JP5269340B2 - 高解像度を有する顕微鏡 - Google Patents
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Description
2.焦点深度が拡大される場合の励起体積の横方向制限
この場合、階調度のコントラストに関して効率が低い現況技術は、径方向の急激な位相変化を有する位相マスクの脱励起光の瞳中での使用によって(例えば、非特許文献2参照)、あるいは象限的な急激な位相変化を有する位相マスクによって(例えば、非特許文献3参照)与えられる。
多くの点源の重ね合わせによる分布の作成(特許文献3参照)に比べて、下記の解決策は明らかにより簡単である。その上、多くの効率的な3D制限が可能である。
1.励起:従来のPSF
脱励起:瞳中にらせん位相を有する分布と瞳中に径方向位相を有する分布の非干渉性重なり
2.励起:従来のPSFと瞳中に径方向位相を有するPSFの非干渉性重なり
脱励起:瞳中にらせん位相を有する分布とらせん位相+径方向位相を有する分布の重なり
図3は、径方向マスク(a)、らせんマスク(b)、および径方向マスクとらせんマスクの組合せ(c)を示し、この組合せは(a)と(b)の直列配列、または完成したグレイ値設計と考えることができる。
r<a/√2の場合、R(r)=exp(−jπ)
S(φ)=exp(−jφ)
SR(r,φ)=R(r)+S(φ)
ただし、r:瞳中における径方向座標、φ:瞳中における角座標(α:瞳の半径)
以下の装置は、励起光線と脱励起光線を区別し、例えば短いパルスを使用したSTEDに関係する。この場合、現況技術から知られているように、まず励起が起こり、その後時間遅延を伴って誘導放出によって脱励起が起こる。励起された状態に留まっている分子は、蛍光を放出しながら緩和し、この蛍光が検出される。
脱励起光線経路ABは、ビーム・スプリッタSTによって2つの光線に分割される。遅延DLを有する一方の脱励起光線経路(この場合、延長の長さは、場合によっては光伝送ファイバを介し、使用されるレーザのコヒーレンス長を上回る)は、らせんマスクSMを含み、他方の脱励起光線経路は、径方向マスクRMを含む。この場合、遅延DLは、ビーム・カップラSVの背後で両部分光線の非干渉性重なりをもたらす。瞳レンズPOを介して、マスクが対物レンズの瞳中またはその近傍に結像される。
試料相互作用の種類とは無関係に、励起光線と脱励起光線は通例、時間的に相次いで試料に当たる。脱励起光線によって試料が「準備され」、続いて準備された状態が励起光線によって「感知され」(GSDおよびスイッチング)、あるいは時間的に遅延した脱励起光線によって励起が改変される(STED)。これによって、励起光線と検出光線の非干渉性重なりが保証される。
図4は、図1の第1の例示的実施形態による脱励起およびその実施例において生じる分布を示す。
図5は、図2による脱励起の場合に生じる分布を示す。
図6は、図2における励起の分布を示す。
シミュレーション結果
スイッチオフのために使用されるPSFs(式(1)では1に正規化されていると仮定する)は、次式に対応する色素の励起可能性(または励起)の低減を招く。
ただし、σはスイッチング(または脱励起)の作用断面積であり、Dは面積あたりの照射エネルギーを表す。したがって、励起からPSFaによって生じる全PSFは以下のようになる。
以下に、スイッチング可能なタンパク質ドロンパの場合のPSFを通るx−z断面を示す(横方向=水平、軸方向=垂直)。この場合、スイッチオフの作用断面積は0.07cm2/mW/sと仮定する(非特許文献6参照)。そうすると、3W/cm2s(すなわち、例えば1μm2の上に10μsの間に3mWが集束する)の照射エネルギーの場合、従来のPSF(図7c)に比べて、実施例2(図5cに対応する脱励起および図6cに対応する励起を有する)では図7aの分布が、実施例1(図4cに対応する脱励起および図6bに対応する励起を有する)では図7bの分布が生じる。
Claims (6)
- 励起光線および脱励起光線、および/または蛍光を発する試料におけるスイッチング光線による、照明中における部分的空間的重なりによって解像度を高めた顕微鏡であって、
試料光が検出され、
脱励起光線またはスイッチング光線が2つの部分光線経路に分割され、
分割された前記2つの部分光線光路を重ね合わせるためのビーム・カップラが前記脱励起光線または前記スイッチング光線に配置され、
前記2つの部分光線経路の非干渉性重なりをもたらすための光路延長が、前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記部分光線光路のうちの一つに配置され、
らせんマスクが前記2つの部分光線光路のうちの一つに配置され、
径方向マスクまたは径方向マスクとらせんマスクとの組み合わせが前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記2つの部分光線光路の他の部分光線光路に配置されている、顕微鏡。 - 前記手段が観察対物レンズの瞳面中またはその近傍に存在する、請求項1に記載の顕微鏡。
- 走査指令によって試料が走査される、請求項1または2に記載の顕微鏡。
- 前記手段を瞳面中に移送するために瞳レンズが設けられている、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 蛍光を発する試料が時間的に相次いで励起光線および脱励起光線および/またはスイッチング光線によって照明され、これらの光線が部分的に空間的に重ねられる、解像度を高めた顕微鏡のための方法であって、
励起放射および/または脱励起放射および/またはスイッチング放射が、これらの空間位相において同時に円形および径方向に影響を受けるようにすること、
脱励起光線またはスイッチング光線を2つの部分光線経路に分割すること、
前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記2つの部分光線光路のうちの一つに配置された光路延長と、前記2つの部分光線光路のうちの一つに配置されたらせんマスクと、前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記2つの部分光線光路の他の部分光線光路に配置された径方向マスクまたは径方向マスクとらせんマスクとの組み合わせとを用いて、前記脱励起光線または前記スイッチング光線において前記2つの部分光線経路の非干渉性重なりがもたらされるようにすることを特徴とする方法。 - 走査指令によって試料が走査される、請求項5に記載の方法。
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