JP2013240341A - 化学物質の消化管吸収を評価するための安定的細胞株および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】動物またはヒトへの投与に伴う薬剤、栄養サプリメント、環境化学物質などの化学物質の吸収を予測するための安定的細胞株、キット、および方法の提供。
【解決手段】膜排出輸送タンパク質を発現する細胞において、そのようなタンパク質の発現を妨げる核酸およびベクター、そのような核酸およびベクターを有する形質転換された細胞および細胞株、さらに、動物における消化管吸収のための化学物質および生分子のスクリーニング法を提供する。
【選択図】図１３

Description

この出願は２００７年３月２日出願の米国仮特許出願第６０／８９２，６６５号および２００６年１１月１０日出願の米国仮特許出願第６０／８５７，９３８号の利益を主張するものであり、いずれも参照により本明細書に組み込まれるものである。

本発明は一般に薬学分野に関連する。より具体的に言えば、本発明の特徴は、動物またはヒトへの投与に伴う薬剤、栄養サプリメント、環境化学物質などの化学物質の吸収を予測するための安定的細胞株、キット、および方法である。

特許、公表された出願、技術論文、および学術論文などの各種公告が本明細書の至るところで引用されている。これら引用公告のそれぞれが全体として本明細書中に組み込まれる。

薬剤吸収は、薬剤の血中浸透に関与する各種メカニズムによる作用の総体的結果である。薬剤吸収の速度および効率が、薬剤がその目標作用点に達する速度および程度に影響を及ぼす。経口投与剤の消化管吸収は、一部には消化管、とりわけ腸における粘膜透過性機能であり、また通過速度が薬剤が吸収部位にとどめられる時間を規定するため、一部には消化管の各種臓器の通過速度機能である。

薬剤の腸吸収はさまざまな経路で行われる。経口投与された薬剤の多くは、腸細胞の細胞膜を経由する受動的細胞間拡散（Ｖａｎ Ａｓｐｅｒｅｎ Ｊら（１９９８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３７：４２９〜３５）または腸上皮の密着結合を経由する受動的細胞間隙拡散（Ｗａｔｓｏｎ ＣＪら（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１：Ｃ３８８〜Ｃ３９７）によって吸収される。上皮における薬剤吸収はさらに膜輸送タンパク質によって媒介される（Ｌｅｅ ＶＨ（２００１）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．２９：４１〜４）。このような輸送タンパク質は薬剤吸収への障害にもなり得る。

さまざまな排出輸送体、とりわけ多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）ファミリー（Ｂｏｒｓｔ Ｐら（２０００）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２：１２９５〜１３０２）、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）（Ｇｅｒｍａｎｎ ＵＡ（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３２Ａ：９２７〜４４）、および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）（Ｓｔａｕｄ Ｆら［２００５］Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３７４：７２０〜５；Ｄｏｙｌｅ ＬＡら［１９９８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５２６：１５６６５〜７０）などが報告されている。このような排出輸送タンパク質が経口投与剤の低吸収または可変的吸収の主な原因であると考えられている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＲＨら［２００１］Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９６：５８４〜９１）。

したがって薬剤吸収およびそれを促進または阻害する要素は、薬物設計および潜在的治療薬としての主要化合物の評価において考慮すべき重要な事柄である。腸における吸収の評価に関し、いくつかのモデルが利用可能である。それらの例としては、ｐａｒａｌｌｅｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（ＰＡＭＰＡ）、ｉｎ ｓｉｔｕ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ、Ｕｓｓｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒｓ、およびＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）やＣａｃｏ−２細胞などの細胞株（Ｂａｌｉｍａｎｅ ＰＶら（２００６）ＡＡＰＳ Ｊ．８：Ｅ１〜１３）が挙げられる。

ヒト大腸腺癌に由来するＣａｃｏ−２細胞は腸吸収試験で広く用いられているモデルである。Ｃａｃｏ−２細胞は成長し分化すると形態学的には腸細胞と同様であり、小腸刷子縁にある酵素の多くを発現し、従って小腸の環境および機能に酷似している。Ｃａｃｏ−２細胞は腸吸収研究に対しさらに利益を提供し、Ｐ−ｇｐ（Ｈｕｎｔｅｒ Ｊら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４９９１〜７）、ＭＲＰタンパク質（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｔら（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：２６５〜７０；Ｇｕｔｍａｎｎ Ｈら（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（ＮＹ）１６：４０２〜７）、およびＢＣＲＰ（Ｘｉａ ＣＱら（２００５）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３３：６３７〜４３）など少なくとも三つの排出輸送体タンパク質を発現する。

薬剤吸収研究のためには、薬剤排出輸送タンパク質が吸収障害に及ぼす作用を評価するのが望ましい。これは輸送体、とりわけＰ−ｇｐの発現または活性を抑制することによって達成可能である。一般に、シクロスポリンＡなどの化学物質がＰ−ｇｐの活性阻害に用いられる。輸送体の化学的抑制は、それらの化学物質が他の細胞タンパク質および機能をも抑制し、したがって吸収実験の結果をゆがめかねない点で不都合である。最近、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰ−ｇｐの発現がＲＮＡｉ技術により低下することが示され（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔら（２００５）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２２：１２８７〜９３）、Ｃａｃｏ−２細胞における多剤耐性遺伝子１（ＭＤＲ１）の発現がＲＮＡｉ技術により低下することが示された（Ｃｅｌｌｉｕｓ Ｔら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３２４：３６５〜７１）。ＲＮＡｉによるＰ−ｇｐ発現抑制が、Ｐ−ｇｐによる輸送化合物の細胞内蓄積を促進し、同化合物に対する感受性を回復させた（Ｗｕ Ｈら（２００３）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６３：１５１５〜１９）。Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰ−ｇｐの遺伝的下方制御は化学抑制剤の使用に比べれば進歩であるが、本モデルにおける薬剤吸収研究は、Ｐ−ｇｐ発現のノックダウンのみではＭＲＰやＢＣＲＰなどの現存輸送体の薬剤排出および吸収障害への寄与を説明できない点において不利である。さらに、生体外で合成され細胞内に直接トランスフェクションされるｓｈＲＮＡは、遺伝子発現を一時的にのみ低下させ、発現は核酸導入から数日後に回復する。さらに、生体外で合成されるｓｈＲＮＡは多くの場合容易にトランスフェクションされる細胞に限定され、数代にわたる細胞継体培養後における遺伝子発現抑制の安定性についてはほとんど知られていない。

主要化合物の腸吸収を正確に評価し予想するためには、あらゆる排出輸送タンパク質の相対的寄与率を明らかにし制御するのが望ましい。同様に、そのような輸送タンパク質の発現および／または機能をより永続的に遺伝子制御するためには、安定的細胞株を産生、利用するのが望ましい。本発明はこれらの長年の課題に取り組むものである。

本発明は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現抑制に関する単離核酸分子、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６に記載されたヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはそれらの対立遺伝子多型を有する。前記核酸分子は一本鎖、二本鎖、三本鎖のいずれでもよい。一部の好ましい態様において、前記核酸分子はＲＮＡである。

ベクターは膜排出輸送タンパク質の発現抑制に関する核酸分子をコードする核酸配列を有し、当該核酸分子は配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６、またはそれらの対立遺伝子多形を有する。前記ベクターにおいて、前記核酸分子は誘導または構成的プロモーターなどの一つ若しくはそれ以上の調節要素に使用可能な状態で連結されている可能性がある。前記ベクターはウイルスベクターであり得、また一部の好ましい実施形態においてはレンチウイルスベクターである。

そのようなベクターによって形質転換された宿主細胞もこの発明によって提供される。ベクターによる形質転換に選択されたそのような宿主細胞は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質を発現し、形質転換が前記タンパク質の発現を抑制するのが好ましい。前記膜排出輸送タンパク質はそのようなタンパク質であればどれでもよい。膜排出タンパク質の例として、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。宿主細胞は上皮細胞でよいが、できれば腸上皮細胞が好ましく、ヒト腸上皮細胞であればさらに好ましい。適切な細胞の例として、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＴ−８４細胞が挙げられる。宿主細胞の培養も提供される。

さらに、細胞における少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現の安定的抑制、前記細胞の試験化合物との接触、前記試験化合物の経細胞輸送の測定、および前記経細胞輸送測定値と無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値との比較から成る、ヒトなどの動物における消化管吸収に関する化合物スクリーニング法も有する。基準値と比べた測定値は、動物の身体における化合物の消化管吸収を示唆するものである。膜排出輸送タンパク質の例として、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。

そのような方法においては、前記抑制は少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子による前記細胞の安定的形質転換からなり得る。適切な細胞の例として、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＴ−８４細胞が挙げられる。適切な核酸分子には、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するもの、およびわずかに修飾された変異株またはそれらの対立遺伝子多型が含まれる。安定的形質転換に関する一つの非限定例は、前記核酸分子を含有するウイルス（好ましくはレンチウイルス）ベクターの使用に関連する。一部の態様において、単一核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制し得る。

さらに、細胞における一番目の膜排出輸送タンパク質の発現の安定的抑制、二番目の細胞における二番目の膜排出輸送タンパク質の発現の安定的抑制、一番目および二番目の細胞の試験化合物との接触、一番目および二番目の細胞における前記試験化合物の経細胞輸送の測定、および前記経細胞輸送測定値と無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値との比較から成る、ヒトなどの動物における消化管吸収に関する化合物スクリーニング法も有する。一部の実施形態において、前記方法はさらに、三番目の細胞における三番目の膜排出輸送タンパク質の発現の安定的阻害、試験化合物と一番目、二番目、三番目の細胞との接触、一番目、二番目、三番目の細胞における試験化合物の経細胞輸送の測定、および前記経細胞輸送測定値と無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値との比較から成る。各比較に関し、測定値は一番目、二番目、三番目の膜排出輸送タンパク質の試験化合物の経細胞輸送に対する相対寄与率を示し、基準値に対する測定値は動物体における前記化合物の消化管吸収を予測させる。膜排出輸送タンパク質の例として、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。

そのような方法においては、一番目、二番目、および／または三番目の膜排出輸送タンパク質の抑制は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子による細胞の形質転換からなり得る。適切な細胞の例として、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＴ−８４細胞が挙げられる。適切な核酸分子には、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するもの、およびわずかに修飾された変異株またはそれらの対立遺伝子多型が含まれる。安定的抑制に関する一つの非限定例は、前記核酸分子を含有するウイルス（好ましくはレンチウイルス）ベクターの使用に関連する。 一部の態様において、単一核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制し得る。

また本発明は膜排出輸送タンパク質の発現抑制方法も提供する。同方法は、膜排出輸送タンパク質の発現を防止する核酸分子をコードする核酸配列を含むベクターによる細胞の安定的形質転換と、細胞中の前記核酸分子の発現から成り、前記核酸分子の発現は前記膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する。レンチウイルスベクターが好ましい。膜排出輸送タンパク質は、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、乳癌耐性タンパク質のいずれでもよい。前記核酸分子は、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の配列、またはわずかに修飾された変異株、またはそれらの対立遺伝子多型を含み得る。安定的形質転換に関する一つの非限定例は、前記核酸分子を含有するウイルス（好ましくはレンチウイルス）ベクターの使用に関連する。一部の態様において、単一核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制し得る。

動物における消化管吸収に関する化合物スクリーニングキットが本発明により提供される。一部の実施形態において、そのようなキットは、一つ若しくはそれ以上の容器に、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現抑制のための少なくとも一つの核酸分子により安定的に形質転換された細胞、および動物における消化器管吸収に関する化合物スクリーニングキット使用説明書を含み得る。本キットにはさらに、膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子によって安定的に形質転換された別の細胞が含まれる可能性がある。膜排出輸送タンパク質の例として、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。適切な細胞の例として、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＴ−８４細胞が挙げられる。適切な核酸分子には、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の配列のもの、およびわずかに修飾された変異株、またはそれらの対立遺伝子多型が含まれる。

さらに本発明は膜排出輸送タンパク質の排出活性を抑制する化合物の同定方法を有する。そのような方法は、一部の実施形態において、一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質発現の安定的抑制、一番目の細胞の膜排出輸送タンパク質基質との接触、膜排出輸送タンパク質を発現する二番目の細胞と試験化合物および膜排出輸送タンパク質基質との接触、一番目の細胞および（試験化合物の存在下および不在下における）二番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の排出活性測定、および測定された排出活性の比較から成り、試験化合物の不在下における排出活性に対する試験化合物の存在下における排出活性の低下、および試験化合物の存在下における排出活性の一番目の細胞における排出活性との少なくとも部分的な同一性は、当該試験化合物が当該膜排出輸送タンパク質を特異的に抑制することを示している。

そのような方法においては、一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の安定的抑制は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子による細胞の形質転換を含み得る。膜排出輸送タンパク質の例として、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。適切な核酸分子には、配列ＩＤ番号１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するもの、およびわずかに修飾された変異株またはそれらの対立遺伝子多型が含まれる。前記一番目および／または二番目の細胞と成り得る細胞の例として、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＴ−８４細胞が挙げられる。安定的抑制に関する一つの非限定例は、前記核酸分子を含有するウイルス（好ましくはレンチウイルス）ベクターの使用に関連する。 一部の態様において、単一核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制し得る。

対象となる膜排出輸送タンパク質のいかなる既知の基質も本方法で使用可能である。そのような基質の例としては、Ｐ−糖たんぱく質に対するジゴキシン、多剤耐性関連タンパク質２に対するビンブラスチンまたはジニトロフェニル−Ｓ−グルタチオン、および乳癌耐性タンパク質に対するミトキサントロンまたはエストロン−３−硫酸が挙げられる。

図１は、本明細書に記載したように、配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５の配列を有するレンチウイルスによって形質導入された細胞において、細胞内カルセイン蛍光法で測定したＰ−ｇｐ機能が有意に低下した（それぞれｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ ８３、８４、８５、８６、または８７）ことを示している。ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞（ＫＤ）を、確立したＰ−ｇｐ阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と同時に処理した（ＫＤ＋ＣｓＡ）。ＣｓＡを陽性対照に（Ｃ２ＢＢｅｌ＋ＣｓＡ）、非ノックダウン、非形質導入のＣ２ＢＢｅｌ細胞（Ｕｎ−ＫＤ）を陰性対照に用いてベースライン時のカルセイン保持を示した。 図２は、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞および対照細胞からのＲＴ−ＰＣＲ増幅によるヒトＰ−ｇｐ ｍＲＮＡのゲル電気泳動分析を示している。レーン１および２にそれぞれ示された非形質導入Ｃ２ＢＢｅｌ（非ノックダウンＣ２ＢＢｅｌ細胞）およびＭＤＲ１／ＭＤＣＫ細胞は、Ｐ−ｇｐ（最上面）に対応する２０８塩基対（ｂｐ）バンドを顕著に表示する。その一方で、配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５の配列を有するレンチウイルスによって形質導入された細胞（それぞれｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ ８３、８４、８５、８６、または８７）では、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡの発現が有意に低下した。β−アクチンが陽性対照として示されている（底面）。 Ｍ１＝１００ｂｐ ＤＮＡマーカー 図３はｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞中のジゴキシン排出比を示している。配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５の配列を有するレンチウイルスによって形質導入された細胞（それぞれｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ ８３、８４、８５、８６、または８７）では、前記排出比（Ｐａｐｐ Ｂ−Ａ：Ａ−Ｂ）は非形質導入Ｃ２ＢＢｅｌ細胞（Ｕｎ−ＫＤ）に比べ有意に低下している。 図４は、配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５の配列を有するレンチウイルスによって形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（それぞれｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ ８３、８４、８５、８６、または８７）におけるＰ−ｇｐタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示している。形質導入細胞では、同時に行われた非形質導入Ｃ２ＢＢｅｌ細胞（Ｃ）に比べ、Ｐ−ｇｐタンパク質発現は有意に低下した。昆虫細胞のミクロソームに発現したＰ−ｇｐを陽性対照に用いた（Ｐ−ｇｐ）。ヒトＰ−ｇｐを発現しないＭＤＣＫ細胞抽出物を陰性対照に用いた（Ｍ）。βアクチンをブロッティング膜に転写されたタンパク量の正常化に対する標準としてブロットした。 図５は、ウエスタンブロット法で測定した、配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５の配列を有するレンチウイルスによって形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（それぞれｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ ８３、８４、８５、８６、または８７）におけるＰ−ｇｐタンパク質発現の抑制率を、非形質導入Ｃ２ＢＢｅｌ細胞に比較して示している。 図６は、Ｃ２ＢＢｅｌ ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン細胞＃３、４、５、６、および７（それぞれ配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、および２１）におけるＭＲＰ２ ｍＲＮＡ発現を示している。ベクター対照（ＶＣ）細胞は実施例７に記載した対照ｓｈＲＮＡベクターにより形質導入を行った。２〜５代継代細胞の全ＲＮＡを５〜７日間成長させた後に単離し、ＭＲＰ２特異的プライマー（配列ＩＤ番号１１および１２）で増幅し、アガロースゲル電気泳動により分離した。細胞抽出物からの全ＲＮＡ抽出の各種効率を明らかにするためにβアクチンを加えた。 図７は、Ｃ２ＢＢｅｌ ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン細胞＃３、４、５、６、および７（それぞれ配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、および２１により形質導入）におけるＭＲＰ２タンパク濃度のウエスタンブロット分析を示している。ベクター対照（ＶＣ）細胞は実施例７に記載した対照ｓｈＲＮＡベクターにより形質導入を行った。電気泳動ゲルに適用される総タンパク量のばらつきを明らかにするため、βアクチンを加えた。 図８は、配列ＩＤ番号２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するレンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（それぞれ、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ ７９８、７９９、８００、８０１、または８０２）におけるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現を示している。形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞を培養、成長させ、全細胞ＲＮＡを抽出した。抽出ＲＮＡをＢＣＲＰ特異的プライマー（配列ＩＤ番号１３および１４）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、産生物をアガロースゲル電気泳動で分離した。非干渉ｓｈＲＮＡ含有の対照レンチウイルスによって形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（ＶＣ）に比べ、５つのｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰインサートはいずれもＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現を有意に低下させた。細胞抽出物からの総ＲＮＡ抽出のさまざまな効率を明らかにするためにβアクチンｍＲＮＡ産生についても評価した。 図９は、配列ＩＤ番号２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するレンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（それぞれ、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ ７９８、７９９、８００、８０１、または８０２）におけるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現の相対値を示している。形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞を培養、増殖し、全細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを実施し、産生物をアガロースゲル電気泳動により分離した（図８）。ＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現値を非干渉ｓｈＲＮＡ含有の対照レンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（ＶＣ）におけるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現値と比較し、干渉ｓｈＲＮＡｓによるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現抑制度を測定した。結果をＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現抑制率として表示する。 図１０は、配列ＩＤ番号２２、２３、２４、２５、または２６の配列を有するレンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（それぞれ、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ ７９８、７９９、８００、８０１、または８０２）におけるＢＣＲＰタンパク質発現を示している。ウエスタンブロット分析により、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞＃７９８、７９９、８００、８０１、および８０２（細胞継代１５〜１６）中のＢＣＲＰタンパク量が非干渉ｓｈＲＮＡ含有の対照レンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（ＶＣ）中に比べ大幅に低下することが示された。電気泳動ゲルに適用されるタンパク質総量のばらつきを明らかにするため、βアクチンを加えた。 図１１は、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞＃７９８、７９９、８００、８０１、および８０２におけるＢＣＲＰタンパク質発現の抑制率を示している（図１０に示されるごとく）。図１０に示したＰ−ｇｐバンドとβアクチンバンドの吸光度の比率を用いて、非干渉ｓｈＲＮＡ含有の対照レンチウイルスで形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞における発現度に対するｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞におけるＢＣＲＰタンパク質発現の抑制率を測定した。 図１２は、細胞継代５〜２０からのｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞株＃８０１におけるＲＴ−ＰＣＲで測定したＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現を示す。ＢＣＲＰ ｍＲＮＡの発現は５代から２０代にかけて低下した。増幅したｍＲＮＡｓを分離し、図１に示すように視覚化した。細胞抽出物からの全ＲＮＡ抽出の各種効率を明らかにするためにβアクチンを加えた。 図１３は、１０代および２０代のｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１におけるＰ−ｇｐ ｍＲＮＡおよびＭＲＰ２ ｍＲＮＡの発現を示している。ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１におけるＰ−ｇｐ ｍＲＮＡの発現は、１０代および２０代の両方において、ベクター対照細胞（ＶＣ）、非形質導入Ｃ２ＢＢｅｌ（Ｗｔ）に比べ上昇した。Ｐ−ｇｐとは対照的に、２０代でのみ試験を行った他の細胞株に比べクローン＃８０１細胞におけるＭＲＰ２ ｍＲＮＡの発現は有意に低かった。細胞抽出物からの全ＲＮＡ抽出の各種効率を明らかにするためにβアクチンを加えた。 図１４は、細胞継体１０および２０に対するｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞株＃８０１におけるＢＣＲＰ、Ｐ−ｇｐ、およびＭＲＰ２タンパク質の発現に関する図１３に対応するウエスタンブロットを示している。ＭＲＰ２バンドは１０代のｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１では認められるが、２０代では認められない。電気泳動ゲルに適用されたタンパク質総量のばらつきを明らかにするため、βアクチンを加えた。

本発明の方法および他の態様に関するさまざまな用語が本明細書および請求項のいたるところで使用されている。そのような用語には、特に別の指定がない限り、本発明が関わる分野におけるそれぞれの通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供された定義に一致した方法において解釈されるものとする。本明細書に記載した方法と同様または同等のいかなる方法および材料も本発明に関する試験の実践に使用可能であるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。

次の略語が本明細書の至るところで使用される。Ｐａｐｐ：透過係数；Ｐａｐｐ ＡＢ：頂部（Ａ）−側底（Ｂ）方向における透過係数；Ｐａｐｐ Ｂ−Ａ：側底（Ｂ）−頂部（Ａ）方向における透過係数；ＥＲ：排出比、Ｐａｐｐ Ｂ−Ａ／Ｐａｐｐ Ａ−Ｂ比；Ｐ−ｇｐ：Ｐ−糖タンパク質；ＭＤＲ１：多剤耐性タンパク質１；ＢＣＲＰ：乳癌耐性タンパク質；ＭＲＰ：多剤耐性関連タンパク質；ＭＲＰ２：多剤耐性関連タンパク質２；ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地；ＦＢＳ、ウシ胎仔血清；ＦＴＣ：フミトレモルギンＣ；ＣｓＡ：シクロスポリンＡ；ＭＫ５７１：ＭＲＰ阻害剤；ＴＥＥＲ、経上皮電気抵抗；ＫＤ：ノックダウン；ＷＴ：野生型、非修飾親細胞株；Ｃ２ＢＢｅｌ ＷＴ：非修飾Ｃ２ＢＢｅｌ細胞；Ｃ２ＢＢｅｌ Ｐｇｐ−ＫＤ：Ｐｇｐの発現が抑制されたＣ２ＢＢｅｌ細胞；Ｃ２ＢＢｅｌ ＢＣＲＰ−ＫＤ：ＢＣＲＰの発現が抑制されたＣ２ＢＢｅｌ細胞；Ｃ２ＢＢｅｌ ＭＲＰ２−ＫＤ：ＭＲＰ２の発現が抑制されたＣ２ＢＢｅｌ細胞；ＭＤＣＫ：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓；ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ：ヒトＭＤＲ１遺伝子によって形質導入されたＭＤＣＫ細胞株（過剰発現する）；ＢＣＲＰ−ＭＤＣＫ：ヒトＢＣＲＰ遺伝子によって形質導入されたＭＤＣＫ細胞株（過剰発現する）；ＭＲＰ２−ＭＤＣＫ：ヒトＭＲＰ２遺伝子によって形質導入されたＭＤＣＫ細胞株（過剰発現する）；ｎｔ、ヌクレオチド。

本明細書および添付請求項で使用したように、文脈から明らかに他の意味が示される場合を除き、単数形「一つの」および「前記」には複数への言及が含まれる。したがってたとえば、「細胞」には二つ若しくはそれ以上の細胞の組合せが含まれる、といった次第である。

量や時間的継続などの測定可能値に関して本明細書で使用される表現である「約」は、開示された方法を実施するためにはそのようなばらつきが適切であるため、規定値±２０％若しくは±１０％を含むよう意図されているが、±５％の方が好ましく、±１％の方がより好ましく、±０．１％であればさらに好ましい。

「単離された」とは、「人の手により」自然状態から変更されたことを意味する。もし分子または組成が実際に発生する場合、それがその本来の環境から変更若しくは除去されるかその両方である場合、それは「単離された」ことになる。たとえば、生きた植物または動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その自然状態における共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で使用されるように「単離」されている。

「核酸分子」と同意語として使用される「ポリヌクレオチド」は、すべてのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもあり得る。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合体であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合体であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡから成るハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合体が無制限に含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方から成る三本鎖領域を意味する。また、ポリヌクレオチドという用語には、一つ若しくはそれ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡｓまたはＲＮＡｓ、および安定性または他の理由から修飾された骨格を有するＤＮＡｓまたはＲＮＡｓが含まれる。「修飾」塩基としては、たとえばトリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対し加えられる可能性があり、したがって、「ポリヌクレオチド」には自然中に一般的に認められるような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、およびウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態が含まれる。「ポリヌクレオチド」にはしばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短い核酸鎖も含まれる。

「ベクター」とは、別の核酸断片が操作可能な形で挿入され、同断片の複製または発現を引き起こすようなプラスミド、ファージ、コスミッド、ウイルスなどのレプリコンのことである。

「発現する」、「発現された」、または核酸分子の「発現」とは、遺伝子産物の生合成を意味する。同用語は遺伝子のＲＮＡへの転写を含む。たとえば、制限するものではないが、アンチセンス核酸または干渉核酸などの制御遺伝子は転写によりアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡとして発現可能である。同用語はＲＮＡの一つ若しくはそれ以上のポリペプチドへの翻訳も含有し、自然に生じる転写後および翻訳後修飾のすべてを含有する。

「操作可能な形でリンクされる」または「操作可能な形で挿入される」とは、コード配列の発現に必要な制御配列が核酸分子中にコード配列に対し適切な位置に配置され、コード配列の発現を可能にすることを意味する。例として、プロモーターはそのコード配列の転写または発現を制御することができる場合、コード配列に操作可能な形でリンクされる。コード配列はセンスまたはアンチセンス方向でプロモーターまたは制御配列に操作可能な形でリンクされ得る。「操作可能な形でリンクされる」は、発現ベクターにおける他の転写制御要素（エンハンサーなど）の処理に適応されることがある。

核酸構造の「非相同」領域とは、より大きな分子内の当該核酸分子の同定可能セグメントであり、自然状態では当該分子と結合した形では認められない。したがって、非相同領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、通常同遺伝子はソース有機体のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡが隣接しないＤＮＡに隣接する。

そのようなＤＮＡが細胞内に導入されると、細胞はＤＮＡなどの外因性または非相同核酸によって「形質変換」または「形質導入」される。前記形質導入ＤＮＡは細胞のゲノム内に統合（共有結合）される場合もされない場合もある。たとえば原核生物、酵母菌、および哺乳動物細胞において、トランスフォーミングＤＮＡはプラスミドなどエピソーム成分上に保持される。真核細胞に関し、安定的に形質転換された細胞または「安定細胞」では、トランスフォーミングＤＮＡが染色体中に統合され、染色体の複製を通じて娘細胞により継承される。この安定性は真核細胞の、トランスフォーミングＤＮＡ含有娘細胞集団から成る細胞株またはクローン構築能によって示される。「クローン」とは、有糸分裂により、単一細胞または共通祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」とは、インビトロにおける多世代にわたる安定的成長が可能な一次細胞のクローンである。

本明細書で用いられているように、「試験化合物」とはすべての精製分子、実質的精製分子、化学混合物の一つ若しくはそれ以上の成分、または本発明の方法を用いて分析できる任意の他の材料を伴う化合物の混合体のことである。試験化合物は、有機化合物、無機化合物、生分子、およびそれらのすべての断片、同位体、同族体、複合体、および誘導体のいずれでもあり得る。「生分子」には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、単糖類、多糖類、およびそれらの断片、同位体、同族体、複合体、および誘導体が含まれる。試験化合物は、天然起源、合成起源のいずれでもあり得、またそれらの自然発生源から単離または精製可能であり、または新たに合成可能である。試験化合物は構造または組成の観点から定義可能であり、または定義できないこともある。前記化合物は不明の構造、いくつかの既知の産物の混合体、または一つ若しくはそれ以上の化合物から成る不確定組成から成る単離産生物であり得る。未定義組成例としては、細胞および組織抽出物、原核細胞、真核細胞、および古細菌細胞を培養した成長培地、発酵もろみ液、タンパク質発現ライブラリなどが挙げられる。

「膜排出輸送タンパク質」は、細胞膜に局在するタンパク質輸送体すべてを意味する。そのような輸送タンパク質は、生物学的機能の一つとして、細胞内部からの化合物排除媒介能（排出活性）を有する可能性がある。排出活性は多重構造に関連しない治療薬に対する広範な基質特異性耐性、すなわち多剤耐性（ＭＤＲ）を引起す可能性がある。膜排出輸送タンパク質の臨床的ＭＤＲ提供能により、そのようなタンパク質の基質および／または抑制剤同定、および生来または獲得薬剤耐性からの脱却への少なからぬ興味が生まれた。

本明細書で用いられるように、「調節する」とは特定の生分子または経路の量、質、または活性におけるすべての変化、強化、または抑制を意味する。「阻害する」または「阻害」または「干渉する」は、対象となる分子、タンパク質、経路の生物学的活性または発現を低下、削減、遮断、防止、遅延、不活性化、脱感作、停止、または下方制御することを意味する。本発明の一部の好ましい実施形態において、対象とするタンパク質または経路の発現または生物学的活性のレベル、たとえば膜排出タンパク質の排出活性または発現は、約５０〜９９％以上の低下（阻害または下方制御）または上昇を意味するが、より具体的には約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を意味する。阻害は直接的、すなわち対象の分子または経路自体に操作を加えるか、間接的、すなわち対象の分子または経路に影響を及ぼす分子または経路に操作を加えるかのいずれでもよい。

「ノックダウン」は、一つ若しくはそれ以上の遺伝子の発現が低下した細胞または有機体のことである。当業者に理解されるように、ノックダウンでは発現が少なくとも約２０％低下し、できれば発現が少なくとも約５０％低下するのが好ましく、少なくとも約７５％低下すればさらに好ましいが、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上などさらに大幅な低下が可能である。

核酸に関し、「同定率」は二つ若しくはそれ以上の核酸配列の比較において認められる配列同定率を指す。

「消化管吸収」とは、生分子や試験化合物などの化学物質の消化管を含む組織中へのまたは組織を介した取り込みのことである。たとえば、吸収には細胞先端側からの化合物の取り込みおよび細胞側底部からの化合物の放出が含まれるが、それらに限定されない。消化管は、胃、小腸、および大腸を含む。「消化管吸収がない」は、当該化合物が全く吸収されないことを意味する。「低消化管吸収」は、吸収されるのが化合物の２５％未満であることを意味する。「中等度消化管吸収」は、吸収されるのが化合物の２５％以上８５％未満であることを意味する。「高度消化管吸収」は、吸収されるのが化合物の８５％以上であることを意味する。

本明細書で用いられるように、「測定する」または「決定する」はすべての質的または量的測定を意味する。

「経細胞輸送」とは化合物の上皮細胞層を介しての移動のことであり、化合物は密着結合などの細胞間間隙ではなく細胞を通して移動する。対照的に、「傍細胞輸送」は化合物の上皮細胞層を介しての移動を指し、化合物は細胞間密着結合を通して移動する。

次の節では本発明の実行に関与する一般手順について説明する。特別の材料について言及する限りにおいて、単に説明目的のためであり、本発明を制約するようには意図されていない。特に他に規定がない限り、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ &Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９８；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク、１９８９；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｅｄｓ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９５．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＳＪ Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｂ．Ｄ Ｈａｍｅｓ、Ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国１９９９；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈａｒｄｉｎら Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒａｔｉｏｎａｌｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００１；およびＭｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ニュージャージー州Ｃｌｉｆｔｏｎ）、Ｖ．２２８）Ｂａｒｒｙ Ｓｔｅｖｅｎ Ｓｅｌｉｎｓｋｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ ２００３に説明された一般的生化学および分子生物学的方法を用いる。

本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成、または生物学的システム（これらは無論多様である）に限定されないことを理解する必要がある。また、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態の説明のみを目的としており、限定的であることは意図されていないことも理解すべきである。

排出輸送タンパク質、特に腸細胞によって発現されるものは、基質薬の吸収を制限する可能性があり、薬剤有用性または薬剤効率を変化させる（多くの場合低下させる）薬物−薬物相互作用を媒介する可能性がある。したがって、薬剤吸収における種々の排出輸送体の役割を理解することは主要化合物の作成において重要である。今まで、排出輸送体の研究は主に化学抑制剤の使用に依存していた。しかし、化学抑制剤は特異的でなく、他の細胞工程に影響を及ぼし薬剤吸収の全体像をぼやけさせるため、その使用には問題がある。本発明に基づき、種々の排出輸送タンパク質の発現が、ウイルスにより形質導入された細胞を用いて遺伝子レベルにおいて安定的に抑制可能であることが判明した。さらに、各種輸送体の標的ノックダウンにより、薬剤輸送に関与する特定の輸送体の同定が高度の確実性をもって可能となることが判明した。本明細書に記載したノックダウン法は、レンチウイルスベクターによるｓｈＲＮＡの内因性発現によって誘導された膜排出輸送タンパク質の安定的、配列特異的サイレンシングを提供する。レンチウイルスベクターによる形質転換は遺伝子発現を永続的安定的に抑制するため、本発明は従来のノックダウン試行よりも有利であり、さらに化学抑制から予想されるような他の細胞機能に関する非特異的抑制を回避するという優位性を提供する。

したがって、一態様において、本発明は動物における消化管吸収のための試験化合物のスクリーニング法を有する。本方法は、細胞における少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現の調節および好ましくは抑制、当該細胞の試験化合物との接触、当該試験化合物の経細胞輸送の測定、および経細胞輸送測定値の無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に関する基準値との比較から成る。前記化合物の経細胞輸送を測定する実験によって得られた値は、前記試験化合物が当該動物への投与によって吸収されそうな程度を示している。したがって前記方法はとりわけインビトロモデルとして有用である。

本明細書で薬剤輸送体または薬剤輸送タンパク質と同義的に称される膜排出輸送タンパク質は、一般に哺乳動物上皮細胞などの哺乳動物細胞の原形質膜を補う一つ若しくはそれ以上のサブユニットから成る。哺乳動物上皮細胞は多くの場合極性細胞であり、そのことはそれらの膜組成が細胞の頂部または外向き部分と側底部または内向き部分とで異なることを意味している。頂部または外向きにより、そのような細胞部分が、腸内腔または尿路または胆管内面など、外部環境に関連した身体部分に面するように意図されている。側底部または内向きにより、そのような細胞部分は身体内部、通常は身体の血液供給に面するように意図されている。上皮細胞は栄養素、薬剤、環境毒素に加え、これらの各範疇における化合物に由来する代謝物の吸収および排出に一定の役割を果たしている。上皮細胞は、隣接細胞が細胞間のイオンおよびそれよりも大きな分子の拡散を制限する細胞間結合である密着結合により結合している中で共に成長可能であり、傍細胞輸送と呼ばれる。 肝細胞と脳毛細血管内皮細胞は上皮細胞と、密着結合および膜輸送タンパク質の非対称的発現など、特定の特徴を共有している。多くの上皮細胞は、身体外部で培養した場合にもこの非対称的方向性を保持する。これにはコラーゲンコーティングされたプラスチック製品の使用や一つ若しくはそれ以上の異化誘導性タンパク質またはホルモンの細胞培地への追加など、特別のインビトロ培養条件が必要とされることがある。他の特殊化した培養条件が当業者に知られており、用意に実践される。

膜排出輸送体は上皮細胞中で非対称性に分布可能である。この非対称性分布は、そのような輸送体の基質である化合物のベクトル輸送を引き起こす可能性がある。ベクトル輸送は、化合物の輸送速度が、その化合物が上皮細胞層の頂部表面または側底部表面のいずれに適用されるかによって大いに異なることを意味する。

哺乳動物の膜輸送は、遺伝子配列関係および化合物の輸送形態に基づいて二群に分類可能である。第一群はＡＢＣ輸送体と称される。「ＡＢＣ」はこの輸送体群の共通構造特性であるアデノシン三リン酸（Ａ）結合（Ｂ）カセット（Ｃ）構造モチーフの存在に言及するものである。通常これらの輸送タンパク質は、化学物質を細胞内部または細胞膜のリン脂質二重層内から細胞外へ、不利な濃度勾配に逆らってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびリン酸イオン（Ｐｉ）への加水分解によって提供されるエネルギーを用いて移動させる。いかなる特定の理論または作用機序にも限定される意図はなく、薬剤輸送体としての役割に加え、ＡＢＣ群のメンバーは胆汁塩およびリン脂質の胆汁への排出および細胞膜のリン脂質およびコレステロール含有量の制御に一定の役割を果たしていると考えられている。

哺乳動物に存在する二番目の主な輸送体群はＳＬＣ群と称され、「ＳＬＣ」とはこの群の主な特徴である「溶質関連担体（Ｓｏｌｕｔｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ）」のことであり、すなわち薬剤の細胞内へのまたは細胞からの輸送は、ナトリウムイオン、陽子、代謝産物などの生理溶液の、溶質交換による反対方向への輸送または同時輸送による同方向への輸送に関連している。ＡＢＣ輸送体群とは異なり、ＳＬＣ群は機能するためにＡＴＰ加水分解に由来するエネルギーを必要としない。その代わりに、そのような輸送体は不利な濃度勾配に逆らって薬剤を輸送するためのエネルギーとして、同時輸送および／または交換された分子またはイオンの濃度勾配を利用する。また、ＡＢＣ群輸送体と異なり、ＳＬＣは頻繁に化合物の細胞内への取り込みを媒介する。尿細管上皮細胞など一部の場合には、ＳＬＣおよびＡＢＣ輸送体は極性上皮側に存在し、一致協力して化合物を血液中から尿中へ不利な濃度勾配に逆らって送達する（Ｗｒｉｇｈｔ Ｓ．ら（２００４）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ ８４：９８７〜１０４９）。

以下の表１に、ＡＢＣ輸送体群のヒトメンバーおよび周知の基質および抑制剤の一部を挙げる（Ｚｈａｎｇ Ｌら（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３：６２〜９）。基質および阻害剤のリストは説明が目的であり、網羅は意図されていない。

薬剤リファンピンおよびハーブ系サプリメントＳｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ ｗｏｒｔは高ＡＢＣＢ１遺伝子発現の確立された誘導物質である。ＡＢＣ輸送体群は多岐にわたる薬効分類の薬剤輸送を媒介し、その中にはシスプラチンやトポテカンなどの抗腫瘍薬、インジナビルやアデホビルなどの抗ウイルス薬、ロスバスタチンなどの抗高脂血症薬などが含まれる。異なった輸送体に対する基質の中にはかなりの重複が認められる。たとえば、インジナビルはＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、およびＡＢＣＣ２の基質である。同様に、トポテカンはＡＢＣＢ１およびＡＢＣＧ２の基質である。少なくともＡＢＣＢ１（または通称Ｐ−ｇｐ）の場合、広範な薬効分類にわたる数種の薬剤が当該輸送体の基質でなくても当該輸送体を抑制することが可能である。さまざまな程度の遺伝子配列ホモロジーを有するこれらのヒト輸送体の相同分子種が、ラット、マウス、イヌ、ヒト以外の霊長類などの哺乳類に存在する。

本発明の方法は、試験化合物の動物における消化管吸収分析用として好ましくはイヌ、ネコ、ウサギを含む愛玩動物などの哺乳動物に適用可能であり、最も好ましくはヒトに適応可能である。そのようなものとして、本方法は対象の動物または動物群を代表する任意の細胞において実行可能である。同細胞は新たに単離、構築した細胞株でもよく、または新たに産生された細胞株でもよい。同細胞は好ましくは少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質を発現するが、一部の実施形態においては同細胞は２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上の輸送タンパク質を発現する。一部の態様において、前記細胞は特定の膜排出輸送タンパク質を具体的に発現するように設計することができ、また２つ若しくはそれ以上の特定の膜排出輸送タンパク質を具体的に発現するよう設計することができる。さらに、そのような細胞は特定の濃度において、または極性細胞においては細胞表面の特定の部位において（たとえば、基底面、先端面、基底面と先端面の両方、またはそれらのいずれでもない部位）、特定の膜排出輸送タンパク質を発現するよう設計することができる。細胞を形質転換して特定の排出タンパク質トランス遺伝子を発現させる方法（本明細書中に記載、例示された方法を含む）が本分野で知られており、日常的に実施されている。本請求の方法および記載の細胞を用いた分析に適した膜排出輸送タンパク質の非限定例としては、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。そのような輸送体は配列ＩＤ番号６、７、または８の配列を有するか、それらの対立遺伝子多型、同族体、および類似体を有する。

前記細胞は当該動物の消化管から単離されているか、同動物の消化管から単離された細胞の特徴を有するのが好ましい。たとえば、前記細胞は胃、小腸、または大腸（これらの臓器の副部品を含む）から単離することができる。一部の好ましい実施形態において、前記細胞は腸細胞、特に小腸上皮細胞である。一部の好ましい実施形態において、前記細胞は腸細胞株である。高度に好ましい実施形態において、前記細胞はＣａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、またはＴ−８４細胞である。あるいは、動物消化管の極性上皮細胞における多くの特徴に近似することが知られている細胞種であるＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞も本発明の一実施形態として使用することができる（Ｍａｋｓｙｍｏｗｙｃｈ、ＡＢおよびＳｉｍｐｓｏｎ ＬＬ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１９５０〜５７（１９９８））。ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＲ−ＭＤＣＫ）は血液脳関門ｃｏｍｐｏｕｎｄのヒトＰ−ｇｐ媒介輸送の評価にすでに用いられている（Ｗａｎｇ Ｑ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２８８：３４９〜５９（２００５））。

少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現調節が、本分野に適した任意の手段により生じ得る。非常に好ましい実施形態において、前記輸送タンパク質の発現は抑制される。一部の態様において、前記抑制は遺伝子レベルで生じる。たとえば、特定の排出輸送タンパク質をコードするトランス遺伝子を発現するように具体的に設計された細胞において、トランス遺伝子は誘導プロモーターの制御下に置くことができる。本発明における使用に適した誘導プロモーターは当業者には周知と思われる。

一部の好ましい実施形態において、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、乳癌耐性タンパク質などの膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子は、さまざまな他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）法の使用により抑制することができる。ＲＮＡサイレンシングには、ＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）Ｈに基づく酵素（「ダイサー」または「ダイサー様」）による二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の小さな２１〜２８ヌクレオチド断片への処理が関与する。分解産物であるｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）がタンパク質エフェクター複合体に組み込まれ、配列に特異的な形で遺伝子発現を制御する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング・メカニズムであり、アンチセンスおよびリボザイムに基づいたアプローチとは異なる（ＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡについてはＪａｉｎ ＫＫ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００４）５：２３９〜４２を参照のこと）。ＲＮＡ干渉は、膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子に厳密な条件下にハイブリダイズし、標的遺伝子の発現を減弱させる核酸（ｄｓＲＮＡなど）を動物に投与することにより、ヒトなどの動物における膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する方法において有用である。ＲＮＡ干渉は膜排出輸送タンパク質遺伝子の一つ若しくはそれ以上の部位を標的とする多重配列を有するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを提供する。ｄｓＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）は、さまざまな種類の細胞において最初にＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３〜３６６）と称されるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素による処理を経た後にｍＲＮＡのより小さなｄｓＲＮＡ分子（それぞれが５’リン酸基と３’ヒドロキシル基を有する二つの２１ｎｔ（ヌクレオチド）鎖から成り、他方の鎖と厳密に相補的な１９ｎｔ領域を有し、２ｎｔ−３’オーバーハングにはさまれた１９ｎｔの二本鎖領域が存在する）への配列特異的な分解を指示すると考えられている。したがってＲＮＡｉは、通常各鎖に１〜２ヌクレオチドの３’オーバーハングが付いた長さ約１９ヌクレオチドの二重鎖領域から成る短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に媒介され、全長約２１〜２３ヌクレオチドとなる。哺乳動物細胞において、長さ約３０ヌクレオチド以上のｄｓＲＮＡは、通常はインターフェロン反応を通じて非特異的ｍＲＮＡ分解を誘発する。しかし、哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡの存在は、インターフェロン反応を誘発するよりもむしろ配列特異的な遺伝子サイレンシングを生じる。

ウイルスベクターまたはＤＮＡベクターは、細胞質において処理され短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。一般に、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、好ましくは約１９塩基対のＲＮＡ二本鎖から成り、選択的にさらに一つ若しくは二つの一本鎖オーバーハングまたはループを有する。ｓｉＲＮＡは共にハイブリダイズされた二つのＲＮＡ鎖を有するか、あるいは自己ハイブリダイゼーション部位を含む単鎖ＲＮＡを有する。ｓｉＲＮＡにはリン酸基および／またはヒドロキシル基を含む一つ若しくはそれ以上の自由鎖端が存在する。通常ｓｉＲＮＡｓには厳しい標的転写条件下にハイブリダイズする部位が含まれる。前記ｓｉＲＮＡの一本の鎖（または、ｓｉＲＮＡの自己ハイブリダイゼーション部位）は通常標的転写部位と厳密に相補的であり、ｓｉＲＮＡが一つのミスマッチもなく標的転写物にハイブリダイズすることを意味する。完全な相補性が得られない本発明の特定の実施形態において、いかなるミスマッチも前記ｓｉＲＮＡ末端またはその近傍にあるのが一般に好ましい。

トランスフェクション、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム介在性トランスフェクション、マイクロインジェクションなどの方法によって哺乳動物の細胞内に移された場合、またはプラスミドに基づいたさまざまな方法の一つによって細胞内に発現された場合、ｓｉＲＮＡｓは遺伝子発現を下方制御することが示されている。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉はたとえばＴｕｓｃｈｌ Ｔ（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６〜８；Ｙｕ Ｊ−Ｙら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：６０４７〜５２；Ｓｕｉ Ｇら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９９：５５１５〜２０；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪら（２００２）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅ ｖ．１６：９４８〜５８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０〜３，２００２；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ Ｍら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４９７〜５００；およびＰａｕｌ ＣＰら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜８においてレビューが行われている。これらおよび他の参考文献に記載されているように、前記ｓｉＲＮＡは二つの個々の核酸鎖またはヘアピン（ステムループ）構造を形成できる自己相補的部位を伴った単鎖から構成される。構造、長さ、ミスマッチ数、ループサイズ、オーバーハングにおけるヌクレオチドのアイデンティティなどにおける多くのバリエーションは、有効なｓｉＲＮＡ誘発性の遺伝子サイレンシングと整合するものである。いかなる理論にも束縛される意図はないが、多種の異なった前駆体の細胞内プロセッシング（たとえばＤＩＣＥＲによる）により、遺伝子サイレンシングを効果的に媒介できるｓｉＲＮＡが産生されると考えられている。一般にイントロンよりもエクソンを標的とする方が好ましく、また標的転写物の３’部位内領域と相補的な配列を選択するのが好ましい。一般にモル比がほぼ等しい異なったヌクレオチドを含んだ配列を選択し、単一残基が複数回繰返される延長は回避するのが好ましい。

したがってｓｉＲＮＡｓは各鎖に１〜２ヌクレオチドの３’オーバーハングの付いた長さ約１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有するＲＮＡ分子から成る可能性があり、全長約２１〜２３ヌクレオチドとなる。本明細書で用いられているように、ｓｉＲＮＡｓにはインビボで処理されそのような分子を生成するさまざまなＲＮＡ構造がさらに含まれる。そのような構造には、互いにハイブリダイズすることによりステム、ループ、および選択的にオーバーハング（好ましくは３’オーバーハング）を形成する二つの相補的要素を含むＲＮＡ鎖が含まれる。好ましくは、前記ステムの長さは約１９ｂｐ、前記ループの長さは約１〜２０、より好ましくは約４〜１０、最も好ましくは約６〜８ｎｔ、および／または前記オーバーハングの長さは約１〜２０、より好ましくは約２〜１５ｎｔである。本発明の特定の実施形態において、前記ステムの長さは最低１９ヌクレオチドであり、最大約２９ヌクレオチドである。４ヌクレオチド以上のループはそれよりも短いループに比べ立体障害を受ける可能性が低く、従って好ましいとも言える。前記オーバーハングには５’リン酸基と３’ヒドロキシル基が含まれる可能性がある。前記オーバーハングには複数個（たとえば１〜５個）のＵ残基が含まれる可能性があるが、含まれなくても問題はない。上述のごとき古典的ｓｉＲＮＡｓは標的とされるｍＲＮＡｓの分解を引き起こし、それによってタンパク合成速度も低下させる。古典経路により作用するｓｉＲＮＡｓに加え、テンプレート転写の３’ＵＴＲに結合する特定のｓｉＲＮＡｓが、古典的ＲＮＡ干渉に関連するが異なるメカニズムにより（たとえば安定性を低下させるよりも当該転写の翻訳を低下させることによって）、前記テンプレート転写によってコードされたタンパク質の発現を抑制する可能性がある。そのようなＲＮＡｓはマイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）と称され、長さは通常約２０〜２６ヌクレオチド、たとえば２２ｎｔである。それらはｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡｓ（ｓｔＲＮＡｓ）として知られるより大きな前駆体またはｍＲＮＡ前駆体に由来し、長さが通常約７０ｎｔで約４〜１５ｎｔのループを備えている（Ｇｒｉｓｈｏｋら（２００１）Ｃｅｌｌ １０６：２３〜４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ Ｇら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８３４〜８；Ｋｅｔｔｉｎｇ ＲＦら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：２６５４〜９）。 この種類の内因性ＲＮＡｓは哺乳動物を含む多くの有機体で認められており、この転写後遺伝子サイレンシングメカニズムが広く行き渡っていることを示している（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ Ｍら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：８５３〜８，２００１；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ＡＥ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎ．１８：１７１〜３）。 マイクロＲＮＡｓは哺乳動物細胞において標的部位を含む標的転写の翻訳を阻止することが示されている（Ｚｅｎｇ Ｙら（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９：１３２７〜３３）。

自然発生のｓｉＲＮＡｓまたは３’ＵＴＲ内（または標的転写の別の部位）で結合し翻訳を抑制する人工（すなわち人によって設計された）ｍＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二本鎖における数多くのミスマッチ、特に二本鎖の中心領域内のミスマッチを容認する可能性がある。実際、自然発生のｓｔＲＮＡｓがインビトロで翻訳を抑制することが示されているｍＲＮＡｓのように頻繁にそのようなミスマッチを示すように、一部のミスマッチは望ましいかまたは必要であるという証拠がある。たとえば、標的転写物とハイブリダイズされた場合、そのようなｓｉＲＮＡｓにはミスマッチ領域で分離された完全な相補性を示す二つの延長が頻繁に含まれる。さまざまな構造が可能である。たとえば、前記ｍＲＮＡには複数のｎｏｎｉｄｅｎｔｉｔｙ（ミスマッチ）領域が含まれる可能性がある。ｎｏｎｉｄｅｎｔｉｔｙ（ミスマッチ）領域は、標的とｍＲＮＡの両方に対をなさないヌクレオチドが含まれるという意味で対称的である必要はない。通常、完全相補性の延長は長さが少なくとも５ヌクレオチド、たとえば６、７またはそれ以上のヌクレオチドであり、一方ミスマッチ領域はたとえば１、２、３、または４ヌクレオチドである。

ｓｉＲＮＡｓおよびｍＲＮＡ前駆体にまねて設計されたヘアピン構造は、細胞内で処理されて標的転写物の発現を低下ないし抑制することが可能な分子になる（ＭｃＭａｎｕｓ Ｍｔら（２００２）ＲＮＡ ８：８４２〜５０）。これらのヘアピン構造は二つのＲＮＡ鎖から成り１９ｂｐ二重鎖構造を形成する古典的ｓｉＲＮＡｓに基づいており、クラスＩまたはクラスＩＩヘアピンに分類される。クラスＩヘアピンはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖（すなわち抑制が好ましい標的転写物に対し相補的な鎖）の５’端または３’端にループを組み込むが、さもなければ古典的ｓｉＲＮＡｓと同一である。クラスＩＩヘアピンは、ステム中における一つ若しくはそれ以上のヌクレオチド・ミスマッチに加え、二本鎖のうちのアンチセンス鎖の３’端または５’端のいずれかに１９ｎｔ二鎖領域またはループを有する点でｍＲＮＡ前駆体に類似する。これらの分子は細胞内で処理されてサイレンシングを媒介できる小さなＲＮＡ二重鎖構造になる。自然発生のｍＲＮＡｓおよびｓｔＲＮＡｓの場合と同様、それらは翻訳抑制を通じてよりもむしろ標的ｍＲＮＡの分解を通じて効果を発揮すると考えられる。

従って二重鎖構造を含むＲＮＡ分子の多様な集合がさまざまなメカニズムを通じてサイレンシングを媒介できることは明白である。本発明の目的のため、そのようなＲＮＡ（一部が標的転写物に結合し、分解誘発、翻訳抑制、または他の手段によりその発現を抑制する）のいずれもがｓｉＲＮＡと見なされ、そのようなｓｉＲＮＡを生成するすべての構造（すなわちＲＮＡの前駆体となる）が本発明の実践に有用である。

本発明に使用されるさらなるＲＮＡ干渉の方法は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特定の望ましいｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドが、トランスフェクションまたはウイルス媒介性感染を通じて標的細胞内に送達される。いったん細胞に入ると、ＤＮＡ配列は自身に折り重なるＲＮＡ分子内に継続的に転写され、分子内塩基対合によりヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、いったん細胞によって処理されると形質導入されたｓｉＲＮＡと同等であり、当該細胞に使用され目的のタンパク質のＲＮＡｉを媒介する。ｓｈＲＮＡの使用は安定的で長期のタンパク質発現抑制を可能にすることから、ｓｉＲＮＡトランスフェクションよりも有利である。形質導入されたｓｉＲＮＡｓによるタンパク質発現の抑制は、数日以上の長期間にわたって生じることのない一過性の現象である。ある場合にはこれは好ましい。より長期間のタンパク質抑制が必要な場合には、ｓｈＲＮＡ媒介の抑制が好ましい。ｓｈＲＮＡの使用は特に好ましい。通常、ｓｉＲＮＡをコードするベクターは、「センス」方向にサイレンシングされる標的遺伝子配列であるプロモーター、標的遺伝子配列のアンチセンスであるスペーサー、およびターミネーターから成る。

膜排出輸送タンパク質の発現抑制は、本分野で知られ容易に実行される他の手段によっても達成される。たとえば、アンチセンス核酸を用いることができる。アンチセンスＲＮＡ転写は、同じ細胞における他の任意のＲＮＡ転写の一部または全部に対し相補的な塩基配列を有する。そのような転写は、ＲＮＡスライシングの調節、ＲＮＡ輸送の調節、およびｍＲＮＡ翻訳の調節などさまざまなメカニズムを通して遺伝子発現を調節することが示されている（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ＤＴ（１９９２）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：７０〜６、１９９２；Ｎｅｌｌｅｎ Ｗら（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：４１９〜２３；およびＢａｋｅｒ ＢＦら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８９：３〜１８）。したがって、本発明の特定の実施形態において、細胞における一つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の抑制は、同細胞におけるアンチセンス核酸分子を発現することによって達成される。

アンチセンス核酸は一般に標的核酸（たとえばｍＲＮＡ転写物）の一部と相補的な一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、または修飾ＲＮＡ）であり、したがって同標的に結合し二本鎖を形成することができる。通常それらは長さが１５〜３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、１０から約５０ヌクレオチドであることもある。通常、結合により膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子などの標的核酸の機能は低下または抑制される。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに結合すると転写を阻止し、ｍＲＮＡに結合すると翻訳を抑制し、および／または核酸の分解を引き起こす可能性がある。膜排出輸送タンパク質の発現抑制は、当該膜排出輸送タンパク質をコードするｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸またはペプチド核酸の投与によって達成可能である。アンチセンス法およびその応用は本分野では良く知られており、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｍ．Ｉ．（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０００、第３１３および３１４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、およびその中の参考文献に記載されている。「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（第一版）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；およびその中の参考文献も参照のこと。

アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞における任意のＲＮＡ転写物の一部に相補的な塩基配列によって合成可能である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスライシングの調節、ＲＮＡ輸送の調節、およびｍＲＮＡ翻訳の調節などさまざまなメカニズムを通じて遺伝子発現を調節することができる。安定性、毒性、組織分布、および細胞の取り込みおよび結合親和性などアンチセンス・オリゴヌクレオチドのさまざまな特性が、（ｉ）ホスホジエステル骨格（たとえばペプチド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホロアミデート・オリゴヌクレオチドなど）の交換、（ｉｉ）糖基（たとえば２−Ｏ−プロピルリボースおよび２’−メトキシエトキシリボース）の修正、および（ｉｉｉ）ヌクレオチド（たとえばＣ−５プロピニルＵ、Ｃ−５チアゾールＵ、およびフェノキサジンＣ）の修正などの化学的修飾を通じて変更される（Ｗａｇｎｅｒ ＲＷ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：１１１６〜８；Ｖａｒｇａ ＬＶら（１９９９）Ｉｍｍｕｎ．Ｌｅｔｔ．６９：２１７〜２４；Ｎｅｉｌｓｅｎ ＰＥ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：７１〜５；およびＷｏｏｌｆ ＴＭ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１７６３〜９）。

膜排出輸送タンパク質の抑制はリボザイムの使用によっても達成可能である。リボザイムまたはデオキシリボザイムと称される特定の核酸分子は、ＲＮＡ分子の配列特異的分裂を触媒することが示されている。分裂部位は、前記ＲＮＡ酵素またはＤＮＡ酵素におけるヌクレオチドの、標的ＲＮＡにおけるヌクレオチドとの相補対によって決定される。したがって、ＲＮＡおよびＤＮＡ酵素はいかなるＲＮＡ分子にも分裂するように設計可能であり、それによってその分解速度を増す（Ｃｏｔｔｅｎ Ｍら（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：３８６１〜６、１９８９；およびＵｓｍａｎ Ｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：５２７〜３３）。

本発明の好ましい態様において、本発明の方法で用いられる細胞はｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの転写サイレンシング核酸によって明確に形質転換が可能であるか、またはそのような核酸をコードするベクターによって当該細胞が当該抑制的核酸分子を発現するように形質転換可能である。前記細胞の形質転換は、本明細書に記載、例示した方法を含む、本分野に適した任意の方法に従って実行することができる。特定の実施形態において、前記抑制的核酸分子は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６、またはそれらの同位体、同族体、または対立遺伝子多型を含む。

本発明の方法に従って、試験化合物は単回投与または反復投与によりスクリーニング可能である。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のｆｒｅｅ ｍａｘｉｍａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｃｍａｘ）からその５００倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のＣｍａｘからその２５０倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のＣｍａｘからその１００倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のＣｍａｘからその５０倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のＣｍａｘからその３０倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。一部の実施形態において、前記試験化合物は当該化合物のＣｍａｘからその１０倍以上の濃度範囲における反復投与により評価される。Ｃｍａｘは本分野で利用可能な任意の方法により測定可能である。当業者は、そのような方法が本分野では既知であり、日常的なものであることを理解するものと思われる。当該化合物は本範囲内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の濃度において試験可能である。

一部の態様において、薬物−薬物相互作用の評価のため、複数の試験化合物が当該細胞と接触させられる。薬物−薬物相互作用は、一つの薬剤が同じ被験者に同時投与されたもう一つの薬剤の薬物動態または薬力学に及ぼす影響と定義される。薬物動態とは、血液、血漿、脳などさまざまな身体組織においてさまざまな薬剤投与量および投与方法が薬剤投与後の時間関数として薬剤濃度に及ぼす影響のことである。薬力学とは、薬剤投与量および投与経路が血圧、血中脂質濃度、組織中の感染性ウイルス粒子数など薬学的反応に及ぼす影響に関する研究のことである。薬剤−薬剤相互作用は通常以下三つのうちいずれかのメカニズムによって生じる：１）二つ若しくはそれ以上の薬剤が、身体において代謝、取り込み、または排出に関与する同じ限定された量の酵素または輸送タンパク質をめぐって競う；２）一つの薬剤が身体による一つ若しくはそれ以上の他の薬剤の代謝、取り込み、または排泄を媒介する酵素、取り込み、または排出輸送体を抑制する、３）一つの薬剤が身体における一つ若しくはそれ以上の他の薬剤の代謝、取り込み、または排出に関与する酵素、取り込み、または排出輸送体の産生を増進または抑制する。一部の場合においては、相互作用物質は薬剤ではなく、グレープフルーツジュースなどのフルーツジュース成分、またはＳａｉｎｔ Ｊｏｈｎ‘ｓ ｗｏｒｔなどのハーブ系サプリメント、といった自然食品成分である。膜排出輸送タンパク質に関連した薬剤−薬剤相互作用の例が報告されている。たとえば、ｐ−糖タンパク質基質であるジゴキシンの経口バイオアベイラビリティはタリノロールによって上昇した（Ｗｅｓｔｐｈａｌ Ｋら（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６８：６〜１２）。もう一つの例では、ジゴキシンの腎クリアランスがクラリスロマイシンによって妨げられ、全身ジゴキシン濃度が上昇した（Ｗａｋａｓｕｇｉ Ｈら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ ６４：１２３〜８）。したがって、膜排出輸送タンパク質によって媒介される薬剤−薬剤相互作用が、薬剤吸収、分布、およびクリアランスに関する薬剤の薬物動態を変え、同薬剤への予想外の反応を引き起こす可能性がある。さまざまな種類の排出輸送タンパク質発現を伴った細胞株は、基質およびそのようなタンパク質抑制剤を明確に特定する能力を提供し、従って潜在的薬剤−薬剤相互作用を予測し薬剤投与法の調整に関するガイダンスを提供することを可能にする。２００６年９月１１日、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は薬剤―薬剤相互作用の判断に関するインビトロ検定法の重要性を論じ、そのような検定法が実行できる方法を示唆するドラフト案を発表した。同ガイダンスはインビトロの所見を確認または反証するのに用いることのできるヒトの臨床試験に関する勧告も提供する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｅｒ／ｄｒｕｇ／ｄｒｕｇＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）。

さらに特徴とされるのは、別々の細胞における異なった膜排出輸送タンパク質の抑制に対する平行分析を利用した消化管吸収に関する化合物のスクリーニング法である。たとえば、所与の試験化合物は一群の細胞においてスクリーニング可能であり、同集団中の各細胞は異なった膜排出輸送タンパク質の発現に対するノックダウンであるか、膜排出輸送タンパク質の異なった組合せである。そのような方法を用いることにより、当業者は試験化合物の消化管吸収における各個別の輸送タンパク質または輸送タンパク質の特定の組合せによる貢献を有利に測定することが可能である。

したがって、一部の態様において、本発明の方法は一番目の細胞における一番目の膜排出輸送タンパク質の発現抑制および二番目の細胞における二番目の膜排出輸送タンパク質の発現抑制、前記一番目および二番目の細胞の試験化合物との接触、および一番目および二番目の細胞における当該試験化合物の経細胞輸送の測定から成る。続いて、前記一番目および二番目の各細胞からの前記経細胞輸送の測定値を次に消化管吸収されない化合物、低消化管吸収の化合物、中等度消化管吸収の化合物、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に関する基準値と比較することができる。前記測定値は、前記試験化合物の経細胞輸送における前記一番目および二番目の膜排出輸送タンパク質の役割を示すものである。さらに、基準値と比べた測定値は対象の動物身体における前記化合物の消化管吸収を予測させる。

一部の態様において、前記方法は個々の細胞における三番目、四番目、五番目、六番目、またはそれ以上の輸送タンパク質、またはそれらの組合せ、などの追加的膜排出輸送タンパク質の抑制から成り、その結果同集団中の細胞数を拡大する。したがって、一部の好ましい実施形態において、本方法は一番目の細胞における一番目の膜排出輸送タンパク質の発現抑制、二番目の細胞における二番目の膜排出輸送タンパク質の発現抑制、および三番目の細胞における三番目の膜排出輸送タンパク質の発現抑制、および前記一番目、二番目、および三番目の細胞における当該試験化合物の経細胞輸送の測定からなる。続いて、前記一番目、二番目、および三番目の各細胞からの前記経細胞輸送の測定値を消化管吸収されない化合物、低消化管吸収の化合物、中等度消化管吸収の化合物、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に関する基準値と比較することができる。前記測定値は、前記試験化合物の経細胞輸送における前記一番目、二番目、および三番目の膜排出輸送タンパク質の役割を示すものである。さらに、基準値と比べた測定値は対象の動物身体における前記化合物の消化管吸収を予測させる。

そのような方法のバリエーションは、一番目の細胞における二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質および二番目の細胞における少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現抑制から成る。一部の態様において、二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現は、たとえば二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制できる単一の核酸分子を用いて抑制可能である。前記二番目の細胞における膜排出輸送タンパク質は前記一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の一つと同じか、または異なった膜排出輸送タンパク質であり得る。これらの方法により、当業者は同細胞における膜排出輸送タンパク質の任意の相乗効果を識別し特徴付けることができる。

前記二番目、三番目、四番目（など）の細胞は、新たに単離、構築された細胞株、または新たに産生された細胞株であり得る。同細胞は少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質を発現するのが好ましいが、一部の実施形態においては同細胞は２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上の輸送タンパク質を発現する。一部の態様において、前記細胞は特定の膜排出輸送タンパク質を発現するよう特異的に設計されることがあり、また二つ若しくはそれ以上の特定の膜排出輸送タンパク質を発現するよう設計されることもある。さらに、そのような細胞は特定の濃度において、または極性細胞においては細胞表面の特定の部位において（たとえば、基底面、先端面、基底面と先端面の両方、またはそれらのいずれでもない部位）、特定の膜排出輸送タンパク質を発現するよう設計することができる。

一群の細胞を用いた分析用として考慮された膜排出輸送タンパク質の非限定例としては、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。

前記細胞はできれば対象動物の消化管から単離されたものであるか、同動物の消化管から単離された細胞の特徴を有するものであるのが好ましい。たとえば、前記細胞は胃、小腸、または大腸（これらの臓器の副部品を含む）から単離することができる。一部の好ましい実施形態において、前記細胞は腸細胞、特に小腸上皮細胞である。一部の好ましい実施形態において、前記細胞は腫瘍性に形質転換され得るかさもなければ不死化された腸細胞株である。非常に好ましい実施形態において、前記細胞はＣａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、またはＴ−８４細胞である。

一番目、二番目、三番目、またはそれ以上の細胞のいずれかにおける当該試験化合物の経細胞輸送は、本分野に適した任意の方法に基づいて測定することができる。日常的に行われる経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定法も利用可能である。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）およびＬＣ−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）も利用可能である（ｖａｎ Ｂｒｅｅｍｅｎ ＲＢら（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１：１７５〜８５）。また、標識が蛍光または液体シンチレーション計測により都合よく検出可能であることから、たとえば当該試験化合物を許容できる染料またはアイソトープで標識することにより、蛍光染料またはラジオアイソトープを使用することができる。非限定例としては蛍光ロダミン１２３および放射性標識されたシクロスポリンＡ、ジゴキシン、リトナビル、タクソール、ベラパミル、およびビンブラスチンが挙げられる（Ｔｒｏｕｔｍａｎ ＭＴ（２００３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：１２１０〜２４）。

当該細胞の単方向性（粘膜−漿膜輸送）またはニ方向性（粘膜−漿膜および漿膜−粘膜輸送）透過性を測定することができる。単方向性輸送では、薬液を細胞単層の先端（粘膜）側に加え、側底（漿膜）側から試料を採取し、累積透過薬を時間、表面積、および投与濃度によって除することによって透過係数を測定する。 ニ方向性輸送では、先端部−側底部（粘膜−漿膜）方向および側底部−先端部（漿膜−粘膜）方向の両方の透過係数を測定する。二重ウェル組織培養プレートの上部ウェルに入れられたいくつかの哺乳動物上皮細胞株が、薬剤、毒素、および栄養素など各種化学物質の透過性および輸送の研究目的で使用されている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＫらＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ Ｌｅａｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ灯、Ｒ．Ｔ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ、Ｅ．Ｈ．Ｋｅｒｎｓ、Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｉｎｓｋｉ、Ｄ．Ｒ．Ｔｈａｋｋｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｗａｎｇ、ｅｄｓ。、ｐｐ２１７〜２３４、Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ、バージニア州Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ ２００４．Ｊ．ＰｏｌｌｉおよびＣ．Ｓｅｒａｂｊｉｔ−Ｓｉｎｇｈ、ｉｂｉｄ、ｐｐ２３５〜２５５）。

当該試験化合物の経細胞輸送の測定値を、当該経細胞輸送に関する基準値、たとえば以前に経細胞輸送が特徴付けられた化合物の消化管吸収速度、効率、容量などと直接比較することが可能である。たとえば、試験化合物から得られた測定値を消化管吸収されない化合物、低消化管吸収、中等度消化管吸収、高度消化管吸収に対する基準値、またはそのような基準値のいかなる組み合わせとも比較することができる。そのような基準値の非限定例を表２に示す（Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ Ｐ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ。Ｃｏｍｍｕｎ．１７５：８８０〜５）。

前記基準値に対して実験的に得られた当該試験化合物測定値は、対象動物の消化管における当該試験化合物の吸収を示すものであり、また少なくとも予測するものである。本発明の方法に従って特徴付けた化合物は参照化合物となり得、相対的な消化管吸収度を表し、別の試験化合物との比較が可能である。

さらに本発明は細胞における膜排出輸送タンパク質の発現抑制法を有する。一部の実施形態において、本方法は膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子による細胞の安定的転換を含む。当該核酸分子は、膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制することにより発現を抑制することができるか、またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を抑制することにより発現を抑制することができる。

当該核酸分子は、その発現または細胞における存在が排出輸送タンパク質遺伝子産物の転写または翻訳を抑制するいかなる調節遺伝子または遺伝子断片でもあり得る。好ましい実施形態において、前記核酸分子はＲＮＡである。さらに好ましい実施形態において、前記核酸分子は干渉ＲＮＡであり、好ましくは二重鎖である。干渉ＲＮＡの非限定例としてはｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが挙げられる。

本発明に従って、特定の個別の核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制できることが判明した。したがって、そのような核酸分子は本明細書中に記載、例示した発明のいずれの方法にも有利に使用することができる。二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質を抑制できる個別の核酸分子に関する非限定例は配列ＩＤ番号２５である。この核酸分子は少なくともＢＣＲＰおよびＭＲＰ２の両方の発現を抑制することが示されている。単一の核酸分子が二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質を抑制できるという所見は、選択された膜排出輸送タンパク質が化合物の細胞吸収および輸送に及ぼす相対的寄与率の測定にとって飛躍的な進歩である。

本明細書に記載または例示されたごとく、本分野で利用可能ないかなる方法に基づいても、細胞はそのような核酸分子によって形質転換され得る。前記細胞はそのような調節核酸分子をコードする核酸配列を有するベクターによって安定的に形質転換されるのが好ましい。特定の対象細胞の形質転換に適したいかなるベクターも本発明に利用可能である。好ましい実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。より好ましい実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。

前記調節核酸分子は、前記対象膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子に相補的であるか、さもなければ同遺伝子へのハイブリダイゼーションおよび／または同発現への干渉を受け易いいかなる配列も含む可能性がある。そのような核酸配列の非限定例としては、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２６、およびそれらの対立遺伝子多型が挙げられる。膜排出タンパク質の好ましいが限定されない例としては、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質−２、および乳癌耐性タンパク質が挙げられる。

膜排出輸送タンパク質の発現調節（特に抑制）の対象と成り得る好ましい細胞は、そのような輸送タンパク質を発現するいかなる細胞でもよい。そのような細胞は輸送タンパク質を自然に発現することができるか、または当該細胞は当該輸送タンパク質を発現するように設計することができる。当該細胞は宿主有機体から新たに単離することができ、または細胞株でもよい。そのような細胞は消化管系統のものであるのが好ましく、腸上皮細胞であるのが特に好ましい。本発明の方法に基づく遺伝的調節を受けやすい細胞株の非限定例には、Ｃａｃｏ−２細胞、ＣｅＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、Ｔ−８４細胞、およびＨＲＴ−１８細胞がある。

本発明はさらに膜排出輸送タンパク質の遺伝的調節を目的とした単離核酸分子を有する。配列の観点から考慮した場合、調節（特に抑制的）塩基配列をコードする本発明の核酸分子には、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２６、およびそれらの対立遺伝子多型、同族体、および自然突然変異体が含まれる。そのような変異体や同族体の核酸配列には一定の相違があることが予想されるため、本発明は配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２６のうちいずれか一つと、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、さらに好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、最も好ましくは９６％、９７％、９８％、および９９％またはそれ以上の同一性を有する。異なった個人においてこれらの制御配列をコードする遺伝子のなかに自然配列バリエーションが存在する可能性があるため、当業者は本発明のポリヌクレオチドの特異的性質を維持しながらこのレベルのバリエーションを見出すことが期待される。したがって、そのような変異体および同族体は実質的に互いに同じと考えられ、本発明の範囲中に含まれる。

本発明の核酸分子は二つの一般的方法によって作成可能である：（１）適切なヌクレオチド三リン酸からの合成、または（２）生物学的起源からの単離。いずれの方法でも、本分野で周知のプロトコルが用いられる。

たとえば配列ＩＤ番号：６〜８など、膜排出輸送タンパク質の全核酸配列などの核酸配列情報が利用できることにより、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の作成が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒまたは同様の装置で採用されたホスホラミダイト法によって作成可能である。生じた構築物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など本分野で周知の方法に従って精製可能である。こうして作成された合成ＤＮＡ分子を続いてクローン化し、適切なベクター中で増幅することができる。

本発明の核酸は、都合の良い任意のクローニング・ベクター中にＤＮＡとして保持することができる。好ましい実施形態において、クローンはプラスミド・クローニング／発現ベクター中に保持し、いずれも適切な原核生物または真核生物宿主細胞中で増殖することができる。

本発明の核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片があり、一本鎖、二本鎖、または三本鎖のことさえもある。従って、本発明は本発明の核酸分子の少なくとも一つの配列とハイブリダイズ可能な配列（特に配列ＩＤ番号６〜８）を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子の検出、またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳時および翻訳前において膜排出輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現の正または負の制御のためのプローブとして有用である。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがそのような分析のためのプローブとして利用可能な方法としては、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザン・ハイブリダイゼーション、（３）ノーザン・ハイブリダイゼーション、および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などのａｓｓｏｒｔｅｄ増幅反応があるが、それらに限定されない。

本発明に関連するものとしてはさらに、膜排出輸送タンパク質またはその同族体、同位体、または変異体をセンスまたはアンチセンス方向にコードするポリヌクレオチド、または細胞または組織特異的プロモーターおよび／または他の調節塩基配列の支配下にある構築物を含有する遺伝子組み換え宿主細胞作成用ベクターおよびキットが含まれる。そのようなベクターは、任意の膜排出輸送タンパク質の発現の調節および好ましくは抑制に適している。好ましい実施形態において、前記膜排出輸送タンパク質はＰ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、または乳癌耐性タンパク質である。

適切な宿主細胞としては、植物細胞、細菌細胞、酵母および真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられるが、それらに限定されない。ヒト細胞であればより好ましい。ヒト腸上皮細胞であればさらに好ましい。最も好ましいのは、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞、ＨＴ−２９細胞、またはＴ−８４細胞である。

多岐にわたるこれらの宿主細胞の形質転換を行うベクターは当業者によく知られている。例として、プラスミド、ファージミド、コスミッド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）に加え、他の細菌ベクター、酵母ベクター、ウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の好ましい態様においては、ウイルスベクターが利用される。レンチウイルスベクターの使用が特に好ましい。

通常、トランスジェニック宿主細胞産生キットには一つ若しくはそれ以上の適切なベクターおよび当該ベクターを用いたトランスジェニック細胞産生に関する説明が含まれる。キットにはさらに別の成分が一つ若しくはそれ以上含まれ、２〜３例を挙げると細胞培養用培地、細胞の形質転換用試薬、遺伝子発現または調節のためのトランスジェニック細胞試験用試薬などである。

一つの実施形態において、制御配列のコード領域は以下の遺伝子のプロモーターなど強力な構成的プロモーターの下に配置されている：ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシン・デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、その他。さらに、多くのウイルスプロモーターが原核細胞中で構造的に機能し、本発明における使用に適している。そのようなウイルスプロモーターとしては、無制限に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＳＶ４０の初期および末期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、マローニ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および他のレトロウイルスの末端反復（ＬＴＲｓ）、および単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ・プロモーターがある。他のプロモーターは当業者に知られている。一つの実施形態において、前記調節配列のコード化領域はメタロチオネイン・プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシサイクリン誘導性プロモーター、タンパク質キナーゼＲ２５葬−オリゴアデニレート合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１など一つ若しくはそれ以上のインターフェロン刺激性反応要素（ＩＳＲＥ）を含有するプロモーターなどの誘導プロモーターの下に配置される。他の適切な誘導プロモーターは当業者には既知であろう。

本分野のベクターを用いて本発明に基づくさまざまな調節核酸配列を伴ったさまざまな細胞の形質転換を行うことが可能である。したがって、本発明の別の態様は、膜排出輸送タンパク質の発現を調節する（好ましくは抑制する）ための核酸分子をコードする核酸配列から成るベクターによって形質転換される宿主細胞を有する。外来遺伝子の細胞内への導入に関し本分野で多くの技法が知られており、本発明のさまざまな実施形態に基づき本発明の方法を実行するための組み換え細胞の構築に使用可能である。使用する技法は異種遺伝子配列の宿主細胞への安定的移動を提供し、異種遺伝子配列は細胞子孫によって遺伝性かつ発現性であり、受容細胞の必要な成長および生理機能には支障を来たさない。使用される可能性のある技法には、染色体導入（細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、ミクロ細胞媒介性遺伝子導入など）、物理的方法（トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体など）、ウイルスベクター導入（組み換えＤＮＡウイルス、組み換えＲＮＡウイルスなど）、などがあるが、それらに限定されない（Ｃｌｉｎｅ ＭＪ（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９〜９２に記載）。本発明の細胞の導入にはウイルスベクターを用いるのが好ましい。前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであればより好ましい。

膜排出輸送タンパク質の発現が抑制されたノックダウン細胞は、当該輸送タンパク質を「転写遺伝子サイレンシング」によってコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより作成可能である。下方制御用に標的とされる種からの遺伝子またはその断片を用いて前記コードされたタンパク質の産生を制御することが可能である。このためにはアンチセンス分子全長を用いることができる。代わりに、翻訳に不可欠なｍＲＮＡの特定部位を標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用してもよい。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用が本分野で知られている。アンチセンス分子は、転写に基づき当該アンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物で細胞を形質転換することにより、ｉｎ ｓｉｔｕで提供される。そのような構築物は、アンチセンス配列全長またはその一部を産生するように設計することができる。この遺伝子サイレンシング効果は、大量のｄｓＲＮＡが産生されるように、配列をコード化するセンスおよびアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組み換えにより過剰生産することによって高めることが可能である（たとえばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅらによる（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国９５：１３９５９〜６４を参照のこと）。この点につき、少なくとも一つのイントロンの一部若しくは全部に相当する配列を含むｄｓＲＮＡが特に効果的であることが判明した。一つの実施形態において、コード配列アンチセンス鎖の一部若しくは全部がトランス遺伝子によって発現される。別の実施形態において、一つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質に対応するコード配列の一部若しくは全部のセンスおよびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションは遺伝子組み換え的に発現される。干渉核酸分子（配列ＩＤ番号１、３、２１、２４、２５、および２６）をコードするレンチウイルスによって形質導入された本発明の細胞であるＣ２ＢＢＥ１細胞は、２００７年１１月５日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に掲載され、アクセス番号＿、＿、＿、＿、＿、および＿をそれぞれ割当てられている。

さらに本発明は動物における消化管吸収に関する化合物スクリーニング用キットを有する。一部の実施形態において、当該キットには、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する少なくとも一つの核酸分子により転換された細胞、および動物における消化器管吸収に関する化合物スクリーニング法におけるキット使用説明書が含まれる。さらに本発明のキットには、二番目の膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子によって転換された二番目の細胞が含まれることがある。さらに本発明のキットには、二番目および三番目の膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子によって転換された二番目および三番目の細胞が含まれることがある。

当該キットの細胞はＣａｃｏ−２細胞でよいが、できればＣＢＢｅｌ細胞であるのが好ましい。しかし、少なくとも一つの対象膜排出輸送タンパク質を安定的に発現する細胞であればどの細胞を使用してもよい。前記細胞は、本明細書に記載、例示したような（それらに限定されるものではないが）、対象膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する任意の核酸分子によって形質転換することができる。たとえば、前記細胞の形質転換に用いられる核酸分子は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６のうち少なくとも一つ、またはそれらの対立遺伝子多型を有する可能性がある。

前記本発明のキットにおいて、発現が干渉核酸による細胞の形質転換によって抑制される対象膜排出輸送タンパク質は、本分野において周知であるか、または後に発見された排出輸送タンパク質であればどれでもよい。好ましい実施形態において、前記膜排出輸送タンパク質は少なくともＰ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、または乳癌耐性タンパク質のうちいずれかである。

一部の実施形態において、本発明のキットは、膜排出輸送タンパク質を発現する細胞、当該細胞の形質転換のためのレンチウイルスベクター、および選択的に、当該細胞によって発現される少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する少なくとも一つの核酸分子から成る。たとえば、前記核酸分子はレンチウイルスベクターにサブクローン可能であり、ベクターは細胞の形質転換に使用可能である。膜排出輸送タンパク質の発現を抑制できる核酸はいずれもレンチウイルスベクターにサブクローン可能であり、細胞を形質転換し膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する、と考えられている。本実施形態のキットには、動物における消化管吸収に関する化合物のスクリーニング法における当該キットの使用説明書が含まれることがある。前記説明書はさらに抑制性核酸のレンチウイルスベクターへのサブクローン法についても教授し得る。

さらに本発明は膜排出輸送タンパク質の生物活性を阻害する化合物の同定方法を有する。抑制される生物活性は輸送タンパク質の排出活性であるのが好ましい。一部の実施形態において、当該方法は一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の発現抑制、一番目の細胞と膜排出輸送タンパク質基質との接触、および一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の生物活性の測定から成る。当該方法にはさらに、膜排出輸送タンパク質の発現が抑制されない二番目の細胞と試験化合物および膜排出輸送タンパク質の基質との接触、同時に当該膜排出輸送タンパク質の発現が抑制されない二番目の細胞と当該膜排出輸送タンパク質の基質との接触、および二番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の生物活性の測定（当該試験化合物が存在する場合と存在しない場合の両方）が含まれる。前記一番目の細胞、前記試験化合物の存在下における前記二番目の細胞、および前記試験化合物の不在下における前記二番目の細胞に対する膜輸送タンパク質の生物活性の測定後、それらの生物活性を比較することができる。当該試験化合物の存在下における当該二番目の細胞の生物活性の当該試験化合物の不在下における当該二番目の細胞の生物活性に比べた低下、および当該試験化合物の存在下における当該二番目の細胞の膜排出輸送タンパク質の生物活性測定値の当該一番目の細胞の生物活性測定値との同一性は、当該試験化合物が当該膜排出輸送タンパク質を特異的に抑制することを示している。

本明細書に例示したように、膜排出輸送タンパク質発現の遺伝的ノックダウンは輸送タンパク質の排出活性の約２０％を抑制するが、しばしば同活性の約５０％を抑制し、８０％若しくはそれ以上を抑制することもある。したがって、「少なくとも部分的な同一性」とは、試験化合物による輸送たんぱく質の化学的抑制はノックダウン細胞に関し測定された排出活性の抑制レベルに匹敵するか上回る、またはノックダウン細胞の排出活性抑制レベルを下回る可能性がある、ことを意味する。同一性は排出活性抑制に関連する。たとえば、一番目の細胞の遺伝的抑制は同細胞における排出活性を対照に比べ９０％抑制する可能性がある。相対的に、前記試験化合物は対照に比べ当該排出活性を８０％抑制する可能性がある。本シナリオにおける当該試験化合物は前記遺伝的ノックダウンに比べ抑制率は少ないが、前記８０％抑制は前記遺伝的ノックダウンの９０％抑制と少なくとも部分的に同一である。本例において、当該試験化合物による９０％抑制は完全に同一である。

本発明の方法の一部の実施形態において、一番目の細胞における膜排出輸送タンパク質の発現抑制は、当該膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子による当該一番目の細胞の形質転換を含む。前記核酸分子は本明細書に記載、例示したように、干渉核酸分子であり得る。好ましい実施形態において当該核酸分子はＲＮＡであり、より好ましい実施形態においては当該核酸分子は配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６、またはそれらの対立遺伝子多型から成る。

一部の非常に好ましい実施形態において、対象膜排出輸送タンパク質はＰ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、または乳癌耐性タンパク質である。Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質２、または乳癌耐性タンパク質は、一番目の細胞における遺伝的ノックダウンの標的および二番目の細胞におけるスクリーニング対象となる化学的抑制の標的である可能性がある。一部の実施形態において、当該一番目または二番目の細胞はＣａｃｏ−２細胞、またはＣ２ＢＢｅｌ細胞、またはそれらの組合せである。

当該対象膜排出輸送タンパク質の任意の既知の基質が本スクリーニング法で使用可能である。そのような基質の非限定例としては、Ｐ−糖たんぱく質に対するジゴキシン、多剤耐性関連タンパク質２に対するビンブラスチンまたはジニトロフェニル−Ｓ−グルタチオン、および乳癌耐性タンパク質に対するミトキサントロンまたはエストロン−３−硫酸が挙げられる。

一部の態様において、本発明の試験化合物スクリーニング法は、複数の試験化合物のスクリーニング用として修正、適合することができる。例えば、二つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質を一番目の細胞において抑制することができ、少なくとも一つ、好ましくは二つ若しくはそれ以上の試験化合物を前記二番目の細胞と接触させる。前記一番目の細胞において抑制され前記二番目の細胞で発現される各膜排出タンパク質の生物活性（排出活性など）を、次に試験化合物の存在もしくは不在の下に測定し、前記生物活性の測定値を上述のように比較する。このように、当該試験化合物存在下における二番目の細胞の生物活性の、当該試験化合物の不在下における二番目の細胞の生物活性に比べた低下、および当該試験化合物存在下における二番目の細胞の当該膜輸送タンパク質の生物活性測定値の、一番目の細胞における生物活性測定値との同一性は、当該試験化合物が当該膜排出輸送タンパク質を特異的に抑制することを示している。

本発明に基づいた前述のいずれのスクリーニング法で同定された化合物も、本発明の範囲内と考えられる。そのような化合物は膜排出輸送タンパク質抑制剤であるのが好ましく、Ｐ−ｇｐ、ＭＲＰ２、またはＢＣＲＰの抑制剤であればさらに好ましい。

本発明をより詳細に説明するために次の例を提供する。これらは本発明を限定するのではなく例示を目的とする。

一般的実施手順
細胞株。本明細書に記載した実験においては親細胞株Ｃ２ＢＢｅｌ（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ−２１０２）を用いて候補となる薬剤分子の吸収ポテンシャルを評価した。Ｃ２ＢＢｅｌ細胞株は１９８８年に希釈を制限することによって前記Ｃａｃｏ−２細胞株から抽出された。前記クローンは形態的均質性およびビリンの頂部局在に基づいて選択した。Ｃ２ＢＢｅｌ細胞は、形態的にヒト大腸のものに匹敵する頂部刷子縁（ＢＢ）を伴った極性単層を形成する。単離されたＢＢｓには微絨毛タンパク質ビリン、フィンブリン、スクラーゼ−イソマルターゼ、ＢＢミオシン−１、および末端網タンパク質であるフォドリンおよびミオシンＩＩが含まれる。前記細胞はヒト腸細胞のものと同様の相当レベルのＢＢミオシン−１を発現する。これらの細胞はクローン性であり、ＢＢ発現に関しては親Ｃａｃｏ−２細胞株よりもはるかに均質であるが、微絨毛の長さ、微絨毛の凝集、特定のＢＢタンパク質の発現レベルに関しては依然不均一である。

細胞播種および品質管理細胞単層を含んだＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）を以下のように作成した：同じ親ストックフラスコから最大１または２ダースの１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器を作成した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器への播種に用いられない細胞はいずれもＴ−１５０ストック組織培養フラスコ中で再培養を行った。１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器の各インサートにラットの尻尾のコラーゲンで前処置を施し、細胞付着性を促進した。次に細胞培地（１０％ウシ胎仔血清を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏの９０％修正イーグル培地）１．５ｍＬを１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器の底部ウェルに加えた。前記細胞をＴ−１５０組織培養フラスコからトリプシン処理によって単離し、細胞培地に再び懸濁した。ピペット操作を繰り返すことによって細胞集会を壊し、均一な細胞 懸濁液を作成した。 懸濁液中の細胞数を血球計を用いて数えた。前記細胞 懸濁液中にさらに細胞培地を加え、細胞数を約１３６，０００個／ｍＬとした。約６８，０００個の細胞を含んだ細胞 懸濁液０．５ｍＬを前記１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器の各上部ウェルに加えた。細胞を一晩付着させ、翌日未使用の細胞培地０．５ｍＬを各ウェルの上方室に、１．５ｍＬを下方室に加えた。細胞集合および輸送体機能のため、各ロットから無作為に抽出した装置の試験を行う前に少なくとも２０日間培地を一日おきに替えた。

一群のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器の品質管理（ＱＣ）試験を以下のように行った：一群のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器から無作為に抽出したインサートをＱＣアッセイ用に除去した。前記細胞をＨａｎｋの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭグルコース含有、前もって３７℃に温めておく）が入った空のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）底板に入れた。培地をウェルから吸引し、ＨＢＳＳｇを用いて前記インサート上の細胞単層をリンスした。前記単層の洗浄後に未使用のＨＢＳＳｇを加え、前記アッセイプレートからインサートを除去し、ＥＮＤＯＨＭ経上皮電気抵抗計測装置（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値を測定した。

ＴＥＥＲ値が１００ ｏｈｍ／ｃｍ^２を上回る単層は透過性研究で使用可能と考えられる。ＴＥＥＲ値がこの範囲を下回った場合は、バッチの残りを未使用の培地でもうしばらく再培養し、再試験を行った。バッチが３回失敗した場合は、バッチ全体を不合格とした。許容限度を上回るバッチからのサンプルウェルを、参照化合物の透過性に関し以下のごとく試験を行った。前もって温めた以下のＱＣ溶液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートの上部ウェルに加えた：０．５ｍＭ Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、１０μＭアテノロール、１０μＭプロプラノロール、１０μＭピンドロール、および１０μＭジゴキシン（ＨＢＳＳｇ中、ｐＨ７．４±０．２）。下部ウェルには前もって３７℃に温めたＨＢＳＳｇが含まれていた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ容器を加湿インキュベーターに入れ、５％ＣＯ_２含有の環境中において３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート終了時に、蛍光検出法によるＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ量の分析およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる他の化合物の分析のため、下部ウェルから試料を採取した。

前記ドナー（上部ウェル）濃度および前記２時間後の試料採取時におけるレシーバー（下部ウェル）濃度の純増から透過率を算出した。時間間隔Ｐａｐｐ（ｔ１〜ｔ２）に対する透過率は次の公式に基づいて計算した：Ｐａｐｐ（ｔ１〜ｔ２）＝（（Ｃｔ２−Ｃｔ１）／（ｔ２−ｔ１）） ｘ Ｖｒ／（Ａ ｘ Ｃｄ）Ｃｔ２−Ｃｔ１は各時間間隔におけるレシーバー（下部）の蓄積濃度差をμＭで表したもの（この例では総時間間隔（１２０分間）が計算に用いられるため、Ｃｔ１は「０」と見なされる）、Ｖｒはレシーバー部の量（ｃｍ^３）、Ａは細胞単層の面積（１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）では１．１３ｃｍ^２）、Ｃｄはドナー試料部（上部ウェル）の濃度をμＭで表したもの（前記ドナー溶液の濃度に等しい）である。ＱＣ目的で用いられた各部の見掛け透過率は、試験を行った全複製（通常はアッセイ条件ごとに３複製インサート）に対する全算出Ｐａｐｐ値の平均であった。

ＱＣ溶液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の下部ウェルに加え、２時間後に上部ウェルのジゴキシン濃度を測定することにより、本分析を繰り返した。下部ウェルから上部ウェルへのジゴキシン輸送に対する算出Ｐａｐｐが上部ウェルから下部ウェルへのジゴキシン輸送に対する算出Ｐａｐｐの少なくとも３倍高いということは、細胞単層におけるＰｇｐの機能的発現を示す。

ｓｈＲＮＡ．Ｃ２ＢＢｅｌ親細胞下部におけるＰ−ｇｐ発現および活性をノックダウンするため、ＲＮＡｉ法を用いた。目標はＰ−ｇｐ遺伝子の長期サイレンシングであった。マサチューセッツ工科大学からのライセンス供与に従って生産、配布されるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）ウェブサイトのＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）検索データベースを用いて、ヒトＰ−ｇｐ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００９２７）の５つの異なった部分からの５つの２１ヌクレオチドｓｈＲＮＡ二重鎖（配列ＩＤ番号１〜５）を設計した。

カルセイン−ＡＭ分析。Ｐ−ｇｐタンパク質の活性を測定するため、カルセイン−ＡＭ分析を行った。カルセイン−ＡＭ（３’、６’−ジ（Ｏ−アセチル−２’、７’−ビス［Ｎ、Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノメチル］フルオレセイン・テトラアセトキシメチル・エステル）はフルオレセイン分子カルセインの疎水性エステルである。カルセイン−ＡＭは細胞内ステラーゼによって蛍光親カルセインに転換される。カルセイン−ＡＭはＰ−ｇｐの基質でもある（米国特許番号５，８７２，０１４）。Ｐ−ｇｐが細胞膜に存在し機能している時には、カルセイン−ＡＭは容易には細胞内に入れない。しかし、Ｐｇｐが存在しないか機能していない時は、カルセイン−ＡＭは容易に細胞に入り、その蛍光対応物であるカルセインに速やかに転換される。従って、カルセイン−ＡＭ分析において、高細胞内蛍光度は低Ｐ−ｇｐ発現または低機能を示唆する。

Ｐ−ｇｐ活性を測定するため、細胞を９６ウェル組織培養プレートに入れ、４８時間にわたって培養した。４８時間後、細胞培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄後、細胞を１μＭカルセイン−ＡＭとともに３０分間培養した。確立されたＰ−ｇｐ抑制剤であるシクロスポリンＡで処理した親細胞を陽性対照として用い、親細胞株においてＰ−ｇｐ抑制が細胞内蛍光度を増すことを検証した。カルセイン−ＡＭとともにインキュベーション後、細胞を未使用の対照緩衝液ですすぎ、励起フィルターおよびエミッションフィルターの波長をそれぞれ４８５ｎｍおよび５３８ｎｍに設定の上、Ｆｌｕｏ−ｓｔａｒ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＣ）を用いて蛍光度を測定した。

ＲＴ−ＰＣＲ。次のプロトコルに従って細胞から総ＲＮＡを抽出した。遠心分離によって培地から細胞を採取し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）１ｍＬ中に 再懸濁し、ゆっくりと揺らしながら室温で５分間インキュベートした。前記 懸濁液を１．５ｍＬ遠心分離管に移し、クロロホルム２００μＬを加え、揺らしながらさらに５分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を４℃で１２分間、遠心分離（１２，０００ｘｇ）を行った。上澄液を滅菌された未使用の１．５ｍＬ遠心分離管に移し、ＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍＬ中に２−プロパノール０．５ｍＬが入った液を加え、室温で１０分間インキュベートした。混合液を４℃で１２分間遠心分離（１２，０００ｘｇ）した。遠心分離後、上澄液を除去し、ペレットを７５％エタノールで洗浄した。試料を４℃で５分間遠心分離（７５００Ｘｇ）後、上澄液を除去した。ペレットを室温で空気乾燥させた。ペレットを前もって５５℃に温めたヌクレアーゼ非含有水に再懸濁し、５５℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＡ収率および純度を２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定した。

ＲＴ−ＰＣＲ混合液を、緩衝液、ＲＮＡ １〜２μｇ、１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、水を含んだ５０μＬの試料として設定した。ヒトＰ−糖タンパク質を増幅するプライマーは以下のとおり：Ｐ−ｇｐ Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号９）、およびＰ−ｇｐ Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴ−３’［配列ＩＤ番号１０］。ヒトＭＲＰ２を増幅するプライマーは以下のとおり：ＭＲＰ２ Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＧＴ−３’（配列ＩＤ番号１１）、およびＭＲＰ２ Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＴＣ−３’（配列ＩＤ番号１２）。ヒトＢＣＲＰを増幅するプライマーは以下のとおり：ＢＣＲＰ Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴ−３’（配列ＩＤ番号１３）、およびＢＣＲＰ Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号１４）。ヒトβアクチンを以下のプライマーを用いて陽性対照として同時に増幅した：β−アクチン Ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＡＣＴＡＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号１５）、およびβ−アクチン Ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡ−３’（配列ＩＤ番号１６）。

ＰＣＲサイクルが次のパラメータを用いてプログラム可能なサーマルサイクラーにて行われた：ｃＤＮＡ合成１サイクル、５５℃で３０分間；変性１サイクル、９４℃で２分間；ＰＣＲ増幅４０サイクル、９４℃で１５秒間、６２℃で３０秒間、および７２℃で１分間；最終伸張１サイクル、７２℃で５分間。２％アガロースゲルによる電気泳動で増幅を確認した。

ウエスタンブロット。細胞単層を９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で密集するまで培養し、培地を除去し、単層を１ＸＰＢＳを用いて洗浄した。細胞を溶解するため、ＲＩＰＡ溶解緩衝液１Ｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｘ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、Ｃａｔ＃ｓｃ−２４９４８）５００μＬを細胞に加え、氷上で１０分間インキュベートした。溶解した細胞を採取し、４℃で遠心分離（１２，０００ｘｇ）にかけた。上澄液／タンパク質溶解液を清潔なチューブに移し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ，Ｃａｔ＃２３２２５）のプロトコルに従って測定した。

タンパク質抽出物を以下のようにＳＤＳ ＰＡＧＥにかけた。タンパク質試料約２５〜５０μｇを８％ポリアクリルアミドゲルに加え、１３０ボルトで１時間流した。電気泳動後、ＢｉｏＲａｄ ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ３電気泳動セルを用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄによって提供されたプロトコルに従って、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。

タンパク質を移した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）（ＴＢＳＴ）含有のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）に溶解した０．２％Ｉｂｌｏｃｋ溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、カタログ＃Ｔ２０１５）を用いて膜をブロックした。ブロックした膜を一次抗体と共にインキュベートした。Ｐ−ｇｐに対してはブロッキング溶液中に５００倍に希釈したマウス抗ヒトＰ−ｇｐ抗体（Ｃ４９４、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、カタログ＃ａｂ２２６５）を用い、４℃で一晩、ＭＲＰ２に対しては１０００倍に希釈した多クローン性ウサギ抗ヒトＭＲＰ２抗体（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｔ＃５０２１３）、ＢＣＲＰに対しては抗ヒトＢＣＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ｃａｔ＃ａｂ３３８０）を用いた。ＴＢＳＴで３回洗浄することにより非結合抗体を除去した。洗浄後、膜を、二次抗体であるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎカタログ＃ＡＰ１２４）をブロック液による２５，０００倍希釈液中で反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄することにより非結合抗体を除去した。メーカーのプロトコルに従い、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃３４０９４）を用いて結合抗体を視覚化し、ＵＶＰ、Ｉｎｃ（Ｕｐｌａｎｄ、カリフォルニア州）のＥｐｉ Ｃｈｅｍ ＩＩ暗室を用いて観察した。

双方向性経細胞輸送アッセイ（Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｓｓａｙ）。細胞単層は培養により、上部および下部ウェルに９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを含む１２ウェルＣｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートにおいて、コラーゲンコーティングされた微小孔性のポリカーボネート膜上に凝集された（播種から約２０〜２８日後）。成長培地は２〜３日ごとに交換した。使用した培地は吸引により除去し、未使用の培地を各ウェルに加えた。Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｓｓａｙ前日に全てのウェルに未使用の培地を加えた。試験化合物による試験の前に、プレートは社内合否基準に合致するものとして認可された。使用したプレートの詳細およびそれらの認証は以下の実施例に示す。参照化合物を用いたプレート認証を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭグルコース含有のＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液を用いてｐＨ７．４±０．１で行った。

前記試験化合物に対する透過性分析緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭグルコース含有のＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ｐＨ７．４±０．１）を用いた。分析用緩衝液の投与溶液濃度は試験化合物によって異なった。試験化合物の通常濃度は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭグルコース含有のＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ｐＨ７．４±０．１）で１０μＭであった。１および２時間の各時点において、前記ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ（先端部から側底部［Ａ−Ｂ］方向の透過性測定に関しては底室または側底室、側底部から先端部［Ｂ−Ａ］方向への透過性測定に関しては最上室または先端室）から２００μＬを採取し、未使用の分析緩衝液で置き換えた。細胞を先端側（Ａ−Ｂ）または側底側（Ｂ−Ａ）に入れ、５％ＣＯ_２および９０％相対湿度により３７℃でインキュベートした。各測定を二回繰り返した。さらに各単層に関するインテグリティマーカー化合物であるＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗの透過性を蛍光測定法を用いて測定した。Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ Ｐａｐｐ値を検討することにより、単層インテグリティが前記透過性試験中に損なわれたか否かを調べた。異常に高いＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ透過性を示す単層はその後の分析から除外した。下記に要約するように、他の化合物はすべてエレクトロスプレーイオン化を用いたＬＣ／ＭＳにより分析した。

以下の公式に基づいて見掛け透過率、Ｐａｐｐ、および回収率を計算した。
Ｐａｐｐ＝（ｄＣｒ／ｄｔ） ｘ Ｖｒ／（Ａ ｘ Ｃｄ０）
回収率＝１００ ｘ （（Ｖｒ ｘ Ｃｒｆｉｎａｌ） ＋ （Ｖｄ ｘ Ｃｄｆｉｎａ
ｌ））／（Ｖｄ ｘ Ｃｄ０））
ここで、ｄＣｒ／ｄｔは時間に対するレシーバー部分における蓄積濃度、ＶｒはＣｍ^３で表したレシーバー部分の量、ＶｄはＣｍ３で表したドナー部分の量、Ａは細胞単層の面積（１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに対し１．１３ｃｍ^２）、Ｃｄ０は０時間における投与溶液の濃度、Ｃｒｆｉｎａｌは培養時間終了時の蓄積レシーバー濃度、Ｃｄｆｉｎａｌは培養時間終了時のドナーの濃度である。

ＬＣ／ＭＳ分析法の要約。溶離緩衝（移動）相の勾配を生成できる液体クロマトグラフィー装置（ＬＣ）を使用した。クロマトグラフィーカラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８ ３０ｘ２．０ｍｍ ｉ．ｄ．、３μｍ、ガードカラム付き）をＬＣに接続し、輸送分析からの緩衝液の試料１０μＬをＬＣに接続された自動試料採取装置によりカラム内に注入した。二つの移動相をさまざまな割合で継続的に混合し、組成勾配を構築した。本分析に用いられた典型的な移動相は、２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）のような水性緩衝液およびアセトニトリルのような有機溶剤である。当該溶出勾配は、二つの移動相レザボアからの適切な割合の移動相を混合することによって形成された。下記に挙げた実施例において、一つのレザボアは水性緩衝液を含み、二番目のレザボアはアセトニトリルと水性緩衝液を９：１（量：量）の割合で含んでいた。当該ＬＣにおける勾配プログラムは、線形（組成が緩衝液からアセトニトリル＋緩衝液に一定の割合で変化）から弾道状（分析の特定の時間に組成が緩衝液からアセトニトリル＋緩衝液に突然変化）に至るさまざまな勾配を形成するように設定することができる。本明細書で用いられた分析用勾配プログラム条件は表３に掲載されており、その中で％Ａは当該勾配における水性緩衝液の割合であり、％Ｂは同勾配におけるアセトニトリル−緩衝液混合物の割合である。時間カラムは、０．０分を試料注入点とした試料注入後の時間を表す。本実施例において、当該勾配は弾道勾配であり、試料注入後１．５分に突然組成を変化させる。

注入の合間に、ＬＣオートサンプラーシリンジを０．２％ギ酸溶液（水／アセトニトリル／２−プロパノール：１／１／１（ｖ／ｖ／ｖ）中）でリンスした。

クロマトグラフィーカラムからの溶離液は三重四重極質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）のエレクトロスプレー・インターフェースに導かれ、そこで溶剤と緩衝液は蒸発させられ、クロマトグラフィーカラムから溶出された化合物はイオン化され陽性または陰性イオンを形成した。

下記の実施例では、装置（通常はＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ２０００、３０００、場合によっては４０００モデル）を用いてイオンを分解、検出した。これらのようなトリプル四重極装置では、一番目の四重極マグネットを用いて親イオンを分離し、それらを二番目の四重極チャンバーで断片化し、三番目の四重極を用いて当該親イオンの特定の断片を検出し、所定の集塊のイオンを当該装置の検出器上に集中させることができる。この検出法はよく多重反応モニタリングまたはＭＲＭと呼ばれる。ＭＲＭは、原子質量単位が少なくとも±１の質量分解能とミリリットル当たりナノグラム域の検出限界を有する、非常に特異的かつ微妙な対象化合物の検出を可能にする。

実施例で言及した化合物の検出に用いられた典型的な親イオンおよび断片イオンを表４に示す。

Ｑ１は最初の四重極マグネットの集団選択設定、Ｑ３は二番目の四重極マグネットの集団選択設定を表す。「＋」印はモニターされるイオン上の電荷を示す。

これらの質量分析計に関し調整可能なもう一つのパラメータは滞留時間であり、前記二つの四重極が親イオンおよび断片（娘）イオンの特定の組合せを選択、検出するように設定される期間のことである。複数の化合物が、同じクロマトグラフィー分析において、クロマトグラフィー条件および質量分析計の滞留時間の適切な調節により検出可能である。典型的な滞留時間の範囲は、イオン対コンビネーション当たり約１０〜１００ミリ秒である。通常熟練した分析家は、イオン質量が少なくとも５原子質量単位異なれば、同じ試料における最大約６つの化合物の検出と定量を可能にするクロマトグラフィー条件と滞留時間の組合せを決定することができる。

濃度範囲が約１〜１０００ｎｇ／ｍＬの分析基準を、輸送分析試料に用いたものと同じマトリックスにおいて作成した。ＭＳ／ＭＳ検出器応答対標準濃度をプロットすることにより標準曲線を作成した。装置メーカー提供のソフトウエアを用いて前記標準曲線を線形または多項応答曲線に適応した。未知の物質中における化合物の濃度を検出器応答からの逆算により測定した。あるいは、対象化合物と固定濃度において標準および試料に加えられた参照標準化合物間の検出器応答の比を用いて標準曲線を作成し、未知の物質の定量を行う。これは試料定量に関する内標準法として知られる。

干渉核酸配列によるＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質導入
干渉核酸配列をＭＩＳＳＩＯＮ（商標）ｓｈＲＮＡヒト腫瘍抑制レンチウイルス形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にサブクローンした。メーカーのプロトコルに基づき、干渉配列（配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５）を有するレンチウイルスを用いてＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質導入を行った。要約すれば、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に一ウェル当たり細胞１．６ ｘ １０^４個）、形質導入前に３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を０．５、１．０、または５．０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染の多重度）でウェルに加え、細胞と共に３７℃で２４時間インキュベートした。この培養後に非結合のレンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から４８時間後、ピューロマイシン１０μｇ／ｍＬを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後３〜４日ごとに交換した。ＭＯＩ １．０で生成された５つのピューロマイシン耐性分離株が個々の細胞クローンとして作成され、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３、８４、８５、８６、および８７（これらのクローンはそれぞれ配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する）が生じた。５つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３および８５は２００７年１１月５日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、それぞれアクセス番号＿および＿が割り当てられた。

ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞におけるＰ−ｇｐ遺伝子発現
ノックダウン細胞（ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３、８４、８５、８６、および８７）におけるＰ−ｇｐの遺伝子発現を、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡ量、タンパク量、およびタンパク質機能活性を観察することにより究明した。ＲＴ−ＰＣＲを用いてＰ−ｇｐ ｍＲＮＡの発現を測定した。Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いて総細胞ＲＮＡを採取、増幅した。続いてＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。５つのｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞のうち４つにおいて、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡ量は対照のＣ２ＢＢｅｌ細胞に比べ大幅に少なかった（図２、上部パネル）。同時にβアクチンが陽性対照として増幅され、その発現は干渉ｓｈＲＮＡによる影響を受けなかった（図２、下部パネル）。

クローン８４に対するＰＣＲの結果は、そのゲル列におけるｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｍｅｒの量が明らかに多いため分かりにくい。カルセイン−ＡＭ分析から、５つのクローンすべてにおいてＰ−ｇｐ機能がノックダウンされることが示される（図１）。カルセイン−ＡＭ取り込みを測定する機能分析から、形質導入体の一部に関してはＰ−ｇｐ ｍＲＮＡのノックダウンが約８０〜９０％の効率で生じたことが示される。

双方向性の輸送実験を行い、既知のＰ−ｇｐ基質であるジゴキシンのｓｈＲＮＡ／Ｐｇｐクローン細胞における排出比を測定した。結果を図３に示す。各ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞において、先端部から底部方向（Ａ−Ｂ）への流量上昇が示され、さらにＰａｐｐの排出比（Ｂ−Ａ／Ａ−Ｂ）が非ノックダウン対照細胞（Ｕｎ−ＫＤ）よりも有意に低いことが示された。これらの結果から、Ｐ−ｇｐ排出活性がＰ−ｇｐ遺伝子を標的としたｓｈＲＮＡｓによって抑制されたことが確認される。

ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞におけるＰ−ｇｐ遺伝子発現をさらに評価する為、細胞溶解物からタンパク質を採取、定量し、８％Ｐｒｅｃｉｓｅ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを用いて分離した。分離後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、実施例１に記載したように免疫ブロット法により評価した。免疫ブロット法が終了後、膜を化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質に曝露し、照度計を用いてタンパク質含有量を視覚化した。図４に示したように、ウエスタンブロット分析から、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞におけるＰ−ｇｐの量は対照細胞に比べ大幅に低下することが示された。表５は図４に示されたウエスタンブロット上のＰ−ｇｐバンドおよびβアクチンバンの各光学密度を示している。Ｐ−ｇｐおよびβアクチンに対する光学密度の比を計算し、ノックダウン率の測定に用いた。抑制率のグラフ表示を図５に示す。

実施例１に記載したように、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞におけるＰ−ｇｐタンパク質活性をカルセイン−ＡＭ法を用いて測定した。結果を図１に示す。これらの結果から、カルセイン蛍光がｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ遺伝的ノックダウン細胞（ＫＤ）のすべてにおいて非ノックダウン対照細胞（Ｕｎ−ＫＤ）に比べ大幅に上昇していることが示される。選択された各ｓｈＲＮＡは、細胞におけるＰ−ｇｐ活性を有意に抑制することができた。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果とは対照的に、カルセイン−ＡＭ法の結果はＰ−ｇｐノックダウン効率の範囲が、異なったｓｈＲＮＡｓにおいて約７０〜９０％であったことを示している。同時に、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞をＰ−ｇｐ活性に関する既知の化学抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）で処理した。試験を行った異なったｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン細胞のそれぞれにおいて、Ｐ−ｇｐ抑制における上昇に対応するカルセイン蛍光のわずかな増大がＣｓＡ処理後に観察された。いずれの蛍光強度上昇も遺伝的ノックダウン単独に比べ統計的（スチューデント ｔ−検定）に有意とはされなかったが（図１）、これらの結果はＰ−ｇｐ活性が一部残留することを示唆している。

Ｃ２ＢＢｅｌ細胞におけるＭＲＰ２発現の抑制
本実施例に関しては、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞におけるＭＲＰ２の遺伝子発現を、ウイルスによる形質導入後のＭＲＰ２ ｍＲＮＡ量と細胞のタンパク質含有量の両方を観察することにより測定した。ｍＲＮＡ量を検査するため、総細胞ＲＮＡを採取し、ＭＲＰ２遺伝子に特異的なプライマー（配列ＩＤ番号１１および１２）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。続いて、２％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し
た。

さらにＭＲＰ２ノックダウン細胞におけるＭＲＰ２遺伝子発現を評価するため、細胞溶解物を採取し、そのタンパク質含有量を測定し、個々のタンパク質を実施例１に記載したように８％Ｐｒｅｃｉｓｅ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質分離ゲルを用いて分離した。分離後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＭＲＰ２を１０００倍希釈のウサギ抗ＭＲＰ２（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｔ＃ａｂ５０２１３、ロット＃３５１２４５）を用いた免疫ブロット法により視覚化した。免疫ブロット法の終了後、膜を化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質に曝露し、照度計を用いてバンド染色度を視覚化した。ウエスタンブロット法によるバンド染色度の低下は、ＭＲＰ２ノックダウン細胞におけるＭＲＰ２タンパク質含有量のベクター対照細胞に比べての低下を示すものと考えられる。

干渉ＲＮＡによるＭＲＰ２のノックダウン：
ＭＲＰ２のノックダウン発現を標的とするため、干渉ＲＮＡをコードする核酸インサート（配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、または２１）を含むレンチウイルスを用いてＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質導入を行った。これらの実験から、測定可能なＭＲＰ２ノックダウンを達成するためには、ＭＲＰ２を標的としたｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２）の方がＢＣＲＰを標的としたｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ）およびＰ−ｇｐを標的としたｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐ）よりも高いＭＯＩｓおよびレンチウイルスによる長い培養時間を必要とすることが示された。ＭＯＩｓ（感染の多重度）を０．５から１０まで試行の結果、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、高効率のＭＲＰ２ノックダウンのためにはＭＯＩ １０が最適であることが示された。形質導入実験において、ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２ウイルス粒子の培養時間も２日に延長した。他の実験条件は全て実施例２に記載したものと同様であった。

個別の細胞クローンとして５つのピューロマイシン耐性分離株が作成され、ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃３、４、５、６、および７（これらのクローンはそれぞれ配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、または２１を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する）が生じた。前記５つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃７は２００７年１１月５日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、アクセス番号＿が割り当てられた。

ＭＲＰ２ノックダウン結果：
１．１ ノックダウン・クローン細胞におけるＭＲＰ２ ｍＲＮＡの発現
図６は、ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２配列（それぞれ、配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、または２１）によるウイルス形質導入後のＣ２ＢＢｅｌ細胞におけるＭＲＰ２ ｍＲＮＡの発現を示している。実施例７に記載したように、ベクター対照（ＶＣ）細胞は非干渉核酸配列（配列ＩＤ番号２７）をコードするレンチウイルスによって形質導入された細胞から作成した。方法は実施例１に記載した。継体数２〜５の細胞からの総細胞ＲＮＡを５〜７日間成長させた後に単離した。同時に行ったＲＴ−ＰＣＲの結果から、ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃３、４、および７におけるＭＲＰ２ ｍＲＮＡの発現抑制が示された（図６）。ＭＲＰ２ ｍＲＮＡバンド強度のβアクチンｍＲＮＡバンド強度に対する比に基づいたＲＴ−ＰＣＲの分析結果（表６参照）から、ＭＲＰ２ ｍＲＮＡ発現が遺伝子ＭＲＰ２ノックダウンにより１５％から１９％に低下したことが示された。

１．２ ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン細胞におけるＭＲＰ２タンパク質の発現
ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン細胞およびベクター対照細胞からのＭＲＰ２タンパク質の細胞溶解量を、実施例２に記載したようにウエスタンブロット法によって測定した。図７で見られるように、ウエスタンブロット法はｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃４、５、６、および７におけるベクター対照（ＶＣ）細胞に比べたＭＲＰ２タンパク質の低下を示していた。ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット法の結果に基づき、配列ＩＤ番号２１に対応する核酸インサートを含んだレンチウイルスによって形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞（ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃７）は、試験を行った５つの干渉配列中最大のＭＲＰ２ノックダウンを示した。

ＭＲＰ２の機能的ノックダウンは、実施例１に記載したように、次のうち一つ若しくはそれ以上の化合物のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器に入れた細胞単層を通る双方向性輸送を測定することによって評価される：ＢＣＥＣＦ（２’、７’−ビス（２−カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン）、ビリルビン−ジグルクロニド、ＢＱ１２３（サイクリックペンタペプチド、エンドセリン受容体拮抗薬）、クリシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、フロセミド、ゲニスチン、グルタチオン−Ｓ−Ｓ−グルタチオン、グルタチオン−メチルフルオレセイン、グレパフロキサシン、メトトレキセート、Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−グルタチオン、ＳＮ３８（ＣＰＴ１１活性代謝物）、Ｓｕｌｆｏｔａｕｒｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＳＴＬＣ）、テルミサルタン（ＢＩＢＲ２７７）およびそのグルクロニド代謝物、テモカプリラート、ビンブラスチン、シスプラチン、または親細胞単層を通る排出を示す他の確立したＭＲＰ２基質。

Ｃ２ＢＢｅｌ細胞におけるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現および活性の抑制
１． ＢＣＲＰノックダウン細胞におけるＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現の分子生物学的性質
ノックダウン細胞におけるＢＣＲＰの遺伝子発現をＢＣＲＰ ｍＲＮＡ量、タンパク量、およびタンパク質機能活性を観察することによって測定した。親細胞株Ｃ２ＢＢｅｌ（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ−２１０２）を用いて、干渉ＲＮＡをコードするレンチウイルスによる細胞の形質導入によるＢＣＲＰ発現の遺伝的抑制を評価した。

マサチューセッツ工科大学からのライセンス供与下に生産、配布されるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）ウェブサイトのＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）検索データベースを用いて、ヒトＢＣＲＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００４８２７）の５つの異なった部位を標的とした５つの２１−ヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号２２〜２６）を設計した。干渉ヌクレオチド配列をＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡレンチウイルス形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にサブクローンし、それを用いて実施例１および２に記載した一般手順に基づきＣ２ＢＢｅｌ細胞を形質導入した。配列ＩＤ番号２２、２３、２４、２５、または２６を有するレンチウイルスによる形質導入によりＭＯＩ １．０で産生された５つの安定的ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ形質転換細胞をクローニングし、それぞれｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃７９８、７９９、８００、８０１、および８０２が生じた。ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８００および８０１は２００７年１１月５日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、それぞれアクセス番号＿、＿、および＿が割り当てられ
た。

ＢＣＲＰ遺伝子のノックダウン発現に関し、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローンの評価を行った。ＢＣＲＰ発現を、上記のごとくＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いてＢＣＲＰ ｍＲＮＡ量を観察することによって、またウエスタンブロット法を用いてタンパク量を観察することによって測定した。

ＲＴ−ＰＣＲに関しては、実施例１および３に記載したように総細胞ＲＮＡを採取し、ＢＣＲＰ ｍＲＮＡ（配列ＩＤ番号１３および１４）に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分離し、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞が非干渉ｓｈＲＮＡベクター対照により形質導入されたＣ２ＢＢｅｌ細胞に比べ、産生されたＢＣＲＰ ｍＲＮＡが大幅に少ないか否かを知るために分析を行った。図８および９に示したように、ＢＣＲＰに特異的な５つの核酸インサートのすべてがｓｈＲＮＡベクター対照Ｃ２ＢＢｅｌ細胞（ＶＣ）で観察された一貫した発現に比べ、ＢＣＲＰ ｍＲＮＡ発現を有意に低下させた。これらの結果は、５つのｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローンがいずれもＢＣＲＰ ｍＲＮＡの産生を抑制することを示している。

ウエスタンブロットに関しては、全細胞溶解物を採取し、タンパク量を計り、続いてタンパク質４０μｇを加えて８％Ｐｒｅｃｉｓｅ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルで分離した。分離後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、免疫ブロットを行った。一次ＢＣＲＰ抗体は２００倍希釈のマウス抗ＢＣＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｂ７０５９、ロット＃０８６Ｋ１７７）であった。ＰＶＤＦ膜を前記一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。免疫ブロット後、膜を１５，０００倍希釈のヤギ抗マウスＨＲＰ−合成抗体（Ｚｙｍａｘ Ｃａｔ＃８１−６５２０、ロット＃５０８９９７２２）に室温で１時間曝露した。化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質を加え、照度計を用いて染色を視覚化した。ウエスタンブロット法により、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞ではＣ２ＢＢｅｌベクター対照（ＶＣ）細胞に比べＢＣＲＰ量が低下していることが示された（図１０および１１）。

さらに、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞におけるＲ
ＮＡ産生について観察を行い、ＢＣＲＰ ｍＲＮＡの抑制が安定的か否かを調べた（図１
２）。結果は、ｍＲＮＡノックダウンが継体５〜２０において着実に上昇したことを示し
ている。

２． ノックダウンクローン細胞におけるＢＣＲＰの機能的性質
輸送アッセイのため、５つのｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰノックダウンクローン細胞をそれぞれトランスウェルに３週間播種した。ＢＣＲＰ基質であるＥ３Ｓ（エストロン−３−硫酸）を透過性アッセイに用い、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞におけるＢＣＲＰ機能を評価した。クローン７９８、７９９、８００、および８０２を９継体後に評価した。クローン８０１は幾分速く成長することが判明したため、他のクローンが成長する間に、輸送アッセイ前に１３回継体が行われた。双方向性輸送実験は実施例１に記載したと同様であり、１０μＭジゴキシン、１０μＭプロプラノロール、および１０μＭアテノロールに加えて１０μＭ Ｅ３Ｓを含んだ実施例１のＱＣ溶液を用いて２時間にわたって実施した。結果は、Ｅ３Ｓに対するＰａｐｐの排出比が対照細胞に比べ有意に低下（０．９１から１４．４２）することを示しており、ＢＣＲＰ活性がｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞において抑制されたことを示唆するものである（表７）。クローン＃８０１のＢＣＲＰ機能抑制（９６．４３％）がＥ３Ｓ輸送で最大であった。

アテノロールおよびプロプラノロール（１０μＭ）を透過性アッセイに関する受動的透過性参照基準として用いた。Ｅ３Ｓ排出測定に用いた同じ細胞単層に対し透過性測定を行った。アテノロールおよびプロプラノロールのＰａｐｐ値はベクター対照細胞で観察されたもの（実施例７に記載）と明らかな相違は認められず、このことはＢＣＲＰノックダウンが経細胞受動拡散経路に影響を及ぼさなかったことを暗示している（表８）。クローン＃８０１細胞のアテノロールＰａｐｐはベクター対照細胞よりもはるかに低かった。透過性測定の前に測定したＴＥＥＲ値も対照細胞と同様であったが、予想外にクローン＃８０１細胞のＴＥＥＲ値のみが５〜１０倍高かった。

３． ＢＣＲＰノックダウンが他の輸送体（ＭＲＰ２およびＰ−ｇｐ）の発現および機能に及ぼす作用
ＭＲＰ２、Ｐ−ｇｐ、およびＢＣＲＰはＣ２ＢＢｅｌ細胞の表面にある非常に重要な輸送体である。これらの輸送体の発現および機能をｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞において研究した。

３．１ ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞におけるＭＲＰ２およびＰ−ｇｐ ｍＲＮＡの発現
ＢＣＲＰノックダウンがＰ−ｇｐおよびＭＲＰ２の発現に及ぼす作用を調べるため、クローン＃８０１細胞におけるｍＲＮＡ値およびタンパク値をさらに調べ、クローン＃７９９細胞と比較した（図１３および１４参照）。結果から、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡ値はクローン＃８０１細胞の方が＃７９９細胞および対照細胞よりも高いように思われた。それとは対照的に、ＭＲＰ２ ｍＲＮＡ値は２０継体を経たクローン＃８０１細胞では低下していた（図１３）。

３．２ ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞におけるＰ−ｇｐの機能的性質
Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡ発現プロフィールの結果に基づき、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞におけるＰ−ｇｐ機能を、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）輸送プレートに入れた２１日齢単層によるジゴキシン排出比を測定することによって検討した。実験条件は実施例１に記載したものと同じであった。前記アッセイは各クローンを９回継体培養した後に実施した。ジゴキシン排出比はクローン＃７９９、８００、８０１、および親細胞単層に対しそれぞれ７２．６７、６４．４７、および５４．２６であり、ＢＣＲＰ−ノックダウン細胞の単層によるこのＰ−ｇｐ特異的基質の排出の方が高いことを示している。結果を表９に示す。結果から、Ｐ−ｇｐ機能がｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ−クローン＃７９９、８００、および８０１で強化されていることが暗示される。

ジゴキシン輸送アッセイの結果から示唆されるように、Ｐ−ｇｐ活性がｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ細胞で上昇したことを確認するため、実施例１に記載したカルセイン−ＡＭ取り込みアッセイをｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン細胞を用いて繰り返した。カルセイン−ＡＭ排出はＢＣＲＰによって仲介されない。従って、カルセイン−ＡＭ取込みにおける当該細胞によるいかなる上昇もＰ−ｇｐ抑制に起因する可能性がある。当該細胞を９６ウェル組織培養プレートに入れ、４８時間にわたって培養を行った。４８時間後、細胞培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄後、細胞を１μＭカルセイン−ＡＭとともに３０分間インキュベートした。確立されたＰ−ｇｐ抑制剤であるシクロスポリンＡで処理した親細胞を陽性対照として用い、親細胞株においてＰ−ｇｐ抑制が細胞内蛍光強度を増すことを検証した。カルセイン−ＡＭとともにインキュベーション後、前記細胞を未使用の対照緩衝液ですすぎ、励起フィルターおよびエミッションフィルターの波長をそれぞれ４８５ｎｍおよび５３８ｎｍに設定の上、Ｆｌｕｏ−ｓｔａｒ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＣ）を用いて蛍光強度を測定した。各クローンを９回継体培養した後に前記アッセイを実施した。表１０に示したように、クローン＃７９９、８００、８０１、および８０２は、ベクター対照細胞に匹敵するＰ−ｇｐ活性の有意な機能的誘導を示した。

カルセイン−ＡＭアッセイにおいて、クローン＃８０１のＰ−ｇｐ機能活性が最大であった。表１０の結果が示唆するＰ−ｇｐ誘導作用が多くの細胞継体を越えて持続するか否かを調べるため、より高い細胞継体である２０継体のｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞を用いてカルセイン−ＡＭアッセイを行った。結果から、２０継体後、＃８０１細胞におけるＰ−ｇｐの活性がベクター対照細胞に比べ最高７３％まで上昇することが示され、総タンパク質については結果は正常化した（表１１）。

４． ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞のその他の性質
レンチウイルス形質導入によって産生された様々なＢＣＲＰノックダウンクローンの成長速度をモニターしながら、あるクローン＃８０１がインビトロで約１５回継体後に加速度的に成長し始めたことに気付いた。親Ｃ２ＢＢｅｌ細胞が薬剤輸送アッセイに適した単分子層を形成するには約３週間を要するため、クローン＃８０１が成熟し薬剤輸送アッセイに適したバリア性を親細胞株および／またはベクター対照細胞株よりも早く形成するか
否かを検討した。

４．１ ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞のバリア性
まず、この細胞株に関し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）に入れた後の様々な段階でＴＥＥＲを測定した（表１２）。結果からＴＥＥＲ値が６日後に９００ Ｏｈｍ／ｃｍ^２を超えることが示され、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器上に緻密な細胞単層が急速に発現することが示唆された。

４．２ ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞におけるＥ３Ｓ、ジゴキシン、および透過性参照化合物の輸送
既述のように、２０細胞継体後にｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１は他の４つのクローンに比べ、成長は速く、はるかに高いＴＥＥＲ値を示すことが判明した。また、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が対照細胞におけるよりも盛んであることが示唆された（表９）。したがって、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞単層でＰ−ｇｐの基質であるジゴキシンの輸送を行い（表１３参照）、Ｐ−ｇｐ ｍＲＮＡ値の見掛けの上昇が排出輸送体機能の上昇に反映されるか否かを調べた。Ｅ３Ｓ、受動的吸収参照化合物、およびＴＥＥＲの輸送についても同時に調べた。

表１３に示したように、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞単層に対するジゴキシン排出比は野生型Ｃ２ＢＢｅｌ対照細胞に対するよりも高かった。カルセイン−ＡＭアッセイを用いて同様の結果が得られた（表１２）。クローン＃８０１単層のＴＥＥＲ値は野生型Ｃ２ＢＢｅｌ対照細胞のＴＥＥＲ値の約５倍であった。一方、Ｅ３Ｓ排出比は親細胞株に比べ依然抑制されており、ＢＣＲＰ機能ノックダウンが持続していることを示すものであった。参照化合物アテノロールおよびプロプラノロールのＰａｐｐ値はそれぞれ低値および高値であり、野生型Ｃ２ＢＢｅｌ対照細胞におけると同じ序列を維持していた。

４．３ ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞におけるＰ−ｇｐおよびＭＲＰ２の発現および機能の安定性
ＢＣＲＰノックダウンが他の輸送体遺伝子に及ぼす作用の安定性を調べるため、タンパク質値に加えＰ−ｇｐおよびＭＲＰ２のｍＲＮＡ値を細胞継体１０〜２０のｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞において測定した。それらの結果から、細胞継体２０においてＰ−ｇｐ ｍＲＮＡの発現が増え、ＭＲＰ２が低下したことが示唆された（図１３および１４参照）。

ＴＥＥＲ測定に加え、ＢＣＲＰ基質であるＥ３ＳおよびＰ−ｇｐ基質であるジゴキシンの双方向性輸送測定を、同時に同じ細胞培地において実施した。継体１８〜２５のクローン＃８０１細胞においてジゴキシン排出（表１４参照）はベクター対照細胞（２５．１３）よりも高く、最大排出比は細胞継体２５（１１４．９８）に対して観察された。

クローン＃８０１細胞においてはベクター対照細胞（１３．９６）に比べ、細胞継体９〜２５におけるＥ３Ｓ排出比（表１５参照）は３．０以下に維持された。クローン＃８０１細胞単層のＴＥＥＲ値は細胞継体９〜２５において３４７から１５８９ ｏｈｍｓ／ｃｍ^２に上昇し、ベクター対照細胞よりも高かった。

薬剤吸収におけるＰ−ｇｐ、ＭＲＰ２、およびＢＣＲＰの役割の評価
以下の予言的実施例は、動物の消化管内における対象薬剤の処理に関与する輸送体のアイデンティティを明らかにするための実験的アプローチを提供する。この実験的アプローチは、（１）単一（形質導入）輸送体を発現する細胞株（ＭＤＣＫなど）、（ｂ）選択的にノックダウンされた輸送体を伴うＣ２ＢＢｅｌ細胞、および（ｃ）化学的輸送体抑制剤の組合せから成る。同時に、これらのツールは薬剤輸送プロセスに関与する輸送体のアイデンティティの決定を高い確度で促進する。

実験１ 排出輸送体の関与。この実験において、試験化合物の双方向性輸送はＣ２ＢＢｅｌＷＴ単層においてスクリーニング可能であり、ＰａｐｐＢ−Ａ／ＰａｐｐＡ−Ｂ比（すなわち排出比、ＥＲ）が算出可能である。これらの実験結果に基づき、下記に記載した他の試験を実施することができる。

この実験法に付いては少なくとも二つの可能な結果が考えられる。最初の可能な結果において、ＥＲ<３は浸透に膜排出輸送タンパク質が関与しないことを示唆する。このシナリオの下では、輸送体に関する試験は確認実験意外には必要ない。二番目の可能な結果において、ＥＲ≧３は浸透にＣ２ＢＢｅｌ細胞中の少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質（Ｐ−ｇｐ、ＭＲＰ２、またはＢＣＲＰ）が関与することを示唆する。これらの輸送体のうちいずれが排出に関与するかを確認するため、以下の実験を行う。

実験２ ＭＲＰ２の関与の確認。対象薬剤の処理にＭＲＰ２が関与するか否かを知るため、本明細書に記載、例示されたように、双方向性の浸透実験を実施することができる。そのような双方向性浸透実験を用いて以下の順列をスクリーニングする：（ａ） 単層を伴わないＣ２ＢＢｅｌ中に試験化合物のみ、（ｂ）Ｃ２ＢＢｅｌ Ｐ−ｇｐノックダウン単層中に試験化合物のみ、（ｃ）Ｃ２ＢＢｅｌ Ｐ−ｇｐノックダウン単層中にＭＲＰ抑制剤（ＭＫ５７１など）を伴う試験化合物、（ｄ）Ｃ２ＢＢｅｌ Ｐ−ｇｐノックダウン単層中にＢＣＲＰ抑制剤（ＦＴＣなど）を伴う試験化合物、（ｅ）ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ単層中に試験化合物のみ、および（ｆ）ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ単層中にＰ−ｇｐ抑制剤（ＣｓＡなど）を伴う試験化合物。

実験３ ＢＣＲＰの関与の確認。対象薬剤の処理にＢＣＲＰが関与するか否かを明らかにするため、本明細書に記載、例示されたように、双方向性の浸透実験を実施することができる。そのような双方向性浸透実験を用いて以下の順列をスクリーニングする：（ａ）単層を伴わないＣ２ＢＢｅｌ中に試験化合物のみ、（ｂ）Ｃ２ＢＢｅｌ ＢＣＲＰ−ノックダウン単層中に試験化合物のみ、（ｃ）ＢＣＲＰ−ＭＤＣＫ単層中に試験化合物のみ、および（ｄ）ＢＣＲＰ−ＭＤＣＫ単層中にＢＣＲＰ抑制剤（ＦＴＣなど）を伴う試験化合物。

実験４ ＭＲＰ２の関与の確認。対象薬剤の処理にＭＲＰ２が関与するか否かを知るため、本明細書に記載、例示されたように、双方向性の浸透実験を実施することができる。そのような双方向性浸透実験を用いて以下の順列をスクリーニングする：（ａ）単層を伴わないＣ２ＢＢｅｌ中に試験化合物のみ、（ｂ）Ｃ２ＢＢｅｌ ＭＲＰ２−ノックダウン単層中に試験化合物のみ、（ｃ）ＭＲＰ２−ＭＤＣＫ単層中に試験化合物のみ、および（ｄ）ＭＲＰ２−ＭＤＣＫ単層中にＭＲＰ２抑制剤（ＭＫ５７１など）を伴う試験化合物。

以下は、二つの細胞株を用いて化合物がＰ−ｇｐ、ＢＣＲＰ、またはその両方の基質であるか否かを明らかにする上記の方法の例である。実施例１に記載したように、各化合物を双方向性細胞単層アッセイで分析した。実施例１に記載したように、選択した化合物の濃度を、ＬＣ／ＭＳ／Ｍｓにより、表１６のコラム２に記録した大量移行をモニターすることによって測定した。前記細胞単層は、Ｐ−ｇｐのみをかなりの程度まで発現する親Ｃ２ＢＢｅｌ細胞またはｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞のいずれかから成っていた。

アンチピリンはいずれの細胞株でも排出を示さないため、Ｐ−ｇｐの基質ではない。エトポシドは両方の細胞株において同程度に排出を示すため、基質である。スルファサラジンは、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞によって排出されるにもかかわらずｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞によって排出されないため、Ｐ−ｇｐ基質ではない。この結果から、スルファサラジンが、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞では高度に発現するが、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞では発現しないＢＣＲＰおよび／またはＭＲＰ２のいずれかの基質であることが示唆される。実際、スルファサラジンはＢＣＲＰ基質であることが知られている（表１）。実際、ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃８０１細胞におけるスルファサラジンの排出比は０．２２であり、これらの細胞がＢＣＲＰノックダウンによって活性が判明するこの化合物に対する取り込み輸送体を有することが示唆される。フロセミドはスルファサラジンと同様のパターンを示すが、取り込み輸送体の存在の証拠は認められない。ジフェンヒドラミンはいずれの細胞株によっても高度に排出されることはないが、デシプラミンは高度に排出され、デシプラミンがＰ−ｇｐ基質であることを示している。これらの結果はｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３または＃８５を用いて上記の試験を繰り返すことにより、また推定上のＰ−ｇｐ基質の排出はＰ−ｇｐノックダウン細胞の単層を通るものがはるかに少ない一方でスルファサラジンおよびフロセミドの排出は依然多いことを示すことによって拡大、確認することが可能である。

Ｃ２ＢＢｅｌ細胞における非標的ｓｈＲＮＡ対照形質導入粒子のｓｈＲＮＡの形質導入
場合によっては、親Ｃ２ＢＢｅｌ細胞は、培地組成、成長速度、および細胞におけるレンチウイルス遺伝子産物の存在によって引起される他の潜在的効果における相違により、ノックダウン細胞株の輸送機能の研究に関し適切な陽性対照とは成り得ないかもしれない。ｓｈＲＮＡクローン細胞を用いて実験を行う場合、ノックダウン結果の正確な解釈を可能とし、観察される反応の特異性の保証を提供するためには、適切な対照が実験デザインの重要な要素である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から得られる配列ＩＤ番号２７を含むＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）非標的ｓｈＲＮＡ対照ベクターは、ＲＩＳＣおよびＲＮＡｉ経路を活性化する有用な陰性対照であるが、ヒト遺伝子は標的としない。

非標的ｓｈＲＮＡ ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡレンチウイルス形質導入粒子（ｃａｔ番号ＳＨＣ００２Ｖ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手し、それを用いて非標的ｓｈＲＮＡによって形質導入されるＣ２ＢＢｅｌ細胞株を作成した。メーカーのプロトコルに基づき、非標的ｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスを用いてＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質転換を行った。要約すれば、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中、一ウェル当たり細胞１．６ ｘ １０^４個）、形質導入前に３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を０．５、１．０、または５．０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染の多重度）でウェルに加え、細胞といっしょに３７℃で２４時間インキュベートした。このインキュベーション後に非結合レンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から４８時間後、ピューロマイシン１０μｇ／ｍＬを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後３〜４日ごとに交換した。陽性細胞を個別の細胞クローンとして作成、増殖し、本明細書に記載したさまざまな機能的アッセイを用いて評価した。実施例４および５に記載した実験の一部においては、親細胞株におけると同様の受動的透過性を有するのに加え、同様または同一のレベルでＰ−ｇｐ、ＢＣＲＰ、およびＭＲＰ２を発現することが示されたクローンを陽性対照として使用した。

試験対照細胞の実験結果：
実施例２に記載したように、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞を配列ＩＤ番号２７を含んだｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターで形質転換した。感染の多重度（ＭＯＩ）の最適度を知るために、三つのＭＯＩｓ（０．５、１．０、および５．０）を用いて細胞の形質導入を行った。実施例３または５に記載したように、遺伝子ノックダウン細胞における同じアッセイのため、分子および機能的アッセイを実施した。ノックダウン細胞の検討に用いたものと同じＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットを用いて、ｓｈＲＮＡベクター対照細胞におけるＢＣＲＰ、ＭＲＰ２、およびＰ−ｇｐの発現を検討した。結果は、ベクター対照細胞が依然輸送体ｍＲＮＡを発現することを示している（表１７）。

ｓｈＲＮＡベクター対照細胞と親Ｃ２ＢＢｅｌ細胞間における典型的輸送特性の比較
表１８に示した輸送アッセイを行う前に、ベクター対照細胞株およびＣ２ＢＢｅｌ細胞株を１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレート上で２１日間培養した。アッセイは実施例１に記載した条件の下に行った。それらの結果から、ベクター対照細胞はＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）容器上でインビトロ薬剤輸送アッセイに適したバリア特性を有する単層を形成すること、また当該細胞はジゴキシン、Ｐ−ｇｐ基質、およびＢＣＲＰ基質であるエストロン−３−硫酸に対する排出活性を発現することが示唆される（表１８）。

本発明は上に記載、例示した実施形態に限定されないが、添付請求項の範囲内でのバリエーションおよび修正が可能である。

（配列表）

膜排出輸送タンパク質の発現が抑制されたノックダウン細胞は、当該輸送タンパク質を「転写遺伝子サイレンシング」によってコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより作成可能である。下方制御用に標的とされる種からの遺伝子またはその断片を用いて前記コードされたタンパク質の産生を制御することが可能である。このためにはアンチセンス分子全長を用いることができる。代わりに、翻訳に不可欠なｍＲＮＡの特定部位を標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用してもよい。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用が本分野で知られている。アンチセンス分子は、転写に基づき当該アンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物で細胞を形質転換することにより、ｉｎ ｓｉｔｕで提供される。そのような構築物は、アンチセンス配列全長またはその一部を産生するように設計することができる。この遺伝子サイレンシング効果は、大量のｄｓＲＮＡが産生されるように、配列をコード化するセンスおよびアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組み換えにより過剰生産することによって高めることが可能である（たとえばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅらによる（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国９５：１３９５９〜６４を参照のこと）。この点につき、少なくとも一つのイントロンの一部若しくは全部に相当する配列を含むｄｓＲＮＡが特に効果的であることが判明した。一つの実施形態において、コード配列アンチセンス鎖の一部若しくは全部がトランス遺伝子によって発現される。別の実施形態において、一つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質に対応するコード配列の一部若しくは全部のセンスおよびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションは遺伝子組み換え的に発現される。干渉核酸分子（配列ＩＤ番号１、３、２１、２４、及び２５）をコードするレンチウイルスによって形質導入された本発明の細胞であるＣ２ＢＢＥ１細胞は、２００７年１１月６日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に掲載され、アクセス番号ＰＴＡ−８７５２、ＰＴＡ−８７５３、ＰＴＡ−８７５１、ＰＴＡ−８７５４、及びＰＴＡ−８７５５をそれぞれ割当てられている。

干渉核酸配列によるＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質導入
干渉核酸配列をＭＩＳＳＩＯＮ（商標）ｓｈＲＮＡヒト腫瘍抑制レンチウイルス形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にサブクローンした。メーカーのプロトコルに基づき、干渉配列（配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５）を有するレンチウイルスを用いてＣ２ＢＢｅｌ細胞の形質導入を行った。要約すれば、Ｃ２ＢＢｅｌ細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に一ウェル当たり細胞１．６ ｘ １０^４個）、形質導入前に３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を０．５、１．０、または５．０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染の多重度）でウェルに加え、細胞と共に３７℃で２４時間インキュベートした。この培養後に非結合のレンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から４８時間後、ピューロマイシン１０μｇ／ｍＬを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後３〜４日ごとに交換した。ＭＯＩ １．０で生成された５つのピューロマイシン耐性分離株が個々の細胞クローンとして作成され、ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３、８４、８５、８６、および８７（これらのクローンはそれぞれ配列ＩＤ番号１、２、３、４、または５を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する）が生じた。５つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８３および８５は２００７年１１月６日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、それぞれアクセス番号ＰＴＡ−８７５２及びＰＴＡ−８７５３が割り当てられた。

個別の細胞クローンとして５つのピューロマイシン耐性分離株が作成され、ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃３、４、５、６、および７（これらのクローンはそれぞれ配列ＩＤ番号１７、１８、１９、２０、または２１を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する）が生じた。前記５つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。ｓｈＲＮＡ／ＭＲＰ２クローン＃７は２００７年１１月６日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、アクセス番号ＰＴＡ−８７５１が割り当てられた。

マサチューセッツ工科大学からのライセンス供与下に生産、配布されるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）ウェブサイトのＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）検索データベースを用いて、ヒトＢＣＲＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００４８２７）の５つの異なった部位を標的とした５つの２１−ヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号２２〜２６）を設計した。干渉ヌクレオチド配列をＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡレンチウイルス形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にサブクローンし、それを用いて実施例１および２に記載した一般手順に基づきＣ２ＢＢｅｌ細胞を形質導入した。配列ＩＤ番号２２、２３、２４、２５、または２６を有するレンチウイルスによる形質導入によりＭＯＩ １．０で産生された５つの安定的ｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰ形質転換細胞をクローニングし、それぞれｓｈＲＮＡ／ＢＣＲＰクローン＃７９８、７９９、８００、８０１、および８０２が生じた。ｓｈＲＮＡ／Ｐ−ｇｐクローン＃８００および８０１は２００７年１１月６日にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９）に登録され、それぞれアクセス番号ＰＴＡ−８７５４及びＰＴＡ−８７５５が割り当てられた。

Claims (5)

1. 配列ＩＤ番号２５の核酸配列を有するベクターによって形質転換された細胞であって、前記核酸配列は、ＢＣＲＰの発現を抑制するための核酸分子をコードするものである、細胞。
2. 請求項１記載の細胞において、当該細胞はＣａｃｏ−２又はＣ２ＢＢｅｌ細胞である、
   細胞。
3. 請求項１又は２記載の細胞において、当該細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のアクセッション番号ＰＴＡ−８７５５として寄託された細胞に対応するものである、細胞。
4. 請求項１、２、又は３記載の細胞を有する細胞培養物。
5. 動物における消化管吸収に関する化合物をスクリーニングするインビトロ方法であって、
   請求項１、２、又は３記載の細胞を試験化合物に接触させる工程と、
   前記試験化合物の経細胞輸送を測定する工程と、
   前記経細胞輸送の測定値と、無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値とを比較する工程と
   を有し、前記基準値と比較した前記測定値は前記動物の身体における当該化合物の消化管吸収を予測させるものである、方法。

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