JP5224344B2 - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、検査対象物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を検出する蛍光顕微鏡に関し、詳しくは、検査対象物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射の影響を軽減して検査対象物の深部の観察を容易にしようとする蛍光顕微鏡に係るものである。

従来の蛍光顕微鏡は、光源からの光を照明光学系を介して検査対象物上に導き、検査対象物から発せられる蛍光を観察光学系を介してＣＣＤカメラに導いて観察可能にし、ＣＣＤカメラでの測光及び撮像のタイミングに合わせて制御手段により光源の点灯及び消灯を制御するものとなっていた（例えば、特許文献１参照）。
特開２００５−１９５９４０号公報

しかし、このような従来の蛍光顕微鏡においては、光源からの光がＣＣＤカメラの視野内に対応した検査対象物の領域に照射されるため、検査対象物表面近傍で発生する蛍光や光源光の表面反射の影響を排除することができなかった。したがって、これら検査対象物表面近傍で発生する蛍光や光源光の表面反射光がノイズとなって、検査対象物の深部で発生する微弱な蛍光を容易に検出することができない場合があった。

そこで、本発明は、このような問題点に対処し、検査対象物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射の影響を軽減して検査対象物の深部の観察を容易にしようとする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明による蛍光顕微鏡は、光源から放射された光を受けて、検査対象物の蛍光物質を励起させて蛍光を発生させる励起光を生成する励起光生成手段と、前記励起光を前記検査対象物内部の蛍光物質の一点に集光する対物レンズと、前記対物レンズの視野よりも狭い視野で前記対物レンズの集光点の像を捕らえて、該対物レンズの集光点で前記蛍光物質が発生する蛍光を検出する光検出手段と、を備え、前記励起光を前記検査対象物の表面における前記対物レンズの視野内にて前記光検出手段の視野外に対応した位置に入射させるようにしたものである。

このような構成により、光源から放射された光を受けて、励起光生成手段で励起光を生成して検査対象物の表面における対物レンズの視野内にて該対物レンズの視野よりも狭い光検出手段の視野外に対応した位置に入射させ、この励起光を対物レンズで検査対象物内部の蛍光物質の一点に集光し、励起光で蛍光物質を励起させて蛍光を発生させ、光検出手段で対物レンズの集光点の像を捕らえると共に、対物レンズの集光点において蛍光物質が発生する蛍光を検出する。

また、前記励起光は、前記対物レンズの光軸を中心とする所定半径の横断面リング状を成したものである。これにより、対物レンズの光軸を中心とする所定半径の横断面リング状を成した励起光を対物レンズの視野内にて光検出手段の視野外に対応した位置に入射する。

さらに、前記対物レンズは、前記励起光生成手段側がテレセントリックな片側テレセントリックレンズである。これにより、励起光生成手段側がテレセントリックな片側テレセントリックレンズで励起光を集光する。

さらにまた、前記励起光生成手段は、個別に傾動する複数のマイクロミラーをマトリクス状に配列したマイクロミラーデバイスである。これにより、複数のマイクロミラーをマトリクス状に配列したマイクロミラーデバイスで複数のマイクロミラーを個別に傾動して励起光を生成する。

そして、前記励起光生成手段は、遮光部材に所定形状の開口を形成したマスクである。これにより、遮光部材に所定形状の開口を形成したマスクで励起光を生成する。

請求項１に係る発明によれば、励起光が検査対象物に入射する際、検査対象物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射光が光検出手段の視野内に取り込まれることがない。したがって、光検出手段で検出される光は、主に、対物レンズの集光点にて検査対象物内部の蛍光物質から発した蛍光となり、検査対象物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射の影響を軽減して検査対象物の深部の観察を容易にすることができる。また、対物レンズの集光点の像を捕らえて該対物レンズの集光点で蛍光物質が発生する蛍光を検出するように光検出手段を設けているので、光検出手段の焦点を検査対象物の所定部位に合わせるだけで、励起光を該検査対象物の所定部位に集光させることができ、励起光の焦点合わせも容易になる。

また、請求項２に係る発明によれば、検査対象物内部の蛍光物質に集光する励起光を増強することができ、励起されて発生する蛍光の強度をより高めることができる。

さらに、請求項３に係る発明によれば、励起光を略一点に集光させることができ、蛍光物質の励起効率を上げることができる。したがって、検査対象物内部で発生する蛍光の光強度を高めることができ、光検出手段による蛍光観察がより容易になる。

さらにまた、請求項４に係る発明によれば、マイクロミラーデバイスの駆動パターンを制御するだけで、任意の形状の励起光を容易に生成することができる。

そして、請求項５に係る発明によれば、励起光生成手段の構成が簡単になり、装置の製造コストを低減することができる。

以下、本発明の実施形態を添付図面に基づいて詳細に説明する。図１は本発明による蛍光顕微鏡の第１の実施形態を示す正面図である。この蛍光顕微鏡は、検査対象物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を検出するもので、光源装置１と、励起光生成手段２と、対物レンズ３と、光検出手段４とを備えて成る。

上記光源装置１は、レーザ光源５と、このレーザ光源５から放射されるレーザ光Ｌ１の放射方向前方に設けられたビームエキスパンダ６とを備えて構成され、レーザ光源５から所定波長のレーザ光Ｌ１を放射し、このレーザ光Ｌ１の光束径をビームエキスパンダ６によって広げて平行光にして放出するようになっている。

上記光源装置１のレーザ光Ｌ１の放出方向前方には、励起光生成手段２が設けられている。この励起光生成手段２は、レーザ光源５から放射されたレーザ光Ｌ１を受けて、検査対象物７の蛍光物質８を励起させ、レーザ光Ｌ１とは波長の異なる蛍光Ｌ２を発生させる励起光Ｌ３を生成するもので、個別に傾動する複数のマイクロミラーをマトリクス状に配列したマイクロミラーデバイスであり、光軸に対して所定角度だけ傾けて配置されている。この場合、マイクロミラーが光源からのレーザ光Ｌ１を検査対象物７側に反射するように傾動している状態を「オン駆動されている」と言い、マイクロミラーがレーザ光Ｌ１を検査対象物７側とは異なる方向に反射するように傾動している状態を「オフ駆動されている」と言う。そして、図２に示すように、後述の対物レンズ３の光軸を中心とする所定半径の横断面リング状を成した励起光Ｌ３を発生するように、図示省略の制御手段により制御されて楕円の円周上に並んだ複数のマイクロミラーがオン駆動されるようになっている。なお、励起光Ｌ３のリングの径は、図２に示すように、対物レンズ３の視野Ｆ１内にて、後述の光検出手段４の視野Ｆ２よりも大きくなるように決定されている。

上記光源装置１から放射されたレーザ光Ｌ１が励起光生成手段２を経て検査対象物７に向かう光路上には、検査対象物７と対向させて対物レンズ３が設けられている。この対物レンズ３は、励起光Ｌ３を検査対象物７内部の蛍光物質８に集光するものであり、励起光生成手段２側がテレセントリックな片側テレセントリックレンズである。

上記対物レンズ３から励起光生成手段２に向かう光路がダイクロイックミラー９によって分岐された光路上には、光検出手段４が設けられている。この光検出手段４は、対物レンズ３の集光点で蛍光物質８が発生する蛍光Ｌ２を検出するもので、観察カメラ１０と、結像レンズ１１と、バンドパスフィルタ１２とを備えて構成されている。なお、上記ダイクロイックミラー９は、上記レーザ光Ｌ１を透過し、上記蛍光Ｌ２を反射するような波長選択性ミラーである。

ここで、上記観察カメラ１０は、蛍光物質８が発生する蛍光Ｌ２を受光するもので、二次元撮像カメラである。また、上記結像レンズ１１は、対物レンズ３の集光点の像を観察カメラ１０の受光面に結像するものであり、対物レンズ３の口径よりも小さな口径を有するレンズが使用され、図２に示すように対物レンズ３の視野Ｆ１よりも狭い視野Ｆ２が得られるようになっている。又は、対物レンズ３の口径よりも小さい形状の開口を形成したマスクを、開口の中心を光軸に一致させて結像レンズ１１に近接して配置してもよい。さらに、観察カメラ１０と結像レンズ１１との間に設けられたバンドパスフィルタ１２は、蛍光物質８が発生する蛍光Ｌ２を選択的に透過させるものであり、ノイズ成分である励起光Ｌ３の検査対象物７表面における反射光等を除去できるようになっている。

次に、このように構成された蛍光顕微鏡の第１の実施形態の動作について説明する。
先ず、図示省略の制御手段から駆動パターンを励起光生成手段２に転送し、励起光生成手段２の複数のマイクロミラーにて、光軸を中心とする所定形状の楕円の円周上に位置する複数のマイクロミラーをオン駆動する。

次に、蛍光顕微鏡の光学系を上下動して、光検出手段４の観察カメラ１０により検査対象物７内部の所定部位、例えば検体の特定部位を観察し、該特定部位に観察カメラ１０の焦点を合わせる。

続いて、光源装置１のレーザ光源５を点灯して、レーザ光Ｌ１を放射する。このレーザ光Ｌ１は、ビームエキスパンダ６によって光束径が拡大されると共に平行光に変換されて励起光生成手段２に入射する。

励起光生成手段２においては、オン駆動された上記複数のマイクロミラーによってレーザ光Ｌ１を検査対象物７側に反射し、横断面リング状の励起光Ｌ３を生成する。

この励起光Ｌ３は、ダイクロイックミラー９を透過して対物レンズ３に入射する。そして、この対物レンズ３によって、図３に示すように検査対象物７の深部の所定部位、例えば検体の特定部位に集光される。このとき、上記特定部位に蛍光物質８が存在する場合には、この蛍光物質８が励起光Ｌ３によって励起され蛍光Ｌ２を発することになる。

蛍光物質８が励起光Ｌ３によって励起されて発生する蛍光Ｌ２は、対物レンズ３により平行光にされた後、ダイクロイックミラー９で光検出手段４側に反射される。そして、結像レンズ１１によって、観察カメラ１０の受光面上に集光される。このとき、観察カメラ１０で観察される検査対象物７上の視野Ｆ２は、結像レンズ１１の口径又は結像レンズ１１に近接して設けられた図示省略のマスクの開口の大きさによって制限される。本発明においては、上記結像レンズ１１の口径又はマスクの開口の大きさが対物レンズ３の口径よりも小さくされているため、観察カメラ１０（光検出手段４）の視野Ｆ２は、図２に示すように対物レンズ３の視野Ｆ１よりも狭くなっている。

ここで、リング状の励起光Ｌ３の径を、図２に示すように、対物レンズ３の視野Ｆ１内にて光検出手段４の視野Ｆ２を内包ように決定すれば、検査対象物７表面に入射する励起光Ｌ３は、図３に示すように光検出手段４の視野Ｆ２外となり、この励起光Ｌ３によって検査対象物７表面で励起される蛍光や励起光Ｌ３の表面反射光は、光検出手段４の視野Ｆ２内に殆ど取り込まれることがない。したがって、光検出手段４で検出される光は、主として検査対象物７の深部の蛍光物質８から放射された蛍光Ｌ２となる。これにより、検査対象物７表面近傍で発生する蛍光や励起光Ｌ３の表面反射の影響を軽減して検査対象物７の深部の観察を容易に行なうことができる。

なお、上記第１の実施形態においては、励起光生成手段２の反射面を対物レンズ３の光軸に対して所定角度だけ傾けて配置した場合について説明したが、本発明はこれに限られず、上記反射面を対物レンズ３の光軸に略直交させて配置してもよい。この場合、オン駆動される複数のマイクロミラーは、所定半径の円周上に並んだものとなる。

図４は本発明による蛍光顕微鏡の第２の実施形態を示す正面図である。第１の実施形態と異なる点は、図５（ｂ）に示すように、励起光生成手段２が透明基板１３の一面に設けられた遮光部材としての遮光膜１４に所定形状の開口１５を形成したマスクである点である。具体的には、励起光生成手段２は、透明基板１３の一面に設けられた遮光膜１４に、同図（ａ）に示すように対物レンズ３の視野Ｆ１内にて光検出手段４の視野Ｆ２よりも大きい径を有するリング状の開口１５を形成したマスクである。したがって、図４に示すように、光源装置１から放射されてマスク（励起光生成手段２）の一面側に入射したレーザ光Ｌ１のうち、上記マスクの開口１５を透過した透過光が励起光Ｌ３となる。

なお、励起光生成手段２は、透明基板１３に設けた遮光膜１４に開口１５を形成したものに限られず、遮光板（遮光部材）に所定形状の開口を形成したものであってもよい。

上記第２の実施形態によれば、励起光生成手段２がマスクであるため、第１の実施形態のようなマイクロミラーデバイスを駆動制御する制御手段を必要とせず、装置の構成が簡単になる。

なお、上記第１及び第２の実施形態においては、励起光Ｌ３が横断面リング状を成したものである場合について説明したが、本発明はこれに限られず、励起光Ｌ３は、対物レンズ３の視野Ｆ１内にて光検出手段４の視野Ｆ２外に対応した位置に入射するようにされたものであれば、例えば円弧やスポット等如何なる形状を有するものであってもよい。

また、上記第１及び第２の実施形態においては、光源装置１にレーザ光源５を使用する場合について説明したが、本発明はこれに限られず、光源装置１には、ＬＥＤ等の他の光源を使用してもよい。

本発明による蛍光顕微鏡の第１の実施形態を示す正面図である。 上記第１の実施形態における励起光生成手段により生成される励起光の大きさと光検出手段の視野の大きさとの関係を示す説明図である。 上記光検出手段の視野外から検査対象物に入射して集光する励起光によって、蛍光物質が励起されて蛍光を発生することを示す説明図である。 本発明による蛍光顕微鏡の第２の実施形態を示す正面図である。 上記第２の実施形態に使用する励起光生成手段を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は中心線断面正面図である。

符号の説明

１…光源装置
２…励起光生成手段
３…対物レンズ
４…光検出手段
５…レーザ光源
７…検査対象物
８…蛍光物質
１３…透明基板
１４…遮光膜（遮光部材）
１５…開口
Ｌ１…レーザ光
Ｌ２…蛍光
Ｌ３…励起光
Ｆ１…対物レンズの視野
Ｆ２…光検出手段の視野

Claims (5)

1. 光源から放射された光を受けて、検査対象物の蛍光物質を励起させて蛍光を発生させる励起光を生成する励起光生成手段と、
   前記励起光を前記検査対象物内部の蛍光物質の一点に集光する対物レンズと、
   前記対物レンズの視野よりも狭い視野で前記対物レンズの集光点の像を捕らえて、該対物レンズの集光点で前記蛍光物質が発生する蛍光を検出する光検出手段と、
   を備え、
   前記励起光を前記検査対象物の表面における前記対物レンズの視野内にて前記光検出手段の視野外に対応した位置に入射させるようにしたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 前記励起光は、前記対物レンズの光軸を中心とする所定半径の横断面リング状を成したものであることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
3. 前記対物レンズは、前記励起光生成手段側がテレセントリックな片側テレセントリックレンズであることを特徴とする請求項１又は２記載の蛍光顕微鏡。
4. 前記励起光生成手段は、個別に傾動する複数のマイクロミラーをマトリクス状に配列したマイクロミラーデバイスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
5. 前記励起光生成手段は、遮光部材に所定形状の開口を形成したマスクであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。

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