JP2010508849A5 - - Google Patents
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Description
膜排出輸送タンパク質の発現が抑制されたノックダウン細胞は、当該輸送タンパク質を「転写遺伝子サイレンシング」によってコードするmRNAの翻訳を抑制することにより作成可能である。下方制御用に標的とされる種からの遺伝子またはその断片を用いて前記コードされたタンパク質の産生を制御することが可能である。このためにはアンチセンス分子全長を用いることができる。代わりに、翻訳に不可欠なmRNAの特定部位を標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用してもよい。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用が本分野で知られている。アンチセンス分子は、転写に基づき当該アンチセンスRNA配列を産生するDNA構築物で細胞を形質転換することにより、in situで提供される。そのような構築物は、アンチセンス配列全長またはその一部を産生するように設計することができる。この遺伝子サイレンシング効果は、大量のdsRNAが産生されるように、配列をコード化するセンスおよびアンチセンスRNAの両方を遺伝子組み換えにより過剰生産することによって高めることが可能である(たとえばWaterhouseらによる(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.米国95:13959〜64を参照のこと)。この点につき、少なくとも一つのイントロンの一部若しくは全部に相当する配列を含むdsRNAが特に効果的であることが判明した。一つの実施形態において、コード配列アンチセンス鎖の一部若しくは全部がトランス遺伝子によって発現される。別の実施形態において、一つ若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質に対応するコード配列の一部若しくは全部のセンスおよびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションは遺伝子組み換え的に発現される。干渉核酸分子(配列ID番号1、3、21、24、及び25)をコードするレンチウイルスによって形質導入された本発明の細胞であるC2BBE1細胞は、2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801University Blvd.、バージニア州Manassas、20110−2209)に掲載され、アクセス番号PTA−8752、PTA−8753、PTA−8751、PTA−8754、及びPTA−8755をそれぞれ割当てられている。
干渉核酸配列によるC2BBel細胞の形質導入
干渉核酸配列をMISSION(商標)shRNAヒト腫瘍抑制レンチウイルス形質導入粒子(Sigma−Aldrich、ミズーリ州St.Louis)にサブクローンした。メーカーのプロトコルに基づき、干渉配列(配列ID番号1、2、3、4、または5)を有するレンチウイルスを用いてC2BBel細胞の形質導入を行った。要約すれば、C2BBel細胞を96ウェルプレートに播種し(細胞培地(90%DMEM+10%FBS)中に一ウェル当たり細胞1.6 x 104個)、形質導入前に37℃で24時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を0.5、1.0、または5.0MOI(multiplicity of infection:感染の多重度)でウェルに加え、細胞と共に37℃で24時間インキュベートした。この培養後に非結合のレンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から48時間後、ピューロマイシン10μg/mLを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後3〜4日ごとに交換した。MOI 1.0で生成された5つのピューロマイシン耐性分離株が個々の細胞クローンとして作成され、shRNA/P−gpクローン#83、84、85、86、および87(これらのクローンはそれぞれ配列ID番号1、2、3、4、または5を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する)が生じた。5つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。shRNA/P−gpクローン#83および85は2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801 University Blvd.,バージニア州Manassas、20110−2209)に登録され、それぞれアクセス番号PTA−8752及びPTA−8753が割り当てられた。
干渉核酸配列をMISSION(商標)shRNAヒト腫瘍抑制レンチウイルス形質導入粒子(Sigma−Aldrich、ミズーリ州St.Louis)にサブクローンした。メーカーのプロトコルに基づき、干渉配列(配列ID番号1、2、3、4、または5)を有するレンチウイルスを用いてC2BBel細胞の形質導入を行った。要約すれば、C2BBel細胞を96ウェルプレートに播種し(細胞培地(90%DMEM+10%FBS)中に一ウェル当たり細胞1.6 x 104個)、形質導入前に37℃で24時間にわたってインキュベートした。形質導入の日、ウェルから培地を除去し、レンチウイルス粒子を0.5、1.0、または5.0MOI(multiplicity of infection:感染の多重度)でウェルに加え、細胞と共に37℃で24時間インキュベートした。この培養後に非結合のレンチウイルス粒子を含む培地を除去し、未使用の培地を補充した。形質導入から48時間後、ピューロマイシン10μg/mLを含んだ選択培地を加え、形質導入細胞を選択するためにその後3〜4日ごとに交換した。MOI 1.0で生成された5つのピューロマイシン耐性分離株が個々の細胞クローンとして作成され、shRNA/P−gpクローン#83、84、85、86、および87(これらのクローンはそれぞれ配列ID番号1、2、3、4、または5を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する)が生じた。5つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。shRNA/P−gpクローン#83および85は2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801 University Blvd.,バージニア州Manassas、20110−2209)に登録され、それぞれアクセス番号PTA−8752及びPTA−8753が割り当てられた。
個別の細胞クローンとして5つのピューロマイシン耐性分離株が作成され、shRNA/MRP2クローン#3、4、5、6、および7(これらのクローンはそれぞれ配列ID番号17、18、19、20、または21を含んだレンチウイルスによる形質導入に対応する)が生じた。前記5つの各細胞クローンを、本明細書に記載したさまざまな分析法を用いて拡張、評価した。shRNA/MRP2クローン#7は2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801 University Blvd.,バージニア州Manassas、20110−2209)に登録され、アクセス番号PTA−8751が割り当てられた。
マサチューセッツ工科大学からのライセンス供与下に生産、配布されるSigma−Aldrich(商標)ウェブサイトのMISSION(登録商標)検索データベースを用いて、ヒトBCRP遺伝子(GeneBankアクセス番号NM_004827)の5つの異なった部位を標的とした5つの21−ヌクレオチド配列(配列ID番号22〜26)を設計した。干渉ヌクレオチド配列をMISSION(登録商標)shRNAレンチウイルス形質導入粒子(Sigma−Aldrich、ミズーリ州St.Louis)にサブクローンし、それを用いて実施例1および2に記載した一般手順に基づきC2BBel細胞を形質導入した。配列ID番号22、23、24、25、または26を有するレンチウイルスによる形質導入によりMOI 1.0で産生された5つの安定的shRNA/BCRP形質転換細胞をクローニングし、それぞれshRNA/BCRPクローン#798、799、800、801、および802が生じた。shRNA/P−gpクローン#800および801は2007年11月6日にAmer.Type Cult.Coll.(10801 University Blvd.,バージニア州Manassas、20110−2209)に登録され、それぞれアクセス番号PTA−8754及びPTA−8755が割り当てられた。
【0008】
ヒト大腸腺癌に由来するCaco−2細胞は腸吸収試験で広く用いられているモデルである。Caco−2細胞は成長し分化すると形態学的には腸細胞と同様であり、小腸刷子縁にある酵素の多くを発現し、従って小腸の環境および機能に酷似している。Caco−2細胞は腸吸収研究に対しさらに利益を提供し、P−gp(Hunter Jら(1993)J.Biol.Chem.268:14991〜7)、MRPタンパク質(Hirohashi Tら(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.292:265〜70;Gutmann Hら(1999)Pharm.Res.(NY)16:402〜7)、およびBCRP(Xia CQら(2005)Drug Metab.Dispos.33:637〜43)など少なくとも三つの排出輸送体タンパク質を発現する。
薬剤吸収研究のためには、薬剤排出輸送タンパク質が吸収障害に及ぼす作用を評価するのが望ましい。これは輸送体、とりわけP−gpの発現または活性を抑制することによって達成可能である。一般に、シクロスポリンAなどの化学物質がP−gpの活性阻害に用いられる。輸送体の化学的抑制は、それらの化学物質が他の細胞タンパク質および機能をも抑制し、したがって吸収実験の結果をゆがめかねない点で不都合である。最近、Caco−2細胞におけるP−gpの発現がRNAi技術により低下することが示され(Watanabe Tら(2005)Pharm.Res.22:1287〜93)、Caco−2細胞における多剤耐性遺伝子1(MDR1)の発現がRNAi技術により低下することが示された(Cellius Tら(2004)Biochem.Biophys.Res.Comm.324:365〜71)。RNAiによるP−gp発現抑制が、P−gpによる輸送化合物の細胞内蓄積を促進し、同化合物に対する感受性を回復させた(Wu Hら(2003)CancerRes.63:1515〜19)。Caco−2細胞におけるP−gpの遺伝的下方制御は化学抑制剤の使用に比べれば進歩であるが、本モデルにおける薬剤吸収研究は、P−gp発現のノックダウンのみではMRPやBCRPなどの現存輸送体の薬剤排出および吸収障害への寄与を説明できない点において不利である。さらに、生体外で合成され細胞内に直接トランスフェクションされるshRNAは、遺伝子発現を一時的にのみ低下させ、発現は核酸導入から数日後に回復する。さらに、生体外で合成されるshRNAは多くの場合容易にトランスフェクションされる細胞に限定され、数代にわたる細胞継体培養後における遺伝子発現抑制の安定性についてはほとんど知られていない。
主要化合物の腸吸収を正確に評価し予想するためには、あらゆる排出輸送タンパク質の相対的寄与率を明らかにし制御するのが望ましい。同様に、そのような輸送タンパク質の発現および/または機能をより永続的に遺伝子制御するためには、安定的細胞株を産生、利用するのが望ましい。本発明はこれらの長年の課題に取り組むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
ヒト大腸腺癌に由来するCaco−2細胞は腸吸収試験で広く用いられているモデルである。Caco−2細胞は成長し分化すると形態学的には腸細胞と同様であり、小腸刷子縁にある酵素の多くを発現し、従って小腸の環境および機能に酷似している。Caco−2細胞は腸吸収研究に対しさらに利益を提供し、P−gp(Hunter Jら(1993)J.Biol.Chem.268:14991〜7)、MRPタンパク質(Hirohashi Tら(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.292:265〜70;Gutmann Hら(1999)Pharm.Res.(NY)16:402〜7)、およびBCRP(Xia CQら(2005)Drug Metab.Dispos.33:637〜43)など少なくとも三つの排出輸送体タンパク質を発現する。
薬剤吸収研究のためには、薬剤排出輸送タンパク質が吸収障害に及ぼす作用を評価するのが望ましい。これは輸送体、とりわけP−gpの発現または活性を抑制することによって達成可能である。一般に、シクロスポリンAなどの化学物質がP−gpの活性阻害に用いられる。輸送体の化学的抑制は、それらの化学物質が他の細胞タンパク質および機能をも抑制し、したがって吸収実験の結果をゆがめかねない点で不都合である。最近、Caco−2細胞におけるP−gpの発現がRNAi技術により低下することが示され(Watanabe Tら(2005)Pharm.Res.22:1287〜93)、Caco−2細胞における多剤耐性遺伝子1(MDR1)の発現がRNAi技術により低下することが示された(Cellius Tら(2004)Biochem.Biophys.Res.Comm.324:365〜71)。RNAiによるP−gp発現抑制が、P−gpによる輸送化合物の細胞内蓄積を促進し、同化合物に対する感受性を回復させた(Wu Hら(2003)CancerRes.63:1515〜19)。Caco−2細胞におけるP−gpの遺伝的下方制御は化学抑制剤の使用に比べれば進歩であるが、本モデルにおける薬剤吸収研究は、P−gp発現のノックダウンのみではMRPやBCRPなどの現存輸送体の薬剤排出および吸収障害への寄与を説明できない点において不利である。さらに、生体外で合成され細胞内に直接トランスフェクションされるshRNAは、遺伝子発現を一時的にのみ低下させ、発現は核酸導入から数日後に回復する。さらに、生体外で合成されるshRNAは多くの場合容易にトランスフェクションされる細胞に限定され、数代にわたる細胞継体培養後における遺伝子発現抑制の安定性についてはほとんど知られていない。
主要化合物の腸吸収を正確に評価し予想するためには、あらゆる排出輸送タンパク質の相対的寄与率を明らかにし制御するのが望ましい。同様に、そのような輸送タンパク質の発現および/または機能をより永続的に遺伝子制御するためには、安定的細胞株を産生、利用するのが望ましい。本発明はこれらの長年の課題に取り組むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】 米国特許第5872014号
【特許文献2】 国際公開第WO2006/021894
【非特許文献】
【特許文献1】 米国特許第5872014号
【特許文献2】 国際公開第WO2006/021894
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】 Artursson,P.et a1.,"Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelia1(Caco−2)cells,"Biochem.Biophys.Res.Commun.,1991,175(3),880−885
【非特許文献2】 Baker,B.F.et a1.,"Novel mechanisms for antisense−mediated regulation of gene expression,"Biochim.Biophys.Acta.,1999,1489,3−18
【非特許文献3】 Balimane,P.V.et a1.,"Current industrial practices of assessing permeability and P−glycoprotein interaction,"AAPS J.,2006,8,E1−E13
【非特許文献4】 Bernstein,E.et a1.,"Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference,"Nature,2001,409(6818),363−366
【非特許文献5】 Borst,P,et a1.,"A family of drug transporters:the multidrug resistance−associated proteins,"J.Natl.Cancer Inst.,2000,92、1295−1302
【非特許文献6】 Brummelkamp,T.R.et a1.,Science,2002,296,550−553
【非特許文献7】 Celius,T.et a1.,"Stable suppression of MDR1 gene expression and function by RNAi in Caco−2 cells,"Biochem.Biophys.Res.Comm.,2004,324,365−371
【非特許文献8】 Cline,M.J.,"Perspectives for gene therapy:inserting new genetic information into mammalian cells by physical techniques and viral vectors,"Pharmac.Ther.,1985,29,69−92
【非特許文献9】 Cotten,M.et a1.,"Ribozyme mediated destruction of RNA in vivo,"EMBO J.,1989,8(12),3861−3866
【非特許文献10】 Denhardt,D.T.,"Mechanism of action of antisense RNA.Sometime inhibition of transcription,processing,transport,or translation,"Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,
70−76
【非特許文献11】 Doyle,L.A.et a1.,"A multidrug resistance transporter from human MCF−7 breast cancer cells,"Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1998,95(26),15665−15670
【非特許文献12】 GenBank Accession No.NM_004827
【非特許文献13】 Germann,U.A.,"P−glycoprotein−−a mediator of multi drug resistance in tumour cells,"Eur.J.Cancer,1996,32A,927−944
【非特許文献14】 Grishok,A.et a1.,"Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small tempora1 RNAs that contro1 C.elegans developmenta1 timing,"Ce11,2001,106,23−24
【非特許文献15】 Gutmann,H.et a1.,"Evidence for different ABC−transporters in Caco−2 cells modulating drug uptake,"Pharm.Res.(NY),1999,16,402−407
【非特許文献16】 Hirohashi,T.et a1.,"Function and expression of multidrug resistance−associated protein family in human colon adenocarcinonma cells(Caco−2),"J.Pharmaco1.Exp.Ther.,2000,292,265−270
【非特許文献17】 Hunter,J.et a1.,"Functional expression of P−glycoprotein in apical membranes of human intestinal Caco−2 cells.Kinetics of vinblastine secretion and interaction with modulators,"J.Bio1.Chem.,1993,268(20),14991−14997
【非特許文献18】 Hutvagner,G.et a1.,"A cellular function for the RNA−interference enzyme Dicer in the maturation of the let−7 small temporal RNA,"Science,2001,293,834−838
【非特許文献19】 J.Polli and C.Serabjit−Singh,in"Pharmaceutica1 Profiling in Drug Discovery for Lead Selection,"R.T.Borchardt et a1.,eds.,pp.235−255,Am.Assoc.Pharm.Scientists,Arlington,VA,2004
【非特許文献20】 Jain,K.K.,"RNAi and siRNA," Pharmacogenomics,2004,5(3),239−242
【非特許文献21】 Ketting,R.F.et a1.,"Dicer functions in RNA interference and in synthesis of sma11 RNA involved in developmental timing in C.elegans,"Genes Dev.,2001,15(20),2654−2659
【非特許文献22】 Lagos−Quintana M.et al,"Identification of novel genes codin for small expressed RNAs Science,2001,294(5543),853−858
【非特許文献23】 Lee,V.H.,"Mucosal drug delivery,"J.Natl.Cancer Inst.Monogr.,2001,29,41−44
【非特許文献24】 McManus,M.T.et a1.,Gene silencing using micro−RNA designed hairpins,"RNA,2002,8(6),842−850
【非特許文献25】 Miyagashi,M.et a1.,"U6 promoter−driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression inmammalian cells,"Nat.Biotech.,
2002,20( 5),49−500
【非特許文献26】 Mizuno,N.et a1.,"Impact of drug transporter studies on drug discovery and development,"Pharmacological Rev.,2003,55(3),425−461
【非特許文献27】 Neilsen,P.E.,"Applications of peptide nucleic acids,"Curr.Opin.Biotech.,1999,10,71−75
【非特許文献28】 Nellen,W.et a1.,"What makes an mRNA anti−sense−itive?"Trends Biochem.Sci.,1993,18(11),419−423
【非特許文献29】 Paddison,P.J.et a1.,"Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence−specific silencing in mammalian cells,"Genes and Dev.,2002,16(8),948−958
【非特許文献30】 Pasquinelli,A.E.,"MicroRNAs:deviants no longer,"Trends Gen.,2002,18(4),171−173
【非特許文献31】 Paul,C.P.et a1.,"Effective expression of small interfering RNA in human cells,"Nat.Biotechno1.,2002,20(5),505−508
【非特許文献32】 Staud,F.et a1.,"Breast cancer resistance protein(BCRP)/ABCG2,"Int.J.Biochem.Ce11 Biol.,2005,37(4),720−725
【非特許文献33】 Stephens,R.H.et a1.,"Kinetic profiling of P−glycoprotein−mediated drug efflux in rat and human intestinal epithelia,"J.Pharmaco1.Exp.Ther.,2001,296(2),584−591
【非特許文献34】 Sui,G.et a1.,"A DNA vector−based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99(8),5515−5520
【非特許文献35】 Troutman,M.T.,"Novel experimental parameters to quantify the modulation of absorptive and secretory transport of compounds by P−glycoprotein in cell culture models of intestinal epithelium,"Pharm.Res.,2003,20(8),1210−1224
【非特許文献36】 Tuschl,T.,"Expanding sma11 RNA interference,"Nat.Biotechno1.,2002,20(5),446−448
【非特許文献37】 U.S.Food and Drug Adminstration(FDA),"Drug Development and Drug Interactions,"May 1,2006,retrieved online at URL http://www.fda.gov/cder/drug/drugInteractions/default.htm
【非特許文献38】 Usman,N.et a1.,"Hammerhead ribozyme engineering,"Curr.Opin.Struct.Bio1.,1996,6(4),527−533
【非特許文献39】 Van Asperen,J.et a1.,"The pharmacological role of P−glycoprotein in the intestinal epithelium,"Pharmacol.Res.,1998,37(6),429−435
【非特許文献40】 Van Breemen,R.B.et a1.,"Caco−2 cell permeability assays to measure drug absorption,"Expert Opin.Drug Metab.Toxico1.,2005,1(12),175−185
【非特許文献41】 Varga,L.V.et a1.,"Antisense strategies:functions and applications in immunology,"Immun.Lett.,1999,69(2),217−224
【非特許文献42】 Wagner,R.W.,"The state of the art in antisense research,"Nat.Medicine,1995,1,1116−1118
【非特許文献43】 Wakasugi,H.et al.,"Effect of clarithromycin on renal excretion of digoxin:interaction with P−glycoprotein,"Clin.Pharmaco1.Ther.,1998,64,123−128
【非特許文献44】 Wang,Q.et a1.,"Evaluation of the MDR−MDCK ce1l line as a permeability screen for the blood−brain barrier,"Int.J.Pharmaceutics,2005,288(2),349−359
【非特許文献45】 Watanabe,T.et a1.,"Construction of a functional transporter analysis system using MDR1 knockdown Caco−2 cells,"Pharm.Res.,2005,22(8),1287−1293
【非特許文献46】 Waterhouse,P.M.et a1.,"Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(23),13959−13964
【非特許文献47】 Watson,C.J.et a1.,"Functional modeling of tight junctions in intestinal ce11 monolayers using polyethylene glycol oligomers,"Am.J.Physiol.Cell Physiol.,2001,281,C388−C397
【非特許文献48】 Weinstein,K.et a1.in"Pharmaceutica1 Profiling in Drug Discovery for Lead Selection,"R.T.Borchardt et a1.,eds.,pp.217−234,Am.Assoc.Pharm.Scientists,Arlington,VA,2004
【非特許文献49】 Westpha1,K.et a1.,"Oral bioavailability of digoxin is enhanced by talinolo1:evidence for involvement of intestina1 P−glycoprotein,"Clin.Pharmacol.Ther.,2000,68,6−12
【非特許文献50】 Woolf,T.M.,"The stability,toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos,"Nucleic Acids Res.,1990,18(7),1763−1769
【非特許文献51】 Wright,S.et a1.,"Molecular and cellular physiology of renal organic cation and anion transport,"Phsyio1.Rev.,2004,84(3),987−1049
【非特許文献52】 Wu,H.et a1.,"Small interfering RNA−induced suppression of MDR1(P−glycoprotein)restores sensitivity to multidrug−resistant cancer cells,"Cancer Res.,2003,63(7),1515−1519
【非特許文献53】 Xia,C.Q.et a1.,"Expression,localization,and functional characteristics of breast cancer resistance protein in Caco−2 cells,"Drug Metab.Dispos.,2005,33(5),637−643
【非特許文献54】 Yu,J−Y.et al.,"RNA interference by expression of short−interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells,"Proc.Nat1.Acad.Sci,2002,99(9),6047−6052
【非特許文献55】 Zeng,Y.et a1.,"Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells,"Mo1.Ce11,2002,9(6),1327−1333
【非特許文献56】 Zhang,L.et a1.,"Scientific perspectives on drug transporters and their role in drug interactions,"Molecular Pharmaceutics,2006,3,62−69
【非特許文献57】 Stage Alexander et al.,"Stable and complete overcoming of MDR1/P−g1ycoprotein−mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference."Cancer Gene Therapy Nov.2004,vol.11,no.11,November(2004−11),699−706
【非特許文献58】 Lee et al.,"siRNA−Getting the messageout"European Journal of Pharmaceutical Sciences,Elsevier,Amsterdam
,NL,vol.27,no.5,1 Apri1,2006(2006−04−01),401−410
【非特許文献59】 Morris Kevin et al.,"Lentivirus−mediated RNA interference therapy for human immunodeficiency virus type 1 infection."Human Gene Therapy May 2006,vol.17,no5,May 2006(2006−05),479−486
【非特許文献60】 Wiznerowicz Maciej et al.,"Tuning silence:conditional systems for RNA interference."Nature Methods Sep.2006,vol.3,no.9,September.2006(2006−09),682−688
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【非特許文献1】 Artursson,P.et a1.,"Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelia1(Caco−2)cells,"Biochem.Biophys.Res.Commun.,1991,175(3),880−885
【非特許文献2】 Baker,B.F.et a1.,"Novel mechanisms for antisense−mediated regulation of gene expression,"Biochim.Biophys.Acta.,1999,1489,3−18
【非特許文献3】 Balimane,P.V.et a1.,"Current industrial practices of assessing permeability and P−glycoprotein interaction,"AAPS J.,2006,8,E1−E13
【非特許文献4】 Bernstein,E.et a1.,"Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference,"Nature,2001,409(6818),363−366
【非特許文献5】 Borst,P,et a1.,"A family of drug transporters:the multidrug resistance−associated proteins,"J.Natl.Cancer Inst.,2000,92、1295−1302
【非特許文献6】 Brummelkamp,T.R.et a1.,Science,2002,296,550−553
【非特許文献7】 Celius,T.et a1.,"Stable suppression of MDR1 gene expression and function by RNAi in Caco−2 cells,"Biochem.Biophys.Res.Comm.,2004,324,365−371
【非特許文献8】 Cline,M.J.,"Perspectives for gene therapy:inserting new genetic information into mammalian cells by physical techniques and viral vectors,"Pharmac.Ther.,1985,29,69−92
【非特許文献9】 Cotten,M.et a1.,"Ribozyme mediated destruction of RNA in vivo,"EMBO J.,1989,8(12),3861−3866
【非特許文献10】 Denhardt,D.T.,"Mechanism of action of antisense RNA.Sometime inhibition of transcription,processing,transport,or translation,"Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,
70−76
【非特許文献11】 Doyle,L.A.et a1.,"A multidrug resistance transporter from human MCF−7 breast cancer cells,"Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1998,95(26),15665−15670
【非特許文献12】 GenBank Accession No.NM_004827
【非特許文献13】 Germann,U.A.,"P−glycoprotein−−a mediator of multi drug resistance in tumour cells,"Eur.J.Cancer,1996,32A,927−944
【非特許文献14】 Grishok,A.et a1.,"Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small tempora1 RNAs that contro1 C.elegans developmenta1 timing,"Ce11,2001,106,23−24
【非特許文献15】 Gutmann,H.et a1.,"Evidence for different ABC−transporters in Caco−2 cells modulating drug uptake,"Pharm.Res.(NY),1999,16,402−407
【非特許文献16】 Hirohashi,T.et a1.,"Function and expression of multidrug resistance−associated protein family in human colon adenocarcinonma cells(Caco−2),"J.Pharmaco1.Exp.Ther.,2000,292,265−270
【非特許文献17】 Hunter,J.et a1.,"Functional expression of P−glycoprotein in apical membranes of human intestinal Caco−2 cells.Kinetics of vinblastine secretion and interaction with modulators,"J.Bio1.Chem.,1993,268(20),14991−14997
【非特許文献18】 Hutvagner,G.et a1.,"A cellular function for the RNA−interference enzyme Dicer in the maturation of the let−7 small temporal RNA,"Science,2001,293,834−838
【非特許文献19】 J.Polli and C.Serabjit−Singh,in"Pharmaceutica1 Profiling in Drug Discovery for Lead Selection,"R.T.Borchardt et a1.,eds.,pp.235−255,Am.Assoc.Pharm.Scientists,Arlington,VA,2004
【非特許文献20】 Jain,K.K.,"RNAi and siRNA," Pharmacogenomics,2004,5(3),239−242
【非特許文献21】 Ketting,R.F.et a1.,"Dicer functions in RNA interference and in synthesis of sma11 RNA involved in developmental timing in C.elegans,"Genes Dev.,2001,15(20),2654−2659
【非特許文献22】 Lagos−Quintana M.et al,"Identification of novel genes codin for small expressed RNAs Science,2001,294(5543),853−858
【非特許文献23】 Lee,V.H.,"Mucosal drug delivery,"J.Natl.Cancer Inst.Monogr.,2001,29,41−44
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
Claims (21)
- 配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列を有するベクターによって形質転換される宿主細胞であって、前記核酸配列は、膜排出輸送タンパク質の発現を抑制するための核酸分子をコードするものである、宿主細胞。
- 請求項1記載の宿主細胞において、当該細胞は膜排出輸送タンパク質を発現するものである。
- 請求項1又は2記載の宿主細胞において、当該細胞は腸上皮細胞である。
- 上記いずれかの請求項に記載の宿主細胞において、前記核酸分子は、2若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制するものである。
- 請求項4記載の方法において、前記膜排出輸送タンパク質は、P−糖タンパク質、及び乳癌耐性タンパク質である。
- 上記いずれかの請求項に記載の宿主細胞を有する細胞培養物。
- 動物における消化管吸収に関する化合物をスクリーニングするインビトロ方法であって、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によってコードされる核酸分子を細胞中で発現させることによって、当該細胞における少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程と、
前記細胞を試験化合物に接触させる工程と、
前記試験化合物の経細胞輸送を測定する工程と、
前記経細胞輸送の測定値と、無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値とを比較する工程と
を有し、
前記基準値と比較した前記測定値は前記動物の身体における当該化合物の消化管吸収を予測させるものである、方法。 - 請求項7記載の方法において、前記細胞における少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程は、配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によって当該細胞を形質転換する工程を有するものであり、前記核酸配列は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものである。
- 請求項7又は8記載の方法において、前記抑制は、2若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する核酸分子によって前記細胞を形質転換する工程を有するものである。
- 動物における消化管吸収に関する化合物をスクリーニングするインビトロ方法であって、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によってコードされる核酸分子を細胞中で発現させることによって、当該第一の細胞における第一の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程と、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によってコードされる核酸分子を細胞中で発現させることによって、当該第二の細胞における第二の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程と、
前記第一および第二の細胞を試験化合物に接触させる工程と、
前記第一および第二の細胞における前記試験化合物の経細胞輸送を測定する工程と、
前記経細胞輸送の測定値と、無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値とを比較する工程と
を有し、
前記測定値は、前記試験化合物の経細胞輸送に対する前記第一および第二の膜排出輸送タンパク質の相対的寄与率を表し、前記基準値と比較した前記測定値は前記動物の身体における当該化合物の消化管吸収を予測させるものである、方法。 - 請求項10記載の方法において、前記第一の膜排出輸送タンパク質は、P−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質2、または乳癌耐性タンパク質であり、及び/若しくは、前記第二の膜排出輸送タンパク質は、P−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質2、または乳癌耐性タンパク質である。
- 請求項10又は11記載の方法において、前記第一の膜排出輸送タンパク質を抑制する工程は、配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によって前記第一の細胞を形質転換する工程を有するものであり、前記核酸配列は、前記第一の膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものであり、及び/若しくは、前記第二の膜排出輸送タンパク質を抑制する工程は、配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によって前記第二の細胞を形質転換する工程を有するものであり、前記核酸配列は、前記第二の膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものである。
- 請求項10〜12のいずれかに記載の方法において、この方法は、さらに、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によってコードされる核酸分子を細胞中で発現させることによって、当該第三の細胞における第三の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程と、
前記第一、第二、および第三の細胞を試験化合物に接触させる工程と、
前記第一、第二、および第三の細胞における前記試験化合物の経細胞輸送を測定する工程と、
前記経細胞輸送の測定値と、無消化管吸収、低度消化管吸収、中等度消化管吸収、または高度消化管吸収の化合物の経細胞輸送に対する基準値とを比較する工程と
を有し、
前記測定値は、前記試験化合物の経細胞輸送に対する前記第一、第二、および第三の膜排出輸送タンパク質の相対的寄与率を表し、前記基準値と比較した前記測定値は前記動物の身体における当該化合物の消化管吸収を予測させるものである。 - 請求項13記載の方法において、前記第三の膜排出輸送タンパク質は、P−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質2、または乳癌耐性タンパク質である。
- 請求項13又は14記載の方法において、前記第三の膜排出輸送タンパク質を抑制する工程は、配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によって前記第三の細胞を形質転換する工程を有するものであり、前記核酸配列は、前記第三の膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものである。
- 少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制するインビトロ方法であって、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列を有するレンチウイルスベクターによって、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質を発現する細胞を形質転換する工程であって、前記核酸配列は、少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものである、前記形質転換する工程と、
前記細胞において前記核酸分子を発現する工程と
を有し、
前記核酸分子の発現は少なくとも一つの膜排出輸送タンパク質の発現を抑制するもので
ある、方法。 - 請求項7又は16記載の方法において、前記少なくとも1つの膜排出輸送タンパク質は、P−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質2、または乳癌耐性タンパク質である。
- 請求項16記載の方法において、前記核酸分子は2若しくはそれ以上の膜排出輸送タンパク質の発現を抑制するものである。
- 請求項9又は18記載の方法において、前記膜排出輸送タンパク質はP−糖タンパク質および乳癌耐性タンパク質である。
- 膜排出輸送タンパク質の排出活性を抑制する化合物を同定するインビトロ方法であって、
配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によってコードされる核酸分子を第一の細胞中で発現させることによって、当該第一の細胞における膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程と、
前記第一の細胞を前記膜排出輸送タンパク質の基質に接触させる工程と、
前記膜排出輸送タンパク質を発現する第二の細胞を、試験化合物および前記膜排出輸送タンパク質の基質に接触させる工程と、
前記第一の細胞と、前記試験化合物の存在下および不在下における第二の細胞とにおける前記膜排出輸送タンパク質の排出活性を測定する工程と、
前記測定された排出活性を比較する工程と
を有し、
前記試験化合物の不在下における排出活性に対する前記試験化合物の存在下における排出活性の低下、および前記第一の細胞における排出活性との、前記試験化合物の存在下における排出活性の少なくとも部分的な同一性は、当該試験化合物が当該膜排出輸送タンパク質を特異的に抑制することを示すものである、方法。 - 請求項20記載の方法において、前記第一の細胞における膜排出輸送タンパク質の発現を抑制する工程は、配列ID番号1、2、3、4、5、17、18、19、20、21、22、23、24、25、若しくは26の核酸配列によって前記第一の細胞を形質転換する工程を有するものであり、前記核酸配列は、膜排出輸送タンパク質の発現を妨げる核酸分子をコードするものである。
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