JP5309649B2 - ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリアミド樹脂組成物に関し、より詳しくは、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂組成物に関する。
近年、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂（５６ナイロン）が製造されている。５６ナイロンは、６６ナイロン等とほぼ同等の機械物性を有する。バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂を用いた例として、特許文献１に、ジカルボン酸単位と、ペンタメチレンジアミン単位を含むジアミン単位とを構成成分とするポリアミド樹脂を含有するポリアミドフィルムが記載されている。
ところで、一般にポリアミド樹脂は、その特性を利用して、耐熱老化性が要求される部品等の用途に広く使用されている。
しかし、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂は、例えば、石化原料から合成される６６ナイロン等と比べ、ハロゲン化銅等の熱安定剤を配合した場合であっても、耐熱老化性が不十分であることが判明している。
しかし、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂は、例えば、石化原料から合成される６６ナイロン等と比べ、ハロゲン化銅等の熱安定剤を配合した場合であっても、耐熱老化性が不十分であることが判明している。
本発明は、上述した課題を解決するためになされたものである。即ち、本発明の目的は、バイオマス由来の原料を使用し、且つ耐熱老化性が改良されたポリアミド樹脂組成物を提供することにある。
そこで本発明者は鋭意検討の結果、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂に含まれる硫黄がポリアミド樹脂の耐熱老化性に影響を与えることを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成した。
かくして本発明によれば、ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを主な単量体成分として用いる重縮合反応により得られるポリアミド樹脂とハロゲン化第一銅とを含み、単量体成分中の硫黄の合計含有量が１．２重量ｐｐｍ以下であることを特徴とするポリアミド樹脂組成物が提供される。
かくして本発明によれば、ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを主な単量体成分として用いる重縮合反応により得られるポリアミド樹脂とハロゲン化第一銅とを含み、単量体成分中の硫黄の合計含有量が１．２重量ｐｐｍ以下であることを特徴とするポリアミド樹脂組成物が提供される。
ここで、本発明のポリアミド樹脂組成物は、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の合計含有量が１００重量ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの合計含有量が５重量ｐｐｍ以下であることが好ましい。
さらに、重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるジカルボン酸が、アジピン酸であることが好ましい。
また、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの合計含有量が５重量ｐｐｍ以下であることが好ましい。
さらに、重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるジカルボン酸が、アジピン酸であることが好ましい。
次に、重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるペンタメチレンジアミンは、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または細胞の処理物を使用し、リジンから産出されたものであることが好ましい。
また、ペンタメチレンジアミンを産出する際に用いるリジンは、グルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。
尚、ペンタメチレンジアミンは、グルコースを発酵させ、直接得てもよい。
また、ペンタメチレンジアミンを産出する際に用いるリジンは、グルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。
尚、ペンタメチレンジアミンは、グルコースを発酵させ、直接得てもよい。
また、本発明のポリアミド樹脂組成物は、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量が５重量ｐｐｍ〜５００重量ｐｐｍであることが好ましい。
また、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えることが好ましい。
また、ポリアミド樹脂を得る重縮合反応の重縮合触媒として燐含有化合物を用い、且つ重縮合触媒として用いられた燐含有化合物に由来する燐の含有量が１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍであることが好ましい。
また、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えることが好ましい。
また、ポリアミド樹脂を得る重縮合反応の重縮合触媒として燐含有化合物を用い、且つ重縮合触媒として用いられた燐含有化合物に由来する燐の含有量が１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍであることが好ましい。
さらに、本発明のポリアミド樹脂組成物は、ポリアミド樹脂１００重量部に対し、強化材５重量部〜１５０重量部をさらに含むことが好ましい。
この場合、強化材が、ガラス繊維であることが好ましい。
この場合、強化材が、ガラス繊維であることが好ましい。
本発明によれば、バイオマス由来の原料を使用し、且つ耐熱老化性が改良されたポリアミド樹脂等が得られる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。尚、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
（ポリアミド樹脂）
本実施の形態で使用するポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンに由来する構造単位を少なくとも含む構造を有する。
さらに、本実施の形態において、ポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンを含む脂肪族ジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とし、これらを用いた重縮合反応により得られたものであることが好ましい。
本実施の形態で使用するポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンに由来する構造単位を少なくとも含む構造を有する。
さらに、本実施の形態において、ポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンを含む脂肪族ジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とし、これらを用いた重縮合反応により得られたものであることが好ましい。
（ペンタメチレンジアミン）
本実施の形態において、単量体成分である脂肪族ジアミン中のペンタメチレンジアミンの濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
ここで、ペンタメチレンジアミン（１，５−ジアミノペンタン）以外の他の脂肪族ジアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，１３−ジアミノトリデカン、１，１４−ジアミノテトラデカン、１，１５−ジアミノペンタデカン、１，１６−ジアミノヘキサデカン、１，１７−ジアミノヘプタデカン、１，１８−ジアミノオクタデカン、１，１９−ジアミノノナデカン、１，２０−ジアミノエイコサン、２−メチル−１，５−ジアミノペンタン等が挙げられる。
本実施の形態において、単量体成分である脂肪族ジアミン中のペンタメチレンジアミンの濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
ここで、ペンタメチレンジアミン（１，５−ジアミノペンタン）以外の他の脂肪族ジアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，１３−ジアミノトリデカン、１，１４−ジアミノテトラデカン、１，１５−ジアミノペンタデカン、１，１６−ジアミノヘキサデカン、１，１７−ジアミノヘプタデカン、１，１８−ジアミノオクタデカン、１，１９−ジアミノノナデカン、１，２０−ジアミノエイコサン、２−メチル−１，５−ジアミノペンタン等が挙げられる。
本実施の形態において、ペンタメチレンジアミンは、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または当該細胞の処理物を使用してリジンから産出される方法が挙げられる。
ポリアミド樹脂の単量体成分として、このようなペンタメチレンジアミンを用いることにより、ポリアミド樹脂の単量体成分に占めるバイオマス由来原料の割合（バイオマス比率）を高くすることができる。
本実施の形態では、ポリアミドにおけるバイオマス比率が２．５１％以上であることが好ましい。バイオマス比率が２．５１％以上の場合、地球温暖化の原因となる二酸化炭素の発生を抑制する効果が得られる。
ポリアミド樹脂の単量体成分として、このようなペンタメチレンジアミンを用いることにより、ポリアミド樹脂の単量体成分に占めるバイオマス由来原料の割合（バイオマス比率）を高くすることができる。
本実施の形態では、ポリアミドにおけるバイオマス比率が２．５１％以上であることが好ましい。バイオマス比率が２．５１％以上の場合、地球温暖化の原因となる二酸化炭素の発生を抑制する効果が得られる。
上記のペンタメチレンジアミンは、例えば、以下の方法によって製造される。即ち、リジンの酵素的脱炭酸反応は、リジン溶液に酸を加えることにより行われる。この場合、リジン溶液のｐＨが酵素的脱炭酸反応に適した範囲に維持されるように、リジン溶液に酸が加えられる。ここで、リジン溶液に加えられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸等の有機酸が挙げられる。次に、酵素的脱炭酸反応により得られた反応生成液を通常の分離精製方法により処理することにより、遊離ペンタメチレンジアミンが採取される。
（ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩）
本実施の形態では、リジンの酵素的脱炭酸反応において、アジピン酸等のジカルボン酸を使用することにより、ポリアミドの単量体成分としてペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を直接採取することができる。以下、酸としてアジピン酸を用いて、リジンの酵素的脱炭酸反応により、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を製造する方法について説明する。
原料として用いるリジンは、通常、遊離塩基（リジンベース）であることが好ましい。さらに、リジンはグルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。また、リジンのアジピン酸塩を原料として用いてもよい。酵素的脱炭酸反応によりペンタメチレンジアミンを生成するリジンとして、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンが挙げられる。中でも、Ｌ−リジンが好ましい。また、リジンの形態としては、精製されたリジン、グルコースを含む合成培地を用いて生成したリジンを含む発酵液が挙げられる。但し、発酵液の場合は、酵素的脱炭酸反応により生成するペンタメチレンジアミンがアジピン酸と塩を形成することが可能であることが必要である。リジン溶液を調製する溶媒としては、好適には水が用いられる。
本実施の形態では、リジンの酵素的脱炭酸反応において、アジピン酸等のジカルボン酸を使用することにより、ポリアミドの単量体成分としてペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を直接採取することができる。以下、酸としてアジピン酸を用いて、リジンの酵素的脱炭酸反応により、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を製造する方法について説明する。
原料として用いるリジンは、通常、遊離塩基（リジンベース）であることが好ましい。さらに、リジンはグルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。また、リジンのアジピン酸塩を原料として用いてもよい。酵素的脱炭酸反応によりペンタメチレンジアミンを生成するリジンとして、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンが挙げられる。中でも、Ｌ−リジンが好ましい。また、リジンの形態としては、精製されたリジン、グルコースを含む合成培地を用いて生成したリジンを含む発酵液が挙げられる。但し、発酵液の場合は、酵素的脱炭酸反応により生成するペンタメチレンジアミンがアジピン酸と塩を形成することが可能であることが必要である。リジン溶液を調製する溶媒としては、好適には水が用いられる。
反応液のｐＨは、アジピン酸によって調整するため、一般に他のｐＨ調整剤や緩衝剤を用いる必要はない。但し、前記溶媒として緩衝液を用いてもよい。このような緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。但し、ペンタメチレンジアミンとアジピン酸との塩を形成させるという点からは、緩衝剤等は用いないことが好ましく、たとえ用いる場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。
リジンとして遊離リジンを用いる場合は、リジン溶液にアジピン酸を加えて酵素的脱炭酸反応に適したｐＨとなるように調整する。具体的には、ｐＨとしては、通常４以上、好ましくは５以上、より好ましくは５．５以上で、通常８以下、好ましくは７以下、より好ましくは６．５以下が挙げられる。なお、リジンとして、リジンのアジピン酸塩を用いる場合は、反応液調製時にアジピン酸を加える必要はない。以下、このように、反応液のｐＨを酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに調整することを「中和」と称す場合がある。
リジンの酵素的脱炭酸反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を添加することによって行うことができる。ＬＤＣとしては、リジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させるものであれば特に制限はない。ＬＤＣとしては、精製酵素を用いてもよく、ＬＤＣを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いてもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。また、細胞をそのまま用いてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液、及びその分画物が挙げられる。
前記微生物としては、Ｅ．ｃｏｌｉ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）等のコリネ型細菌、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等のセラチア属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特にＥ．ｃｏｌｉが好ましい。
前記微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞を用いることができる。
リジン溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応液のｐＨが前記範囲となるように、アジピン酸を反応液に添加する。アジピン酸は連続的に添加してもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して添加してもよい。反応条件は、ＬＤＣがリジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させる条件であれば特に制限されず、濃度は、通常２０℃以上、好ましくは３０℃以上、通常６０℃以下、好ましくは４０℃以下で行う。
リジン溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応液のｐＨが前記範囲となるように、アジピン酸を反応液に添加する。アジピン酸は連続的に添加してもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して添加してもよい。反応条件は、ＬＤＣがリジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させる条件であれば特に制限されず、濃度は、通常２０℃以上、好ましくは３０℃以上、通常６０℃以下、好ましくは４０℃以下で行う。
原料のリジン又はリジン・アジピン酸塩は、反応開始時に反応液に全量添加してもよく、ＬＤＣ反応の進行に応じて、分割して添加してもよい。
酵素反応は、バッチ式によって行うと、アジピン酸の添加を容易に行うことができる。また、ＬＤＣ、ＬＤＣを産生する細胞又はその処理物を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって、反応を行うこともできる。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及びアジピン酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。
酵素反応は、バッチ式によって行うと、アジピン酸の添加を容易に行うことができる。また、ＬＤＣ、ＬＤＣを産生する細胞又はその処理物を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって、反応を行うこともできる。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及びアジピン酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。
上記のようにして、リジンの酵素的脱炭酸反応によるペンタメチレンジアミン生成に伴って上昇するｐＨを、アジピン酸を用いて逐次中和することにより、酵素反応が良好に進行する。このようにして生成するペンタメチレンジアミンは、アジピン酸塩として反応液中に蓄積する。
ＬＤＣ反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、反応液から公知の方法を組み合わせることによって単離、精製することができる。例えば、反応液をオートクレーブ等により殺菌した後、遠心分離により上清を回収し、活性炭等を用いて上清を脱色し、適宜濃縮する。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、使用態様に応じて、溶液のままであってもよく、結晶であってもよい。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の結晶は、例えば、濃縮した反応液を冷却することによりペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を析出させることによって、形成させることができる。上記のようにして得られる結晶は、ペンタメチレンジアミンとアジピン酸を等モルで含んでいるため、ポリアミド製造の原料として好適であり、必要に応じて乾燥して使用することができる。
本実施の形態において、ＬＤＣ反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、晶析又は蒸留により、反応液から単離・精製することが好ましい。リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、晶析又は蒸留により反応液から単離・精製することによって、不純物として混入しているアミノ酸等の濃度を低減させることができる。また、アミノ酸のなかでも、メチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸の濃度を低減させ、これらの含硫アミノ酸に由来する硫黄含有量を低減させることができる。
ここで、本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物において、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の、ポリアミド樹脂組成物に含まれる含有量が１００重量ｐｐｍ以下、好ましくは、５０重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１０重量ｐｐｍ以下に低減させることが好ましい。重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等のモノアミノジカルボン酸；リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン等のジアミノモノカルボン酸等が挙げられる。
さらに、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の中でも、メチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸のポリアミド樹脂組成物に含まれる含有量を低減させることが好ましい。この場合、ポリアミド樹脂を得るための単量体成分であるペンタメチレンジアミンにおいて、特に、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの含有量を５重量ｐｐｍ以下、好ましくは、３重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１重量ｐｐｍ以下に低減させることが好ましい。かかるメチオニンの含有量が低減されたペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とした重縮合反応により、発酵法において混入した不純物が低減されたポリアミド樹脂が得られる。
また、本実施の形態において、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸が低減されることにより、これらの含硫アミノ酸に由来する硫黄の、ポリアミド樹脂組成物中の含有量を、１．２重量ｐｐｍ以下、好ましくは、１．１重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１．０重量ｐｐｍ以下に低減させることができる。
含硫アミノ酸に由来する硫黄の、ポリアミド樹脂組成物中の含有量を低減させることにより、硫黄の含有量が過度に多い場合と比較して、ポリアミド樹脂組成物の耐熱老化性を向上させることができる。
含硫アミノ酸に由来する硫黄の、ポリアミド樹脂組成物中の含有量を低減させることにより、硫黄の含有量が過度に多い場合と比較して、ポリアミド樹脂組成物の耐熱老化性を向上させることができる。
（晶析法）
以下に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、晶析により反応液から単離・精製する一例について説明する。
通常、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は着色しているため、晶析前に脱色することが好ましい。脱色剤としては活性炭、合成吸着剤、活性白土、シリカ、ゼオライト等が挙げられ、中でも活性炭が好ましい。
脱色後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は、窒素バブリングにより溶存酸素を追い出した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が５０重量％〜６９重量％、好ましくは６０重量％〜６７重量％まで濃縮する。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が過度に小さいと、晶析後の収率が低下し、過度に大きいと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に混入するアミノ酸等の不純物濃度が高くなる傾向がある。
以下に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、晶析により反応液から単離・精製する一例について説明する。
通常、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は着色しているため、晶析前に脱色することが好ましい。脱色剤としては活性炭、合成吸着剤、活性白土、シリカ、ゼオライト等が挙げられ、中でも活性炭が好ましい。
脱色後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は、窒素バブリングにより溶存酸素を追い出した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が５０重量％〜６９重量％、好ましくは６０重量％〜６７重量％まで濃縮する。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が過度に小さいと、晶析後の収率が低下し、過度に大きいと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に混入するアミノ酸等の不純物濃度が高くなる傾向がある。
濃縮は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の温度５０℃〜７０℃、減圧度１５０Ｔｏｒｒ以下で行うのが好ましい。温度が過度に低いと、濃縮時間が長くなり、温度が過度に高いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩が分解するので好ましくない。また、減圧度が１５０Ｔｏｒｒを超えると濃縮時間が長くなるので好ましくない。
晶析は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を冷却してペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を析出させて行われる。種晶の添加は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を冷却する降温途中で行うことが好ましい。種晶は、析出するペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩が好ましい。但し、種晶としての効果が得られればそれに限定されない。
冷却時の降温速度は、通常１℃／ｈｒ以上、好ましくは２℃／ｈｒ以上、さらに好ましくは３℃／ｈｒ以上、又通常３０℃／ｈｒ以下、好ましくは２０℃／ｈｒ以下、さらに好ましくは１０℃／ｈｒ以下である。降温速度が過度に遅いと、晶析に長時間を要する。降温速度が過度に早いと、結晶サイズが小さくなる傾向にあり、精製度合いが低下する方向であり好ましくない。
晶析終了温度は、通常１℃以上、好ましくは５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上、又通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下、さらに好ましくは２０℃以下である。晶析終了温度が過度に高いと、収率が低下する傾向がある。晶析終了温度が過度に低いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを移送時に配管が閉塞しやすくなるので好ましくない。
晶析率は、濃縮液のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度と晶析終了温度により適宜決定される。通常、晶析率は１重量％以上、好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは１０重量％以上、又通常４６重量％以下、好ましくは３９重量％以下、さらに好ましくは３５重量％以下に制御することが好ましい。晶析率が過度に低いと、収率が低下する傾向がある。晶析率が過度に高いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に混入する不純物濃度が高くなる傾向がある。
晶析後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーは、常法に従い、固液分離して結晶として得られる。例えば、遠心濾過を行う場合は、母液を振り切った後に、遠心濾過器が回転している状態で少量の脱塩水をシャワー状にふりかけ、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に付着している母液をさらに洗い流すと精製度が上がり好ましい。
脱塩水量は、ｗｅｔケーキ（若干の水を含んだペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩）に対して、通常１重量％以上、好ましくは５重量％以上、又通常４０重量％以下、好ましくは３０重量％以下である。脱塩水量が過度に少ないと、洗浄効果が小さくなる傾向がある。脱塩水量が過度に多いと、収率が低下する傾向がある。このようにして得られた結晶を１番晶と称する。
脱塩水量は、ｗｅｔケーキ（若干の水を含んだペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩）に対して、通常１重量％以上、好ましくは５重量％以上、又通常４０重量％以下、好ましくは３０重量％以下である。脱塩水量が過度に少ないと、洗浄効果が小さくなる傾向がある。脱塩水量が過度に多いと、収率が低下する傾向がある。このようにして得られた結晶を１番晶と称する。
固液分離後の母液や洗浄液は回収して、再度、濃縮、晶析、固液分離を行い、２番晶を得る。同様にして、３番晶、４番晶等を得ることができる。
前述した１番晶を１回晶析品とすると、これを再度脱塩水に溶解し、濃縮、晶析、ふりかけ洗浄及び固液分離を行うことにより、より精製度の高い２回晶析品を得ることができる。同様にして、さらに精製度の高い３回晶析品、４回晶析品も得ることができる。
前述した１番晶を１回晶析品とすると、これを再度脱塩水に溶解し、濃縮、晶析、ふりかけ洗浄及び固液分離を行うことにより、より精製度の高い２回晶析品を得ることができる。同様にして、さらに精製度の高い３回晶析品、４回晶析品も得ることができる。
（蒸留）
次に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を、蒸留により反応液から単離・精製する一例について説明する。
本実施の形態では、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液にアルカリを添加・混合してペンタメチレンジアミンを遊離させ、その後、（１）溶媒で抽出した上で蒸留する方法、（２）そのまま蒸留する方法、が挙げられる。
（１）の方法の具体例としては、例えば、特開２００４−０００１１４号公報に記載された方法が挙げられる。また、（２）の方法を用いる場合は、蒸留に先立って脱水蒸留を行い、アジピン酸のアルカリ塩を析出・分離しておくことが好ましい。
次に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を、蒸留により反応液から単離・精製する一例について説明する。
本実施の形態では、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液にアルカリを添加・混合してペンタメチレンジアミンを遊離させ、その後、（１）溶媒で抽出した上で蒸留する方法、（２）そのまま蒸留する方法、が挙げられる。
（１）の方法の具体例としては、例えば、特開２００４−０００１１４号公報に記載された方法が挙げられる。また、（２）の方法を用いる場合は、蒸留に先立って脱水蒸留を行い、アジピン酸のアルカリ塩を析出・分離しておくことが好ましい。
（ジカルボン酸）
次に、本実施の形態において、ポリアミド樹脂を得るために使用する単量体成分としてのジカルボン酸の具体例は、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸が挙げられる。これらの中でも、アジピン酸が好ましい。また、ジカルボン酸としてアジピン酸を用いる場合、ジカルボン酸中のアジピン酸の濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
次に、本実施の形態において、ポリアミド樹脂を得るために使用する単量体成分としてのジカルボン酸の具体例は、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸が挙げられる。これらの中でも、アジピン酸が好ましい。また、ジカルボン酸としてアジピン酸を用いる場合、ジカルボン酸中のアジピン酸の濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
さらに、本発明により得られる効果を損なわない程度において、他の単量体成分を用いることができる。このような他の単量体成分としては、例えば、６−アミノカプロン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、パラアミノメチル安息香酸等のアミノ酸；ε−カプロラクタム、ω−ラウロラクタム等のラクタム；シクロヘキサンジアミン、ビス−（４−アミノヘキシル）メタン等の脂環式ジアミン；キシリレンジアミン等の芳香族ジアミンが挙げられる。
（重縮合方法）
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することが出来る。重縮合方法の一例としては、例えば、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を含む水溶液を高温高圧下で、脱水反応を進行させる加熱重縮合法；脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を加圧加熱下で重縮合して得られた低次縮合物（オリゴマー）を高分子量化する方法；脂肪族ジアミンを溶解した水溶液と、ジカルボン酸塩を水性溶媒又は有機溶媒に溶解させた溶液とを接触させ、これらの界面で重縮合反応させる界面重縮合法等が挙げられる。
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することが出来る。重縮合方法の一例としては、例えば、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を含む水溶液を高温高圧下で、脱水反応を進行させる加熱重縮合法；脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を加圧加熱下で重縮合して得られた低次縮合物（オリゴマー）を高分子量化する方法；脂肪族ジアミンを溶解した水溶液と、ジカルボン酸塩を水性溶媒又は有機溶媒に溶解させた溶液とを接触させ、これらの界面で重縮合反応させる界面重縮合法等が挙げられる。
本実施の形態では、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合方法としては、化学工業的な観点から加熱重縮合法が好ましい。加熱重縮合法により脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合する場合、脂肪族ジアミンとジカルボン酸とを反応させたジカルボン酸塩を調製し、脱塩水の存在下でこのジカルボン酸塩を加熱し、脱水反応を進行させる方法が好ましい。この方法で得られたポリアミドは、加熱重縮合後、さらに固相重縮合することによって、分子量を上昇させることが可能である。固相重縮合は、例えば、１００℃〜当該樹脂の融点の温度範囲で、真空中又は不活性ガス中で加熱することにより行われる。
（重縮合触媒）
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応は、重縮合触媒として下記式（１）で表される燐含有化合物と脱塩水とを用いて行われることが好ましい。
ＭｘＨｙＰＯｚ 式（１）
（但し、式（１）中、Ｍは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である。Ｘ及びＹは、式（１）の化合物が全体として電気的に中性となり、かつ、Ｘ＋Ｙ＝３を満たす０〜３の整数である。Ｚは２〜４の整数である。）
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応は、重縮合触媒として下記式（１）で表される燐含有化合物と脱塩水とを用いて行われることが好ましい。
ＭｘＨｙＰＯｚ 式（１）
（但し、式（１）中、Ｍは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である。Ｘ及びＹは、式（１）の化合物が全体として電気的に中性となり、かつ、Ｘ＋Ｙ＝３を満たす０〜３の整数である。Ｚは２〜４の整数である。）
式（１）で表される燐含有化合物としては、燐酸水素塩類が好ましい。また、燐含有化合物として、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が含まれる。
また、燐酸種としては、正燐酸、亜燐酸または次亜燐酸が挙げられる。
また、燐酸種としては、正燐酸、亜燐酸または次亜燐酸が挙げられる。
本実施の形態において、式（１）で表される燐含有化合物の中でも、ナトリウム塩が最も好ましい。具体例としては、例えば、亜燐酸１水素２ナトリウム塩５水和物（Ｎａ２ＨＰＯ３）、亜燐酸２水素１ナトリウム塩２．５水和物（ＮａＨ２ＰＯ３）等が挙げられる。
さらに、ナトリウム塩の場合、（Ｎａ原子数）／（Ｐ原子数）が０．１以上が好ましく、１以上がより好ましく、２以上が特に好ましい。具体的には、Ｘ＝１又は２、Ｙ＝２又は１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩が好ましく、中でもＸ＝２、Ｙ＝１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩がより好ましく、特に、Ｎａ２ＨＰＯ３が最も好ましい。
さらに、ナトリウム塩の場合、（Ｎａ原子数）／（Ｐ原子数）が０．１以上が好ましく、１以上がより好ましく、２以上が特に好ましい。具体的には、Ｘ＝１又は２、Ｙ＝２又は１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩が好ましく、中でもＸ＝２、Ｙ＝１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩がより好ましく、特に、Ｎａ２ＨＰＯ３が最も好ましい。
重縮合触媒として使用される式（１）で表される燐含有化合物の使用量は、単量体成分の総重量に対し、燐原子換算で１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍ、好ましくは５重量ｐｐｍ〜５０重量ｐｐｍ（以下、ｗｔ−ｐｐｍと記すことがある。）である。燐含有化合物の使用量が過度に少ないと、重縮合反応が促進しない傾向がある。燐含有化合物の使用量が過度に多いと、得られるポリアミド樹脂の強度や透明性が損なわれる傾向がある。
また、式（１）で表される燐含有化合物と併せて使用する脱塩水の使用量は、通常、単量体成分に対し、１重量％〜２００重量％、好ましくは５０重量％〜１５０重量％の割合である。脱塩水の使用量が過度に少ない場合、及び過度に多い場合、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応における反応速度が低下することがある。
また、式（１）で表される燐含有化合物と併せて使用する脱塩水の使用量は、通常、単量体成分に対し、１重量％〜２００重量％、好ましくは５０重量％〜１５０重量％の割合である。脱塩水の使用量が過度に少ない場合、及び過度に多い場合、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応における反応速度が低下することがある。
本実施の形態において、式（１）で表される燐含有化合物を含む重縮合触媒を使用して脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合することにより、得られたポリアミド樹脂中に、式（１）で表される燐含有化合物に由来する燐化合物が含まれる。
かかるポリアミド樹脂における、式（１）で表される燐含有化合物に由来する燐化合物の含有量は、燐原子換算で１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍ、好ましくは、３重量ｐｐｍ〜５０重量ｐｐｍの範囲である。
このように、式（１）で表される燐含有化合物を含む重縮合触媒を使用して脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合することにより、得られたポリアミド樹脂の耐衝撃性を向上させることができる。
かかるポリアミド樹脂における、式（１）で表される燐含有化合物に由来する燐化合物の含有量は、燐原子換算で１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍ、好ましくは、３重量ｐｐｍ〜５０重量ｐｐｍの範囲である。
このように、式（１）で表される燐含有化合物を含む重縮合触媒を使用して脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合することにより、得られたポリアミド樹脂の耐衝撃性を向上させることができる。
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合により得られるポリアミドの分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択される。実用性の観点から、通常、ポリアミドの２５℃における９８％硫酸溶液（ポリアミド濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）の相対粘度の下限が、通常１．５以上、好ましくは１．８以上、特に好ましくは２．２以上であり、上限は、通常８．０以下、好ましくは５．０以下、特に好ましくは３．５以下である。相対粘度が過度に小さいと実用的強度が得られない傾向がある。相対粘度が過度に大きいと、ポリアミドの流動性が低下し、成形加工性が損なわれる傾向がある。
（ポリアミド樹脂組成物）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物には、熱安定剤としてハロゲン化第一銅が含まれる。
ここで、ハロゲン化第一銅としては、例えば、ヨウ化第一銅、臭化第一銅、塩化第一銅等が挙げられる。これらの中でも、ポリアミド樹脂の熱安定性の点で、ヨウ化第一銅、塩化第一銅が好ましい。ハロゲン化第一銅は、それぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ポリアミド樹脂組成物に配合されるハロゲン化第一銅の配合量は、銅原子に換算した含有量として、通常５重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０重量ｐｐｍ以上、特に好ましくは８０重量ｐｐｍ以上であり、上限は、通常５００重量ｐｐｍ以下、好ましくは３００重量ｐｐｍ以下、特に好ましくは１５０重量ｐｐｍ以下である。
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物には、熱安定剤としてハロゲン化第一銅が含まれる。
ここで、ハロゲン化第一銅としては、例えば、ヨウ化第一銅、臭化第一銅、塩化第一銅等が挙げられる。これらの中でも、ポリアミド樹脂の熱安定性の点で、ヨウ化第一銅、塩化第一銅が好ましい。ハロゲン化第一銅は、それぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ポリアミド樹脂組成物に配合されるハロゲン化第一銅の配合量は、銅原子に換算した含有量として、通常５重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０重量ｐｐｍ以上、特に好ましくは８０重量ｐｐｍ以上であり、上限は、通常５００重量ｐｐｍ以下、好ましくは３００重量ｐｐｍ以下、特に好ましくは１５０重量ｐｐｍ以下である。
ここで、ポリアミド樹脂組成物に配合されるハロゲン化第一銅の配合量は、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えるように、好ましくは、４０以上、さらに好ましくは５０以上となるようにポリアミド樹脂組成物に配合されることが好ましい。
銅含有量が過度に少ないと、耐熱老化性が低下する傾向がある。
銅含有量が過度に少ないと、耐熱老化性が低下する傾向がある。
また、本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物は、上記ハロゲン化第一銅に加え、ハロゲン化アルカリ金属塩を含むことにより、耐熱老化性がさらに向上する。
ハロゲン化アルカリ金属塩としては、例えば、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。これらの中でも、ヨウ化カリウムの使用が好ましい。ハロゲン化アルカリ金属塩はそれぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ハロゲン化アルカリ金属塩の配合量は、下限が、通常０．０１重量％以上、好ましくは０．０５重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上であり、上限は、通常、１重量％以下、好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．２重量以下である。
ハロゲン化アルカリ金属塩としては、例えば、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。これらの中でも、ヨウ化カリウムの使用が好ましい。ハロゲン化アルカリ金属塩はそれぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ハロゲン化アルカリ金属塩の配合量は、下限が、通常０．０１重量％以上、好ましくは０．０５重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上であり、上限は、通常、１重量％以下、好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．２重量以下である。
（強化材）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物に強化材を配合することにより、ポリアミド樹脂組成物の実用的強度をさらに向上させることができる。
強化材の配合量は、ポリアミド樹脂１００重量部に対し、下限は、通常５重量部以上、好ましくは２０重量部以上、特に好ましくは４０重量部以上であり、上限は、通常１５０重量部以下、好ましくは１２０重量部以下、特に好ましくは１００重量部以下である。強化材の配合量が過度に多いと、ポリアミド樹脂組成物の流動性が低下する傾向がある。
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物に強化材を配合することにより、ポリアミド樹脂組成物の実用的強度をさらに向上させることができる。
強化材の配合量は、ポリアミド樹脂１００重量部に対し、下限は、通常５重量部以上、好ましくは２０重量部以上、特に好ましくは４０重量部以上であり、上限は、通常１５０重量部以下、好ましくは１２０重量部以下、特に好ましくは１００重量部以下である。強化材の配合量が過度に多いと、ポリアミド樹脂組成物の流動性が低下する傾向がある。
このような強化材としては、例えば、ガラス繊維、ガラスフレーク、炭素繊維、窒化硼素、チタン酸カリウム、硼酸アルミニウム、が挙げられる。これらの中でも、補強効果が高いガラス繊維が好ましい。
ガラス繊維としては、通常、熱可塑性樹脂に配合される公知のガラス繊維が使用でき、なかでも、Ｅガラス（無アルカリガラス）から製造されるチョップドストランドが好ましい。ガラス繊維の繊維径は、通常、１μｍ〜２０μｍ、好ましくは、５μｍ〜１５μｍである。また、ガラス繊維は、ポリアミド樹脂との接着性を向上させるために、シランカップリング剤等により表面処理されていることが好ましい。
（添加剤）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂には、必要に応じて、各種の添加剤が配合される。添加剤としては、例えば、酸化防止剤、耐候剤、離型剤、滑剤、顔料、染料、結晶核剤、可塑剤、帯電防止剤、難燃剤、充填剤、他の重縮合体等が挙げられる。
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂には、必要に応じて、各種の添加剤が配合される。添加剤としては、例えば、酸化防止剤、耐候剤、離型剤、滑剤、顔料、染料、結晶核剤、可塑剤、帯電防止剤、難燃剤、充填剤、他の重縮合体等が挙げられる。
具体的には、酸化防止剤又は熱安定剤としては、ヒンダードフェノール系化合物、ヒドロキノン系化合物、ホスファイト系化合物及びこれらの置換体等が挙げられる。耐候剤としては、レゾルシノール系化合物、サリシレート系化合物、ベンゾトリアゾール系化合物、ベンゾフェノン系化合物、ヒンダードアミン系化合物等が挙げられる。離型剤又は滑剤としては、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族ビスアミド、ビス尿素、ポリエチレンワックス等が挙げられる。顔料としては、硫化カドミウム、フタロシアニン、カーボンブラック等が挙げられる。染料としては、ニグロシン、アニリンブラック等が挙げられる。結晶核剤としては、タルク、シリカ、カオリン、クレー等が挙げられる。可塑剤としては、ｐ−オキシ安息香酸オクチル、Ｎ−ブチルベンゼンスルホンアミド等が挙げられる。
帯電防止剤としては、アルキルサルフェート型アニオン系帯電防止剤、４級アンモニウム塩型カチオン系帯電防止剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等の非イオン系帯電防止剤、ベタイン系両性帯電防止剤等が挙げられる。難燃剤としては、メラミンシアヌレート、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の水酸化物、ポリリン酸アンモニウム、臭素化ポリスチレン、臭素化ポリフェニレンオキシド、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂あるいはこれらの臭素系難燃剤と三酸化アンチモンとの組み合わせ等が挙げられる。充填剤としては、グラファイト、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化アンチモン、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化鉄、硫化亜鉛、亜鉛、鉛、ニッケル、アルミニウム、銅、鉄、ステンレス、ベントナイト、モンモリロナイト、合成雲母等の粒子状、針状、板状充填材が挙げられる。他の重合体としては、他のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、液晶ポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ＡＢＳ樹脂、ＳＡＮ樹脂、ポリスチレン等が挙げられる。これらは、ポリアミド樹脂を製造する工程において、添加量、添加工程等が適宜選択され、添加すればよい。
本実施の形態において、ポリアミド樹脂の重縮合から成形までの任意の段階で、ポリアミド樹脂組成物に添加剤、強化材を配合することができる。中でも、ポリアミド樹脂と添加剤、強化材とを押出機中に投入し、これらを溶融混練することにより、ポリアミド樹脂組成物を調製することが好ましい。
また、本実施の形態のポリアミド樹脂は、射出成形、フィルム成形、溶融紡糸、ブロー成形、真空成形等の任意の成形方法により、所望の形状に成形することができる。成形品としては、例えば、射出成形品、フィルム、シート、フィラメント、テーパードフィラメント、繊維等が挙げられる。また、ポリアミド樹脂は、接着剤、塗料等にも使用することができる。
さらに、本実施の形態のポリアミド樹脂の具体的な用途例としては、自動車・車両関連部品として、例えば、インテークマニホールド、ヒンジ付きクリップ（ヒンジ付き成形品）、結束バンド、レゾネーター、エアークリーナー、エンジンカバー、ロッカーカバー、シリンダーヘッドカバー、タイミングベルトカバー、ガソリンタンク、ガソリンサブタンク、ラジエータータンク、インタークーラータンク、オイルリザーバータンク、オイルパン、電動パワステギヤ、オイルストレーナー、キャニスター、エンジンマウント、ジャンクションブロック、リレーブロック、コネクター、コルゲートチューブ、プロテクター等の自動車用アンダーフード部品；ドアハンドル、フェンダー、フードバルジ、ルーフレールレグ、ドアミラーステー、バンパー、スポイラー、ホイールカバー等の自動車用外装部品；カップホルダー、コンソールボックス、アクセルペダル、クラッチペダル、シフトレバー台座、シフトレバーノブ等の自動車用内装部品が挙げられる。
また、本実施の形態のポリアミド樹脂は、釣り糸、漁網等の漁業関連資材、スイッチ類、超小型スライドスイッチ、ＤＩＰスイッチ、スイッチのハウジング、ランプソケット、結束バンド、コネクタ、コネクタのハウジング、コネクタのシェル、ＩＣソケット類、コイルボビン、ボビンカバー、リレー、リレーボックス、コンデンサーケース、モーターの内部部品、小型モーターケース、ギヤ・カム、ダンシングプーリー、スペーサー、インシュレーター、キャスター、端子台、電動工具のハウジング、スターターの絶縁部分、ヒューズボックス、ターミナルのハウジング、ベアリングリテーナー、スピーカー振動板、耐熱容器、電子レンジ部品、炊飯器部品、プリンタリボンガイド等に代表される電気・電子関連部品、家庭・事務電気製品部品、コンピューター関連部品、ファクシミリ・複写機関連部品、機械関連部品等各種用途に使用することができる。
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例および比較例において使用したポリアミド樹脂とその単量体成分、ポリアミド樹脂組成物の評価方法は以下の通りである。
実施例および比較例において使用したポリアミド樹脂とその単量体成分、ポリアミド樹脂組成物の評価方法は以下の通りである。
（１）ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量
重縮合反応に使用する単量体成分であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量は、アミノ酸分析計（株式会社日立製作所製Ｌ−８９００）を用いて測定した。
先ず、試料を水に溶かし所定の濃度の水溶液とし分析試料とした。分析条件は、生体アミノ酸分離条件、分析法はニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ、４４０ｎｍ）とした。標準品には、アミノ酸混合液（和光純薬工業株式会社製ＡＮＩＩ型及びＢ型）を希釈したものを用い、試料注入量は１０μＬとした。定量計算として、Ｐｒｏは４４０ｎｍ、他のアミノ酸は５７０ｎｍのピーク面積から一点外部標準法にてアミノ酸の含有量を算出した（単位：重量ｐｐｍ）。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄の含有量は、得られた含硫アミノ酸の測定値に基づき算出した（単位：重量ｐｐｍ）。
重縮合反応に使用する単量体成分であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量は、アミノ酸分析計（株式会社日立製作所製Ｌ−８９００）を用いて測定した。
先ず、試料を水に溶かし所定の濃度の水溶液とし分析試料とした。分析条件は、生体アミノ酸分離条件、分析法はニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ、４４０ｎｍ）とした。標準品には、アミノ酸混合液（和光純薬工業株式会社製ＡＮＩＩ型及びＢ型）を希釈したものを用い、試料注入量は１０μＬとした。定量計算として、Ｐｒｏは４４０ｎｍ、他のアミノ酸は５７０ｎｍのピーク面積から一点外部標準法にてアミノ酸の含有量を算出した（単位：重量ｐｐｍ）。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄の含有量は、得られた含硫アミノ酸の測定値に基づき算出した（単位：重量ｐｐｍ）。
（２）相対粘度（ηｒ）
ポリアミド樹脂の相対粘度（ηｒ）は、ポリアミド樹脂の９８％硫酸溶液（濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）を調製し、２５℃で、オストワルド式粘度計を使用して測定した（単位：ｄｌ／ｇ）。
ポリアミド樹脂の相対粘度（ηｒ）は、ポリアミド樹脂の９８％硫酸溶液（濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）を調製し、２５℃で、オストワルド式粘度計を使用して測定した（単位：ｄｌ／ｇ）。
（３）燐化合物の含有量の分析
ポリアミド樹脂に含まれる燐化合物の含有量は、ポリアミド樹脂を、硫酸−硝酸で湿式分解し、その後、ＩＣＰ質量分析法により測定した燐原子量として求めた（単位：重量ｐｐｍ）。
ポリアミド樹脂に含まれる燐化合物の含有量は、ポリアミド樹脂を、硫酸−硝酸で湿式分解し、その後、ＩＣＰ質量分析法により測定した燐原子量として求めた（単位：重量ｐｐｍ）。
（４）ポリアミド樹脂組成物の調製
燐含有化合物を含む重縮合触媒を用いたペンタメチレンジアミン及びアジピン酸の重縮合により調製したポリアミド樹脂に、後述する表１に示す組成で、塩化第１銅（関東化学株式会社製）、ガラス繊維（日本電気硝子株式会社製Ｔ２４９Ｈ）を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
ポリアミド樹脂組成物の調製には、二軸混練機（東芝機械株式会社製：ＴＥＭ−３５Ｂ型二軸混練機）を用いた。設定温度は、実施例１、実施例３及び比較例１は２７０℃であり、実施例２、実施例４及び比較例２は２８０℃である。尚、ガラス繊維は折損抑制のためサイドフィードした。
燐含有化合物を含む重縮合触媒を用いたペンタメチレンジアミン及びアジピン酸の重縮合により調製したポリアミド樹脂に、後述する表１に示す組成で、塩化第１銅（関東化学株式会社製）、ガラス繊維（日本電気硝子株式会社製Ｔ２４９Ｈ）を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
ポリアミド樹脂組成物の調製には、二軸混練機（東芝機械株式会社製：ＴＥＭ−３５Ｂ型二軸混練機）を用いた。設定温度は、実施例１、実施例３及び比較例１は２７０℃であり、実施例２、実施例４及び比較例２は２８０℃である。尚、ガラス繊維は折損抑制のためサイドフィードした。
（５）耐熱老化試験
後述する表１に示す配合組成のポリアミド樹脂組成物を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、射出成形機（日本製鋼所株式会社社製：Ｊ７５ＥＩＩ型射出成形機）を使用してＩＳＯ試験片を成形した。
ガラス繊維を配合した実施例２、実施例４及び比較例２の場合、射出成形機の樹脂温度は２７０℃、金型温度は８０℃である。ガラス繊維を配合しない実施例１、実施例３及び比較例１の場合は、射出成形機の樹脂温度は２６５℃、金型温度は８０℃である。
得られたＩＳＯ試験片を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さの、放置前の試験片の引張り強さに対する割合を求めた。数値が大きいほど、耐熱老化性が良好である（単位：％）。
後述する表１に示す配合組成のポリアミド樹脂組成物を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、射出成形機（日本製鋼所株式会社社製：Ｊ７５ＥＩＩ型射出成形機）を使用してＩＳＯ試験片を成形した。
ガラス繊維を配合した実施例２、実施例４及び比較例２の場合、射出成形機の樹脂温度は２７０℃、金型温度は８０℃である。ガラス繊維を配合しない実施例１、実施例３及び比較例１の場合は、射出成形機の樹脂温度は２６５℃、金型温度は８０℃である。
得られたＩＳＯ試験片を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さの、放置前の試験片の引張り強さに対する割合を求めた。数値が大きいほど、耐熱老化性が良好である（単位：％）。
（アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼへの変異導入株ＡＬ２作製）
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ｌに溶解］１０ｍｌに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ｌに溶解］１０ｍｌに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
（反応液組成）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
鋳型ＤＮＡ１μｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造株式会社製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造株式会社：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造株式会社製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造株式会社製）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造株式会社：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造株式会社製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造株式会社製）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造株式会社製）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造株式会社：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．１μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造株式会社：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．１μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ株式会社製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造株式会社製）により５’末端をリン酸化した。
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、構造に間違いないと判断し、当該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。構築したｐＫＭＢ１を制限酵素ＳａｌＩで切断して得られた約４．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造株式会社製）により両末端を平滑化した後、ＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを含むリンカー（配列番号５）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＶで切断し、再び上記方法により連結し、このプラスミドをｐＫＭＢ３と命名した。
（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアスパルトキナーゼ遺伝子変異株の作製）
＜コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株アスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）株のアスパルトキナーゼ遺伝子（以下ｌｙｓＣ）の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号６および配列番号７）を用いたＰＣＲによって行った。
＜コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株アスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）株のアスパルトキナーゼ遺伝子（以下ｌｙｓＣ）の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号６および配列番号７）を用いたＰＣＲによって行った。
なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌおよびＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン株式会社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調整した。また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、６８℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。ただし、１サイクル目は９４℃で１分２０秒の保温を行った。
得られたｌｙｓＣ遺伝子のＤＮＡ断片はフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製を行い、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績株式会社製）を用いてゲルから回収した。
このＤＮＡ断片を、大腸菌ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（宝酒造株式会社製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを用いてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５および配列番号１６）によるコロニーＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡは、コロニーを５０μｌの滅菌水に研濁した後、５分間煮沸処理した上清とした。
（反応液組成）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ 各々プライマー、０．２μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
鋳型ＤＮＡ１μｌ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ 各々プライマー、０．２μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。
（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は４分とした。
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は４分とした。
これにより１２８６ｂｐのＰＣＲ増幅産物を得る株を選抜し、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ｌｙｓＣ挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデルＡＢＩ３１３０ｘｌ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ．３を用いて確認した。
＜ＡＴＣＣ１３０３２株アスパルトキナーゼ遺伝子変異導入用プラスミドの構築＞
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｌｙｓＣ遺伝子の９３１番目から９３３番目のＡＣＣ（Ｔｈｒ）をＡＴＣ（Ｉｌｅ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。遺伝子前半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８および配列番号９）および後半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１０および配列番号１１）を合成し、増幅断片を鋳型としてＰＣＲを行った。
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｌｙｓＣ遺伝子の９３１番目から９３３番目のＡＣＣ（Ｔｈｒ）をＡＴＣ（Ｉｌｅ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。遺伝子前半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８および配列番号９）および後半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１０および配列番号１１）を合成し、増幅断片を鋳型としてＰＣＲを行った。
得られた断片をエタノール沈殿によって精製し、これを鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８および配列番号１１）によって増幅させた。この断片を１．０％アガロース電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色を用いて可視化することによりｌｙｓＣ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ゲルから切り出してキットにより精製した。回収した断片はリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製の後、プラスミドベクターｐＫＭＢ１に制限酵素ＳａｃＩ、ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
このようにして得られた変異導入用プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ５α）を塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドをシークエンス解析により、１２８６ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉと命名した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドをシークエンス解析により、１２８６ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉと命名した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。
＜アスパルトキナーゼ遺伝子変異株の作製＞
ＡＴＣＣ１３０３２株にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
ＡＴＣＣ１３０３２株にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１ＩがＡＴＣＣ１３０３２株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｙｓＣ遺伝子とＡＴＣＣ１３０３２株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。その結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を約３０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｙｓＣ遺伝子がｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｌｙｓＣ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Ｌ−リジンとＬ−スレオニンによる協奏的フィードバック阻害が解除されたことによるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を指標に選択し、得られた変異株をＡＬ１と命名した。
この様にして得られた株の中には、そのｌｙｓＣ遺伝子がｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｌｙｓＣ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Ｌ−リジンとＬ−スレオニンによる協奏的フィードバック阻害が解除されたことによるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を指標に選択し、得られた変異株をＡＬ１と命名した。
（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＬ１のｈｏｍ遺伝子変異株の作製）
＜ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下ｈｏｍ）遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）ＡＴＣＣ１３０３２株のホモセリン脱水素酵素（以下ｈｏｍ）遺伝子の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１２および配列番号１３）を用いたＰＣＲによって行った。
＜ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下ｈｏｍ）遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）ＡＴＣＣ１３０３２株のホモセリン脱水素酵素（以下ｈｏｍ）遺伝子の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１２および配列番号１３）を用いたＰＣＲによって行った。
なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌおよびＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調整した。また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９８℃で５秒、６８℃で２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の前に９４℃で１分、最終サイクルの後に７２℃で３分の保温を行った。
＜ｈｏｍ遺伝子変異導入用プラスミドの構築＞
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｈｏｍ遺伝子配列の１７５番目から１７７番目の配列をＧＴＴ（Ｖａｌ）からＧＣＴ（Ａｌａ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｈｏｍ遺伝子配列の１７５番目から１７７番目の配列をＧＴＴ（Ｖａｌ）からＧＣＴ（Ａｌａ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。
遺伝子前半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２および配列番号１４）および後半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５および配列番号１３）を合成し、増幅断片を鋳型としてＰＣＲを行った。得られた断片をエタノール沈殿によって精製し、これを鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２および配列番号１５）によって増幅させた。
この断片を１．０％アガロース電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色を用いて可視化することによりｈｏｍ遺伝子を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ゲルから切り出してキットにより精製した。回収した断片はリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製の後、プラスミドベクターｐＫＭＢ３に制限酵素ＥｃｏＲＶで切断したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
このようにして得られた変異導入用プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ５α）を塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドをシークエンス解析により、約１．０ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９と命名した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。
＜ｈｏｍ遺伝子変異株の作製＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＬ１株にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＬ１株にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９がＡＴＣＣ１３０３２株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｈｏｍ遺伝子とＡＴＣＣ１３０３２株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を約３個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｈｏｍ遺伝子がｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｈｏｍ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、変異導入箇所増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー（配列１６および配列１７）およびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅを用いた融解曲線分析（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社製ライトサイクラー１．５）による変異検出によって行った。この結果Ｖ５９Ａ変異が導入されたｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ組換え体であることが確認された。こうして得られた変異株をＡＬ２と命名した。
この様にして得られた株の中には、そのｈｏｍ遺伝子がｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｈｏｍ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、変異導入箇所増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー（配列１６および配列１７）およびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅを用いた融解曲線分析（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社製ライトサイクラー１．５）による変異検出によって行った。この結果Ｖ５９Ａ変異が導入されたｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ組換え体であることが確認された。こうして得られた変異株をＡＬ２と命名した。
［リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製］
次いで、後述するカダベリン塩酸塩水溶液の調製に用いるリジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株の作製手順について説明する。
次いで、後述するカダベリン塩酸塩水溶液の調製に用いるリジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株の作製手順について説明する。
＜大腸菌ＤＮＡ抽出＞
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、大腸菌ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）水溶液０．１５ｍｌに懸濁した。
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、大腸菌ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）水溶液０．１５ｍｌに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時間保温した。更に、ドデシル硫酸ナトリウムを、最終濃度が０．５％になるように加え、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を加え、室温で１０分間緩やかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０℃〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように加えた後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、後述のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。
＜ｃａｄＡのクローニング＞
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記手順で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（下記の配列番号１８及び配列番号１９で表わされる配列からなるＤＮＡ）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なった。
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記手順で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（下記の配列番号１８及び配列番号１９で表わされる配列からなるＤＮＡ）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なった。
なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌ及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調製した。
また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。
ＰＣＲの終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断した。得られたＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離した後、臭化エチジウム染色を用いて可視化することにより、ｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行なった。
回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社製）を制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及び５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。
＜ｃａｄＡ増幅株の培養＞
上記手順により得られた大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地入り５００ｍｌ容フラスコ１本で前培養した後、１０ｍｌの培養液を２００ｍｌの２倍濃度ＬＢ培地が入った１ｌ容フラスコに接種し、温度３５℃、通気なし（０ｖｖｍ）、振とう回転数１６０ｒｐｍの条件下で培養を行なった。培養４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように加え、その後１４時間培養を継続した。
次に、６０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離を行い培養液からの菌体回収を行なった。この湿菌体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液に懸濁して保存、または、後述のリジン脱炭酸反応に使用した。
上記手順により得られた大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地入り５００ｍｌ容フラスコ１本で前培養した後、１０ｍｌの培養液を２００ｍｌの２倍濃度ＬＢ培地が入った１ｌ容フラスコに接種し、温度３５℃、通気なし（０ｖｖｍ）、振とう回転数１６０ｒｐｍの条件下で培養を行なった。培養４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように加え、その後１４時間培養を継続した。
次に、６０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離を行い培養液からの菌体回収を行なった。この湿菌体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液に懸濁して保存、または、後述のリジン脱炭酸反応に使用した。
（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の作成）
＜コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株によるリジンの発酵生産＞
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株を、滅菌ＬＢ培地を２００ｍｌ含む１Ｌ容フラスコ５本に１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前々培養液（計１Ｌ）を得た。この前々培養液の全量を、９９ＬのＬＰＧ１培地（表１参照）を入れた全容２００Ｌの培養タンクに植菌し、３０℃、ｐＨ７．２、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気、撹拌回転数はＤＯが３ｐｐｍ以上になるように可変させて６時間培養した。この全量を、２．５ｍ３のＬＰＧ培地を含む全容５ｍ３の発酵槽に無菌的に移送し、滅菌空気を１ｖｖｍで通気、３０℃で培養を開始した。
＜コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株によるリジンの発酵生産＞
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株を、滅菌ＬＢ培地を２００ｍｌ含む１Ｌ容フラスコ５本に１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前々培養液（計１Ｌ）を得た。この前々培養液の全量を、９９ＬのＬＰＧ１培地（表１参照）を入れた全容２００Ｌの培養タンクに植菌し、３０℃、ｐＨ７．２、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気、撹拌回転数はＤＯが３ｐｐｍ以上になるように可変させて６時間培養した。この全量を、２．５ｍ３のＬＰＧ培地を含む全容５ｍ３の発酵槽に無菌的に移送し、滅菌空気を１ｖｖｍで通気、３０℃で培養を開始した。
ｐＨは、アンモニアガスを供給することにより７．２に制御した。撹拌回転数はＤＯが３ｐｐｍ以下にならないように段階的に変更した。培地中のグルコースが枯渇した時点から、滅菌したフィード溶液［５０％（ｗ／ｖ）グルコース、４．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン］を定速で連続的に供給し、５０時間まで培養を継続した。培養終了後の全容積は約３．５ｍ３であった。培養後のリジン濃度の測定は、ＢＬ５リジンセンサ（王子計測機器株式会社製）により行い、培養終了後のリジン濃度は、約９０ｇ／Ｌであった。
尚、表１にＬＰＧ１培地を示す。
尚、表１にＬＰＧ１培地を示す。
＜ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の作成＞
上述した操作により作成したリジンを含む発酵溶液に、ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭの濃度となるように加え、更に、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体を、ＯＤ６６０が０．５になるように加えてリジン脱炭酸反応を開始した。
反応時の条件は、温度３７℃、通気量なし（０ｖｖｍ）、撹拌回転数７０ｒｐｍとした。反応中の溶液のｐＨは、２５０ｋｇのアジピン酸をイオン交換水４００Ｌに懸濁したスラリーを加え、ｐＨ６．５になるように制御し、合計２２時間反応させた。
反応終了時には、リジン残存濃度が０．０３ｇ／Ｌ以下であり、ほぼ１００％のリジンがペンタメチレンジアミンに変換されていた。反応後の溶液（約４ｍ３）は、菌体の不活化処理（８０℃、３０分）を実施した後、分子量１３，０００カットのＵＦ膜モジュール（旭化成工業株式会社製ＡＣＰ−３０５３）を通して高分子量の不純物除去を行なった。
上述した操作により作成したリジンを含む発酵溶液に、ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭの濃度となるように加え、更に、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体を、ＯＤ６６０が０．５になるように加えてリジン脱炭酸反応を開始した。
反応時の条件は、温度３７℃、通気量なし（０ｖｖｍ）、撹拌回転数７０ｒｐｍとした。反応中の溶液のｐＨは、２５０ｋｇのアジピン酸をイオン交換水４００Ｌに懸濁したスラリーを加え、ｐＨ６．５になるように制御し、合計２２時間反応させた。
反応終了時には、リジン残存濃度が０．０３ｇ／Ｌ以下であり、ほぼ１００％のリジンがペンタメチレンジアミンに変換されていた。反応後の溶液（約４ｍ３）は、菌体の不活化処理（８０℃、３０分）を実施した後、分子量１３，０００カットのＵＦ膜モジュール（旭化成工業株式会社製ＡＣＰ−３０５３）を通して高分子量の不純物除去を行なった。
尚、配列番号と配列番号に対応した塩基配列は以下の通りである。
（配列番号）
１ ＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣ
２ ＡＡＡＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧ
３ ＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧ
４ ＣＴＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡ
５ ＧＧＡＴＡＴＣＣ
６ ＧＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧ
７ ＧＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡ
８ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧ
９ ＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴ
１０ ＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＣＴ
１１ ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
１２ ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡ
１３ ＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴ
１４ ＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡ
１５ ＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣ
１６ ＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧ
１７ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣ
１８ ＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧ
１９ ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡＧ
（配列番号）
１ ＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣ
２ ＡＡＡＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧ
３ ＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧ
４ ＣＴＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡ
５ ＧＧＡＴＡＴＣＣ
６ ＧＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧ
７ ＧＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡ
８ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧ
９ ＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴ
１０ ＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＣＴ
１１ ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
１２ ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡ
１３ ＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴ
１４ ＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡ
１５ ＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣ
１６ ＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧ
１７ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣ
１８ ＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧ
１９ ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡＧ
［ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離］
（１）活性炭による脱色
直径７００ｍｍの活性炭塔に活性炭（三菱化学カルゴン株式会社製ＭＭ−１１）１０５ｋｇ（約４４０Ｌ）を仕込み、２日間脱塩水を通水した。次に、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液（約４ｍ３）を１．３２ｍ３／ｈの速度で通液し、最後に５００Ｌの脱塩水を通水した。初期４６０Ｌをパージした後、活性炭処理したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を採取した。
（１）活性炭による脱色
直径７００ｍｍの活性炭塔に活性炭（三菱化学カルゴン株式会社製ＭＭ−１１）１０５ｋｇ（約４４０Ｌ）を仕込み、２日間脱塩水を通水した。次に、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液（約４ｍ３）を１．３２ｍ３／ｈの速度で通液し、最後に５００Ｌの脱塩水を通水した。初期４６０Ｌをパージした後、活性炭処理したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を採取した。
（２）濃縮
ＰＰプリーツカートリッジフィルターＴＣＰ−ＪＸを通して、前記活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を２ｍ３撹拌槽に仕込み、ジャケット温度１１０℃、内温５７℃、真空度１４０Ｔｏｒｒ〜１５０Ｔｏｒｒにて濃縮を開始し、適宜、活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を仕込みながら濃縮を行った。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度は６３．５重量％であった。
ＰＰプリーツカートリッジフィルターＴＣＰ−ＪＸを通して、前記活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を２ｍ３撹拌槽に仕込み、ジャケット温度１１０℃、内温５７℃、真空度１４０Ｔｏｒｒ〜１５０Ｔｏｒｒにて濃縮を開始し、適宜、活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を仕込みながら濃縮を行った。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度は６３．５重量％であった。
尚、上記濃縮液等のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン濃度は、１Ｎ−ＨＣｌ水溶液にて滴定して、ｐＨの変曲点までの滴定量から算出した。同様に上記濃縮液等のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のアジピン酸濃度は、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液にて滴定して、ｐＨの変曲点までの滴定量から算出した。滴定には、自動滴定装置（三菱化学株式会社製ＧＴ−０６型）を使用した。
（３）晶析
次に、同一の２ｍ３撹拌槽にて晶析を行った。撹拌翼は３枚後退翼、撹拌速度は４０ｒｐｍ、降温速度は８℃／ｈである。
内温３７．４℃のときに、予め作成したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を種晶として１ｋｇ添加して結晶を析出させ、内温１０．５℃で晶析終了として、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを得た。尚、種晶としてのペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、本実施例に準じてラボスケールにて準備した。
次に、同一の２ｍ３撹拌槽にて晶析を行った。撹拌翼は３枚後退翼、撹拌速度は４０ｒｐｍ、降温速度は８℃／ｈである。
内温３７．４℃のときに、予め作成したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を種晶として１ｋｇ添加して結晶を析出させ、内温１０．５℃で晶析終了として、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを得た。尚、種晶としてのペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、本実施例に準じてラボスケールにて準備した。
（４）遠心濾過
直径１．２２ｍの遠心濾過器を用い、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを３回に分けて遠心濾過した。回転数は９８０ｒｐｍ、母液振り切り時間は１５分、母液振り切り後に１０℃の脱塩水約１２ｋｇをシャワー状に振りかけて洗浄し、その脱塩水の振り切り時間は１５分間とした。
直径１．２２ｍの遠心濾過器を用い、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを３回に分けて遠心濾過した。回転数は９８０ｒｐｍ、母液振り切り時間は１５分、母液振り切り後に１０℃の脱塩水約１２ｋｇをシャワー状に振りかけて洗浄し、その脱塩水の振り切り時間は１５分間とした。
１番晶（１回晶析品）として得られたｗｅｔケーキは約１９０ｋｇ（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩として約１６０ｋｇ）であった。
尚、上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩重量は、ｗｅｔケーキの水分量を水分計（三菱化学株式会社製：電量滴定式水分測定装置ＣＡ−０６型）と、水分気化装置（三菱化学株式会社製：ＶＡ−０６型）とを使用して測定し、測定値から算出した。
尚、上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩重量は、ｗｅｔケーキの水分量を水分計（三菱化学株式会社製：電量滴定式水分測定装置ＣＡ−０６型）と、水分気化装置（三菱化学株式会社製：ＶＡ−０６型）とを使用して測定し、測定値から算出した。
（５）２回晶析品
１回晶析品の一部を脱塩水に溶解し５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液とし、これに１回晶析品を得たのと同様の操作を加えて、より精製度の高い２回晶析品（ｗｅｔケーキ約４０ｋｇ）を得た。
１回晶析品の一部を脱塩水に溶解し５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液とし、これに１回晶析品を得たのと同様の操作を加えて、より精製度の高い２回晶析品（ｗｅｔケーキ約４０ｋｇ）を得た。
［ペンタメチレンジアミンの精製・単離］
前述した［ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離］の（４）遠心濾過において、遠心濾過後の濾液であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を回収した。次に、回収したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン濃度を測定し、水溶液中のペンタメチレンジアミンのモル数を算出した。続いて、この水溶液に、算出したペンタメチレンジアミンのモル数の２倍のモル数に相当する水酸化ナトリウム（濃度４８重量％水溶液）を添加し、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液からペンタメチレンジアミンを遊離させた。同時に、アジピン酸ナトリウムが析出した。
次に、遊離したペンタメチレンジアミンを含むスラリーを６０℃、５０Ｔｏｒｒにて脱水蒸留を行った。さらに、析出したアジピン酸ナトリウムを遠心濾過にて固液分離した。
次に、得られた濾液を８０℃、３０Ｔｏｒｒにて単蒸留してペンタメチレンジアミンを得た。得られたペンタメチレンジアミンの数量は約９０ｋｇであった。
前述した［ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離］の（４）遠心濾過において、遠心濾過後の濾液であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を回収した。次に、回収したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン濃度を測定し、水溶液中のペンタメチレンジアミンのモル数を算出した。続いて、この水溶液に、算出したペンタメチレンジアミンのモル数の２倍のモル数に相当する水酸化ナトリウム（濃度４８重量％水溶液）を添加し、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液からペンタメチレンジアミンを遊離させた。同時に、アジピン酸ナトリウムが析出した。
次に、遊離したペンタメチレンジアミンを含むスラリーを６０℃、５０Ｔｏｒｒにて脱水蒸留を行った。さらに、析出したアジピン酸ナトリウムを遠心濾過にて固液分離した。
次に、得られた濾液を８０℃、３０Ｔｏｒｒにて単蒸留してペンタメチレンジアミンを得た。得られたペンタメチレンジアミンの数量は約９０ｋｇであった。
（実施例１）
＜ポリアミド樹脂の製造＞
上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離にて調製したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品２５ｋｇに脱塩水２５ｋｇを添加した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜燐酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、窒素雰囲気下で混合物を溶解させ、原料水溶液を得た。
プランジャーポンプにて予め窒素置換したオートクレーブに、上記の原料水溶液を移送した。ジャケット温度を２８０℃に、オートクレーブの圧力を１．４７ＭＰａにそれぞれ調節し、内容物を２７０℃に昇温した。
＜ポリアミド樹脂の製造＞
上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離にて調製したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品２５ｋｇに脱塩水２５ｋｇを添加した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜燐酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、窒素雰囲気下で混合物を溶解させ、原料水溶液を得た。
プランジャーポンプにて予め窒素置換したオートクレーブに、上記の原料水溶液を移送した。ジャケット温度を２８０℃に、オートクレーブの圧力を１．４７ＭＰａにそれぞれ調節し、内容物を２７０℃に昇温した。
次に、オートクレーブ内の圧力を除々に放圧した後、更に減圧して所定の撹拌動力に到達した時点で反応終了とした。反応終了後に窒素にて復圧し、内容物をストランド状に冷却水槽へ導入した後、回転式カッターでペレット化した。得られたペレットは、１２０℃、１ｔｏｒｒ（０．１３ｋＰａ）の条件で、水分量が０．１％以下となる迄乾燥し、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（ηｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表１に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表１に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
（実施例２）
実施例１で得られたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、さらに、後述する表２に示すように、銅含有量１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
実施例１で得られたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、さらに、後述する表２に示すように、銅含有量１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
（参考例３）
蒸留により単離したペンタメチレンジアミン、アジピン酸（旭化成ケミカルズ株式会社製）及び脱塩水を用い、濃度約５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を調製し、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．１に調整した。このペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜リン酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（ηｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
蒸留により単離したペンタメチレンジアミン、アジピン酸（旭化成ケミカルズ株式会社製）及び脱塩水を用い、濃度約５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を調製し、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．１に調整した。このペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜リン酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（ηｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
（参考例４）
参考例３で使用したポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
参考例３で使用したポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
（比較例１）
実施例１において、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品に代えて、１番晶（１回晶析品）を使用した以外は、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（ηｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
実施例１において、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品に代えて、１番晶（１回晶析品）を使用した以外は、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（ηｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
（比較例２）
比較例１で用いたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
実施例１〜実施例２、参考例３〜参考例４、比較例１、比較例２において得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に含まれる硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量を測定した。
またこれらのポリアミド樹脂組成物について耐熱老化性の評価を行った。結果を表２に示す。
比較例１で用いたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
実施例１〜実施例２、参考例３〜参考例４、比較例１、比較例２において得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に含まれる硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量を測定した。
またこれらのポリアミド樹脂組成物について耐熱老化性の評価を行った。結果を表２に示す。
表２に示す結果から、硫黄の含有量が１．２重量ｐｐｍ未満であるペンタメチレンジアミンとアジピン酸との重縮合反応により得られたポリアミド樹脂と、ハロゲン化第一銅とを含むポリアミド樹脂組成物（実施例１〜実施例２）は、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さが低下せず、耐熱老化性が良好であることが分かる。
一方、硫黄の含有量が１．２重量ｐｐｍ以上であるペンタメチレンジアミンとアジピン酸との重縮合反応により得られたポリアミド樹脂を含むポリアミド樹脂組成物（比較例１，２）は、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さが大幅に低下し、耐熱老化性が改善されないことが分かる。
一方、硫黄の含有量が１．２重量ｐｐｍ以上であるペンタメチレンジアミンとアジピン酸との重縮合反応により得られたポリアミド樹脂を含むポリアミド樹脂組成物（比較例１，２）は、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さが大幅に低下し、耐熱老化性が改善されないことが分かる。
Claims (8)
- ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液からペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を単離するペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法であって、
ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液を濃縮し、濃縮したペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液を冷却して晶析し、ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩スラリーとし、
該ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩スラリーを固液分離することによりペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。 - 前記ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液の濃縮における温度が５０℃〜７０℃の範囲であることを特徴とする請求項１に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記濃縮したペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩濃度が５０重量％〜６９重量％の範囲であることを特徴とする請求項１又は２に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液の冷却における降温速度が１℃／ｈｒ〜３０℃／ｈｒの範囲であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液の晶析終了温度が１℃以上３０℃以下の範囲であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩スラリーの晶析率が１重量％以上４６重量％以下であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記固液分離が遠心濾過でなされることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
- 前記ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩水溶液におけるペンタメチレンジアミンが、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または当該細胞の処理物を使用し、リジンから産出されたものであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩の製造方法。
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