyen frecuentemente dos tramos de complementariedad perfecta separados por una región de apareamiento erróneo. Son posibles una variedad de estructuras. Por ejemplo, el ARNm puede incluir múltiples zonas de no identidad (apareamiento erróneo). Las zonas de no identidad (apareamiento erróneo) no es necesario que sean simétricas en el sentido de que tanto la diana como el ARNm incluyen nucleótidos no apareados. Normalmente, los tramos de complementariedad perfecta son al 30 menos de 5 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 6, 7 o más nucleótidos de longitud, mientras las regiones de apareamiento erróneo pueden ser, por ejemplo, de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud.

Las estructuras de horquilla diseñadas para imitar los ARNip y precursores de ARNm se procesan de manera intracelular para dar moléculas que pueden reducir o inhibir la expresión de transcritos diana (McManus MT et al. (2002) RNA 8: 842-50). Estas estructuras de horquilla, que se basan en los ARNip 35 clásicos que consisten en dos cadenas de ARN que forman una estructura de dúplex de 19 pb se clasifican como horquillas de clase I o clase II. Las horquillas de clase I incorporan un bucle en el extremo 5’ o 3’ de la cadena del ARNip antisentido (es decir, la cadena complementaria al transcrito diana cuya inhibición se desea) pero por lo demás son idénticas a los ARNip clásicos. Las horquillas de clase II se parecen a precursores de ARNm en que incluyen una región de dúplex de 19 nt y un bucle o bien en el extremo 3’ o 40 bien en el 5’ de la cadena antisentido del dúplex además de uno o más apareamientos erróneos de nucleótidos en el tallo. Estas moléculas se procesan de manera intracelular en estructuras de dúplex de ARN pequeñas que pueden mediar el silenciamiento. Parecen ejercer sus efectos a través de la degradación de ARNm diana en lugar de a través de la represión traduccional tal como se cree que es el caso para los ARNm y ARNtp que se producen de manera natural. 45

Por tanto, es evidente que un conjunto diverso de moléculas de ARN que contienen estructuras de dúplex puede mediar el silenciamiento a través de diversos mecanismos. Para los fines de la presente invención, cualquier ARN de este tipo, del que se une una parte a un transcrito diana y reduce su expresión, ya sea desencadenando la degradación, inhibiendo la traducción, o mediante otros medios, se considera que es un ARNip, y cualquier estructura que genera tal ARNip (es decir, sirve como precursor del ARN) es útil en 50 la práctica de la presente invención.

Un método adicional de interferencia por ARN para su uso en la presente invención es el uso de los ARN de horquilla corta (ARNhc). Un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de ARNip deseada particular se suministra a una célula diana a través de transfección o infección mediada por virus. Una vez en la célula, la secuencia de ADN se transcribe de manera continua en moléculas 55 de ARN que se forman de nuevo un bucle sobre sí mismas y forman estructuras de horquilla a través del apareamiento de bases intramolecular. Estas estructuras de horquilla, una vez procesadas por la célula, son equivalentes a moléculas de ARNip transfectadas y se usan por la célula para mediar ARNi de la proteína deseada. El uso de ARNhc tiene una ventaja sobre la transfección de ARNip ya que el primero puede conducir a inhibición a largo plazo, estable de la expresión de proteínas. La inhibición de la expresión de 60 proteínas por ARNip transfectados es un fenómeno transitorio que no se produce durante períodos de tiempo

más largos que varios días. En algunos casos, esto puede preferirse y desearse. En los casos en los que son necesarios períodos de inhibición de proteínas más largos, es preferible la inhibición mediada por ARNhc. Se prefiere particularmente el uso de ARNhc. Normalmente, los vectores que codifican para ARNip son constructos que comprenden un promotor, una secuencia del gen diana que va a silenciarse en la orientación “sentido”, un espaciador, la secuencia antisentido de la secuencia génica diana, y un terminador. 5

También puede efectuarse la inhibición de la expresión de las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana mediante otros medios que se conocen y se practican fácilmente en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse ácidos nucleicos antisentido. Los transcritos de ARN antisentido tienen una secuencia de bases complementaria a parte o a la totalidad de cualquier otro transcrito de ARN en la misma célula. Se ha mostrado que tales transcritos modulan la expresión génica a través de una variedad de 10 mecanismos incluyendo la modulación del corte y empalme de ARN, la modulación del transporte de ARN y la modulación de la traducción de ARNm (Denhardt DT (1992) Ann. N Y Acad. Sci. 660: 70-6, 1992; Nellen W et al. (1993) Trends Biochem. Sci. 18: 419-23; y, Baker BF et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta. 1489: 3-18). Por consiguiente, en determinadas realizaciones de la invención, la inhibición de una o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en una célula se logra expresando una molécula de ácido 15 nucleico antisentido en la célula.

Los ácidos nucleicos antisentido son generalmente ácidos nucleicos monocatenarios (ADN, ARN, ADN modificado o ARN modificado) complementarios a una parte de un ácido nucleico diana (por ejemplo, un transcrito de ARNm) y por tanto pueden unirse a la diana para formar un dúplex. Normalmente, son oligonucleótidos que oscilan desde 15 hasta 35 nucleótidos de longitud pero pueden oscilar desde 10 hasta 20 aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Normalmente, la unión reduce o inhibe la función del ácido nucleico diana, tal como un gen que codifica para una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido pueden bloquear la transcripción cuando se unen a ADN genómico, pueden inhibir la traducción cuando se unen a ARNm, y/o pueden conducir a la degradación del ácido nucleico. Puede lograrse la inhibición de la expresión de una proteína transportadora de flujo de 25 salida de membrana mediante la administración de ácidos nucleicos antisentido o ácidos nucleicos peptídicos que comprenden secuencias complementarias a las del ARNm que codifica para la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Se conocen bien en la técnica la tecnología antisentido y sus aplicaciones y se describen en Phillips, M. I. (ed.) Antisense Technology, Methods Enzymol., 2000, Volúmenes 313 y 314, Academic Press, San Diego, y las referencias citadas en el presente documento. Véase también Crooke, S. 30 (ed.) “ANTISENSE DRUG TECHNOLOGY: PRINCIPLES, STRATEGIES, AND APPLICATIONS” (1ª Edición) Marcel Dekker; y las referencias citadas en el presente documento.

Pueden sintetizarse oligonucleótidos antisentido con una secuencia de bases que es complementaria a una parte de cualquier transcrito de ARN en la célula. Los oligonucleótidos antisentido pueden modular la expresión génica a través de una variedad de mecanismos incluyendo la modulación del 35 corte y empalme de ARN, la modulación del transporte de ARN y la modulación de la traducción de ARNm. Pueden alterarse diversas propiedades de oligonucleótidos antisentido incluyendo estabilidad, toxicidad, distribución tisular y captación celular y afinidad de unión a través de modificaciones químicas incluyendo (i) sustitución del esqueleto de fosfodiéster (por ejemplo, ácido nucleico peptídico, oligonucleótidos de fosforotioato y oligonucleótidos de fosforamidato), (ii) modificación de la base de azúcar (por ejemplo, 2’-O-40 propilrribosa y 2’-metoxietoxirribosa), y (iii) modificación del nucleósido (por ejemplo, propinil-U en C-5, tiazol-U en C-5 y fenoxazina C) (Wagner RW (1995) Nat. Medicine 1: 1116-8; Varga LV et al. (1999) Immun. Lett. 69: 217-24; Neilsen PE (1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 71-5; y, Woolf TM (1990) Nucleic Acids Res. 18: 1763-9).

También puede efectuarse la inhibición de proteínas transportadoras de flujo de salida de 45 membrana mediante el uso de ribozimas. Se ha mostrado que determinadas moléculas de ácido nucleico denominadas ribozimas o desoxirribozimas catalizan la escisión específica de secuencia de moléculas de ARN. El sitio de escisión está determinado por el apareamiento complementario de nucleótidos en la enzima de ARN o ADN con nucleótidos en el ARN diana. Por tanto, pueden diseñarse las enzimas de ARN y ADN para escindir cualquier molécula de ARN, aumentando de ese modo su tasa de degradación (Cotten M et al. 50 (1989) EMBO J. 8: 3861-6, 1989; y, Usman N et al. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 527-33).

En aspectos preferidos de la invención, las células usadas en los métodos inventivos pueden transformarse específicamente con ácidos nucleicos de silenciamiento de la transcripción tal como se reivindican, o pueden transformarse con vectores que codifican para tales ácidos nucleicos de tal manera que la célula expresa las moléculas de ácido nucleico inhibidoras. Puede llevarse a cabo la transformación de las 55 células según cualquier medio adecuado en la técnica, incluyendo los descritos y puestos como ejemplo en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico inhibidoras comprenden SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, o análogos, homólogos, derivados, o variantes alélicas de las mismas.

Según los métodos inventivos, pueden seleccionarse compuestos de prueba a una dosis única, o con dosis múltiples. En algunas realizaciones, se evalúa el compuesto de prueba en dosificaciones múltiples 60

que oscilan desde la concentración plasmática terapéutica máxima libre del compuesto (Cmáx) hasta una concentración igual a o mayor que 500 veces con respecto a la Cmáx del compuesto. En alguna realización, se evalúa el compuesto de prueba en dosificaciones múltiples que oscilan desde la Cmáx del compuesto hasta una concentración igual a o mayor que 250 veces con respecto a la Cmáx del compuesto. En algunas realizaciones, se evalúa el compuesto de prueba en dosificaciones múltiples que oscilan desde la Cmáx del 5 compuesto hasta una concentración igual a o mayor que 100 veces con respecto a la Cmáx del compuesto. En algunas realizaciones, se evalúa el compuesto de prueba en dosificación múltiples que oscilan desde la Cmáx del compuesto hasta una concentración igual a o mayor que 50 veces con respecto a la Cmáx del compuesto. En algunas realizaciones, se evalúa el compuesto de prueba en dosificaciones múltiples que oscilan desde la Cmáx del compuesto hasta una concentración igual a o mayor que 30 veces con respecto a 10 la Cmáx del compuesto. En algunas realizaciones, se evalúa el compuesto de prueba en dosificaciones múltiples que oscilan desde la Cmáx del compuesto hasta una concentración igual a o mayor que 10 veces con respecto a la Cmáx del compuesto. Puede determinarse Cmáx según cualquier medio disponible en la técnica. Los expertos apreciarán que tales medios son conocidos y de rutina en la técnica. Puede someterse a prueba el compuesto en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más concentraciones dentro de este 15 intervalo.

En algunos aspectos, se ponen en contacto múltiples compuestos de prueba con la célula para evaluar interacciones fármaco-fármaco. Se definen las interacciones fármaco-fármaco como las influencias de un fármaco sobre la farmacocinética o farmacodinamia de un segundo fármaco administrado conjuntamente al mismo sujeto. La farmacocinética se refiere a la influencia de dosis de fármacos variables y 20 de los métodos de administración sobre la concentración del fármaco en diversos tejidos corporales, tales como sangre, plasma sanguíneo, cerebro, etc., como una función del tiempo tras la administración del fármaco. La farmacodinamia se refiere al estudio de la influencia de dosis del fármaco y la vía de administración sobre la respuesta farmacológica, tal como la tensión arterial, el nivel de lípidos en sangre, el número de partículas virales infecciosas en un tejido, etc., tras la administración del fármaco. Normalmente, 25 las interacciones fármaco-fármaco se producen mediante uno de tres mecanismos: 1) dos o más fármacos compiten por la misma cantidad limitada de una enzima o proteína trasportadora responsable de su metabolismo, captación o flujo de salida en el organismo; 2) un fármaco inhibe una enzima, un transportador de captación o flujo de salida que media el metabolismo, la captación o excreción de uno o más de otros fármacos por el organismo; o 3) un fármaco mejora o inhibe la producción de una enzima, un transportador 30 de captación o el flujo de salida responsable del metabolismo, la captación o el flujo de salida de uno o más de otros fármacos en el organismo. En algunos casos, la sustancia interaccionante no es un fármaco, sino más bien un componente natural de un producto dietético, tal como un componente de un zumo de frutas, tal como zumo de pomelo, o un complemento herbal, tal como hierba de San Juan. Se han notificado ejemplos de interacción fármaco-fármaco asociados con una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 35 Por ejemplo, la biodisponibilidad oral de digoxina, un sustrato de la glicoproteína p, aumentó con talinolol (Westphal K et al. (2000) Clin. Pharmacol. Ther. 68: 6-12). En otro ejemplo, se obstaculizó el aclaramiento renal de digoxina por claritromicina dando como resultado una concentración de digoxina sistémica elevada (Wakasugi H et al. (1998) Clin. Pharmacol. Ther. 64: 123-8). Por tanto, las interacciones fármaco-fármaco mediadas por proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana pueden alterar la farmacocinética de 40 un fármaco en cuanto a la absorción, distribución y aclaramiento del fármaco, y pueden conducir a una respuesta inesperada al fármaco. Las líneas celulares con patrones variables de expresión de proteínas transportadoras de flujo de salida ofrecen la capacidad para identificar sustratos e inhibidores de tal proteína explícitamente, y por tanto hacen posible predecir posibles interacciones fármaco-fármaco y proporcionar una orientación para el ajuste del régimen de dosificación de fármacos. El 11 de setiembre de 2006, la 45 Administración de Fármacos y Alimentos de los EE.UU. (FDA) anunció una orientación en borrador que trata la importancia de ensayos in vitro para determinar interacciones fármaco-fármaco y que sugiere maneras en que podrían llevarse a cabo tales ensayos. La orientación también proporciona recomendaciones sobre estudios clínicos humanos que pueden usarse para confirmar o refutar los hallazgos in vitro (http://www.fda.gov/cder/drug/drugInteractions/default.htm). 50

También se presentan métodos para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal que utilizan un análisis paralelo de la inhibición de diferentes proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en células separadas. Por ejemplo, un compuesto de prueba dado puede seleccionarse en un panel de células, siendo cada célula en el panel un silenciamiento para la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana diferente, o una combinación diferente de proteínas 55 transportadoras de flujo de salida de membrana. Usando tales métodos, los expertos en la técnica pueden determinar ventajosamente la contribución de cada proteína transportadora individual o de combinaciones particulares de proteínas transportadoras a la absorción gastrointestinal de un compuesto de prueba.

Por consiguiente, en algunos aspectos, los métodos inventivos comprenden inhibir la expresión de una primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula e inhibir la 60 expresión de una segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula, poner en contacto las células primera y segunda con un compuesto de prueba, y medir el transporte

transcelular del compuesto de prueba en las células primera y segunda. Después pueden compararse las mediciones de transporte transcelular de cada una de las células primera y segunda con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. Las mediciones indican el papel de las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana primera y 5 segunda en el transporte transcelular del compuesto de prueba. Además, las mediciones en relación con los valores de referencia son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal de interés.

En algunos aspectos, los métodos comprenden inhibir proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana adicionales tales como una tercera, cuarta, quinta, sexta, o más proteínas transportadoras, o 10 combinaciones de las mismas, en células separadas, ampliando de ese modo el número de células en el panel. Por tanto, en realizaciones preferidas, los métodos comprenden inhibir la expresión de una primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula, inhibir la expresión de una segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula, e inhibir la expresión de una tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una tercera célula, poner 15 en contacto las células primera, segunda y tercera con un compuesto de prueba, y medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera, segunda y tercera. Después pueden compararse las mediciones de transporte transcelular de cada una de las células primera, segunda y tercera con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal. 20 Las mediciones indican el papel de las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana primera, segunda y tercera en el transporte transcelular del compuesto de prueba. Además, las mediciones en relación con los valores de referencia son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal de interés.

Las variaciones en tales métodos comprenden inhibir la expresión de dos o más proteínas 25 transportadoras de flujo de salida de membrana en una primera célula, y al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula. En algunos aspectos, puede inhibirse la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana, por ejemplo, por medio de una única molécula de ácido nucleico que puede inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana. La proteína transportadora de flujo de salida de membrana 30 en la segunda célula puede ser la misma que una de las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en la primera célula, o puede ser una proteína transportadora de flujo de salida de membrana diferente. Estos métodos proporcionan al experto la ventaja de que puede discernir y caracterizar cualquier efecto sinérgico de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en la célula.

Las células segunda, tercera, cuarta (y similares) pueden ser líneas celulares establecidas, 35 aisladas recientemente o pueden ser líneas celulares producidas de novo. Preferiblemente, las células expresan al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, aunque en algunas realizaciones, la célula expresa 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de tales proteínas transportadoras. En algunos aspectos, las células pueden modificarse mediante ingeniería genética específicamente para expresar una proteína transportadora de flujo de salida de membrana particular, y pueden modificarse mediante ingeniería 40 genética específicamente para expresar dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana particulares. Además, pueden modificarse mediante ingeniería genética tales células para expresar las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana particulares a una densidad particular, o, en células polarizadas, en una ubicación particular en la superficie celular, por ejemplo, en la superficie basal, en la superficie apical, tanto en la superficie basal como en la apical, o en ninguna de las superficies basal o apical. 45

Los ejemplos no limitativos de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana que se contemplan para análisis usando paneles de células incluyen glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama.

Preferiblemente, las células se aíslan de, o alternativamente tienen las características de una célula aislada del tracto gastrointestinal del animal de interés. Por ejemplo, pueden aislarse las células del 50 estómago, el intestino delgado o el intestino grueso, incluyendo de cualquier subparte de estos órganos. En algunas realizaciones preferidas, las células son células intestinales, particularmente células epiteliales intestinales. En algunas realizaciones preferidas, las células son líneas celulares intestinales, que pueden transformarse de manera neoplásica, o inmortalizarse de otro modo. En realizaciones sumamente preferidas, las células son células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 o células T-84. 55

Puede medirse el transporte transcelular del compuesto de prueba en cualquiera de las células primera, segunda, tercera o más según cualquier medio adecuado en la técnica. También pueden usarse mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), que se llevan a cabo rutinariamente. Pueden usarse cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM) y CL-espectrometría de masas en tándem (CL-EM-EM) (van Breemen RB, et al. (2005) Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 1: 175-85). Además, pueden usarse 60

colorantes fluorescentes o radioisótopos, por ejemplo, marcando el compuesto de prueba con un colorante o isótopo aceptable según puedan detectarse convenientemente los marcadores mediante fluorescencia o recuento por centelleo líquido. Los ejemplos no limitativos incluyen rodamina 123 fluorescente, y ciclosporina A, digoxina, ritonavir, taxol, verapamilo y vinblastina radiomarcados (Troutman MT (2003) Pharm. Res. 20: 1210-24). 5

Puede medirse la permeabilidad unidireccional (transporte mucoso a seroso) o bidireccional (transporte mucoso a seroso y seroso a mucoso) de las células. En el transporte unidireccional, se añade una disolución de fármaco al lado apical (mucoso) de las monocapas celulares, se recogen muestras del lado basolateral (seroso), y se determina un coeficiente de permeabilidad mediante el fármaco acumulativo transportado a su través dividido entre el tiempo, área superficial y concentración de dosis. En el transporte 10 bidireccional, se determinan ambos coeficientes de permeabilidad en las direcciones apical a basolateral (seroso a mucoso) y basolateral a apical (mucoso a seroso). Se han usado varias líneas celulares epiteliales de mamíferos sembradas en placa sobre el pocillo superior de placas de cultivo tisular de doble pocillo con el fin de estudiar la permeabilidad y el transporte de diversos productos químicos, incluyendo fármacos, toxinas y nutrientes (Weinstein K et al. en “Pharmaceutical Profiling in Drug Discovery for Lead Selection”, R.T. 15 Borchardt, E.H. Kerns, C.A. Lipinski, D.R. Thakker y B. Wang, eds., págs. 217-234, Am. Assoc. Pharm. Scientists, Arlington, VA, 2004. J. Polli y C. Serabjit-Singh, íbid., págs. 235-255.)

Pueden compararse directamente las mediciones de transporte transcelular del compuesto de prueba con valores de referencia del transporte transcelular, es decir, tasa de absorción gastrointestinal, eficacia, capacidad, etc., de compuestos en los que se ha caracterizado anteriormente el transporte 20 transcelular. Por ejemplo, pueden compararse las mediciones obtenidas a partir del compuesto de prueba con valores de referencia de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal, con alta absorción gastrointestinal o con cualquier combinación de tales valores de referencia. Se proporcionan ejemplos no limitativos de tales valores de referencia en la tabla 2 (Artursson P. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 880-5). 25

Tabla 2. Correlación de la permeabilidad y absorción de C2BBe1 en células humanas.

Fármaco

Papp en células C2BBE1 (10-6 cm/s) % de absorción en ser humano

Corticosterona

54,5 100

Testosterona

51,8 100

Propranolol

41,9 90

Alprenolol

40,5 93

Warfarina

38,3 98

Metoptolol

27 95

Felodipino

22,7 100

Hidrocortisona

21,5 89

Dexametasona

12,5 100

Ácido salicílico

11,9 100

Ácido acetilsalicílico

2,4 100

Practolol

0,9 100

Terbutalina

0,38 73

Atenolol

0,2 50

Manitol

0,18 16

Arginina-vasopresina

0,14 0

Sulfasalazina

0,13 13

1-Desamino-8-D-arginina

0,13 1

Olsalazina

0,11 2

Polietilenglicol

0,052 0

Los valores de medición del compuesto de prueba obtenidos experimentalmente en relación con los valores de referencia son indicativos, y al menos predictivos, de la absorción del compuesto de prueba en el tracto gastrointestinal del animal de interés. Se contempla que los compuestos caracterizados según los métodos de la invención pueden servir como compuestos de referencia, que representan el grado relativo de 5 absorción gastrointestinal, frente a los que pueden compararse compuestos de prueba adicionales.

La invención también presenta métodos para inhibir la expresión de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en células. En algunas realizaciones, los métodos comprenden transformar de manera estable una célula con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. La molécula de ácido nucleico puede inhibir la expresión 10 inhibiendo la transcripción del gen que codifica para la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, o puede inhibir la expresión inhibiendo la traducción de ARNm en la proteína.

La molécula de ácido nucleico puede ser cualquier gen regulador o fragmento de un gen cuya expresión o presencia en la célula inhibe la transcripción o traducción del producto génico de la proteína transportadora de flujo de salida. En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico es ARN. En 15 realizaciones más preferidas, la molécula de ácido nucleico es ARN de interferencia, y es preferiblemente bicatenario. Los ejemplos no limitativos del ARN de interferencia incluyen ARNip y ARNhc.

Se ha descubierto según la presente invención que determinadas moléculas de ácido nucleico individuales pueden inhibir la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana. Por consiguiente, pueden usarse ventajosamente tales moléculas de ácido nucleico en cualquiera 20 de los métodos inventivos descritos y puestos como ejemplo en el presente documento. Un ejemplo no limitativo de una molécula de ácido nucleico individual que puede inhibir dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana es SEQ ID NO: 25. Se ha demostrado que esta molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de al menos tanto BCRP como MRP2. La observación de que una única molécula de ácido nucleico puede inhibir dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana representa 25 un avance significativo para la determinación de la contribución relativa de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana seleccionadas en la absorción y el transporte celular de compuestos.

Puede transformarse una célula con tales moléculas de ácido nucleico según cualquier medio disponible en la técnica tal como los descritos o puestos como ejemplo en el presente documento. Se prefiere que las células se transformen de manera estable con un vector que comprende una secuencia de ácido 30 nucleico que codifica para tales moléculas de ácido nucleico reguladoras. Puede usarse cualquier vector adecuado para la transformación de la célula particular de interés en la presente invención. En realizaciones preferidas, el vector es un vector viral. En realizaciones más preferidas, el vector es un vector lentiviral.

Las moléculas de ácido nucleico reguladoras incluyen las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, y variantes alélicas de las mismas. Las proteínas transportadoras de flujo de salida de 35 membrana son glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 y proteína de resistencia al cáncer de mama.

Las células preferidas que pueden seleccionarse como diana para la modulación, particularmente inhibición, de la expresión de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana pueden ser cualquier célula que expresa tales proteínas transportadoras. Tales células pueden expresar las proteínas 40 transportadoras de manera natural, o pueden modificarse mediante ingeniería genética las células para expresar las proteínas transportadoras. Las células pueden ser recién aisladas de un organismo huésped, o

pueden ser líneas celulares. Se prefiere que tales células sean de un linaje gastrointestinal, y se prefiere particularmente que tales células sean células epiteliales intestinales. Los ejemplos no limitativos de líneas celulares adecuadas para la regulación genética según los métodos inventivos incluyen células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29, células T-84 y células HRT-18.

La invención también presenta moléculas de ácido nucleico aisladas para la regulación genética de 5 la expresión del transporte de flujo de salida de membrana. Considerada en cuanto a sus secuencias, las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican para secuencias reguladoras, particularmente inhibidoras, incluyen las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, y variantes alélicas, homólogos y mutantes naturales de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. Debido a que se espera que tales variantes y homólogos presenten determinadas diferencias en la secuencia 10 de nucleótidos, esta invención proporciona polinucleótidos aislados que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% o 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% u 80%, incluso más preferiblemente el 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, e incluso más preferiblemente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, y lo más preferiblemente el 96%, 15 97%, 98% y 99% o más con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. Debido a la probable variación de secuencia natural que existe entre los genes que codifican para estas secuencias reguladoras en diferentes individuos, un experto en la técnica esperaría encontrar este nivel de variación, mientras que manteniéndose al mismo tiempo las propiedades únicas de los polinucleótidos de la presente invención. Por consiguiente, tales variantes y homólogos se consideran sustancialmente las mismas 20 unas que otras y están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Pueden prepararse moléculas de ácido nucleico de la invención mediante dos métodos generales: (1) pueden sintetizarse a partir de nucleótidos trifosfato apropiados, o (2) pueden aislarse a partir de fuentes biológicas. Ambos métodos utilizan protocolos bien conocidos en la técnica.

La disponibilidad de información de la secuencia de nucleótidos tal como la secuencia de ácido 25 nucleico completa de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, por ejemplo, las SEQ ID NO: 6-8, permite la preparación de una molécula de ácido nucleico aislada de la invención mediante síntesis de oligonucleótidos. Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos mediante el método de la fosforamidita empleado en el sintetizador de ADN 38A de Applied Biosystems o dispositivos similares. Puede purificarse el constructo resultante según métodos conocidos en la técnica, tales como cromatografía líquida de alta 30 resolución (HPLC). Entonces una molécula de ADN sintético así construida puede clonarse y amplificarse en un vector apropiado.

Pueden mantenerse los ácidos nucleicos de la presente invención como ADN en cualquier vector de clonación conveniente. En una realización preferida, se mantienen clones en vector de clonación/expresión de plásmido, pudiendo propagarse cualquiera de los cuales en una célula huésped 35 procariota o eucariota adecuada.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ADNc, ADN genómico, ARN, y fragmentos de los mismos que pueden ser monocatenarios, bicatenarios o incluso tricatenarios. Por tanto, esta invención proporciona oligonucleótidos (cadenas sentido o antisentido de ADN o ARN) que tienen secuencias que pueden hibridar con al menos una secuencia de una molécula de ácido nucleico de la 40 presente invención, en particular, las SEQ ID NO: 6-8. Tales oligonucleótidos son útiles como sondas para detectar genes que codifican para proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana, o para la regulación positiva o negativa de la expresión de genes que codifican para una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en o antes de la traducción del ARNm en proteínas. Los métodos en los que pueden utilizarse oligonucleótidos o polinucleótidos como sondas para tales ensayos incluyen, pero no se 45 limitan a: (1) hibridación in situ; (2) hibridación de tipo Southern (3) hibridación de tipo Northern; y (4) reacciones de amplificación distribuidas tales como reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y reacción en cadena de la ligasa (LCR).

También se presentan según la presente invención vectores y kits para producir células huésped transgénicas que comprenden un polinucleótido que codifica para una secuencia reguladora para inhibir la 50 expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, u homólogo, análogo o variante de la misma en una orientación sentido o antisentido, o un constructo bajo el control de promotores específicos de tejidos o células y/u otras secuencias reguladoras. Tales vectores son adecuados para modular, y preferiblemente inhibir, la expresión de cualquier proteína transportadora de flujo de salida de membrana. En realizaciones preferidas, la proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, 55 proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama.

Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células vegetales, células bacterianas, de levaduras y otras células de hongos, células de insectos y células de mamíferos. Se prefieren más las células humanas. Incluso se prefieren más células epiteliales intestinales humanas. Las más

preferidas son células Caco-2, células C2BBe1, células HT-29 o células T-84.

Los vectores para transformar una amplia variedad de estas células huésped se conocen bien por los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levaduras (YAC), así como otros vectores bacterianos, de levaduras y virales. En aspectos preferidos de la invención, se usan vectores 5 virales. Se prefiere particularmente que se usen vectores lentivirales.

Normalmente, los kits para producir células huésped transgénicas contendrán uno o más vectores apropiados e instrucciones para producir las células transgénicas usando el vector. Los kits pueden incluir además uno o más componentes adicionales, tales como medios de cultivo para cultivar las células, reactivos para realizar la transformación de las células y reactivos para someter a prueba las células transgénicas para 10 determinar la expresión o regulación génica, por nombrar sólo unos pocos.

En una realización, se coloca la región codificante de la secuencia reguladora bajo un promotor constitutivo potente, tal como los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, -actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano, y otros. Además, muchos promotores virales funcionan de constitutiva en células 15 eucariotas y son adecuados para su uso en la presente invención. Tales promotores virales incluyen sin limitación, promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Maloney, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de Epstein Barr (VEB), virus del sarcoma de Rous (VSR) y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. 20 Los expertos en la técnica conocen otros promotores. En una realización, se coloca la región codificante de la secuencia reguladora bajo un promotor inducible tal como el promotor de metalotioneína, promotor inducible de tetraciclina, promotor inducible de doxiciclina, promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE) tal como proteína cinasa R 2’,5’-oligoadenilato sintetasas, genes Mx, ADAR1, y similares. Los expertos en la técnica conocerán otros promotores inducibles adecuados. 25

Pueden usarse los vectores de la invención para transformar diversas células con las diversas secuencias de ácido nucleico reguladoras de la invención. Por tanto, otro aspecto de la invención presenta células huésped transformadas con vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de ácido nucleico para modular, preferiblemente inhibir, la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Se conocen numerosas técnicas en la técnica para la 30 introducción de genes foráneos en células y pueden usarse para construir las células recombinantes con fines de llevar a cabo los métodos inventivos, según las diversas realizaciones de la invención. La técnica usada debe proporcionar la transferencia estable de la secuencia génica heteróloga a la célula huésped, de tal manera que la secuencia génica heteróloga pueda heredarse y expresarse por la progenie celular, y de modo que no se alteren el desarrollo y las funciones fisiológicas necesarios de las células receptoras. Las 35 técnicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, transferencia cromosómica (por ejemplo, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas), métodos físicos (por ejemplo, transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, portador de liposomas), transferencia mediante vectores virales (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en Cline MJ (1985) Pharmac. Ther. 29: 69-92). Es preferible que se 40 use un vector viral para transformar las células de la invención. Es más preferible que el vector viral sea un vector lentiviral.

Pueden crearse células con silenciamiento con expresión inhibida de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana inhibiendo la traducción del ARNm que codifica para la proteína transportadora mediante “silenciamiento génico postranscripcional”. Puede utilizarse el gen de la especie seleccionado como 45 diana para la regulación por disminución, o un fragmento del mismo, para controlar la producción de la proteína codificada. Pueden usarse moléculas antisentido de longitud completa para este fin. Alternativamente, pueden utilizarse oligonucleótidos antisentido dirigidos a regiones específicas de ARNm que son críticos para la traducción. El uso de moléculas antisentido para disminuir los niveles de expresión de un gen predeterminado se conoce en la técnica. Pueden proporcionarse moléculas antisentido in situ para 50 transformar células con un constructo de ADN que, tras la transcripción, produce las secuencias de ARN antisentido. Pueden diseñarse tales constructos para producir secuencias antisentido parciales o de longitud completa. Puede mejorarse este efecto de silenciamiento génico sobreproduciendo de manera transgénica tanto ARN sentido como antisentido de la secuencia codificante del gen de modo que se produce una alta cantidad de ARNbc (por ejemplo, véase Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 13959-64). 55 Con respecto a esto, se ha encontrado que son particularmente eficaces secuencias que contienen ARNbc que corresponden a una parte o a la totalidad de al menos un intrón. En una realización, se expresa parte o toda la cadena antisentido de la secuencia codificante mediante un transgén. En otra realización, se expresan de manera transgénica cadenas sentido y antisentido de hibridación de parte o la totalidad de la secuencia codificante para una o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana. Las células de la 60

invención, células C2BBE1 transducidas con lentivirus que codifican para moléculas de ácido nucleico interferentes (las SEQ ID NO: 1, 3, 21, 24 y 25), se han puesto en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 6 de noviembre de 2007 y se les han asignado los números de registro PTA-8752, PTA-8753, PTA-8751, PTA-8754 y PTA-8755, respectivamente.

La invención también presenta kits para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en 5 animales. En algunas realizaciones, los kits comprenden una célula que se ha transformado con al menos una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, así como instrucciones para usar el kit en un método para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en animales. Los kits de la invención pueden comprender además una segunda célula transformada con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de una segunda 10 proteína transportadora de flujo de salida de membrana. El kit de la invención también puede comprender además una segunda y tercera células transformadas con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de una segunda y tercera proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.

Las células de los kits pueden ser células Caco-2, y preferiblemente son células C2BBe1. Sin embargo, puede usarse cualquier célula que expresa de manera estable al menos una proteína 15 transportadora de flujo de salida de membrana de interés. Pueden transformarse las células con cualquier molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana de interés, tal como pero sin limitarse a, las que se describen y se ponen como ejemplo en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico usada para transformar las células puede tener al menos una de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, o variantes alélicas de 20 las mismas.

En los kits inventivos, la proteína transportadora de flujo de salida de membrana de interés cuya expresión se inhibe mediante la transformación de la célula con el ácido nucleico interferente puede ser cualquier proteína transportadora de flujo de salida conocida en la técnica, o descubierta posteriormente. En realizaciones preferidas, la proteína transportadora de flujo de salida de membrana es al menos una de 25 glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama.

En algunas realizaciones, los kits inventivos comprenden una célula que expresa una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, un vector lentiviral para la transformación de la célula, y opcionalmente comprende al menos una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de al menos una 30 proteína transportadora de flujo de salida de membrana expresada por la célula. Por ejemplo, puede subclonarse dicha molécula de ácido nucleico en el vector lentiviral, y puede usarse el vector para transformar la célula. Se contempla que puede subclonarse cualquier ácido nucleico que puede inhibir la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana en el vector lentiviral, y usarse para transformar la célula para inhibir la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida. Los kits de esta 35 realización pueden comprender instrucciones para usar el kit en un método para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en animales. Las instrucciones también pueden enseñar cómo subclonar un ácido nucleico inhibidor en el vector lentiviral.

La invención también presenta métodos para identificar compuestos que inhiben la actividad biológica de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. Se prefiere que la actividad 40 biológica que se inhibe sea la actividad de flujo de salida de la proteína transportadora. En algunas realizaciones, los métodos comprenden inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula, poner en contacto la primera célula con un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y determinar la actividad biológica de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula. Los métodos también comprenden poner 45 en contacto una segunda célula en la que la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana no se inhibe con un compuesto de prueba y un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y en paralelo, poner en contacto una segunda célula en la que la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana no se inhibe con un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y determinar la actividad biológica de la proteína 50 transportadora de flujo de salida de membrana en la segunda célula en presencia y ausencia del compuesto de prueba. Tras determinarse la actividad biológica de la proteína transportadora de membrana para la primera célula, la segunda célula en presencia del compuesto de prueba, y la segunda célula en ausencia del compuesto de prueba, pueden compararse las actividades biológicas. Una disminución en la actividad biológica en la segunda célula en presencia del compuesto de prueba en relación con la actividad biológica 55 en la segunda célula en ausencia del compuesto de prueba, y una identidad al menos parcial del valor determinado para la actividad biológica de la proteína transportadora de membrana en la segunda célula en presencia del compuesto de prueba con el valor determinado para la actividad biológica en la primera célula es indicativo de que el compuesto de prueba inhibe específicamente la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 60

El silenciamiento génico de la expresión de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana inhibe aproximadamente el 20% de la actividad de flujo de salida de la proteína transportadora, inhibe frecuentemente aproximadamente el 50% de la actividad, y puede inhibir el 80% o más de la actividad, tal como se pone como ejemplo en el presente documento. Por tanto, por “identidad al menos parcial” se entiende que la inhibición química de una proteína transportadora por un compuesto de prueba puede igualar 5 o superar los niveles de inhibición de la actividad de flujo de salida determinada para células con silenciamiento, o puede disminuir por debajo de los niveles de inhibición la actividad de flujo de salida de células con silenciamiento. La identidad se refiere a la inhibición de la actividad de flujo de salida. Para fines de ilustración, la inhibición genética de una primera célula puede proporcionar una inhibición del 90% de actividad de flujo de salida en la primera célula, en relación con los controles. En comparación, el compuesto 10 de prueba puede proporcionar una inhibición del 80% de la actividad de flujo de salida, en relación con los controles. Aunque el compuesto de prueba en este escenario proporciona menos inhibición que el silenciamiento genético, el inhibición del 80% proporciona una identidad al menos parcial con la inhibición del 90% del silenciamiento genético. En este ejemplo, la inhibición del 90% por el compuesto de prueba sería identidad total o completa. 15

En algunas realizaciones de los métodos inventivos, inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula comprende transformar la primera célula con una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico interferente tal como se describe y se pone como ejemplo en el presente documento. En realizaciones preferidas, la 20 molécula de ácido nucleico es ARN, y en realizaciones más preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26 o variantes alélicas de las mismas.

En algunas realizaciones sumamente preferidas, la proteína transportadora de flujo de salida de membrana de interés es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína 25 de resistencia al cáncer de mama. La glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama puede ser la diana del silenciamiento genético en la primera célula, y seleccionándose la diana de inhibición química en la segunda célula. En algunas realizaciones, la primera célula o la segunda célula es una célula Caco-2, o una célula C2BBe1, o combinaciones de las mismas. 30

Puede usarse cualquier sustrato conocido de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana de interés en los métodos de selección. Los ejemplos no limitativos de tales sustratos incluyen digoxina para la glicoproteína P, vinblastina o dinitrofenil-S-glutatión para la proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2, y mitoxantrona o estrona-3-sulfato para la proteína de resistencia al cáncer de mama.

En algunos aspectos, los métodos inventivos de selección del compuesto de prueba pueden 35 modificarse y adaptarse para seleccionar los múltiples compuestos de prueba. Por ejemplo, pueden inhibirse dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana en la primera célula, y al menos se ponen en contacto uno, preferiblemente dos o más compuestos de prueba con la segunda célula. La actividad biológica, tal como actividad de flujo de salida, de cada proteína de flujo de salida de membrana que se inhibe en la primera célula, y que se expresa en la segunda célula, se determina entonces en presencia o 40 ausencia de un compuesto de prueba, y se comparan los valores determinados de la actividad biológica tal como se describió anteriormente. Como tal, una disminución en la actividad biológica en la segunda célula en presencia del/de los compuesto(s) de prueba en relación con la actividad biológica en la segunda célula en ausencia del/de los compuesto(s) de prueba, y una identidad al menos parcial del valor determinado para la actividad biológica de la(s) proteína(s) transportadora(s) de membrana en la segunda célula en presencia 45 del/de los compuesto(s) de prueba con el valor determinado para la actividad biológica en la primera célula es indicativo de que el/los compuesto(s) de prueba inhibe(n) específicamente la(s) proteína(s) transportadora(s) de salida de membrana.

Se contempla que los compuestos identificados mediante cualquiera de los métodos de selección inventivos anteriores se contemplan están dentro del alcance de esta invención. Tales compuestos son 50 preferiblemente inhibidores de proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana, y más preferiblemente son inhibidores de P-gp, MRP2 o BCRP.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir la invención con mayor detalle. Pretenden ilustrar, y no limitar, la invención.

EJEMPLO 1 55

Procedimientos experimentales generales

Línea celular. Se usó la línea celular parental, C2BBe1 (número de registro de ATCC CRL-2102)

en los experimentos descritos en el presente documento para evaluar la absorción potencial de moléculas de fármaco candidatas. La línea celular C2BBe1 se derivó a partir de la línea celular Caco-2 en 1988 mediante dilución limitante. Se seleccionó el clon basándose en la homogeneidad morfológica y la localización de villina apical exclusiva. Las células C2BBe1 forman una monocapa polarizada con un borde en cepillo (BB) apical morfológicamente comparable al del colon humano. Los BB aislados contienen las proteínas de 5 microvellosidades villina, fimbrina, sacarasa-isomaltasa, BB miosina-1 y las proteínas de la membrana terminal fodrina y miosina II. Las células expresan niveles sustanciales de BB miosina 1 similar a la del enterocito humano. Aunque clonales, y mucho más homogéneas que la línea celular Caco-2 parental con respecto a expresión de BB, estas células son todavía heterogéneas para la longitud de las microvellosidades, agregación de las microvellosidades y niveles de expresión de determinadas proteínas de 10 BB.

Siembra de células y control de calidad. Se prepararon dispositivos Transwell® (Corning, Inc., Coming, NY), que contenían monocapas de células, tal como sigue: se prepararon hasta una o dos docenas de dispositivos Transwell® de 12 pocillos a la vez a partir del mismo matraz de disolución madre original. Se volvieron a cultivar cualquiera de las células no usadas para la siembra en dispositivos Transwell® en 15 matraces de cultivo tisular de disolución madre T-150. Se pretrató cada inserto de un dispositivo Transwell® de 12 pocillos con colágeno de cola de rata para estimular la unión celular. Entonces, se añadieron 1,5 ml de medios de cultivo celular (90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal) a los pocillos inferiores de un dispositivo Transwell® de 12 pocillos. Se separaron las células de matraces de cultivo tisular T-150 mediante tripsinización y se resuspendieron en medios de cultivo 20 celular. Se dividieron las agrupaciones de células pipeteando reiteradas veces para generar una suspensión uniforme de células. Se contó el número de células en suspensión usando un hemocitómetro. Se añadió un medio de cultivo celular complementario a la suspensión celular para llevar el recuento celular hasta aproximadamente 136.000 células por ml. Se añadieron 0,5 ml de suspensión celular, que contenía aproximadamente 68.000 células, a cada pocillo superior del dispositivo Transwell® de 12 pocillos. Se 25 dejaron que las células se unieran durante la noche y se alimentaron con medio de cultivo celular nuevo al día siguiente añadiendo 0,5 ml de medio a la cámara superior y 1,5 ml de medio a la cámara inferior de cada pocillo. Se cambió el medio cada dos días durante al menos 20 días antes de someter a prueba un dispositivo seleccionado al azar de cada lote para determinar la confluencia celular y la función como transportador.

Se llevó a cabo la prueba de control de calidad (QC) de un lote de dispositivos Transwell® tal 30 como sigue: se retiraron insertos seleccionados al azar de un lote de dispositivos Transwell® para el ensayo de QC. Se colocaron las células en una placa inferior de Transwell® de blanco que contenía solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a pH 7,4 que contenía HEPES 10 mM y glucosa (HBSSg) 15 mM precalentado hasta 37ºC. Se aspiró el medio de los pocillos y se usó HBSSg para enjuagar las monocapas celulares sobre los insertos. Se añadió HBSSg nuevo después de que se lavaron las monocapas, se retiraron los insertos de 35 la placa de ensayo y se determinó el valor de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de las monocapas usando un aparato de medición de resistencia eléctrica transepitelial ENDOHM (World Precision Instruments).

Se consideran aceptables las monocapas que tenían un valor de TEER superior a 100 ohm/cm2 para su uso en estudios de permeabilidad. Si el valor de TEER disminuye por debajo de este intervalo, se volvió a cultivar el resto del lote con medio nuevo durante un tiempo adicional y se volvió a someter a prueba. 40 Si el lote falló tres veces, se rechazó el lote completo. Se sometieron a prueba pocillos de muestra del lote que estuvieron por encima del límite aceptable para determinar la permeabilidad de compuestos de referencia, tal como sigue: se añadió la siguiente disolución de QC precalentada a la cámara superior del inserto de Transwell®; amarillo lucifer 0,5 mM, atenolol 10 M, propranolol 10 M, pindolol 10 M y digoxina 10 M en HBSSg a pH 7,4  0,2. Los pocillos inferiores contenían HBSSg precalentado hasta 37ºC. Se 45 colocó el dispositivo Transwell en un incubador humidificado y se incubó durante 2 horas a 37°C en una atmósfera que contenía CO2 al 5%. Al término del periodo de incubación, se retiraron muestras del pocillo inferior para análisis del contenido en amarillo lucifer mediante detección por fluorescencia, y los demás compuestos mediante CL/EM/EM.

Se calcularon los valores de permeabilidad a partir de las concentraciones del donador (pocillo 50 superior) (pocillo superior) y los aumentos netos en concentraciones del receptor (pocillos inferiores) en el intervalo de toma de muestras de 2 horas. Se calculó la permeabilidad durante el intervalo de tiempo, Papp (t1-t2), según la siguiente fórmula: Papp(t1-t2) = ((Ct2-Ct1)/(t2-t1)) x Vr/(A x Cd). Ct2-Ct1 es la diferencia de concentración acumulativa en el compartimento receptor (inferior) en cada intervalo de tiempo en M, (en este ejemplo se supone que Ct1 es “0” debido a que se usa el intervalo de tiempo completo (120 min.) en el 55 cálculo); Vr es el volumen del compartimento receptor (en cm3); A es el área de la monocapa celular (1,13 cm2 para Transwell® de 12 pocillos) y Cd es la concentración en el compartimento de muestra donador (pocillo superior) en M, que es igual a la concentración en la disolución donadora descrita anteriormente. La permeabilidad aparente para cada compuesto usado para fines de QC era el promedio de todos los valores de Papp calculados para todos los duplicados sometidos a prueba, normalmente 3 insertos duplicados por 60 condición de ensayo.

Se repitió este ensayo añadiendo la disolución de QC al pocillo inferior del dispositivo Transwell® y midiendo la concentración de digoxina en el pocillo superior tras 2 horas. Un Papp calculado para transportar digoxina desde el pocillo inferior hasta el superior que es al menos 3 veces mayor que el calculado para transportar desde el pocillo superior hasta el inferior indica la expresión funcional de P-gp en las monocapas celulares. 5

ARNhc. Para silenciar la actividad y expresión de P-gp en la línea celular parental C2BBe1, se usó tecnología de ARNi. El objetivo era el silenciamiento a largo plazo del gen de P-gp. Se diseñaron cinco dúplex de ARNhc de 21 nucleótidos (las SEQ ID NO: 1-5) a partir de cinco partes diferentes del genoma de P-gp humana (número de registro de Gen Bank NM000927) usando la base de datos de búsqueda MISSION ® del sitio web de Sigma-Aldrich®, que se produce y se distribuye bajo licencia del Instituto de Tecnología de 10 Massachusetts.

Ensayo de calceína-AM. Para determinar la actividad de la proteína P-gp, se realizaron ensayos de calceína-AM. Calceína-AM (éster tetraacetoximetílico de 3’,6’-di(O-acetil-2’,7’-bis[N,N-bis(carboximetil)-aminometil]fluoresceína) es un éster hidrófobo de la calceína de molécula fluorescente. Se convierte la calceína-AM en la calceína original fluorescente mediante esterasas intracelulares. La calceína-AM también 15 es un sustrato de P-gp (patente estadounidense nº 5.872.014). La calceína-AM no puede entrar fácilmente a las células cuando está presente P-gp en la membrana celular y es funcional. Sin embargo, cuando no está presente P-gp o no es funcional, la calceína-AM puede entrar fácilmente en una célula y convertirse rápidamente en su homólogo fluorescente, calceína. Por tanto, en el ensayo de calceína-AM, la alta fluorescencia intracelular es una indicación de baja expresión o función de P-gp. 20

Para determinar la actividad de P-gp, se sembraron células en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. Tras 48 horas, se retiraron los medios de cultivo celular y se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tras el lavado, se incubaron las células con calceína-AM 1 M durante 30 minutos. Se usaron células parentales tratadas con ciclosporina A, un inhibidor de P-gp establecido, como control positivo para verificar que la inhibición de P-gp aumentó la fluorescencia 25 intracelular en líneas celulares parentales. Tras la incubación con calceína-AM, se enjuagaron las células con tampón de control nuevo y se midió la fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia Fluo-star (BMG Lab Technologies, NC) con filtros de excitación y emisión fijados a longitudes de onda de 485 nm y 538 nm, respectivamente.

RT-PCR. Se extrajo el ARN total de células según el siguiente protocolo. Se recogieron las células 30 del cultivo mediante centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de reactivo TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. Se transfirió la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,5 ml, al que se le añadieron 200 l de cloroformo, seguido por un periodo de incubación adicional de 5 minutos con agitación. Tras la incubación, se centrifugó la suspensión a 12.000 x g durante 12 minutos a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 1,5 ml estéril, nuevo y se 35 complementó con 0,5 ml de 2-propanol por 1 ml de reactivo TRIzol y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Entonces se centrifugó la mezcla a 12.000 x g durante 12 minutos adicionales a 4ºC. Tras la centrifugación, se retiró el sobrenadante y se lavó el sedimento con etanol al 75%. Se centrifugó nuevamente la muestra a 7500 X g durante 5 minutos a 4ºC, seguido por la retirada del sobrenadante. Se dejó secar el sedimento al aire a temperatura ambiente. Se resuspendió el sedimento en agua libre de 40 nucleasas precalentada (55ºC) y se incubó a 55ºC durante 10 minutos. Se cuantificaron el rendimiento y la pureza de ARN mediante la absorbancia a 260 nm y 280 nm.

Se establecieron las mezclas de RT-PCR como muestras de 50 l que contenían tampón, 1-2 g de ARN, 10 M de cebador directo, 10 M de cebador inverso, polimerasa Taq y agua. Los cebadores para amplificar glicoproteína P humana eran tal como sigue: P-gp directo 5’-GCTCCTGACTATGCCAAAGC-3’ 45 (SEQ ID NO: 9); y P-gp inverso 5’-TCTTCACCTCCAGGCTCAGT-3’ (SEQ ID NO: 10). Los cebadores para amplificar MRP2 humana eran tal como sigue: MRP2 directo 5’-CTGGTTGGGAACCTGACTGT-3’ (SEQ ID NO: 11); y MRP2 inverso 5’-CAACAGCCACAATGTTGGTC-3’ (SEQ ID NO: 12). Los cebadores para amplificar BCRP humana eran tal como sigue: BCRP directo 5’-GTGGCCTTGGCTTGTATGAT 3’ (SEQ ID NO: 13); y BCRP inverso 5’-GATGGCAAGGGAACAGAAAA 3’ (SEQ ID NO: 14). Se amplificó -actina 50 humana en paralelo como control positivo usando los siguientes cebadores: -actina directo 5’-ACTATCGGCAATGAGCGGTTC-3’ (SEQ ID NO: 15); y -actina inverso 5’-AGAGCCACCAATCCACACAGA-3’ (SEQ ID NO: 16).

Se realizaron los ciclos de PCR en un termociclador programable con los siguientes parámetros: síntesis de ADNc, 1 ciclo, 55ºC durante 30 minutos; desnaturalización, 1 ciclo, 94ºC durante 2 minutos; 55 amplificación por PCR, 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 62ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto; y extensión final, 1 ciclo, 72ºC durante 5 minutos. Se confirmó la amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%.

Inmunotransferencia de tipo Western. Se hicieron crecer monocapas celulares hasta confluencia en 90% de DMEM + 10% de FBS, se retiró el medio y se lavaron las monocapas usando 1X PBS. Para lisar las células, se aplicaron 500 l de tampón de lisis RIPA, 1X (Santa Crux Biotechnologies, CA, nº de cat. sc-24948), a las células y se incubaron en hielo durante 10 min. Se recogieron las células lisadas y se centrifugaron a 12.000 x g a 4ºC. Se transfirió el lisado de sobrenadante/proteína a un tubo limpio y se 5 determinó la concentración de proteína siguiendo el protocolo del kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, IL, nº de cat. 23225).

Se sometieron extractos de proteínas a SDS-PAGE tal como sigue. Se cargaron aproximadamente de 25 a 50 g de muestra de proteína sobre geles de poliacrilamida-SDS al 8% y se corrió a 130 voltios durante 1 hora. Tras la electroforesis, se transfirieron las proteínas a membranas de PVDF usando una celda 10 de electroforesis BioRad MiniProtean 3 siguiendo un protocolo proporcionado por Bio-Rad.

Tras transferirse las proteínas, se bloquearon las membranas con disolución Iblock al 0,2% (Applied Biosistemas, CA. nº de catálogo T2015) en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía Tween-20® al 0,05% (TBST) durante 1 hora. Se incubaron las membranas bloqueadas con anticuerpo primario; para P-gp, P-gp de ratón anti-humana, C494, (Abcam, Cambridge, MA, nº de cat. ab2265) diluido 15 1:500 con disolución de bloqueo durante la noche a 4ºC; para MRP2, anticuerpo de MRP2 de conejo policlonal anti-humano (Abcam, Cambridge, MA, nº de cat. 50213) diluido 1:1000 y para BCRP, anticuerpo de BCRP de ratón anti-humano (Abcam, Cambridge, MA, nº de cat. ab3380). Se retiró el anticuerpo no unido lavando 3 veces con TBST. Tras el lavado, se hicieron reaccionar las membranas con el anticuerpo secundario, IgG de cabra anti-ratón unida a peroxidada de rábano, (IgG de cabra anti-ratón-HRP, nº de cat. 20 Chemicon AP124) diluido 1:25000 con disolución de bloqueo durante 1 hora. Se retiró el anticuerpo secundario no unido lavando 3 veces con TBST. Se visualizó el anticuerpo unido usando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Femto (Pierce, nº de cat. 34094) y se visualizó con Epi Chem II darkroom de UVP, Inc (Upland, CA) siguiendo los protocolos del fabricante.

Ensayo de transporte transcelular bidireccional. Se hicieron crecer monocapas celulares hasta 25 confluencia (aproximadamente de 20 a 28 días tras la siembra) sobre membranas de policarbonato, microporosas, recubiertas con colágeno en placas Transwell® de Costar de 12 pocillos que contenían 90% de DMEM + 10% de FBS en los pocillos superior e inferior. Se cambió el medio de crecimiento cada dos a tres días. Se retiró el medio usado mediante aspiración y se añadió medio nuevo a cada uno de los pocillos. Se proporcionó a todos los pocillos, medio nuevo el día antes de los ensayos de transporte. Se certificó que 30 las placas cumplían los criterios de aceptación internos antes de los estudios con compuestos de prueba. Se muestran detalles de las placas usadas y su certificación en los ejemplos a continuación. Se realizó la certificación de placas usando compuestos de referencia usando solución salina equilibrada de Hank que contenía HEPES 10 mM y glucosa 15 mM a un pH de 7,4  0,1.

El tampón de ensayo de permeabilidad para los artículos de prueba era solución salina equilibrada 35 de Hank que contenía HEPES 10 mM, glucosa 15 mM, a un pH de 7,4  0,1. Las concentraciones de las disoluciones de dosificación en tampón de ensayo variaron con el compuesto de prueba. Las concentraciones típicas del compuesto de prueba eran de 10 M en solución salina equilibrada de Hank que contenía HEPES 10 mM, glucosa 15 mM, a un pH de 7,4  0,1. En cada punto de tiempo, 1 y 2 horas, se tomó una alícuota de 200 L de la cámara receptora (la cámara basolateral o inferior para determinaciones de permeabilidad apical 40 a basolateral [A a B] o la cámara superior o apical para determinaciones de permeabilidad basolateral a apical [B a A]) y se sustituyó por tampón de ensayo nuevo. Se dosificaron células en el lado apical (A a B) o lado basolateral (B a A) y se incubaron a 37ºC con CO2 al 5% y humedad relativa del 90%. Se realizó cada determinación por duplicado. También se midió la permeabilidad del amarillo lucifer, un compuesto marcador de la integridad de la monocapa, para cada monocapa usando un ensayo de fluorescencia. Se examinaron 45 los valores de Papp del amarillo lucifer para determinar si se alteró la integridad de la monocapa durante el estudio de permeación. Se excluyeron del análisis posterior las monocapas que presentaron valores de permeabilidad del amarillo lucifer anómalamente altos. Se sometieron a ensayo todos los demás compuestos mediante CL/EM usando ionización por electrospray tal como se resumirá a continuación.

Se calcularon la permeabilidad aparente, Papp, y la recuperación en porcentaje según las 50 siguientes fórmulas:

Papp = (dCr/dt) x Vr/(A x Cd0)

Recuperación porcentual = 100 x (((Vr x Crfinal)+(Vd x Cdfinal)/(Vd x Cd0))

donde, dCr /dt es la concentración acumulativa en el compartimento receptor frente al tiempo; Vr es el volumen del compartimento receptor en cm3; Vd es el volumen del compartimento donador en cm3; A es el

área de la monocapa celular (1,13 cm2 para Transwell de 12 pocillos); Cd0 es la concentración de la disolución de dosificación a tiempo 0; Crfinal es la concentración receptora acumulativa al término del periodo de incubación; y Cdfinal es la concentración del donador al término del periodo de incubación.

Resumen de métodos analíticos CL/EM. Se usó un instrumento de cromatografía líquida (CL) que puede generar un gradiente de fase de tampón de elución (móvil). Se conectó una columna de cromatografía 5 (Keystone Hypersil BDS C18 30 x 2,0 mm d.i., 3 m, con precolumna) al CL y se inyectó una muestra de 10 l de tampón del ensayo de transporte en la columna mediante el inyector automático conectado al CL. Se mezclaron de manera continua dos fases móviles en diversas proporciones para estabilizar un gradiente de composición. Fases móviles típicas usadas para este ensayo son un tampón acuoso, tal como tampón de formiato de amonio 25 mM, pH 3,5 y un disolvente orgánico, tal como acetonitrilo. Se formó el gradiente de 10 elución mezclando proporciones apropiadas de las fases móviles de dos recipientes de fases móviles. En el ejemplo enumerado a continuación, un recipiente contenía el tampón acuoso y el segundo recipiente contenía una mezcla de acetonitrilo y tampón acuoso en la proporción de 9:1 (volumen:volumen). Puede ajustarse el programa de gradiente en el CL para formar una variedad de gradientes desde lineales, en los que la composición cambia de tampón a acetonitrilo más tampón a una tasa fijada, hasta balísticos, en los que la 15 composición cambia bruscamente de tampón a acetonitrilo más tampón en un tiempo específico en el análisis. Se enumeran en la tabla 3 las condiciones de programa de gradiente para el análisis usadas en el presente documento, en la que %A se refiere a la fracción de tampón acuoso en el gradiente y %B se refiere a la fracción de mezcla de acetonitrilo-tampón en el gradiente. El tiempo de columna se refiere al tiempo tras inyectarse la muestra, siendo 0,0 minutos el punto de inyección de la muestra. En este ejemplo el gradiente 20 es un gradiente balístico, que cambia bruscamente la composición a los 1,5 minutos tras la inyección de la muestra.

Tabla 3. Condiciones de programa de gradiente de CL.

Tiempo (min.)

% de A % de B

0,0

100 0

0,5

100 0

1,5

0 100

2,0

0 100

2,1

100 0

3,5

100 0

Se enjuagó la jeringa del inyector automático de CL con ácido fórmico al 0,2% en 25 agua/acetonitrilo/2-propanol: 1/1/1 (v/v/v) entre inyecciones.

Se dirigió el eluyente de la columna cromatográfica hacia la interfase de electrospray de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (EM/EM), en el que se evaporaron el disolvente y el tampón, y se ionizaron los compuestos eluidos de la columna cromatográfica para formar iones positivos o negativos.

En los ejemplos a continuación se usó un instrumento, normalmente un dispositivo PE SCIEX API 30 modelo 2000, 3000 o en algunos casos uno 4000, para separar y detectar los iones. Los instrumentos de triple cuadrupolo, tales como éstos, pueden separar los iones originales usando el primer cuadrupolo magnético, pueden fragmentarlos en la segunda cámara de cuadrupolo y pueden detectar fragmentos específicos del ion original usando el tercer cuadrupolo para enfocar iones de una masa especificada previamente en el detector del instrumento. Este modo de detección se denomina frecuentemente 35 monitorización de reacción múltiple o MRM. La MRM permite una detección muy específica y sensible de compuestos de interés con resoluciones en masa de al menos  1 unidad de masa atómica y límites de detección en el intervalo de nanogramo por mililitro.

Se presentan en la tabla 4 iones fragmento y originales típicos usados para la detección de los compuestos mencionados en los ejemplos. 40

Tabla 4. Iones fragmento y originales usados para la detección.

Compuesto

Q1/Q3

Atenolol

+267,4/145,2

Propranolol

+260,4/116,2

Pindolol

+249,3/116,2

Digoxina

+798,6/651,5

Q1 se refiere al parámetro de selección de masa del primer imán cuadrupolar y Q3 se refiere al parámetro de selección de masa del segundo imán cuadrupolar. El signo “+” se refiere al signo de la carga en los iones monitorizados.

Otro parámetro que puede ajustarse en estos espectrómetros de masas es el tiempo de 5 permanencia, que se refiere al periodo de tiempo en el que se fijan los dos cuadrupolos para seleccionar y detectar una combinación particular de iones originales y fragmento (hijos). Pueden detectarse múltiples compuestos en el mismo análisis cromatográfico mediante el ajuste apropiado de las condiciones cromatográficas y los tiempos de permanencia del espectrómetro de masas. Los tiempos de permanencia típicos oscilan desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 milisegundos por combinación de par 10 iónico. Habitualmente, los analistas expertos pueden determinar una combinación de condiciones cromatográficas y tiempos de permanencia que permitirán la detección y cuantificación de hasta aproximadamente 6 compuestos en la misma muestra, siempre que sus masas iónicas difieran en al menos 5 unidades de masa atómica.

Se prepararon patrones analíticos con concentraciones que oscilaban desde aproximadamente 1 15 ng/ml hasta aproximadamente 1.000 ng/ml en la misma matriz que se usó para muestras del ensayo de transporte. Se preparó una curva patrón representando gráficamente la respuesta del detector EM/EM frente a la concentración patrón. Se ajustó la curva patrón a una curva de respuesta lineal o polinómica usando un software proporcionado por el fabricante del instrumento. Se determinó la concentración del compuesto desconocida mediante cálculo inverso a partir de la respuesta del detector. Alternativamente, se usa la razón 20 de respuestas del detector entre los compuestos de interés y un compuesto patrón de referencia añadido a los patrones y las muestras a una concentración fijada para construir la curva patrón y cuantificar lo desconocido. Esto se conoce como el método de patrón interno de cuantificación de muestras.

EJEMPLO 2

Transducción de células C2BBe1 con secuencias de ácido nucleico interferentes 25

Se subclonaron secuencias de ácido nucleico interferentes en partículas de transducción lentiviral supresoras de tumor humano de ARNhc MISSION® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se usaron lentivirus que contenían las secuencias interferentes (las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 ó 5) para transducir células C2BBe1 según los protocolos del fabricante. En resumen, se sembraron células C2BBe1 en una placa de 96 pocillos a 1,6 x 104 células por pocillo en medios de cultivo celular (90% de DMEM + 10% de FBS) y se incubaron a 37ºC 30 durante 24 horas antes de la transducción. En el día de la transducción, se retiraron los medios de los pocillos y se añadieron partículas lentivirales a los pocillos a 0,5, 1,0, ó 5,0 MOI (multiplicidad de infección) y se incubaron con las células durante 24 horas a 37ºC. Se retiraron los medios que contenían partículas lentivirales no unidas tras esta incubación y se suministraron medios nuevos. A las 48 horas tras la transducción, se añadió un medio selectivo que contenía puromicina 10 g/ml y se cambió cada 3-4 días 35 después de esto para seleccionar las células transducidas. Se prepararon cinco aislados resistentes a puromicina generados a una MOI de 1,0 como clones celulares individuales, lo que dio lugar a los clones ARNhc/P-gp nº 83, 84, 85, 86 y 87 (estos clones corresponden a transducción con lentivirus que contenían las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 ó 5, respectivamente). Se expandieron y se evaluaron cada uno de los cinco clones celulares usando los diversos ensayos descritos en el presente documento. Se han puesto los clones 40 ARNhc/P-gp nº 83 y 85 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 6 de noviembre de 2007 y se les han asignado el nº de registro PTA-8752 y nº de registro PTA-8753, respectivamente.

EJEMPLO 3

Expresión génica de P-gp en células del clon ARNhc/P-gp 45

Se determinó la expresión génica de P-gp en células con silenciamiento (clones ARNhc/P-glucosa plasmática nº 83, 84, 85, 86 y 87) observando el contenido en ARNm de P-gp, contenido en proteína y actividad funcional de la proteína. Se usó RT-PCR para determinar la expresión de ARNm de P-gp. Se recogió y se amplificó el ARN celular total usando cebadores específicos para ARNm de P-gp. Entonces se separaron los productos de RT-PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se determinó que 4 5 de las 5 células del clon ARNhc/P-gp contenían sustancialmente menos ARNm de P-gp que células C2BBe1 control (figura 2, panel superior). Se amplificó -actina, en paralelo, como control positivo, y no se vio afectada su expresión por el ARNhc de interferencia (figura 2, panel inferior).

Se confunde el resultado de PCR para el clon 84 por la presencia evidente de grandes cantidades de dímero de cebador en ese carril de gel. Los ensayos de calceína-AM indican que la función de P-gp se 10 silencia en los 5 clones (figura 1). Los ensayos funcionales que miden la captación de calceína-AM indican que el silenciamiento de ARNm de P-gp se produjo con una eficacia de aproximadamente el 80% al 90% para algunos transductores (figura 1).

Se llevó a cabo un experimento de transporte bidireccional para determinar la razón de flujo de salida de digoxina, un sustrato de P-gp conocido, en células del clon ARNhc/P-gp. Se muestran los 15 resultados en la figura 3. Cada una de las células del clon ARNhc/P-gp demostraron un aumento en el flujo apical a basal, y demostraron además que la razón de flujo de salida de Papp (B-A/A-B) era significativamente inferior que para células control sin silenciamiento (Un-KD). Los resultados confirman que se inhibió la actividad de flujo de salida de P-gp mediante los ARNhc seleccionados como diana para el gen de P-gp. 20

Para evaluar además la expresión génica de P-gp en células del clon ARNhc/P-gp, se obtuvo la proteína a partir de lisados celulares, se cuantificó y se separó sobre un gel de proteína de SDS-PAGE Precise® al 8%. Tras la separación, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF y se evaluaron mediante inmunotransferencia tal como se describió en el ejemplo 1. Tras completarse la inmunotransferencia, se expusieron las membranas a un sustrato de peroxidasa de rábano picante 25 quimioluminiscente y se visualizó el contenido en proteína usando un luminómetro. Tal como se muestra en la figura 4, el análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicó una disminución sustancial en la cantidad de P-gp presente en células del clon ARNhc/P-gp, en comparación con las células control. La tabla 5 proporciona la densidad óptica para cada una de las bandas de P-gp y -actina en la inmunotransferencia de tipo Western mostrada en la figura 4. Se calculó la razón de densidades ópticas para P-gp y -actina y se 30 usaron para determinar el silenciamiento en porcentaje. En la figura 5, se proporciona una representación gráfica de la inhibición en porcentaje.

Tabla 5. Densidad ótica para inmunotransferencia de tipo Western de la expresión de P-gp con silenciamiento en células del clon ARNhc/P-gp C2BBe1.

ID de muestra

Valor calibrado Valor calibrado Razón de P-gp/actina % de inhibición

P-gp Actina

ARNhc/P-gp nº83

1309 1474 0,89 37,31

ARNhc/P-gp nº84

1240 1712 0,72 49,19

ARNhc/P-gp nº85

1195 1716 0,70 51,11

ARNhc/P-gp nº86

1052 1369 0,77 46,06

ARNhc/P-gp nº87

967 1037 0,93 34,58

C2BBe1 tipo natural

958 672 1,42

35

Se determinó la actividad de la proteína P-gp en células del clon ARNhc/P-gp usando un ensayo de calceína-AM tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1. Se muestran los resultados en la figura 1. Los resultados demuestran que aumenta sustancialmente la fluorescencia de calceína en todas las células

con silenciamiento genético (KD) de ARNhc/P-gp, en relación con las células control sin silenciamiento (Un-KD). Cada ARNhc elegido podía inhibir significativamente la actividad de P-gp en las células. A diferencia de los resultados del análisis mediante RT-PCR, los resultados del ensayo de calceína-AM muestran que la eficacia del silenciamiento de P-gp osciló desde aproximadamente el 70% hasta aproximadamente el 90% entre los diferentes ARNhc. En paralelo, también se trataron células del clon ARNhc/P-gp con un inhibidor 5 químico conocido de la actividad de P-gp, ciclosporina A (CsA). En cada una de las diferentes células del clon ARNhc/P-gp sometidas a prueba, se observó un pequeño aumento de la fluorescencia de calceína, que corresponde a un aumento en la inhibición de P-gp, tras el tratamiento con CsA. Aunque no se determinó que ninguno de los aumentos en la fluorescencia fuese estadísticamente significativo (prueba de la “t” de Student) con respecto al silenciamiento genético solo (figura 1), estos resultados sugieren que sigue habiendo cierta 10 actividad de P-gp residual.

EJEMPLO 4

Inhibición de la expresión de MRP2 en células C2BBe1

Para este ejemplo, se determinó la expresión génica de MRP2 en células C2BBe1 observando tanto el contenido en ARNm de MRP2 así como el contenido en proteína de las células tras la transducción 15 viral. Para examinar el contenido de ARNm, se recogió el ARN celular total y se amplificó mediante RT-PCR usando cebadores específicos para el gen de MRP2 (SEQ ID NO: 11 y 12). Entonces se analizaron los productos de RT-PCR tras la separación mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%.

Para evaluar adicionalmente la expresión génica de MRP2 en células con silenciamiento de MRP2, se obtuvieron lisados celulares, se cuantificó su contenido en proteína y se separaron las proteínas 20 individuales en un gel de separación para proteínas de SDS-PAGE Precise® al 8% tal como se describió en el ejemplo 1. Tras la separación, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF y se visualizó la MRP2 mediante inmunotransferencia usando dilución 1:1000 de anti-MRP2 de conejo (Abcam, Cambridge MA, nº de cat. ab50213, lote nº 351245). Tras la inmunotransferencia, se expusieron las membranas a un sustrato de peroxidasa de rábano picante quimioluminiscente y se visualizó la intensidad de tinción de las 25 bandas usando un luminómetro. Una disminución en la intensidad de tinción de las bandas mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicaría una disminución en la cantidad de proteína MRP2 presente en células con silenciamiento de MRP2 en comparación con células control de vector.

Silenciamiento de MRP2 mediante ARN de interferencia:

Para seleccionar como diana la expresión con silenciamiento de MRP2, se transdujeron células 30 C2BBe1 con lentivirus que contenían como insertos de ácido nucleico las SEQ ID NO 17, 18, 19, 20 ó 21, que codifican para el ARN de interferencia. Los experimentos indicaron que el ARNhc seleccionado como diana para MRP2 (ARNhc/MRP2) requiere MOI superiores y tiempos de incubación más prolongados con el lentivirus que el ARNhc seleccionado como diana para BCRP (ARNhc/BCRP) y P-gp (ARNhc/P-gp) con el fin de lograr un silenciamiento medible de MRP2. Tras someter a prueba MOI (multiplicidad de infección) desde 35 0,5 hasta 10, el análisis mediante RT-PCR mostró que una MOI de 10 es óptima para silenciamiento de MRP2 de alta eficacia. También se amplió el tiempo de incubación de partículas virales de ARNhc/MRP2 hasta 2 días en los experimentos de transducción. Todas las demás condiciones experimentales eran las mismas tal como se describieron en el ejemplo 2.

Se prepararon cinco aislados resistentes a puromicina como clones celulares individuales, lo que 40 dio lugar a los clones ARNhc/MRP2 nº 3, 4, 5, 6 y 7 (estos clones corresponden a la transducción con lentivirus que contenían las SEQ ID NO 17, 18, 19, 20 ó 21, respectivamente). Se expandieron y se evaluaron cada uno de los cinco clones celulares usando los diversos ensayos descritos en el presente documento. Se ha puesto el clon ARNhc/MRP2 nº 7 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 6 de noviembre de 2007 y se le ha asignado el nº de registro PTA-8751. 45

Resultados del silenciamiento de MRP2:

1.1 Expresión de ARNm de MRP2 en células del clon con silenciamiento.

La figura 6 muestra la expresión de ARNm de MRP2 en células C2BBe1 tras la transducción viral con secuencias de ARNhc/MRP2 (las SEQ ID NO 17, 18, 19, 20 ó 21, respectivamente). Se prepararon células control de vector (VC) a partir de células transducidas con lentivirus que codifican para una secuencia 50 de ácido nucleico no interferente (SEQ ID NO 27), tal como se describe en el ejemplo 7. Se describieron métodos en el ejemplo 1. Se aisló el ARN celular total de células con números de pases que oscilaron desde 2 hasta 5 después de 5 a 7 días de crecimiento. Los resultados de RT-PCR paralelos mostraron inhibición de la expresión de ARNm de MRP2 en los clones ARNhc/MRP2 nº 3, nº 4 y nº 7 (figura 6). El análisis de los resultados de RT-PCR basándose en la razón de intensidad de banda de ARNm de MRP2 con respecto a la 55 intensidad de banda de ARNm de -actina (véase la tabla 6) indicó que disminuyó la expresión de ARNm de

MRP2 desde el 15% hasta el 19% mediante silenciamiento genético de MRP2.

Tabla 6. Silenciamiento en porcentaje de la expresión de ARNm de MRP2 en células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían insertos de ARNhc/MRP2.

Célula C2BBe1

Razón de intensidad de banda de MRP2 con respecto a intensidad de banda de -actina Disminución en porcentaje en la razón en comparación con el control

Control de vector

0,67 ……

ARNhc/MRP2 nº 3

0,57 15,12

ARNhc/MRP2 nº 4

0,57 155,31

ARNhc/MRP2 nº 5

0,63 6,04

ARNhc/MRP2 nº 6

0,72 -7,59

ARNhc/MRP2 nº 7

0,54 19,53

1.2 Expresión de proteína de MRP2 en células del clon ARNhc/MRP2. 5

Se determinó el contenido en lisado celular de proteína MRP2 de células de clones ARNhc/MRP2 y células control de vector mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western tal como se describió en el ejemplo 2. Tal como se observa en la figura 7, el análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicó una reducción de proteína MRP2 en los clones ARNhc/MRP2 nº 4, 5, 6 y 7 en comparación con células control de vector (VC). Basándose en los resultados de RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, las 10 células C2BBe1 transducidas con lentivirus que contenían insertos de ácido nucleico que corresponden a SEQ ID NO 21 (clon ARNhc/MRP2 nº 7) mostraron el mayor grado de silenciamiento de MRP2 de las 5 secuencias interferentes examinadas.

Se valorará el silenciamiento funcional de MRP2 midiendo el transporte bidireccional de uno o más de los siguientes compuestos, que se sabe que son sustratos de MRP2, a través de monocapas celulares 15 sembradas sobre dispositivos Transwell® tal como se describió en el ejemplo 1: BCECF (2’,7’-bis(2-carboxietil)-5(6)-carboxifluoresceína); diglucurónido de bilirrubina; BQ123 (pentapéptido cíclico, antagonista del receptor de endotelina); crisina; CPT11 (irinotecán); furosemida; genistina; glutatión-S-S-glutatión; glutatión-metilfluoresceína; grepafloxacino; metotrexato; N-etilmaleimida-S-glutatión; SN 38 (metabolito activo de CPT11); ácido sulfotaurolitocólico (STLC); telmisaltán (BIBR 277) y su metabolito de glucurónido; 20 temocaprilato; vinblastina; cisplatino u otros sustratos de MRP2 establecidos que muestran un flujo de salida a través de monocapas celulares parentales.

EJEMPLO 5

Inhibición de la expresión de ARNm de BCRP y actividad en células C2BBe1

1. Caracterización biológica molecular de la expresión de ARNm de BCRP en células con silenciamiento de 25 BCRP.

Se determinó la expresión génica de BCRP en células con silenciamiento observando el contenido en ARNm de BCRP, el contenido en proteína y la actividad funcional de la proteína. Se usó la línea celular parental, C2BBe1 (número de registro de ATCC CRL-2102), para evaluar la inhibición genética de la expresión de BCRP mediante la transformación de células con vectores lentivirales que codificaban para el 30 ARN de interferencia.

Se diseñaron cinco secuencias de 21 nucleótidos (las SEQ ID NO: 22-26) que seleccionaban como diana cinco partes diferentes del gen de BCRP humana (número de registro de GeneBank NM004827) usando la base de datos de búsqueda MISSION® del sitio web de Sigma-Aldrich®, que se produce y se distribuye bajo una licencia del Instituto de Tecnología de Massachusetts. Se subclonaron secuencias de 35 nucleótidos interferentes en partículas de transducción lentiviral de ARNhc MISSION® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se usaron para transformar células C2BBe1 según los procedimientos generales expuestos en

los ejemplos 1 y 2. Se clonaron cinco transformantes de ARNhc/BCRP estables, producidos mediante transducción, a una MOI de 1,0, con lentivirus que contenían las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 ó 26, lo que dio lugar a los clones ARNhc/BCRP nº 798, 799, 800, 801 y 802, respectivamente. Se han puesto los clones ARNhc/BCRP nº 800 y 801 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 6 de noviembre de 2007 y se les han asignado los nº de registro PTA-8754 y PTA-5 8755, respectivamente.

Se evaluaron los clones ARNhc/BCRP para la expresión con silenciamiento del gen de BCRP. Se determinó la expresión de BCRP observando el contenido en ARNm de BCRP mediante amplificación por RT-PCR tal como se describió anteriormente, así como observando el contenido en proteína medido mediante inmunotransferencia de tipo Western. 10

Para RT-PCR, se recogió el ARN celular total tal como se describió en los ejemplos 1 y 3 y se amplificó mediante RT-PCR usando cebadores específicos para el ARNm de BCRP (las SEQ ID NO: 13 y 14). Se separaron los productos de RT-PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se analizaron para determinar si las células del clon ARNhc/BCRP producían sustancialmente menos ARNm de BCRP que las células C2BBe1 transducidas con un control de vector de ARNhc no interferente. Tal como se 15 muestra en las figuras 8 y 9, los cinco insertos de ácido nucleico específicos para BCRP redujeron significativamente la expresión de ARNm de BCRP en relación con el nivel de expresión observado para células C2BBe1 control de vector (VC) de ARNhc. Estos resultados indican que los cinco clones ARNhc/BCRP inhiben la producción de ARNm de BCRP.

Para la inmunotransferencia de tipo Western, se recogieron lisados de células completas, se 20 cuantificó el contenido en proteína y entonces se cargaron 40 g de proteína y se separaron en un gel de proteína de SDS-PAGE Precise® al 8%. Tras la separación, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF y se sometieron a inmunotransferencia. El anticuerpo de BCRP primario era una dilución 1:200 de anti-BCRP de ratón (Sigma nº de cat. B7059, nº de lote 086K177). Se incubaron las membranas de PVDF con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC. Tras la inmunotransferencia, se expusieron las membranas a una 25 dilución 1:15000 de anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con HRP (Zymax nº de cat. 81-6520, nº de lote 50899722) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se visualizó la tinción mediante la adición de un sustrato de peroxidasa de rábano picante quimioluminiscente, usando un luminómetro. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicó una disminución en la cantidad de BCRP presente en las células del clon ARNhc/BCRP en comparación con las células control de vector (VC) C2BBe1 (figuras 10 y 11). 30

También se examinó la producción de ARN en células del clon ARNhc/BCRP nº 801 mediante RT-PCR para determinar si la inhibición de ARNm de BCRP era estable (figura 12). Los resultados indican que el silenciamiento de ARNm aumentó uniformemente entre los pases 5 y 20.

2. Caracterización funcional de BCRP en células del clon con silenciamiento.

Se sembraron cada una de las cinco células del clon con silenciamiento ARNhc/BCRP sobre 35 dispositivos Transwell durante tres semanas para el ensayo de transporte. Se usó E3S (estrona-3-sulfato) un sustrato de BCRP, para el ensayo de permeabilidad que evaluaba la función de BCRP en células del clon ARNhc/BCRP. Se sometieron a ensayo los clones 798, 799, 800 y 802 tras 9 pases. Se encontró que el clon 801 creció un poco más rápido, así que se pasó 13 veces antes del ensayo de transporte mientras que se esperaba que los demás clones crecieran. Los experimentos de transporte bidireccional eran iguales a los 40 descritos en el ejemplo 1 y se realizaron usando la disolución de QC del ejemplo 1 que contenía E3S 10 M además de digoxina 10 M, propranolol 10 M y atenolol 10 M durante 2 horas. El resultado indicó que la razón de flujo de salida de Papp para E3S se redujo significativamente (desde 0,91 hasta 14,42) en comparación con las células control, lo que sugiere que se inhibió la actividad de BCRP en células del clon ARNhc/BCRP (tabla 7). El clon nº 801 mostró la mayor inhibición para la función de BCRP en el transporte de 45 E3S (96,43%).

Tabla 7: Transporte de E3S (estrona-3-sulfato) en células del clon ARNhc/BCRP. Los valores de Papp están en unidades de 10-6 cm/s calculados tal como se describió en el ejemplo 1.

Número de células de clon ARNhc/BCRP

Eflujo de E3S

A-B

B-A Razón de eflujo

nº 798

0,86 12,46 14,42

nº 799

0,87 8,88 10,23

nº 800

0,82 2,67 3,28

nº 801

0,34 0,31 0,91

nº 802

0,77 4,38 5,70

Célula control

0,39 10,09 25,87

Se usaron atenolol y propranolol (10 M) como patrones de referencia permeables de manera pasiva para el ensayo de permeabilidad. Se realizó el ensayo de permeabilidad sobre las mismas monocapas celulares usadas para el ensayo de flujo de salida de E3S. Los valores de Papp de atenolol y propranolol no eran diferentes obviamente de lo observado para las células control de vector (descritas en el ejemplo 7), lo 5 que implica que el silenciamiento de BCRP no afectó a la ruta de difusión pasiva transcelular (tabla 8). El Papp de atenolol en las células del clon nº 801 era mucho menor que en las células control de vector. Los valores de TEER, determinados antes del ensayo de permeabilidad, también eran similares a los de las células control excepto las células del clon nº 801, que, inesperadamente, tuvieron un valor de TEER de 5 a 10 veces mayor. 10

Tabla 8: Flujo de salida de compuestos de referencia en la monocapa celular de células del clon ARNhc/BCRP. Los valores de Papp están en unidades de 10-6 cm/s calculados tal como se describió en el ejemplo 1.

Número de células de clon ARNhc/BCRP

Atenolol (A-B) Propranolol (A-B) TEER (ohm/cm2)

nº 798

0,22 22,68 189

nº 799

0,21 19,76 173

nº 800

0,18 24,27 172

nº 801

0,08 25,26 3162

nº 802

0,24 24,21 317

Control de vector

0,20 19,50 477

3. Efecto del silenciamiento de BCRP sobre la expresión y función de otros transportadores (MRP2 y P-gp). 15

MRP2, P-gp y BCRP son transportadores muy importantes ubicados en la superficie celular de células C2BBe1. Se estudiaron la expresión y función de estos transportadores en células del clon ARNhc/BCRP.

3.1 Expresión de ARNm de MRP2 y de P-gp en células del clon ARNhc/BCRP.

Para determinar el efecto del silenciamiento de BCRP sobre la expresión de P-gp y de MRP2, se 20 estudiaron adicionalmente los niveles de proteínas y de ARNm en células del clon nº 801 y se compararon con células del clon nº 799 (véanse las figuras 13 y 14). Los resultados mostraron que los niveles de ARNm de P-gp parecían ser superiores en células del clon nº 801 que en las células del nº 799 y control. Por el contrario, se redujeron los niveles de ARNm de MRP2 en las células del clon nº 801 pasadas 20 veces (figura 13). 25

3.2 Caracterización funcional de P-gp en células del clon ARNhc/BCRP.

Basándose en los resultados del perfil de expresión de ARNm de P-gp, se examinó la función de P-gp en células del clon ARNhc/BCRP determinando la razón de flujo de salida de digoxina a través de monocapas de 21 días de sembradas en placas de transporte Transwell® de 12 pocillos. Las condiciones

experimentales eran las mismas que las descritas en el ejemplo 1. Se llevó a cabo el ensayo tras haberse pasado cada clon 9 veces. Las razones de flujo de salida de digoxina fueron de 72,67, 64,47 y 54,26 para los clones nº 799, 800, 801 y monocapas celulares parentales, respectivamente, indicando un mayor flujo de salida de este sustrato específico de P-gp a través de monocapas de células con silenciamiento de BCRP. Se presentan los resultados en la tabla 9. Los resultados sugieren que puede potenciarse la función de P-gp en 5 los clones ARNhc/BCRP nº 799, 800 y 801.

Tabla 9. Transporte de digoxina mediante células del clon ARNhc/BCRP.

Número de células de clon ARNhc/BCRP

Eflujo de digoxina

A-B

B-A Razón de eflujo

nº 798

0,33 7,12 21,43

nº 799

0,11 8,11 72,67

nº 800

0,06 3,76 64,47

nº 801

0,05 2,69 54,26

nº 802

0,22 3,44 15,77

Célula control

0,20 3,69 18,65

Para confirmar que aumentó la actividad de P-gp en células de ARNhc/BCRP, tal como sugieren los resultados del ensayo de transporte de digoxina, se repitió el ensayo de captación de calceína-AM 10 descrito en el ejemplo 1 con células del clon ARNhc/BCRP. El flujo de salida de calceína-AM no está mediado por BCRP. Por tanto, puede atribuirse cualquier aumento en la captación de calceína-AM por las células a la inhibición de P-gp. Se sembraron las células en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. Tras 48 horas, se retiraron los medios de cultivo celular y se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tras el lavado, se incubaron las células con calceína-AM 1 M durante 30 15 minutos. Se usaron células parentales tratadas con ciclosporina A, un inhibidor de P-gp establecido, como control positivo para verificar que la inhibición de P-gp aumentó la fluorescencia intracelular en líneas celulares parentales. Tras la incubación con calceína-AM, se enjuagaron las células con tampón de control nuevo y se midió la fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia Fluo-star (BMG Lab Technologies, NC) con filtros de excitación y emisión fijados a longitudes de onda de 485 nm y 538 nm, 20 respectivamente. Se llevó a cabo el ensayo después de haberse pasado cada clon 9 veces. Tal como se muestra en la tabla 10, los clones nº 799, 800, 801 y 802 mostraron una inducción funcional significativa de la actividad de P-gp que era comparable a células control de vector.

Tabla 10: Transporte de calceína-AM por células de ARNhc/BCRP.

Número de células de clon ARNhc/BCRP

UFR/g de proteína % reducción de calceína-AM en comparación con control de vector

nº 798

10,13 0,33

nº 799

6,99 31,18

nº 800

4,26 58,07

nº 801

1,08 89,37

nº 802

6,76 33,42

Control de vector

10,16

El clon nº 801 mostró la mayor actividad funcional de P-gp en el ensayo de calceína-AM. Se realizó un ensayo de calceína-AM usando células del clon ARNhc/BCRP nº 801 de un pase celular superior, pase 20, para determinar si el efecto inductivo de P-gp, sugerido por los resultados en la tabla 10, persistió durante numerosos pases celulares. Los resultados mostraron que tras el pase celular 20, la actividad de P-gp en 5 células nº 801 aumentó hasta el 73% en comparación con células control de vector, los resultados están normalizados para la proteína total (tabla 11).

Tabla 11. Transporte de calceína-AM por células del clon ARNhc/BCRP nº 801 en el pase 20.

Línea celular/nº de pase

Fluorescencia media normalizada D.E. Fluorescencia media normalizada en presencia de CSA D.E. % de aumento con respecto a células control de vector

801/p20

5,08 0,50 72,31 1,51 72,65

Células control de vector

23,92 4,38 62,86 4,34 ----

4. Caracterización adicional de células del clon ARNhc/BCRP nº 801. 10

Mientras se monitorizan las tasas de crecimiento de diversos clones con silenciamiento de BCRP producidos mediante transducción lentiviral, se observó que un clon, nº 801, comenzó a crecer a una tasa acelerada tras haberse pasado aproximadamente 15 veces in vitro. Debido a que lleva aproximadamente 3 semanas que las células C2BBe1 parentales formen monocapas adecuadas para ensayos de transporte de fármacos, se investigó si maduraría o no el clon nº 801 y si formaría propiedades de barrera adecuadas para 15 ensayos de transporte de fármacos antes que la línea celular parental y/o la línea control de vector.

4.1 Propiedad de barrera de las células del clon ARNhc/BCRP nº 801.

En primer lugar, se determinó la TEER para esta línea celular (tabla 12) a diversos tiempos tras la siembra en dispositivos Transwell®. Los resultados mostraron que los valores de TEER eran superiores a 900 Ohm/cm2 tras 6 días, lo que indica que se desarrollan rápidamente monocapas celulares apretadas sobre 20 dispositivos Transwell®.

Tabla 12: TEER para células del clon ARNhc/BCRP nº 801 determinada tras 3, 6, 10, 15, 20 y 25 días de siembra sobre dispositivos Transwell

Día tras la siembra sobre dispositivos Transwell

3 6 10 15 20 25

TEER (ohm/cm2)

273 979 1383 1464 1934 2736

4.2 Transporte de E3S, digoxina y compuestos de referencia de permeabilidad en células del clon 25 ARNhc/BCRP nº 801

Tal como se observa, tras el pase celular 20 se encontró que el clon ARNhc/BCRP nº 801 creció más rápido y presentó valores de TEER mucho mayores que los otros cuatro clones. Además, los resultados de RT-PCR sugirieron que la expresión de ARNm de P-gp y de proteína era mayor que en las células control (tabla 9). Por tanto, el transporte de digoxina, que es un sustrato de P-gp se realizó en las monocapas 30 celulares del clon ARNhc/BCRP nº 801 (véase la tabla 13) para determinar si se reflejó el aumento evidente en los niveles de ARNm de P-gp en la función del transportador de flujo de salida aumentada. También se determinaron el transporte de E3S, de compuestos de referencia absorbidos de manera pasiva y TEER al mismo tiempo.

Tal como se muestra en la tabla 13, la razón de flujo de salida de digoxina para las monocapas 35

celulares del clon ARNhc/BCRP nº 801 era mayor que para las células control C2BBe1 de tipo natural. Se obtuvieron resultados similares usando el ensayo de calceína-AM (tabla 12). Los valores TEER de monocapas del clon nº 801 eran aproximadamente 5 veces mayores que las de las células control C2BBe1 de tipo natural. Por el contrario, la razón de flujo de salida de E3S todavía estaba suprimida en relación con las líneas celulares parentales, lo que indica que persistía el silenciamiento funcional de BCRP. Los valores 5 de Papp del compuesto de referencia atenolol y propranolol eran altos y bajos, respectivamente, conservando el mismo orden jerárquico que en las células control C2BBe1 de tipo natural.

Tabla 13: Transporte de digoxina, E3S y compuestos de referencia por células del clon ARNhc/BCRP nº 801 22 y 25 días tras la siembra sobre dispositivos Transwell

22 días 25 días

control wt C2BBe1

KD nº 801 control wt C2BBe1 KD nº 801

ER de digoxina

18,65 54,26 15,38 42,46

ER de E3S

25,58 0,91 23,06 1,45

TEER

477 3162 490 2225

Papp de atenolol A-B/X 106 cm/s

0,13 0,05 0,12 0,08

Papp de propranolol A-B/X 106 cm/s

17,2 15,5 18,2 13,6

10

4.3 Estabilidad de la expresión y función de P-gp y MRP2 en células del clon ARNhc/BCRP nº 801.

Para determinar la estabilidad del efecto del silenciamiento de BCRP sobre la expresión de otros genes transportadores, se determinaron los niveles de ARNm de P-gp y de MRP2 así como niveles de proteínas en células ARNhc/BCRP del clon nº 801 desde el pase celular 10 hasta el 20. Los resultados indicaron que aumentó la expresión de ARNm de P-gp y se redujo la de MRP2 en el pase celular 20 (véanse 15 las figuras 13 y 14).

Se realizaron mediciones de transporte bidireccional de E3S, un sustrato de BCRP, y digoxina, un sustrato de P-gp así como mediciones de TEER al mismo tiempo en los mismos cultivos celulares. El flujo de salida de digoxina (véase la tabla 14) era mayor que en la célula control de vector (25,13) en células del clon nº 801 desde el pase 18 hasta el 25 y se observó la mayor razón de flujo de salida para el pase celular 25 20 (114,98).

Tabla 14: Efecto del silenciamiento de BCRP sobre el transporte de digoxina por las células del clon ARNhc/BCRP nº 801 en diferentes pases celulares.

Pase celular

9 18 25 Control de vector

Razón de eflujo (Papp(B-A/A-B))

20,43 14,57 114,98 25,13

TEER (ohm/cm2)

347 439 1589 296

Se mantuvo la razón de flujo de salida de E3S (véase la tabla 15) inferior a 3,0 desde el pase 25 celular 9 hasta el 25 en células del clon nº 801 en comparación con células control de vector (13,96). Los valores de TEER de las monocapas celulares del clon nº 801 aumentaron desde 347 hasta 1589 ohms/cm2 desde el pase celular 9 hasta el 25 y eran mayores que en las células control de vector.

Tabla 15: Efecto del silenciamiento de BCRP sobre el transporte de E3S por las células del clon ARNhc/BCRP nº 801 en diferentes pases celulares. 30

Pase celular

9 18 25 Control de vector

Razón de eflujo (Papp(B-A/A-B))

0,59 1,54 0,52 13,96

TEER (ohm/cm2)

347 565 1589 296

EJEMPLO 6

Evaluación del papel de P-gp, MRP2 y BCRP en la absorción de fármacos

El siguiente ejemplo profético proporciona un enfoque experimental para determinar la identidad de un/unos transportador(es) responsables de manejar un fármaco de interés dentro del tracto gastrointestinal 5 de animales. Este enfoque experimental comprende una combinación de una/unas línea(s) celular(es) (por ejemplo, MDCK) que expresan transportadores individuales (transfectados), (b) células C2BBe1 con transportadores silenciados selectivamente y (c) inhibidores químicos de transportadores. En conjunto, estas herramientas facilitarán la determinación de la identidad de los transportadores implicados en un proceso de transporte de fármacos con un alto grado de certeza. 10

Experimento 1. Participación de transportador(es) de flujo de salida. En este experimento, puede seleccionarse el transporte bidireccional de un compuesto de prueba en monocapas de C2BBe1 WT y puede calcularse la razón Papp B-A/Papp A-B (es decir, razón de flujo de salida, ER). Basándose en los resultados de estos experimentos, pueden llevarse a cabo pruebas posteriores, tal como se describen a continuación.

Hay al menos dos posibles desenlaces de este enfoque experimental. En el primer desenlace 15 posible, una ER < 3 indica que la permeación no implica proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana. Bajo esta perspectiva, no se requeriría ninguna prueba adicional para los transportadores, excepto por posibles experimentos de confirmación. En el segundo desenlace posible, una ER  3 indica que la permeación implica al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana presente en las células C2BBe1 (por ejemplo, P-gp, MRP2 o BCRP). Para identificar cuál de este/estos transportador(es) 20 está(n) implicado(s) en el flujo de salida, se realizaran los siguientes experimentos.

Experimento 2. Confirmación de la participación de P-gp. Para determinar si P-gp desempeña un papel en el manejo del fármaco de interés, pueden llevarse a cabo experimentos de permeación bidireccional, tal como se describe y se pone como ejemplo en el presente documento. Se usarán tales experimentos de permeación bidireccional para seleccionar las siguientes combinaciones: (a) compuesto de prueba solo en 25 monocapas de C2BBe1 WT; (b) compuesto de prueba solo en monocapas con silenciamiento de P-gp de C2BBe1; (c) compuesto de prueba con inhibidor de MRP (por ejemplo, MK571) en monocapas con silenciamiento de P-gp de C2BBe1; (d) compuesto de prueba con inhibidor de BCRP (por ejemplo, FTC) en monocapas con silenciamiento de P-gp de C2BBe1; (e) compuesto de prueba solo en monocapas de MDR1-MDCK; y (f) compuesto de prueba con un inhibidor de P-gp (por ejemplo, CsA) en monocapas de MDR1-30 MDCK

Experimento 3. Confirmación de la participación de BCRP. Para determinar si BCRP desempeña un papel en el manejo del fármaco de interés, pueden llevarse a cabo experimentos de permeación bidireccional, tal como se describe y se pone como ejemplo en el presente documento. Se usarán tales experimentos de permeación bidireccional para seleccionar las siguientes permutaciones: (a) compuesto de 35 prueba solo en monocapas de C2BBe1 WT; (b) compuesto de prueba solo en monocapas con silenciamiento de BCRP de C2BBe1; (c) compuesto de prueba solo en monocapas de BCRP-MDCK; y (d) compuesto de prueba con inhibidor de BCRP (por ejemplo, FTC) en monocapas de BCRP-MDCK.

Experimento 4. Confirmación de la participación de MRP2. Para determinar si MRP2 desempeña un papel en el manejo del fármaco de interés, pueden llevarse a cabo experimentos de permeación 40 bidireccional, tal como se describe y se pone como ejemplo en el presente documento. Se usarán tales experimentos de permeación bidireccional para seleccionar las siguientes permutaciones: (a) compuesto de prueba solo en monocapas de C2BBe1 WT; (b) compuesto de prueba solo en monocapas con silenciamiento de MRP2 de C2BBe1; (c) compuesto de prueba solo en monocapas de MRP2-MDCK; y (d) compuesto de prueba con inhibidor de MRP2 (por ejemplo, MK571) en monocapas de MRP2-MDCK. 45

El siguiente es un ejemplo de los enfoques descritos anteriormente usando dos líneas celulares para identificar si los compuestos son o no sustratos para P-gp o BCRP o para ambos. Se sometió a ensayo cada compuesto en un ensayo de monocapa celular bidireccional tal como se describió en el ejemplo 1. Se determinaron las concentraciones de los compuestos seleccionados mediante CL/EM/EM, tal como se describió en el ejemplo 1, monitorizando las transiciones de masa registradas en la columna 2 de la tabla 16. 50

Las monocapas celulares consistían o bien en las células C2BBe1 parentales o bien en las células del clon ARNhc/BCRP nº 801 que expresan sólo P-gp en un grado significativo.

Tabla 16: Comparación de las razones de flujo de salida bidireccional de sustratos de P-gp seleccionados y no sustratos a través de monocapas de células del clon ARNhc/BCRP nº 801 o células C2BBe1 parentales. 5

Compuesto

Transición de masa Razón de eflujo en células de clon 801 KD Razón de eflujo en células C2BBe1 ¿Sustrato de P-gp

Antipirina

189,20/56,10 0,92 0,84 No

Etopósido

589,30/229,00 11,53 13,67 Sí

Sulfasalazina

329,00/284,90 0,22 15,45 No

Furosemida

329,00/284,90 1,38 21,76 No

Difenilhidramina

256,30/167,10 1,64 2,41 No

Desipramina

267,20/72,00 6,84 5,59 Sí

Antipirina no es un sustrato para P-gp debido a que no muestra flujo de salida en ninguna línea celular. Etopósido es un sustrato debido a que muestra flujo de salida en ambas líneas celulares en un grado similar. Sulfasalazina no es un sustrato de P-gp debido a que no experimenta flujo de salida mediante las células de clon ARNhc/BCRP nº 801 aunque experimenta flujo de salida mediante las células C2BBe1. Este 10 resultado sugiere que sulfasalazina es un sustrato para cualquier BCRP y/o MRP2 que se expresan a altos niveles en las células C2BBe1, pero no en células del clon ARNhc/BCRP nº 801. En efecto, se sabe que sulfasalazina es un sustrato de BCRP (tabla 1). En efecto, la razón de flujo de salida de sulfasalazina en las células del clon ARNhc/BCRP nº 801 es de 0,22, lo que sugiere que estas células tienen un transportador de captación para este compuesto cuya actividad se revela mediante el silenciamiento de BCRP. Furosemida 15 muestra un patrón similar a sulfasalazina, pero sin evidencia de presencia de un transportador de captación. Difenilhidramina no experimenta un alto flujo de salida mediante ninguna línea celular, mientras que desipramina sí, lo que indica que desipramina es un sustrato de P-gp. Podrían ampliarse y confirmarse estos resultados repitiendo el estudio anterior usando clones ARNhc/P-gp nº 83 ó nº 85 y demostrando que el flujo de salida del supuesto sustrato de P-gp es mucho menor a través de monocapas de las células con 20 silenciamiento de P-gp, mientras que sulfasalazina y furosemida todavía muestran un alto flujo de salida.

EJEMPLO 7

Transducción de ARNhc de partículas de transducción de control de ARNhc no seleccionado como diana en células C2BBe1

En algunos casos, las células C2BBe1 parentales pueden no ser controles positivos apropiados 25 para estudiar la función de transporte de las líneas celulares con silenciamiento, debido a las diferencias en composición de los medios, tasas de crecimiento y otros posibles efectos producidos por la presencia de productos génicos lentivirales en las células. Cuando se realizan experimentos usando células del clon de ARNhc, los controles apropiados son un elemento clave de diseño experimental para permitir una interpretación precisa de los resultados de silenciamiento y proporcionar garantías de la especificidad de las 30 respuestas observadas. El vector de control de ARNhc no seleccionado como diana MISSION® que contiene la SEQ ID NO: 27 disponible de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, es un control negativo útil que activará la ruta del ARNi y el RISC, pero no selecciona como diana ningún gen humano.

Se obtuvieron partículas de transducción lentiviral de ARNhc MISSION® de ARNhc no seleccionado como diana (nº de cat. SHC002V) de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO y se usaron para generar 35 líneas celulares C2BBe1 transducidas con ARNhc no seleccionado como diana. Se usaron lentivirus que contenían el ARNhc no seleccionado como diana para transformar células C2BBe1 según los protocolos del fabricante. En resumen, se sembraron células C2BBe1 en una placa de 96 pocillos a 1,6 x 104 células por pocillo en medios de cultivo celular (90% de DMEM + 10% de FBS) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas antes de la transducción. En el día de la transducción, se retiraron los medios de los pocillos y se añadieron 40

partículas lentivirales a los pocillos a 0,5, 1,0 ó 5,0 MOI (multiplicidad de infección) y se incubaron con las células durante 24 horas a 37ºC. Se retiraron los medios que contenían partículas lentivirales no unidas después de esta incubación y se suministraron medios nuevos. A las 48 horas tras la transducción, se añadió un medio selectivo que contenía puromicina 10 mg/ml y se cambió cada 3-4 días después de esto para seleccionar las células transducidas. Se prepararon células positivas como clones celulares individuales, 5 después se hicieron crecer y se evaluaron en los diversos ensayos funcionales descritos en el presente documento. Se usaron clones que muestran que expresan P-gp, BCRP y MRP2 a niveles similares o idénticos a los de las líneas celulares parentales así como que tienen propiedades de permeabilidad pasiva similares, como controles positivos en algunos de los experimentos descritos en los ejemplos 4 y 5.

Resultados experimentales de las pruebas con células control 10

Se transformaron células C2BBe1 con un vector lentiviral de ARNhc que contenía SEQ ID NO. 27 tal como se describió en el ejemplo 2. Para determinar el grado óptimo de multiplicidad de infección (MOI), se usaron tres MOI para transducir las células (0,5, 1,0 y 5,0). Se llevaron a cabo los ensayos moleculares y funcionales tal como se describió en los ejemplos de 3 a 5 para los mismos ensayos en células con silenciamiento génico. Se examinó la expresión de BCRP, MRP2 y P-gp en células control de vector de 15 ARNhc mediante RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, que se realizaron mediante los mismos métodos usados para examinar células con silenciamiento. Los resultados indican que las células control de vector todavía expresan los ARNm de transportador (tabla 17).

Tabla 17: Expresión de ARNm de BCRP, MRP2 y P-gp en células control de vector (VC) de ARNhc. 20

Grupo celular

MOI Razón de transportador/-actina

P-gp

BCRP MRP2

C2BBe1

--- 0,62 0,70 1,54

Control de vector

0,5 0,66 0,73 1,53

1,0 0,97 0,78 2,04

5,0 0,85 0,66 1,74

Comparación de propiedades de transporte típicas entre células control de vector de ARNhc y C2BBe1 parentales

Se cultivaron líneas celulares C2BBe1 y control de vector en placas Transwell® de 12 pocillos durante 21 días antes de realizar los ensayos de transporte indicados en la tabla 18. Se realizaron los 25 ensayos en las condiciones descritas en el ejemplo 1. Los resultados indican que las células control de vector forman monocapas sobre dispositivos Transwell® con propiedades de barrera adecuadas para ensayos de transporte de fármacos in vitro y que expresan actividad de flujo de salida frente a digoxina, un sustrato de P-gp y estrona-3-sulfato, un sustrato de BCRP (tabla 18).

Tabla 18: Comparación de propiedades de transporte típicas entre célula control de vector de 30 ARNhc (MOI = 1) y C2BBe1 parentales.

Papp y sustrato

Control de vector de ARNhc C2BBe1 parental

Papp A-B (E3S) (x 106 cm/s)

0,74 0,63

Papp B-A (x 106 cm/s)

10,36 10,69

Razón de Papp (B-A/A-B)

14 17

Papp A-B (Digoxina) (x 106 cm/s)

0,33 0,2

Papp B-A (x 106 cm/s)

8,24 3,69

Razón de Papp (B-A/A-B)

25 19

Papp A-B (Atenolol) (x 106 cm/s)

0,39 0,35

Papp A-B (Propranolol) (x 106 cm/s)

13,88 22,4

TEER (ohm.cm2)

446 477

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 (ARNhc-83 de P-gp humana)

CCGGCCGAACACATTGGAAGGAAATCTCGAGATTTCCTTCCAATGTGTTCGGTTTTTG

SEQ ID NO: 2 (ARNhc-84 de P-gp humana) 5

CCGGGCAGCAATTAGAACTGTGATTCTCGAGAATCACAGTTCTAATTGCTGCTTTTTG

SEQ ID NO: 3 (ARNhc-85 de P-gp humana)

CCGGCGACAGAATAGTAACTTGTTTCTCGAGAAACAAGTTACTATTCTGTCGTTTTTG

SEQ ID NO: 4 (ARNhc-86 de P-gp humana)

CCGGGCTCATCGTTTGTCTACAGTTCTCGAGAACTGTAGACAAACGATGAGCTTTTTG 10

SEQ ID NO: 5 (ARNhc-87 de P-gp humana)

CCGGGCTGCTTTCCTGCTGATCTATCTCGAGATAGATCAGCAGGAAAGCAGCTTTTTG

SEQ ID NO: 6 (glicoproteína P I humana, nº de registro de Gen Bank NM_000927)

SEQ ID NO: 7 (Proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2, nº de registro de Gen Bank NM000392)

5

SEQ ID NO: 8 (Proteína de resistencia al cáncer de mama humana, nº de registro de Gen Bank NM004827)

SEQ ID NO: 9 (P-gp humana directo)

GCTCCTGACTATGCCAAAGC

SEQ ID NO: 10 (P-gp humana inverso) 5

TCTTCACCTCCAGGCTCAGT

SEQ ID NO: 11(MRP2 humana directo)

CTGGTTGGGAACCTGACTGT

SEQ ID NO: 12 (MRP2 humana inverso)

CAACAGCCACAATGTTGGTC 10

SEQ ID NO: 13 (BCRP humana directo)

GTGGCCTTGGCTTGTATGAT

SEQ ID NO: 14(BCRP humana inverso)

GATGGCAAGGGAACAGAAAA

SEQ ID NO: 15 (-actina humana directo) 15

ACTATCGGCAATGAGCGGTTC

SEQ ID NO: 16(-actina humana inverso)

AGAGCCACCAATCCACACAGA

SEQ ID NO: 17 (ARNhc-03 de MRP2 humana)

CCGGCGTGTATAAATCCAGGACCAACTCGAGTTGGTCCTGGATTTATACACGTTTTTG 5

SEQ ID NO: 18 (ARNhc-04 de MRP2 humana)

CCGGCCTGGTGGATAGCAACAATATCTCGAGATATTGTTGCTATCCACCAGGTTTTTG

SEQ ID NO: 19 (ARNhc-05 de MRP2 humana)

CCGGGCATCTGAAGTCCCTGAGAAACTCGAGTTTCTCAGGGACTTCAGATGCTTTTTG

SEQ ID NO: 20 (ARNhc-06 de MRP2 humana) 10

CCGGGCCGGTGGTCAGATTATCATTCTCGAGAATGATAATCTGACCACCGGCTTTTTG

SEQ ID NO: 21 (ARNhc-07 de MRP2 humana)

CCGGCCATAGCTTCATTCCTGAGTACTCGAGTACTCAGGAATGAAGCTATGGTTTTTG

SEQ ID NO: 22(ARNhc-798 de BCRP humana)

CCGGGCCTCGATATTCCATCTTCAACTCGAGTTGAAGATGGAATATCGAGGCTTTTTG 15

SEQ ID NO: 23 (ARNhc-799 de BCRP humana)

CCGGGCAACAACTATGACGAATCATCTCGAGATGATTCGTCATAGTTGTTGCTTTTTG

SEQ ID NO: 24 (ARNhc-800 de BCRP humana)

CCGGCCTTCTTCGTTATGATGTTTACTCGAGTAAACATCATAACGAAGAAGGTTTTTG

SEQ ID NO: 25(ARNhc-801 de BCRP humana) 20

CCGGGCTGTGGCATTAAACAGAGAACTCGAGTTCTCTGTTTAATGCCACAGCTTTTTG

SEQ ID NO: 26 (ARNhc-802 de BCRP humana)

CCGGCCTGCCAATTTCAAATGTAATCTCGAGATTACATTTGAAATTGGCAGGTTTTTG

SEQ ID NO: 27 (ARNhc no codificante)

CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT 25

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Absorption Systems Group LLC

Owen, III, Albert J.

Hidalgo, Ismael J.

Li, Jibin 30

Zhang, wei

<120> LÍNEAS CELULARES ESTABLES Y MÉTODOS PARA EVALUAR LA ABSORCIÓN GASTROINTESTINAL DE PRODUCTOS QUÍMICOS

<130> ABSY-0006

<150> Documento US 60/857.938 35

<151> 10-11-2006

<150> Documento US 60/892.665

<151> 02-03-2007

<160> 27

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 5

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccggccgaac acattggaag gaaatctcga gatttccttc caatgtgttc ggtttttg 58 10

<210> 2

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2 15

ccgggcagca attagaactg tgattctcga gaatcacagt tctaattgct gctttttg 58

<210> 3

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20

<400> 3

ccggcgacag aatagtaact tgtttctcga gaaacaagtt actattctgt cgtttttg 58

<210> 4

<211> 58

<212> ADN 25

<213> Homo sapiens

<400> 4

ccgggctcat cgtttgtcta cagttctcga gaactgtaga caaacgatga gctttttg 58

<210> 5

<211> 58 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

ccgggctgct ttcctgctga tctatctcga gatagatcag caggaaagca gctttttg 58

<210> 6 35

<211> 4872

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

5

210> 7

<211> 4868

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5

<400> 7

<210> 8

<211> 4445

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

5

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5

<400> 9

gctcctgact atgccaaagc 20

<210> 10

<211> 20

<212> ADN 10

<213> Homo sapiens

<400> 10

tcttcacctc caggctcagt 20

<210> 11

<211> 20 15

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

ctggttggga acctgactgt 20

<210> 12 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

caacagccac aatgttggtc 20 25

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13 30

gtggccttgg cttgtatgat 20

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

gatggcaagg gaacagaaaa 20 5

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15 10

actatcggca atgagcggtt c 21

<210> 16

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 16

agagccacca atccacacag a 21

<210> 17

<211> 58

<212> ADN 20

<213> Homo sapiens

<400> 17

ccggcgtgta taaatccagg accaactcga gttggtcctg gatttataca cgtttttg 58

<210> 18

<211> 58 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

ccggcctggt ggatagcaac aatatctcga gatattgttg ctatccacca ggtttttg 58

<210> 19 30

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

ccgggcatct gaagtccctg agaaactcga gtttctcagg gacttcagat gctttttg 58 35

<210> 20

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 20

ccgggccggt ggtcagatta tcattctcga gaatgataat ctgaccaccg gctttttg 58 5

<210> 21

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21 10

ccggccatag cttcattcct gagtactcga gtactcagga atgaagctat ggtttttg 58

<210> 22

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 22

ccgggcctcg atattccatc ttcaactcga gttgaagatg gaatatcgag gctttttg 58

<210> 23

<211> 58

<212> ADN 20

<213> Homo sapiens

<400> 23

ccgggcaaca actatgacga atcatctcga gatgattcgt catagttgtt gctttttg 58

<210> 24

<211> 58 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

ccggccttct tcgttatgat gtttactcga gtaaacatca taacgaagaa ggtttttg 58

<210> 25 30

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

ccgggctgtg gcattaaaca gagaactcga gttctctgtt taatgccaca gctttttg 58 35

<210> 26

<211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26

ccggcctgcc aatttcaaat gtaatctcga gattacattt gaaattggca ggtttttg 58 5

<210> 27

<211> 57

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27 10

ccggcaacaa gatgaagagc accaactcga gttggtgctc ttcatcttgt tgttttt 57

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES
2. 1.- Una célula huésped transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 5
3. 2.- Una célula huésped según la reivindicación 1, expresando la célula una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.
4. 3.- Una célula huésped según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, siendo la célula una célula epitelial intestinal.
5. 4.- Una célula huésped según cualquier reivindicación anterior, en la que la molécula de ácido 10 nucleico inhibe la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.
6. 5.- Una célula huésped según la reivindicación 4, en la que las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P y proteína de resistencia al cáncer de mama.
7. 6.- Un cultivo celular que comprende una célula huésped según cualquier reivindicación anterior.
8. 7.- Un método in vitro para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal 15 que comprende inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte transcelular de compuestos 20 sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; siendo dichas mediciones, en relación con los valores de referencia, predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal.
9. 8.- Un método según la reivindicación 7, en el que inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula comprende transformar la célula con una 25 secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.
10. 9.- Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la inhibición comprende transformar la célula con una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de dos o más proteínas 30 transportadoras de flujo de salida de membrana.
11. 10.- Un método in vitro para seleccionar compuestos para absorción gastrointestinal en un animal que comprende inhibir la expresión de una primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, inhibir la expresión de una 35 segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una segunda célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto las células primera y segunda con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera y segunda, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de referencia para el transporte 40 transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; en el que las mediciones indican la contribución relativa de la primera y segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana al transporte transcelular del compuesto de prueba y en el que dichas mediciones en relación con los valores de referencia son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el organismo del animal. 45
12. 11.- Un método según la reivindicación 10, en el que la primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama, y/o en el que la segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama. 50
13. 12.- Un método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que inhibir la primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la primera célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha primera proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y/o en el que inhibir la segunda 55

    proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la segunda célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha segunda proteína transportadora de flujo de salida de membrana.
14. 13.- Un método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además inhibir la 5 expresión de una tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una tercera célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto las células primera, segunda y tercera con un compuesto de prueba, medir el transporte transcelular del compuesto de prueba en las células primera, segunda y tercera, y comparar las mediciones de transporte transcelular con valores de 10 referencia para el transporte transcelular de compuestos sin absorción gastrointestinal, con baja absorción gastrointestinal, con moderada absorción gastrointestinal o con alta absorción gastrointestinal; en el que las mediciones indican la contribución relativa de la primera, segunda y tercera proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana al transporte transcelular del compuesto de prueba y en el que dichas mediciones, en relación con los valores de referencia, son predictivas de la absorción gastrointestinal del compuesto en el 15 organismo del animal.
15. 14.- Un método según la reivindicación 13, en el que la tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama.
16. 15.- Un método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que inhibir la tercera 20 proteína transportadora de flujo de salida de membrana comprende transformar la tercera célula con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de dicha tercera proteína transportadora de flujo de salida de membrana.
17. 16.- Un método in vitro para inhibir la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo 25 de salida de membrana que comprende transformar una célula que expresa al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana con un vector lentiviral que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana, y expresar dicha molécula de ácido nucleico en 30 la célula, en el que la expresión de la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana.
18. 17.- Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 16, en el que la al menos una proteína transportadora de flujo de salida de membrana es glicoproteína P, proteína asociada con resistencia a múltiples fármacos 2 o proteína de resistencia al cáncer de mama. 35
19. 18.- Un método según la reivindicación 16, en el que la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión de dos o más proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana.
20. 19.- Un método según la reivindicación 9 o la reivindicación 18, en el que las proteínas transportadoras de flujo de salida de membrana son glicoproteína P y proteína de resistencia al cáncer de mama. 40
21. 20.- Un método in vitro para identificar compuestos que inhiben la actividad de flujo de salida de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana que comprende inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en una primera célula, expresando en dicha célula una molécula de ácido nucleico codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, poner en contacto la primera célula con un sustrato de la proteína 45 transportadora de flujo de salida de membrana, poner en contacto una segunda célula que expresa la proteína transportadora de flujo de salida de membrana con un compuesto de prueba y un sustrato de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana, determinar la actividad de flujo de salida de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula, y en la segunda célula en presencia y ausencia del compuesto de prueba, y comparar las actividades de flujo de salida determinadas, 50 en el que una disminución en la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba en relación con la actividad de flujo de salida en ausencia del compuesto de prueba, y una identidad al menos parcial de la actividad de flujo de salida en presencia del compuesto de prueba con la actividad de flujo de salida en la primera célula indica que el compuesto de prueba inhibe específicamente la proteína transportadora de flujo de salida de membrana. 55
22. 21.- Un método según la reivindicación 20, en el que inhibir la expresión de una proteína transportadora de flujo de salida de membrana en la primera célula comprende transformar la primera célula

    con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ó 26, codificando dicha secuencia de ácido nucleico para una molécula de ácido nucleico que interfiere con la expresión de la proteína transportadora de flujo de salida de membrana.