JP2005195576A - バイオチップ用基板およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、バイオチップ使用時に各スポットの蛍光強度のＳ／Ｎ比を向上させ、正確で感度の高い測定ができるバイオチップ用基板の提供を目的とする。
【解決手段】生体高分子オリゴマを固定化するバイオチップ用基板であって、前記固定化する側の表面で蛍光を実質的に反射することを特徴とするバイオチップ用基板。好ましくは、基材と、該基材の生体高分子オリゴマを固定化する側の表面に形成した膜とから実質的に構成され、かつ前記膜が前記基材よりも屈折率が高い反射膜を含むことを特徴とするバイオチップ用基板。
【選択図】図１

Description

本発明は、数百〜一万種類以上の遺伝子に対応するＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖やタンパク質断片などの生体高分子オリゴマを微小量づつ整列、固定化するバイオチップに好適な基板に関する。

バイオチップの代表的なものとして、多種類のＤＮＡの断片を数百〜数万の微小なスポットとして基板上に固定させた、ＤＮＡチップがある。ＤＮＡチップに人間や動物のＤＮＡで評価したいものを作用させる（ハイブリダイゼーション）ことにより一度に多数のＤＮＡの配列を検出評価し、個体間の配列の違いや、細胞状態の違いによる遺伝子発現量の差などを解析できる。なお、ＲＮＡ、タンパクまたは糖鎖等についても同様であり、以下の説明では代表例としてＤＮＡについて説明する。

バイオチップには、基板上にＤＮＡを固定させる方法により、フォトリソグラフィを利用した固相合成法と、あらかじめ用意した多種類の検出ＤＮＡを基板上に並べていくスタンプ（スタンピング）法とに大別される。いずれの方法によっても基板上に固定化されたＤＮＡ（以下、プローブという）に対して、混合ＤＮＡ断片（以下、検体という）を作用させる。検体を検出する手段としては、あらかじめ検体に蛍光分子を修飾し、これを蛍光読取装置にかけ、励起光を当てたときの、各スポットの蛍光強度の相対的な強弱を調べるのが一般的である。

蛍光強度は励起光強度に対して弱く、また検体の濃度は、最も薄いＤＮＡから最も濃いＤＮＡものまで千倍から一万倍の開きがある。濃度が薄い検体については、基材自身の表面や付着物などからの自家蛍光や反射がノイズとなって、正確な検出が難しかった。

従来、蛍光強度とノイズの比（Ｓ／Ｎ比）を向上させるため、プローブ同士で類似した塩基配列が少なくなるように直交性を予め設計することで誤ったハイブリダイゼーションを減らす方法（特許文献１参照）も提案されているが、プローブの設計にコストがかかり、またプローブ選択の自由度が制限されるなどの問題点がある。基材上にプローブと親和性の高い膜を形成しておくことでスポット形成の確度を高め、蛍光密度を高くする方法（特許文献２参照）も提案されているが、プローブと親和性の高い膜の開発、製造および基材面で膜品質を均一にするための管理にコストがかかるなどの問題点もある。また、基材表面をフロスト加工することによりスポット内の表面積を稼ぐもの（特許文献３参照）も提案されているが、さらなるＳ／Ｎ比向上が求められている。

基材の裏面、すなわち検体が固定される面と反対側に反射膜を設けることで、蛍光分子に当たる励起光および受光機に向かう蛍光をそれぞれ理論上倍にし、読み取り蛍光強度を向上させるバイオチップ用基材も提案されている。しかしながらこの方法では、基材が透明基材に限定されるほか、基材内への光の出入りがあるためＳ／Ｎ比としては理論どおりに向上していない。また、スポットを取り囲む基材平面に垂直な外壁に反射膜を設けることで周囲からのノイズをさえぎり、スポットからの蛍光強度を向上させようとする方法もある（特許文献４参照）が、反射した蛍光が直接蛍光読み取りセンサーの方向を向いていないので蛍光強度を向上させるのには不充分である。

特開２００３−９９４３８号公報（１〜３頁） 特開２００３−１４７４４号公報（１〜５頁） 特開２００３−１０７０８６号公報（１〜４頁） 特開２００２−１２２５９６号公報（１〜６頁）

本発明は、バイオチップ使用時に各スポットの蛍光強度のＳ／Ｎ比を向上させ、正確で感度の高い測定ができるバイオチップ用基板の提供を目的とする。

本発明は、生体高分子オリゴマを固定化するバイオチップ用基板であって、前記固定化する側の表面で蛍光を実質的に反射することを特徴とするバイオチップ用基板を提供する。別の本発明は、基材と、該基材の生体高分子オリゴマを固定化する側の表面に形成した膜とから実質的に構成される、生体高分子オリゴマを固定化するバイオチップ用基板であって、前記膜が前記基材よりも屈折率が高い反射膜を含むことを特徴とするバイオチップ用基板を提供する。また、別の本発明は、金属製基材と、前記金属製基材の生体高分子オリゴマを固定化する側の表面に形成した有機膜とから実質的に構成されるバイオチップ用基板を提供する。さらに、別の本発明は、基材の、生体高分子オリゴマを固定化させる側の面に、基材よりも屈折率の大きい反射膜を塗布またはスパッタリングで形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法を提供する。

本発明の提供するバイオチップ用基板を使用することにより検体に施した蛍光を検出する際に、その蛍光を基材の裏面で反射させずに評価体が固定されている面で反射させるため蛍光強度が高くなり、しかも、検体が固定されている箇所以外の部分からの蛍光（以下、バックグランドともいう）や前記固定されている面に付着している汚れなどによるノイズを低減させることから優れたＳ／Ｎ比が得られる。また、基材の種類も透明体に限らず不透明体でも使用できる。

本発明において反射膜を有する場合の反射膜として、ＴｉＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＺｒＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、Ｓｉ_３Ｎ_４、ＴｉＮ_Ｘ（０＜Ｘ≦１）、Ｃｒ、ＡｇおよびＧｅからなる群から選ばれる１種以上を含む反射膜を採用すると、上記の効果がさらに顕著となる。中でも前記反射膜の上にＳｉＯ_２を含む膜、評価体との親和性が高い有機物を含む有機膜をこの順番に積層させると特に優れたＳ／Ｎ比が得られる。

このような優れたＳ／Ｎ比を有することから、従来のバイオチップの利用方法、測定機器などを特段変更しなくても正確な情報が得られる。また、従来、高精度の情報が得られにくかった、低発現と呼ばれる、低濃度の検体からの微弱な強度レベルの蛍光測定を高精度でできる。さらに、優れたＳ／Ｎ比が得られやすいことから、バイオチップ上の各試料のスポット径を小さくでき、より高密度化、高集積化ができる。

本明細書において、バイオチップ用基板とは、そのまま生体高分子オリゴマを固定化して使用できるもの、または有機膜を形成することにより生体高分子オリゴマを固定化して使用できるものをいう。本発明のバイオチップ用基板（以下、本基板という）は、生体高分子オリゴマを固定化するバイオチップ用基板であって、前記固定化する側の表面で蛍光を実質的に反射することを特徴とする。固定化する側の表面（以下、固定化面という）で蛍光を実質的に反射するとは、固定化面で反射される蛍光強度が、固定化面の反対面（以下、裏面という）で反射される蛍光強度に比べて少なくとも数倍以上高いことをいう。

本基板において、ベースとなる基材としては平板であれば特に制限されないが、材料としては、各種ガラス、合成石英ガラス、セラミックス、金属、プラスチックスなどが挙げられ、これらを単独でまたは併用するとよい。中でも各種ガラス、合成石英ガラス、金属であると、バイオチップに通常用いられる、５００ｎｍから６５０ｎｍ付近での励起光による基材自身の蛍光が少ないためＳ／Ｎ比への基材への影響が小さいため好ましい。

基材がガラスであると、平坦性に優れるため好ましい。ガラスの作成法としては、特に制限されないが、いわゆるフロート法などが好適に挙げられ、フロート法で得られるガラス板が代表的な基材の一つである。また、基材がプラスチックスであると入手性、経済性の点で好ましい。また、基材の形状・形態としては特に制限はないが、プレートまたはフィルムが挙げられる。プレートであると、製作や使用が容易であり、原価面でも有利であるため好ましい。基材の固定化面の表面性状としては、特に制限されないが、バイオチップの１測定点の直径である約１０〜５００μｍの範囲内で平坦な程好ましい。

本基板が、基材と、基材の固定化面上に形成した膜とから実質的に構成され、前記膜が前記基材よりも屈折率が高い反射膜を含むものであると固定化面での蛍光の反射が充分なされるため好ましい。反射膜を有する場合の前記基材としては、非金属製のものが反射膜を形成する効果が大きいため好ましく、ガラスまたはプラスチックスなどが好ましいものとして挙げられる。

本基板において、前記反射膜が前記基材よりも屈折率が高いものであると、評価体からの蛍光で基材方向に進むものの大部分が該反射膜で反射されるためＳ／Ｎ比に優れたバイオチップ用基板を提供できる。

反射膜を形成した本基板の構成の断面図を図１に示す。図中、１は基材、２は反射膜、４は基材の固定化面、５は基材の裏面、１０は本基板、をそれぞれ示す。図４は、本発明のバイオチップ使用時の概略説明図で、図中、３１は基材、３２は反射膜、３４は基材３１の固定化面、３５は基材３１の裏面、３７は励起光、３８は蛍光、３９は蛍光分子が結合された検体、４０は本基板、をそれぞれ示し、検体分子からの蛍光の内、基材方向に出ている蛍光が反射膜３２で反射される様子を示す。

本基板において、反射膜２は基材より屈折率が高ければ特に制限されないが、金属元素を含む無機膜であると蛍光および励起光が反射されやすいため好ましい。前記金属元素としては、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃｒ、Ａｇ、またはＧｅなどが好ましく挙げられる。前記金属元素を含む反射膜としては、ＴｉＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＺｒＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、Ｓｉ_３Ｎ_４、ＴｉＮ_Ｘ（０＜Ｘ≦１）、ＣｒおよびＡｇからなる群から選ばれる１種以上を含むものであると高屈折率の反射膜が簡便に形成できるため好ましい。前記群にＧｅを含むとさらに好ましい。すなわち、前記反射膜としては、ＴｉＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＺｒＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、Ｓｉ_３Ｎ_４、ＴｉＮ_Ｘ（０＜Ｘ≦１）、Ｃｒ、ＡｇおよびＧｅからなる群から選ばれる１種以上であるとさらに好ましい。なかでもＴｉＮ_Ｘ膜またはＧｅ膜は、バイオチップに通常用いられる５００ｎｍから６５０ｎｍ付近での励起光による蛍光が微弱であるため最も好ましい。

反射膜２の特性としては屈折率が１．６以上であると好ましく、屈折率が１．８以上であるとさらに好ましい。また、基材１との屈折率の差が０．２以上であるとさらに好ましい。

反射膜２の膜厚としては、金属膜厚測定機で測定して５〜２００ｎｍであると好ましく、１０〜１００ｎｍであるとさらに好ましく、２０〜６０ｎｍであると特に好ましい。反射膜２の膜厚が５ｎｍ未満であると所望の屈折率、反射率などの光学特性が得られにくく、膜厚が２００ｎｍを超えると厚さにむらが生じ、測定誤差を生ずるおそれがあり、また原価面でも有利ではない。なお、反射膜２としては単層の膜に限定されず、複層膜でもよい。複層膜の場合、その膜厚は合計した膜厚をいうものとする。また、反射膜２としては基材の固定化面全体を被覆する場合だけでなく、固定化面を部分的に被覆してもよい。反射膜２が部分的に被覆する場合の断面図の模式図を図３に示す。図中、３０は本基材、２１は基材、２２は反射膜、２４は基材２１の固定化面、２５は基材２１の裏面、をそれぞれ示す。

反射膜２の表面粗さＲａが５００ｎｍ未満であると、バイオチップ上での検体処理が均一にでき、また検体の蛍光シグナル読み取り時に焦点も均一になるため好ましい。反射膜２の表面粗さＲａが１００ｎｍ未満であるとさらに好ましく、反射膜２の表面粗さＲａが５０ｎｍ未満であると特に好ましい。

反射膜２の形成法としては特に制限されないが、乾式法としては、スパッタリング法、蒸着法、化学気相成長法（ＣＶＤ）などが挙げられ、湿式法としては、塗布法、浸漬法などが挙げられる。材料を片面のみにコーティングするためにはスパッタリング法または蒸着法が好ましく、均一な膜厚を得るためにはスパッタリング法がさらに好ましい。また、これらのコーティングは、クラス１００００以上のクリーンルームで行うと測定誤差となる付着物を減らすことができるため特に好ましい。

本基板１０は、反射膜２の上にさらに検体、すなわち生体高分子オリゴマとの親和性がある有機膜１３を形成すると検体の本基板への固定が強固になり好ましい。このような有機膜１３としては、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、または表面にアルデヒド基、カルボイミド基などの官能基を含む膜が生体高分子オリゴマとの親和性が高いため好ましいものとして挙げられる。

有機膜１３の膜厚としては、１〜５０ｎｍが好ましい。有機膜１３も単層膜に限らず複層膜でもよい。複層膜の場合の膜厚は、合計した膜厚をいうものとする。また、有機膜１３の作成法としては、浸漬法または塗布法などが好適な方法として挙げられる。

さらに、前記有機膜１３を使用する際には、反射膜１２と有機膜１３との間にＳｉＯ_２を主成分とする膜（以下、単にＳｉＯ_２膜と略す）１６を設けると表面に存在する水酸基などの極性基に有機物を結合または静電吸着させやすいため好ましい。ＳｉＯ_２膜が実質的にＳｉＯ_２からなる膜であると上記効果が顕著であるためさらに好ましい。ＳｉＯ_２膜１６の膜厚としては、１〜５０ｎｍであると好ましい。ＳｉＯ_２膜１６も単層膜に限らず複層膜でもよい。複層膜の場合の膜厚は、合計した膜厚をいうものとする。ＳｉＯ_２膜１６の作成法としてはスパッタリング法、蒸着法、ＣＶＤ、塗布法または浸漬法などが挙げられる。なかでもスパッタリング法が膜厚の均一性などの点で好ましい。基材の１１の上に、順に、反射膜１２、ＳｉＯ_２膜１６、有機膜１３を形成した本基板２０の構成の断面図を図２に示す。

本基板１０において、基材１と反射膜２との間に密着性を改良する膜を別途形成してもよい。また、基材１の固定化面４と裏面５に別途、変形防止、識別性付与等の反射性付与以外の目的で膜を形成してもよい。

本基板１０の構成の一例としては、ガラス材料またはプラスチックからなる基材１の上にＴｉＮ_Ｘ（０＜Ｘ≦１）またはＧｅを含む反射膜２を構成し、さらにその上にＳｉＯ_２膜を構成し、ＳｉＯ_２膜の上にアミノシランを含む有機膜を構成する例などが挙げられる。

また本基板の別の構成としては、金属製基材と、該金属製基材の生体高分子オリゴマの固定化面に形成した有機膜とから実質的に構成されるものがある。固定化面となる金属製基材の面が平滑であると好ましく、より好ましくは鏡面であるとさらに好ましい。有機膜としては、反射膜上に形成される有機膜として前述した有機膜が好適に採用される。

以下に、本発明の実施例を示す。
［例１］
Ｔｉ（ＯＣ_４Ｈ_９）_４を２．５５ｇ、エタノールを１７ｇ、アセチルアセトン０．７５ｇを混合し、充分撹拌しながら０．１ｍｏｌ／ｄｍ^３の硝酸水溶液１．１ｇを滴下して加え、そのまま１時間、室温で撹拌し、塗布液とした。よく洗浄した厚さ１ｍｍ、平坦度５０μｍ、屈折率１．５のスライドガラス（松浪硝子製）を上記塗布液に２０秒間浸漬したのち、２４ｃｍ／分の速度で引き上げて成膜した。１２０℃で１５分の乾燥後、５５０℃で３０分焼成し、ＴｉＯ_２膜を表面に有する基板（以下、本基板Ａという）を得た。ＴｉＯ_２膜の膜厚は１００ｎｍ、表面粗さＲａは５０ｎｍ、屈折率２．４、表面抵抗が２×１０^１０Ω／□であった。また、比較のためポリ−Ｌ−リジンをコートしたスライドガラス（以下、比較基板という）を用意した。

本基板Ａと比較基板の蛍光特性を比較するため、固定化するための生体高分子オリゴマとして蛍光標識分子（Ｃｙ３、Ｃｙ５）を結合させたＤＮＡ断片（７５量体）を、蒸留水で希釈しＤＮＡ濃度が０．１〜１μｇ／μＬである希釈液を作成した。この希釈液を、直径０．５ｍｍのステンレスピンの先端に付け、本基板Ａと比較基板の両方に点着した。点着は、金具によりステンレスピンが垂直になるように固定し、かつ、ステンレスピンが垂直方向に自由に動くようにして、基板表面に接触したステンレスピンの先端から基板表面に溶液が写し取られるようにして行い、１点点着する毎に、ステンレスピンの先端に溶液を付けた。点着された溶液は１点当りおよそ０．５〜１．５ｎＬであった。

この点着したスポットが乾燥するまで静置したのち、点着面を、蛍光測定装置を用いて、励起光５３２ｎｍおよび６３５ｎｍに対してそれぞれ５７５ｎｍおよび６７０ｎｍの蛍光を観察した。その結果、本基板Ａからの蛍光が比較基板からの蛍光より強度が高く、しかもスポット内での蛍光強度の分布も均一であった。

［例２］
例１において基板Ａの代わりに、厚さ１ｍｍで５０μｍ以内の平坦性を有し、屈折率１．５のソーダライムガラスの平板上に、Ｔｉターゲットを使用し、ＡｒとＮ_２との混合ガス（ガス流量３０±１０ｓｃｃｍ）中で、圧力１３３μＰａ、投入電力０．２６±０．１ｋｗ、搬送速度２．４２±０．５ｍｍ／ｓ、基板無加熱の条件によりスパッタリングし、膜厚約４０ｎｍ、表面粗さＲａ３０ｎｍ、屈折率２．５、表面抵抗が２×１０^１０Ω／□のＴｉＮ_ｘがコーティングされた、本基板Ｂを用い、比較基板を用いない以外は例１と同様にした。蛍光を調べた結果、スポット内での蛍光強度の分布も均一で、強度の高い蛍光が観察された。

［例３］
例２において、Ｔｉターゲットの代わりにＣｒターゲットを使用し、スパッター条件中、ＡｒとＮ_２との混合ガスの代わりにＡｒガスを使用して膜厚約１００ｎｍ、表面抵抗が５×１０^１０Ω／□のＣｒ膜を形成後、さらにＳｉターゲットを使用し、Ｏ_２ガス（ガス流量３０±１０ｓｃｃｍ）中で、圧力１３３μＰａ、投入電力０．２６±０．１ｋｗ、搬送速度２．０９±０．５ｍｍ／ｓ、基板無加熱の条件でスパッタリングし、Ｃｒ膜の上に膜厚約１０〜２０ｎｍのＳｉＯ_２膜が形成された本基板Ｃを使用した以外は例２と同様にした。蛍光を調べた結果、スポット内での蛍光強度の分布も均一で、強度の高い蛍光が観察された。

［例４］
例３において、得られた本基板ＣのＳｉＯ_２膜の上にさらに膜厚約５ｎｍのアミノシランからなる有機膜を形成するためアミノシランを含むメタノール溶液に浸漬後、乾燥させて得られた本基板Ｄを本基板Ｃの代わりに使用した以外は例３と同様にした。蛍光を調べた結果、スポット内での蛍光強度の分布も均一で、強度の高い蛍光が観察された。例３と例４を比べると有機膜のある例４の方が蛍光強度が高かった。

本発明の提供するバイオチップ用基板は、検体ＤＮＡ等からの蛍光に対するＳ／Ｎ比が高いことから正確な情報が得られる。特に、従来、高精度の分析が難しいとされていた、低濃度の検体の蛍光の特徴である、低発現であっても高精度の分析ができる。また、Ｓ／Ｎ比が高いことから、スポットの微小化ができ、高集積化されたバイオチップを提供できる。したがって、遺伝子関連の研究や遺伝子解析等に有用なバイオチップを提供できる。

本基板の構成の断面図。 有機膜を有する本基板の構成の断面図。 反射膜が部分的に形成された構成の断面図。 本基板のバイオチップ使用時概略説明図。

符号の説明

１、１１、２１、３１：基材
２、１２、２２、３２：反射膜
４、１４、２４、３４：基材の固定化面
５、１５、２５、３５：基材の裏面
１０、２０、３０、４０：本基板
１３：有機膜
１６：ＳｉＯ_２膜
３７：励起光
３８：蛍光
３９：蛍光分子が結合された検体

Claims (8)

1. 生体高分子オリゴマを固定化するバイオチップ用基板であって、前記固定化する側の表面で蛍光を実質的に反射することを特徴とするバイオチップ用基板。
2. 前記バイオチップ用基板が、基材と、該基材の生体高分子オリゴマを固定化する側の表面に形成した膜とから実質的に構成され、かつ前記膜が前記基材よりも屈折率が高い反射膜を含む請求項１記載のバイオチップ用基板。
3. 前記基材がガラスまたはプラスチックからなる請求項２記載のバイオチップ用基板。
4. 前記反射膜の屈折率が１．６以上である請求項２または３記載のバイオチップ用基板。
5. 前記反射膜が、ＴｉＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＺｒＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、Ｓｉ_３Ｎ_４、ＴｉＮ_Ｘ（０＜Ｘ≦１）、Ｃｒ、ＡｇおよびＧｅからなる群から選ばれる１種以上を含む請求項２、３または４記載のバイオチップ用基板。
6. 前記反射膜の上に前記生体高分子オリゴマとの親和性がある有機膜を有する請求項２〜５のいずれか記載のバイオチップ用基板。
7. 前記バイオチップ用基板が、金属製基材と、該金属製基材の生体高分子オリゴマを固定化する側の表面に形成した有機膜とから実質的に構成される請求項１記載のバイオチップ用基板。
8. 基材の、生体高分子オリゴマを固定化させる側の面に、基材よりも屈折率の大きい反射膜を塗布またはスパッタリングで形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
   

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