JP5281222B2 - 表面試料から発せられた蛍光シグナルの増幅 - Google Patents
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Description
蛍光励起シグナルは、有利には薄層板の形態のその基板を透過して一般的に試料の方に向けられる。蛍光を励起する別の方法は、薄層板を透過し励起光を照射することによって、またはプリズム結合によって、エバネッセント波を発生させることである。
基板の一表面に形成された、蛍光マーカーを保持している生体の捕獲フェーズとして機能する、生物特異的な表面を表面試料とすることが可能である。このようにして、例えば、二重鎖核酸のような複合物を形成することが可能である。生物特異的な表面は、光照射技術または別の方法でプローブを配設することによる、プローブの合成によって作られたものでもよい。この複合体は抗体−抗原会合体でもよく、この場合、基板の表面に付着させられた抗体が生物特異的な表面を形成する。複合体を形成する表面の厚さは数nmから数百nmの間である。複合体は、形成後に、例えば該複合体を乾燥または吸着することにより、基板の表面に付着させることもできる。
さらに最近では、蛍光発光に関するモデルが、異なる物理的形式化でだが、J.ENDERLEIN等による論文“Highly efficient optical detection of surface generated fluorescence”(Applied Optics、Vol. 38、 No.4、1999年、pp724-732)に提案されている。
本発明は、表面上の分子は屈折率の不連続を構成し、それらは最大屈折率を有する媒質でその蛍光発光の大部分を発するという事実を利用する。表面分子の蛍光発光の角分布は大容積での分子の角分布とは大幅に異なる。液体の場合、蛍光分子は相互に関連して配向しないので蛍光発光は等方的であると考えられている(双極子モーメントの配向はランダム分布)。蛍光分子が数十nmから数百nmの薄層を構成する場合、現象は異なる。蛍光発光で発せられたシグナルは、蛍光分子から構成される電気双極子の配向に関連している。ゆえに、表面蛍光のために、屈折率が全く異なる二つの媒体の境界面に蛍光分子を配置することは好適である。
よって、蛍光シグナルに対して透明であるほど十分に薄い層の形態をした、屈折率の大きい素材を利用することが可能で、この薄層は、蛍光シグナルに対して透明な基板で支えられている。
異なる素材のサブレイヤの積層で構成される薄層を利用することも可能で、この薄層は、特に屈折率および蛍光シグナルに対する透明性に関して、従来の薄層と同じ光学的特性を有する。
方法は、窒化珪素、炭化珪素、酸化チタン、酸化アルミニウム、ZrO2、ZrO4Ti、HfO2、Y2O3、ダイアモンド、MgO、オキシ窒化物(SiXOYNZ)、YF3またはMgF2のようなフッ化材料から選ばれた材料による薄層を、基板と表面試料の間に挿入する過程を含むこともできる。薄層は、複数のサブレイヤを堆積して形成することもできる。このときサブレイヤの光学的特性および厚さが、後者の方法で形成された全体に必要な性質を与える(A. HERPIN著、C.R.Acad.Sciences、Paris、225、182、1947年参照)
場合によっては、上記基板上に形成された薄層は熱処理されていてもよい。
表面試料は、生物特異的な表面が蛍光マーカーを持つ試料分子と結び付いている複合体で構成することができる。
試料が浸かっている媒体は液体、ゲルまたは気体である。
薄層を構成する素材は、その屈折率が基板を構成している素材の屈折率及び表面試料が浸かっている媒体の屈折率よりより大きくなるように選ばれる。
デバイス10は、ケーシング20の上板に設けられたハウジングに、蛍光を測定するために、配設されており、表面試料13がケーシング20の内側に向かうように配置されている。ケーシングには流入開口部21と排出開口部22があり、それによって、表面試料は、表面試料が浸かる媒体を構成する液体30と接触するようになっている。
蛍光シグナルは計測器40で受信される。図1で適切に図示されているように、蛍光シグナルは、薄層12および透明基板11を透過して計測器40に到達する。これはいわゆる背面モードである。
支持部材はガラス、シリカまたはポリスチレン系のスライドでよい。それは蛍光測定のスペクトル領域に対して透明である。基板の一表面に配置されている薄層は、窒化珪素、酸化チタン、酸化アルミニウムのような材料から、蒸着または複製(光学的薄膜技術)によって形成することができる。薄層の層厚が数μmより厚い場合、薄膜の形態で配設または(接着または分子付着によって)基板の上に転写することもできる。
−公知の技術で使われているガラス基板、言い換えれば、蛍光増幅薄層のないガラス基板。
−本発明によるデバイスで、薄層が窒化珪素でできているデバイス。
−本発明によるデバイスで、薄層が熱処理された窒化珪素(窒素内での熱処理は窒化層を緻密にする)でできているデバイス。
測定結果は、Si3N4の薄層を備えるデバイスは単なるガラス基板に対し1.6倍に蛍光が増強され、熱処理されているSi3N4の薄層を備えるデバイスは単なるガラス基板に対し2.4倍に蛍光が増強されるということを示した。
11 基板
12 薄層
13 表面試料
20 ケーシング
21 流入開口部
22 排出開口部
30 媒体
40 計測器
50 ペトリ皿
60 スライド
61 開口部
62 空気
Claims (10)
- 基板(11)と表面試料(13)の間への、薄層(12)の挿入を含む、蛍光シグナルを伝達する基板(11)により支えられた表面試料(13)から発せられた蛍光シグナルを、励起シグナルに応じて増幅する方法であって、
薄層は回折格子を有しない非導波路であり、
表面試料が薄層の表面上に配設され、薄層の屈折率は基板の屈折率より大きくかつ表面試料(13)が浸かっている媒体(30、62)の屈折率より大きく、励起シグナルおよび蛍光シグナルは薄層に概ね垂直に入射して薄層を透過し、薄層(12)は透明基板(11)を透過した後に測定される蛍光シグナルを伝達することを特徴とする方法。
- 表面試料(13)を支える基板(11)は、ガラス、石英、シリカ、プラスチック材料例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのような材料から選ばれた材料からなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 基板(11)と表面試料(13)の間に挿入される薄層(12)は、窒化珪素、炭化珪素、酸化チタン、酸化アルミニウム、ZrO2、ZrO4Ti、HfO2、Y2O3、ダイアモンド、MgO、オキシ窒化物(SiXOYNZ)、YF3またはMgF2のようなフッ化材料から選ばれた材料からなることを特徴とする請求項1ないし2のいずれか1項に記載の方法。
- 上記薄層(12)は、次の方法、つまりCVDタイプの方法(LPCVD、PEDVE等)またはPVDタイプの方法、薄膜転写、ゾル−ゲル法による、蒸着、複製、転写、薄膜堆積薄膜のうちの一つによって基板(11)上に得られた層であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 上記薄層(12)は、次の方法、つまり接着および分子付着のうちの一つによって基板(11)上に転移される層であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 基板(11)上に得られる上記薄層(12)は熱処理されることを特徴とする請求項4ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 表面試料(13)は、生物特異的な表面が蛍光マーカーを持つ試料分子と結び付いている複合体からなることを特徴とする請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 表面試料(13)が浸かっている媒体(30、62)は液体、ゲルまたはガスであることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 表面試料(13)により発せられた蛍光発光を、請求項1ないし8のいずれか1項に記載された方法により増幅するためのデバイス(10)であって、蛍光シグナルを伝達し、かつ表面試料(13)を支えるための基板(11)と、該基板(11)と表面試料(13)の間に挿入されている薄層(12)とを含み、表面試料が薄層の表面上に配設され、薄層の屈折率は基板の屈折率および蛍光発光の測定中表面試料が浸かっている媒体の屈折率より大きく、薄層(12)は蛍光シグナルを伝達するデバイス(10)。
- 請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法を実行し、蛍光発光による読み取りをするバイオチップであって、蛍光シグナルを伝達することができ、かつその数だけ認識領域を構成する複数の表面試料(13)を支えるための基板(11)と、該基板(11)と表面試料(13)の間に挿入されている材料の薄層(12)とを含み、表面試料が薄層の表面上に配設され、薄層の屈折率は基板の屈折率および蛍光発光の測定中表面試料が浸かっている媒体の屈折率より大きく、薄層(12)は蛍光シグナルを伝達するバイオチップ。
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