JP5208730B2 - Ｃｄ４０シグナル伝達によって媒介される増殖性障害の診断および治療のための方法 - Google Patents

Ｃｄ４０シグナル伝達によって媒介される増殖性障害の診断および治療のための方法 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、診断医学および予後医学の分野、より詳しくは、異常なＣＤ４０シグナル伝達と関連している増殖性障害、例えば、癌および前癌状態の治療における治療薬の有効性を調べる方法に関する。
（発明の背景）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのリガンドおよびその対応する受容体の多数のメンバーは、アポトーシスを誘導することまたは細胞生存および増殖を増強することによって正常細胞の成長を調節する。正常細胞のホメオスタシスを維持するのは、アポトーシスシグナルと生存および増殖シグナルの間のこのバランスである。今日までに、少なくとも２６種のＴＮＦファミリー受容体および１８種のＴＮＦファミリーリガンドが同定されている。受容体およびリガンド双方の生物学的に活性な形は、自己組織化したタンパク質三量体である。受容体およびリガンド双方の膜貫通型および可溶性型が同定されている。受容体の細胞内ドメインは配列相同性を共有していないが、その細胞外ドメインは４０アミノ酸のシステインリッチリピートを含む。その細胞質テールは、細胞内タンパク質の２つの主要な群：ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）およびデスドメイン（ＤＤ）含有タンパク質と相互作用することによってシグナルを送る。少なくとも６種のヒトＴＲＡＦと、これらの受容体のいくつかの細胞質テール上のＴＲＡＦ結合部位間の相互作用によって、いくつかのシグナル伝達経路、例えば、ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢまたはＰＫＢと呼ばれる、セリン／トレオニンキナーゼ）、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が開始される。例えば、非特許文献１参照のこと。
ＴＮＦファミリー受容体メンバーＣＤ４０は、正常および腫瘍性ヒトＢ細胞双方、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、内皮細胞、単球性および上皮細胞、いくつかの上皮癌および肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌および結腸癌をはじめとする多数の充実腫瘍の表面に存在する５０〜５５ｋＤａの細胞表面抗原である。ＣＤ４０リガンドの、Ｂ細胞膜上のＣＤ４０抗原との結合により、Ｂ細胞活性化および増殖を刺激する正の補助刺激シグナルが提供され、これがＢ細胞の、高レベルの可溶性免疫グロブリンを分泌する形質細胞への成熟をもたらす。ＣＤ４０は、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、−３、−５および−６を活性化し、これがＣＤ４０の、ＣＤ４０Ｌとの（膜結合型ＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌのいずれか）結合に続いて、さまざまなシグナル伝達経路、例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）。ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＡＫＴおよびＮＦ−κＢ調節をアップレギュレートする（例えば、非特許文献２）。
Ｂ細胞系統の腫瘍種に由来する悪性Ｂ細胞は、ＣＤ４０を発現し、生存および増殖についてＣＤ４０シグナル伝達に依存していると思われる。低および高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症およびホジキン病を患う患者から得た形質転換細胞は、ＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０発現はまた、急性骨髄芽球白血病の症例の２／３およびＡＩＤＳ関連リンパ腫の５０％においても検出される。
いくつかの癌種および肉腫はまた、高レベルのＣＤ４０発現を示すが、これらの癌細胞におけるＣＤ４０発現に関連するＣＤ４０シグナル伝達の役割はあまり理解されていない。ＣＤ４０発現癌種としては、膀胱癌（非特許文献３、非特許文献４）、乳癌（非特許文献５、非特許文献６）、前立腺癌（非特許文献７）、腎細胞癌（非特許文献８）、未分化上咽頭癌（ＵＮＰＣ）（非特許文献９）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（非特許文献１０、非特許文献１１）、甲状腺乳頭癌（非特許文献１２）、皮膚悪性黒色腫（非特許文献１３）、胃癌（非特許文献１４）および肝臓癌（例えば、ヒト肝細胞癌を論じる、非特許文献１５参照のこと）が挙げられる。ＣＤ４０発現肉腫については、例えば、ヒト骨肉腫およびユーイング肉腫を論じる、非特許文献１６参照のこと。
ＣＤ４０シグナル伝達は、ＩｇＭまたはＦａｓによって誘導されるアポトーシスから未熟Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫を保護する（例えば、非特許文献１７参照のこと）。マンテル（Ｍａｎｔｅｌ）細胞リンパ腫細胞は、高レベルのＣＤ４０を発現し、外因性ＣＤ４０リガンドの添加はその生存およびフルダラビン誘導性アポトーシスからのそれらの救出を増強することがわかった（非特許文献１８）。
悪性Ｂ細胞生存および増殖におけるＣＤ４０シグナル伝達の役割のために、ＣＤ４０抗原は、抗癌療法の可能性ある標的となる。実際、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで悪性ヒトＢ細胞の増殖および／または分化を阻害する（例えば、特許文献１参照のこと）。さらに、侵攻性ヒトリンパ腫のマウスモデルは、動物生存の促進における抗ＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証した。例えば、非特許文献１９、非特許文献２０および非特許文献２１参照のこと。
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）はまた、ＣＤ１５４としても知られ、３２〜３３ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、２つの、より小さい生物学的に活性な可溶性型、それぞれ、１８ｋＤａおよび３１ｋＤａでも存在する（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）。ＣＤ４０Ｌは、活性化されているが、休止中のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞で発現される（非特許文献２５、非特許文献２６および非特許文献２７）。ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌは双方ともクローニングされており、特性決定されている（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０および非特許文献３１）。ヒトＣＤ４０Ｌを記載する、特許文献２も参照のこと。ＣＤ４０Ｌ遺伝子を用いてトランスフェクトされ、ＣＤ４０Ｌタンパク質をその表面に発現する細胞は、その他の刺激性シグナルとともに、Ｂ細胞増殖を誘発でき、抗体産生を誘導することができる（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）前掲および特許文献３）。リンパ系腫瘍、自己免疫疾患、心血管疾患および本態性血小板血症を患う患者は、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の血清レベルが上昇しており、これは健常な被験体では見られない。ＣＤ４０Ｌの恒常的発現は、いくつかのＢ細胞リンパ系腫瘍、例えば、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびＨＩＶ感染Ｂ細胞リンパ腫を患う一部の患者で観察されている。例えば、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５および非特許文献３６）参照のこと。ＣＤ４０Ｌは、腫瘍性濾胞内のＣＤ４０発現腫瘍Ｂ細胞の、またはホジキン病領域中ＣＤ４０発現リードシュテンベルグ細胞内の細胞接触依存性相互作用において重要な役割を果たしている可能性がある（非特許文献３７）。しかし、悪性Ｂ細胞の生存対細胞死反応をもたらす、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の機序は完全にはわかっていない。例えば、濾胞性リンパ腫細胞では、アポトーシス誘導性ＴＲＡＩＬ分子（ＡＰＯ−２Ｌ）のダウンレギュレーション（非特許文献３８）およびＢｃｌ−２の過剰発現、Ｂ−ＣＬＬの場合には、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）のダウンレギュレーション（非特許文献３９）が、生存の機序として提案されている。対照的に、濾胞性リンパ腫における証拠は、ＣＤ４０活性化がＴＮＦ（非特許文献４０）およびＣＤ９５分子（非特許文献４１）のアップレギュレーションを導くということを示す。
腫瘍性細胞の生存および増殖におけるＣＤ４０シグナル伝達の重要な役割を考えると、ＣＤ４０発現腫瘍、詳しくは、ＣＤ４０シグナル伝達を標的とする治療計画に対して反応性である個体を同定する方法が必要である。
米国特許公開公報第２００４／０１０９８５７号明細書 米国特許第５，９４５，５１３号明細書 米国特許第５，９４５，５１３号明細書 Ｙｏｕｎｅｓ ａｎｄ Ｋａｄｉｎ（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８、３５２６〜３５３４による概説 Ｙｏｕｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｅ（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ １４：１３５〜１４３；ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ ａｎｄ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ（２０００）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６７：２−１７ Ｐａｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０−５９５ Ｂｒａｅｓｃｈ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２：５６２−５６７ Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：２９９９−３００７ Ｗｉｎｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５０：２７−３６ Ｒｏｋｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：１７５８−１７６８ Ｋｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：８９１−８９９ Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１１５２−１１６０ Ａｍｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０：４３８−４４２ Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２２６１−２２７０ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｙｒｏｉｄ ９：７４９−７５５ ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１９５３−１９６１ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２３（６）：１６９７−７０２ Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３０（４）：９２０−２６ Ｌｏｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（８）：１８４３−８４９ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３７２２−３７２５ Ｃｌｏｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０３：２１７−２１９ Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８３：２７８７−２７９４ Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１７６−３１８５ Ｓｚｏｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：２１７−２２３ Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１７４９−１７５４ Ｍａｚｚｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７０２５−７０２８ Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５９６５−５９６７ Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２５７３−２５７８ Ｓｐｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３−１５５０ Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１−１４ Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３−１４１０ Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２ Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１０９１−１１０１ Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４３１３−４３２１ Ｃｌｏｄｉ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ １０３：２７０−２７５ Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：２６８９−２６９７ Ｍｏｓｅｓ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２４２−１２４９ Ｔｒｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４９４０−４９４７ Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３７−５０ Ｃａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：９１２−９２２ Ｒｉｂｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０３：６８４−６８９ Ｌａｙｔｒａｇｏｏｎ−Ｌｅｗｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６１：２６６−２７１ Ｗｏｒｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１８８３−１８９０ Ｐｌｕｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：２８７５−２８８５
（発明の簡単な概要）
抗ＣＤ４０治療薬、例えば、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるシグナル伝達を調節するものおよび／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を調節するものから恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する被験体を同定する方法を提供する。このような抗ＣＤ４０治療薬としては、それだけには限らないが、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用、特に、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉する薬理作用のある物質、さらに、または、あるいは、作用様式としてＡＤＣＣ活性を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法は、１種以上の注目する抗ＣＤ４０治療薬に対するｅｘ ｖｉｖｏ細胞応答をモニターするための、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存ならびにＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの使用を含む。これらのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかでＣＤ４０リガンドで刺激されているＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む、候補被験体に由来する試験生体サンプルおよび対照生体サンプルを提供することと、試験生体サンプルを、注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させることと、試験生体サンプル内の少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを検出することと、バイオマーカー（類）の発現レベルを、注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させていない対照生体サンプルにおいて検出された対応する発現レベルと比較することとを含む。これらのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイに用いるためのバイオマーカーとして、その発現レベルが治療介入に対する反応性の予後指標であるタンパク質および／または遺伝子、例えば、抗ＣＤ４０治療薬の作用様式に応じて、細胞アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーおよび細胞増殖または生存のバイオマーカーが挙げられる。抗ＣＤ４０治療薬がＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の混乱を介してその作用様式を有する場合は、細胞アポトーシス、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路および細胞増殖または生存のバイオマーカーを、これらのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいて使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のさらなるマーカー、例えば、それだけには限らないが、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用によってアップレギュレートされるサイトカイン、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）をアッセイできる。抗ＣＤ４０治療薬がＡＤＣＣ、例えば、抗ＣＤ４０抗体を介してその作用様式を有する場合は、これらのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいて細胞アポトーシスのバイオマーカーを使用できる。
本発明のその他の実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬を用いる介入から恩恵を受ける個体または個体の下位個体群の予測となる１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルについて候補被験体をスクリーニングする。したがって、一実施形態では、候補被験体、例えば、Ｂ細胞系統の癌または前癌状態を有する被験体から採取した生体サンプルを、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０抗原の発現レベル、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベル、可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）の循環レベルおよび可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の循環レベルからなる群から選択される１種以上のＣＤ４０関連因子についてスクリーニングする。これらのＣＤ４０関連因子は疾患の予後指標であり得、さらに、抗ＣＤ４０治療薬の作用様式にかかわらず、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入に対して反応する、または反応しない被験体を同定するために使用できる。対照または参照標準と比較した場合の、生体サンプル内の、これらのＣＤ４０関連因子のうち１種以上の発現レベルの上昇は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、ＡＤＣＣを調節する、または両方である抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入から恩恵を受ける個体を示す。このスクリーニング方法を用いて同定された候補被験体は、注目する抗ＣＤ４０治療薬を用いて治療できるか、または本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて抗ＣＤ４０治療薬に対する反応性についてさらにスクリーニングできる。
さらにその他の実施形態では、候補被験体を１種以上の臨床的に有用な予後マーカーの有無についてスクリーニングして、その他の種類の癌治療薬に関しては不良予後であるが抗ＣＤ４０治療薬を用いる介入から恩恵を受ける候補被験体の下位個体群を規定する。このように、候補被験体から採取した生体サンプルを、その作用様式が、ＣＤ４０ターゲッティングまたはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を介してではない現在の治療薬を用いて不良予後の指標であることがわかっている１種以上の臨床的に有用な予後マーカーについてスクリーニングする。所与の癌または前癌状態の臨床的に有用な予後マーカーはいずれも、スクリーニング方法に含めることができる。いくつかの実施形態では、候補被験体の下位個体群は、治療の最新治療法が治癒的ではない、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を患う患者に相当し、スクリーニング方法に含まれる臨床的に有用な予後マーカーは、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８、β２ミクログロブリンおよび細胞遺伝学的マーカー、例えば、ｐ５３突然変異状態、ＡＴＭ突然変異状態および染色体欠失、例えば、染色体１７ｐ欠失および染色体１１ｑ欠失からなる群から選択される。このスクリーニング方法を用いて同定される下位個体群内の候補被験体は、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、抗ＣＤ４０治療薬に対する反応性についてさらにスクリーニングできる。
本発明はまた、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む癌を有する被験体の治療における、および異常なＣＤ４０発現および／またはシグナル伝達に関連した悪性腫瘍に発達する危険にある前癌状態を有する被験体の治療における抗ＣＤ４０治療薬の有効性をモニターする方法を提供する。このように、本明細書に開示されたｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて先にスクリーニングされている場合も、されていない場合もある、抗ＣＤ４０治療薬を用いる療法を受けている被験体を、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療後の、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存および／または１種以上のＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のうち少なくとも１種のバイオマーカーの発現のｉｎ ｖｉｖｏ変化についてモニターする。アッセイされる特定のバイオマーカーは、上記の治療薬の作用様式に基づいて選択できる。あるいは、またはさらに、被験体は、抗ＣＤ４０治療薬を用いた治療後の、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０抗原、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０の循環レベルおよびｓＣＤ４０Ｌの循環レベルからなる群から選択される１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルのｉｎ ｖｉｖｏ変化についてモニターできる。このように、被験体から第１の生体サンプルを得、これらのバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子のうち１種以上の発現レベルについてアッセイし、アッセイされた各因子のベースライン発現レベルを得、次いで、被験体から１以上の次の生体サンプルを得、同一バイオマーカー（類）および／またはＣＤ４０関連因子（類）についてアッセイするが、ここで、次の生体サンプルは、注目する抗ＣＤ４０治療薬の少なくとも１用量の投与後に得る。モニタリングは、抗ＣＤ４０治療薬が被験体に投与される任意の所与の治療プロトコールの有効性を確かめるために単一時点で行ってもよいし、複数時点で行ってもよい。アッセイされているバイオマーカーに応じて、任意の２時点間のバイオマーカーの発現レベルの低下または増大が、癌または前癌状態の治療における抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示すものであり得る。モニタリングが、１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルの低下を示す場合には、このような結果は、癌または前癌状態の治療における抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示すものであり得る。
生体サンプル中のこれらの種々のバイオマーカーおよびＣＤ４０関連因子、ならびにいずれかの臨床的に有用な予後マーカーの発現レベルは、例えば、免疫組織化学技術または核酸ベースの技術、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを用いてタンパク質または核酸レベルで検出できる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のバイオマーカーの発現におけるレベルの上昇または増大が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対する正の治療反応を示す。その他の実施形態では、少なくとも１種のバイオマーカーの発現におけるレベルの低下または減少が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対する正の治療反応を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＣＤ４０受容体を標的とし、ＡＤＣＣ調節し、ＣＤ４０シグナル伝達、特に、ＣＤ４０の、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との相互作用によって媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路を干渉するか、または両方である抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する被験体を同定する方法を対象とする。一実施形態では、本方法は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達と関連している３種のバイオマーカー、特に、細胞増殖または生存および細胞アポローシス経路のバイオマーカーならびにＡＫＴ、ＮＦ−κＢおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路をはじめとする重要なＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの発現レベルに対する、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉するアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療薬の効果をモニターするためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。本明細書において後述されるように、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉するアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療薬の効果をモニターするために役立ち得るさらなるマーカーとして、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を介してアップレギュレートされるサイトカインが挙げられる。細胞アポトーシス経路のバイオマーカーはまた、ＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬、例えば、作用様式としてＡＤＣＣを有する抗ＣＤ４０抗体の効果をモニターするために役立ち得る。本明細書において「ＣＤ４０アンタゴニスト」と呼ばれる、ＣＤ４０シグナル伝達のアンタゴニストとして作用する治療薬は、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０受容体との結合によって、通常、誘発される１種以上のシグナル伝達合図を干渉し得る。本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、ＣＤ４０アンタゴニストを用いた介入およびＣＤ４０を標的とし、ＡＤＣＣを調節する治療薬から恩恵を受ける被験体と、これらの種類の治療薬を用いた介入が有益にならないものとを識別することができる。さらに、またはあるいは、候補被験体を、１種以上のＣＤ４０関連因子および／または１種以上の臨床的に有用な予後マーカーの有無、またはその上昇したか、減少したレベルについてスクリーニングして、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入から恩恵を受ける候補被験体の個体または下位個体群を規定できる。これらのスクリーニング方法において同定された被験体を、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いてさらにスクリーニングすることができる。本明細書に記載されるバイオマーカーおよびＣＤ４０関連因子はまた、ＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性のモニタリングにおいて、および個々の癌患者または癌患者の下位個体群における薬剤反応性の根拠の調査においても用途を見い出せる。
本明細書において「腫瘍」とは、悪性であろうと良性であろうと、すべての腫瘍性細胞成長および増殖ならびにすべての前癌状態および癌性細胞および組織を指す。本明細書において「腫瘍性」とは、悪性であろうと良性であろうと、異常な組織成長をもたらす任意の形の調節不全のまたは未制御の細胞成長を指す。したがって、「腫瘍性細胞」は、調節不全のまたは未制御の細胞成長を有する悪性および良性細胞を含む。
用語「癌」および「癌性」とは、通常、未制御の細胞成長を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指すか、説明する。癌の例としては、それだけには限らないが、リンパ腫および白血病および充実腫瘍が挙げられる。「Ｂ細胞関連癌」または「Ｂ細胞系統の癌」とは、調節不全のまたは未制御の細胞成長がＢ細胞と関連しているいずれの種類の癌も意味する。
癌との関連で「不応性」とは、特定の治療薬を用いる療法に対して耐性であるか、非反応性である特定の癌を意味する。癌は、特定の治療薬を用いる治療の開始から（すなわち、治療薬に対する最初の曝露に対して非反応性である）か、または、治療薬を用いる第１の治療期間の過程にかけてか、もしくは、治療薬を用いる次の治療期間の間のいずれかの、治療薬に対する耐性の発生の結果としてのいずれかで、特定の治療薬を用いる療法に対して不応性であり得る。
「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」または「ＣＤ４０」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する膜貫通糖タンパク質を意味とする（例えば、米国特許第５，６７４，４９２号および同４，７０８，８７１号、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ ８：１４０３、Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３６：３３、Ｂａｒｃｌａｙ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｔｈｅ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ（２ｄ ｅｄ．； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）参照のこと）。ヒトＣＤ４０遺伝子の選択的スプライスによる転写物変異体によってコードされるこの遺伝子の２種のアイソフォームが同定されている。第１のアイソフォーム（「長いアイソフォーム」または「アイソフォーム１」としても知られる）は、最初の１９残基によって表されるシグナル配列を有する、２７７アミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０参照のこと）によってコードされる配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ４３０４５として最初に報告され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２４１でアイソフォームとして同定された））として発現される。第２のアイソフォーム（「短いアイソフォーム」または「アイソフォーム２」としても知られる）は、同様に、最初の１９残基によって表されるシグナル配列を有する、２０３アミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５２８５４）によってコードされる配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６９０５９３））として発現される。ヒトＣＤ４０のこれらの２種のアイソフォームの前駆体ポリペプチドは、共通のそれらの最初の１６５残基（すなわち、配列番号１０および配列番号１２の残基１〜１６５）を共有している。短いアイソフォーム（配列番号１０で示される）の前駆体ポリペプチドは、コーディングセグメントを欠く転写物変異体（配列番号９）によってコードされ、翻訳フレームシフトをもたらし、得られるＣＤ４０アイソフォームは、短い、ＣＤ４０の長いアイソフォームに含まれるもの（配列番号１２の残基１６６〜２７７に示されるＣ末端）とは別個のＣ末端（配列番号１０の残基１６６〜２０３）を含む。本発明の目的上、用語「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」または「ＣＤ４０」は、ＣＤ４０の短いアイソフォームおよび長いアイソフォームの両方を包含する。
本明細書において他で記載されるように、ＣＤ４０抗原は、種々の細胞種の表面にディスプレイされる。「表面にディスプレイされた」および「表面に発現された」とは、ＣＤ４０抗原のすべてまたは一部が細胞の外部に曝されることを意味する。ディスプレイされたまたは発現されたＣＤ４０抗原は完全にまたは部分的にグリコシル化されている場合がある。
「アゴニスト活性」は、物質がアゴニストとして機能することを意味する。アゴニストは、細胞上の受容体と結合し、受容体の天然リガンドによって開始されるものと同様または同一の反応または活性を開始する。ＣＤ４０のアゴニストは、それだけには限らないが、以下の反応のいずれかまたはすべてを誘導する：Ｂ細胞増殖および分化、抗体産生、細胞内接着、Ｂ細胞記憶生成、アイソタイプスイッチ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーションおよび炎症性サイトカイン、例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦの分泌。「アンタゴニスト活性」とは、物質がアンタゴニストとして機能することを意味する。ＣＤ４０のアンタゴニストは、ＣＤ４０受容体の、アゴニストリガンド、特に、ＣＤ４０Ｌとの結合によって誘導される任意の反応の誘導を妨げるか、減少させる。アンタゴニストはアゴニスト結合に対する反応のいずれか１種以上の誘導を、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは、７０％、８０％、８５％、最も好ましくは、９０％、９５％、９９％または１００％減少させることができる。ＣＤ４０リガンド結合特異性および抗ＣＤ４０治療薬、例えば、抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト活性を測定する方法は、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、標準競合結合アッセイ、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするためのアッセイＢ細胞増殖アッセイ、バンチェロー（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）様Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産生についてのＴ細胞ヘルパーアッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイの同時刺激およびＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションのアッセイが挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ００／７５３４８および米国特許第６，０８７，３２９号に開示されるようなアッセイを参照のこと。また、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日に出願された「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された仮出願および譲渡された米国特許出願第６０／５１７，３３７号（それぞれ、代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））および同６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））および２００４年１１月４日に出願され、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開され、同様に「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））も参照のこと。これらの各々の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
「顕著な」アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される、中立物質または陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％大きいアゴニスト活性を意味する。「顕著な」アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される、中立物質または陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも２倍大きいか、少なくとも３倍大きいアゴニスト活性であることが好ましい。したがって、例えば、注目するＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合には、「顕著な」アゴニスト活性は、中立物質または陰性対照によって誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍大きいか、少なくとも３倍大きいＢ細胞増殖のレベルの誘導である。一実施形態では、非特異的免疫グロブリン、例えば、ＣＤ４０と結合しないＩｇＧ１は陰性対照として働く。「顕著なアゴニスト活性がない」物質は、中立物質または陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性の最大約２５％大きいアゴニスト活性を示し、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される、中立物質または陰性対照によって誘導されるアゴニスト活性よりも最大約２０％大きい、１５％大きい、１０％大きい、５％大きい、１％大きい、０．５％大きいまたはさらに最大約０．１％大きいことが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。このような抗体は、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原と結合している場合は、上記のように顕著なアゴニスト活性がない。本発明の一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１つの細胞応答において顕著なアゴニスト活性がない。本発明のもう１つの実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、２以上の細胞応答（例えば、増殖および分化、または増殖、分化およびＢ細胞の抗体産生）のアッセイにおいて顕著なアゴニスト活性がない。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書において後述されるように、注目する抗ＣＤ４０治療薬は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、完全ヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはＣＨＩＲ−５．９、またはその抗原結合性断片である。
任意の当技術分野で公知のアッセイを用いて、抗ＣＤ４０治療薬が１以上のＢ細胞応答のアンタゴニストとして作用するかどうかを調べることができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、Ｂ細胞増殖、Ｂ細胞分化、抗体産生、細胞内接着、Ｂ細胞記憶生成、アイソタイプスイッチ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーションおよび炎症性サイトカイン、例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦの分泌からなる群から選択される少なくとも１種のＢ細胞応答のアンタゴニストとして作用する抗ＣＤ４０抗体である。特に注目されるのは、ヒトＢ細胞の表面にあるヒトＣＤ４０抗原と結合している場合には、Ｂ細胞増殖に関して顕著なアゴニスト活性がないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。
このような一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞増殖アッセイ、例えば、本明細書において以下、実施例６に記載されるものにおいて測定されるＢ細胞増殖のアンタゴニストであり、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、中立物質または陰性対照によって誘導されるＢ細胞増殖よりも最大約２５％高いレベルでＢ細胞増殖を刺激し、中立物質または陰性対照によって誘導されるＢ細胞増殖よりも２０％大きい、１５％大きい、１０％大きい、５％大きい、１％大きい、０．５％大きいまたはさらに最大約０．１％大きいことが好ましい。
その他の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞増殖アッセイ、例えば、本明細書において以下、実施例６に記載されるものにおいて測定される、別の抗ＣＤ４０抗体、例えば、Ｓ２Ｃ６抗ＣＤ４０抗体によって誘導される、Ｂ細胞増殖のアンタゴニストであり、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でその他の抗ＣＤ４０抗体によって刺激されるＢ細胞増殖のレベルは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でその他の抗ＣＤ４０抗体によって誘導されるＢ細胞増殖の最大約２５％であり（すなわち、少なくとも７５％阻害）、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でその他の抗ＣＤ４０抗体によって誘導されるＢ細胞増殖の最大約２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに最大約０．１％が好ましい。
さらにその他の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書において以下、実施例６において記載されるＢ細胞活性化アッセイにおいて測定される、細胞株ＥＬ４Ｂ５によって誘導されるＢ細胞増殖のアンタゴニストであり、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でＥＬ４Ｂ５細胞株によって刺激されるＢ細胞増殖のレベルは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でこの細胞株によって誘導されるＢ細胞増殖の最大約２５％である（すなわち、少なくとも７５％阻害）であり、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でこの細胞株によって誘導されるＢ細胞増殖の最大約２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに約０．１％が好ましい。
さらにその他の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書において以下、実施例６に記載される、Ｂ細胞による抗体産生についてのヒトＴ細胞ヘルパーアッセイにおいて測定される、ヒトＢ細胞によるヒトＴ細胞誘導性抗体産生のアンタゴニストである。このように、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下、Ｔ細胞によって刺激されたＢ細胞によるＩｇＧ抗体産生、ＩｇＭ抗体産生またはＩｇＧおよびＩｇＭ両方の抗体産生のレベルが、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でＴ細胞によって刺激されたＢ細胞によるそれぞれの抗体産生の最大約５０％であり（すなわち、少なくとも７５％阻害）、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下でＴ細胞によって刺激されたＢ細胞によるそれぞれの抗体産生の最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらに約０．１％が好ましい。
「ＣＤ４０リガンド」とは、１種以上のＣＤ４０シグナル伝達経路と結合し、活性化できるいずれかのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。したがって、「ＣＤ４０リガンド」としては、それだけには限らないが、全長ＣＤ４０リガンドタンパク質ならびにＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達と結合し、刺激するという機能を実施するのに十分な活性を保持するその変異体および断片が挙げられる。天然ＣＤ４０リガンド、例えば、ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１５４としても知られる）の修飾としては、それだけには限らないが、置換、欠失、末端切断、伸長、融合タンパク質、断片、ペプチドミメティクスなどが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは、生体サンプルのＣＤ４０発現腫瘍性細胞でのＣＤ４０シグナル伝達を刺激するための、可溶性ＣＤ４０Ｌ、例えば、可溶性組換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｎｇｈａｍ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の使用を含む。 「ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達」とは、細胞表面受容体ＣＤ４０の、ＣＤ４０リガンドとの相互作用に起因するいずれかの生物活性を意味する。ＣＤ４０シグナル伝達の例としては、ＣＤ４０発現細胞増殖および生存ならびにＣＤ４０発現細胞内の１以上のＣＤ４０シグナル伝達経路の刺激をもたらすシグナルがある。ＣＤ４０「シグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）」または「シグナル変換経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）」とは、ＣＤ４０受容体の、ＣＤ４０リガンド、例えば、ＣＤ４０Ｌとの相互作用に起因し、シグナル経路によって伝達された場合に、シグナル伝達カスケード中の１種以上の下流分子の活性化をもたらすシグナルを生じる、少なくとも１種の生化学的反応または生化学的反応の一群を意味するものとする。シグナル伝達経路は、細胞表面ＣＤ４０受容体から細胞の原形質膜を超えて、１種以上の一連のシグナル伝達分子を介して、細胞の細胞質を介して、時には、細胞の核へシグナルの伝達を導くいくつかのシグナル伝達分子を含む。本発明の特に注目されるものとして、ＣＤ４０シグナル伝達経路、例えば、ＡＫＴの活性化および最終的にＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介したＮＦ−κＢの活性化をもたらすＡＫＴシグナル伝達経路、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路、例えば、それぞれ、ＥＲＫおよびｐ３８の活性化をもたらす、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路およびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路がある。これらのシグナル伝達経路の活性化およびブロッキングの間のバランスが、以下、本明細書に記載される細胞生存またはアポトーシスのいずれかに有利に働く。
本発明の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイおよび、検出ステップにおいて、またはこれらのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいて試験されている候補抗ＣＤ４０治療薬として抗体を用いる予後アッセイを対象とする。以下の用語および定義はこのような抗体に当てはまる。
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造特徴を有する糖タンパク質である。これらの用語は同義的に用いられる。いくつかの例では、免疫グロブリンの抗原特異性が公知である場合がある。
用語「抗体」は広義で用いられ、完全に組み立てられた抗体、抗原と結合できる抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体など）および前記のものを含む組換えペプチドを意味する。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」とは、実質的に均質な抗体集団、すなわち、少量で存在し得る、天然に存在する可能性のある突然変異を除いて同一である集団を含む個別の抗体から得られた抗体を指す。
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびもう一方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間の配列において大きく異なるという事実を指す。可変領域は、抗原結合特異性を付与する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分配されているわけではない。軽鎖および重鎖可変ドメイン双方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域にセルされている（ｃｅｌｌｅｄ）。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβプリーツシート配置を採る４つのＦＲ領域を含み、３つのＣＤＲによって連結され、これはループ連結を形成し、βプリーツシート構造の一部形成する場合もある。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接近してまとまっており、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌ Ｎｏ．９１−３２４２、Ｖｏｌ．Ｉ、ｐａｇｅｓ ６４７−６６９参照のこと）。定常ドメインは抗体を抗原と結合させることに直接関与していないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞毒性における抗体の参加、補体依存性細胞傷害性の阻害および肥満細胞脱顆粒を示す。
本明細書において、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中、残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中、３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）を含む：Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中、残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中、（Ｈｌ）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｌｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基であると、本明細書では考える。
「抗体断片」は、無傷の抗体、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域の一部を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１０５７−１０６２）、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つ同一の抗原結合性断片が生じ、各々、１つの抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片とを含み、その名前は容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋できるＦ（ａｂ’）２断片が生じる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合で結合している、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインからなる二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。合わせて、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみしか含まないＦｖの半分）も、完全結合部位よりもより低い親和性でであるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基、例えば、抗体ヒンジ領域由来の１個以上のシステインが加わっていることがＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有しているＦａｂ’の意味である。Ｆａｂ’断片はＦ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド架橋の還元によって生じる。抗体断片のその他の化学的カップリングも公知である。
脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリンｓ）の「軽鎖」はいずれも、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の一方に割り当てることができる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、υ、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）活性を有する。
本明細書において用いられる場合、語句「標識」は、抗体と直接的にまたは間接的に結合しており、「標識された」抗体を生じる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体検出可能である場合もあるし（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学変化を触媒する場合もある。
本明細書において「宿主細胞」とは、組換えベクターまたはその他のトランスファーポリヌクレオチドの受容者として使用できるか、使用されている単細胞実体としての微生物または真核細胞または培養細胞株を指し、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異のために、形態においてまたはゲノムＤＮＡもしくは全ＤＡＮ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一ではない場合があるということは理解される。
「ヒトエフェクター細胞」は、１種以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。この細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を実施することが好ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、通常、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体を単離することに加えて、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ定常領域に対して非ＡＤＣＣ抗体由来の可変領域または可変領域断片を設計することによって、このようなＡＤＣＣ媒介性抗体を作製できることは留意されたい。
用語「Ｆｃ受容体」またはＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するよう用いられる。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体と結合するもの（γ受容体）であり、これとしてはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライスされた形も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２； Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−３４１に概説されている。今後同定されるものを含め、その他のＦｃＲｓは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語はまた、新生児受容体、母のＩｇＧの胎児への移行に関与しているＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）。
ヒト抗体を作製するには、いくつかの方法がある。例えば、分泌細胞をエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に感染させることによって不死化させることができる。しかし、ＥＢＶ感染細胞はクローニングすることが困難であり、通常、比較的低い収率でしか免疫グロブリンを産生しない（Ｊａｍｅｓ ａｎｄ Ｂｅｌｌ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １００：５−４０）。規定の組合せのトランスフォーミング遺伝子を導入することによって、将来、ヒトＢ細胞の不死化が達成できる可能性がある。このような可能性は、ＳＶ４０ラージ腫瘍性タンパク質およびＨ−ｒａｓの発癌性対立遺伝子とともの、テロメラーゼ触媒サブユニットの発現が、正常ヒト上皮細胞および繊維芽細胞の腫瘍性変換をもたらしたということが最近実証されたことによって浮き上がっている（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：４６４−４６８）。現在、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生がない状態でヒト抗体のレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−３７０に概説される、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１； Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６； Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３； Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：７２２−７２７）。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすということが記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５）。このような生殖細胞系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８）。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６）は、抗原でチャレンジすると、高親和性完全ヒト抗体を生成するトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、メガ塩基対のヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の、上記のような内因性ＪＨセグメントに欠失のあるマウスへの生殖系列組込みによって達成された。これらのマウス（ゼノマウス（登録商標）ＩＩテクノロジー（Ａｂｇｅｎｉｘ； Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））は、約６６のＶＨ遺伝子、完全ＤＨおよびＪＨ領域、および３つの異なる定常領域を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、また、３２のＶκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスにおいて産生される抗体は、ヒトにおいて見られるものと、遺伝子再構成、アセンブリーおよびレパートリーをはじめ、あらゆる点で酷似している。ヒト抗体は、マウス遺伝子座における遺伝子再構成を妨げる内因性セグメントの欠失のために内因性抗体を上回って優先的に発現される。このようなマウスは、特に注目される抗原を用いて免疫化できる。
このように免疫化された動物から得た血清を、初回抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングできる。リンパ球をリンパ節または脾臓細胞から単離でき、ＣＤ１３８陰性およびＣＤ１９陽性細胞を選択することによってＢ細胞をさらに選択できる。一態様では、このようなＢ細胞培養物（ＢＣＣ）を骨髄腫細胞と融合して、上記で詳述したハイブリドーマを作製することができる。
もう１つの態様では、このようなＢ細胞培養物を、初回抗原に対する反応性についてさらにスクリーニングできることが好ましい。このようなスクリーニングとして、標的／抗原タンパク質を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、注目する抗原と結合する既知抗体を用いる競合アッセイおよび標的抗原を発現する一過性にトランスフェクトされたＣＨＯまたはその他の細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合が挙げられる。
本発明の予後アッセイに用いる、バイオマーカー、サイトカインマーカー、ＣＤ４０関連因子および臨床的に有用な予後マーカー
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞生存、増殖、アポトーシスおよびＣＤ４０シグナル伝達経路のうち１種以上のバイオマーカーの発現レベルの変化をモニターするためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは単独で用いてもよく、またはその他の予後アッセイ、例えば、その他のＣＤ４０関連因子の発現に基づいて、および／または抗ＣＤ４０治療薬によって用いられるものとは異なる作用様式を有する標準治療薬を用いる治療介入で不良予後を示すその他の臨床的に有用な予後マーカーの発現の有無または発現の増大もしくは低下に基づいて抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対して反応性である、癌または前癌状態を有する候補被験体を同定する予後アッセイと併用してもよい。「抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に反応性」とは、候補被験体（すなわち、以下、本明細書に記載される癌または前癌状態を有する個体）が、抗ＣＤ４０治療薬で治療された場合に、治療が求められる癌または前癌状態に対して正の治療反応を有することを意味する。
ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいて使用するためのバイオマーカー
シグナル伝達経路は、シグナル伝達を促進するタンパク質ファミリー特徴とする。用語「ファミリー」とは、タンパク質および核酸分子に言及する場合は、共通構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書に定義される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する２種以上のタンパク質または核酸分子を意味するものとする。このようなファミリーメンバーは天然に存在するものである場合もあり、天然に存在しないものである場合もあり、同一または異なる種のいずれかに由来するものである場合もある。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質、ならびにヒト起源のその他の別個のタンパク質を含み得るか、あるいは、非ヒト起源の相同体を含み得る。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有し得る。
セリン／トレオニンキナーゼのＡＫＴ（プロテインキナーゼＢについてはＰＫＢと呼ばれることもある）ファミリーは、細胞増殖、生存および代謝に一体的に関与している。ＰＫＢは最初、レトロウイルス癌遺伝子として同定された。現在、ＡＫＴファミリーの３種の変異体、４８０残基ＡＫＴ−１、４８１残基ＡＫＴ−２および４７９残基ＡＫＴ−３が特性決定されている。悪性腫瘍におけるＡｋｔ遺伝子の役割は、いくつかの癌におけるＡＫＴタンパク質の、その増幅および／または過剰発現によって示されている。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００２）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １４：３８１−３９８； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：５９８５−５９９１； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２７９３−２８０１； Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２１：８１−８６； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９７３−２９７７； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ．３８６：２９３−３０１参照のこと。本発明の目的上、ＡＫＴファミリーのタンパク質のメンバーは、通常、ＡＫＴタンパク質と呼ばれるが、本発明の方法は、ＡＫＴの３種の形すべて、すなわち、ＡＫＴ−１、ＡＫＴ−２およびＡＫＴ−３ならびにその変異体に当てはまることは認識される。
ＡＫＴは、ＰＨ（プレクストリン相同性）ドメインを含む増殖因子調節性セリン／トレオニンキナーゼである。このＰＨドメインは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビホスフェートおよびホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェートの脂質生成物と相互作用し、これがＡＫＴの細胞のサイトゾルからその原形質膜への輸送をもたらす。この輸送は、ＡＫＴを上流活性化キナーゼ、ＰＤＫｌ（ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）に提示するために必要である。種々の生存および増殖因子、例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、インスリン、トロンビンおよびＮＧＦが、ＡＫＴの輸送を活性化することがわかっている。ＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質の活性化された（すなわち、リン酸化された）形は、多数の基質、例えば、ＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）、ｅＮＯＳ（内皮一酸化窒素合成酵素）、ＦＫＨＲ１（フォークヘッド転写因子ファミリーメンバー１）、Ｂａｄ（Ｂｃｌ−２アポトーシス促進性ファミリーメンバー）およびｐ２１ ＣＩＰ（細胞周期進行の阻害剤）をリン酸化する。これらの作用は、さまざまな生物学的効果、例えば、アポトーシスの抑制、グルコース代謝の制御、細胞増殖、転写、翻訳、細胞遊走および血管新生をもたらし得る。ＡＫＴタンパク質は、細胞が癌性となった場合にはその活性化と関連する抗アポトーシス活性を有する。ＡＫＴのリン酸化は、細胞周期およびアポトーシスに関与する基質の核−細胞質局在を誘発すると考えられている。これは、結果的に悪性腫瘍になる事象、例えば、増殖シグナル自律性の獲得、アポトーシスシグナルに対する非感受性、無制限の複製、持続性の血管新生、組織浸潤および転移の宿主をもたらす。
活性化ＡＫＴ（すなわち、ｐ−ＡＫＴ）は、下流エフェクター分子のリン酸化を含むいくつかの別個の経路によって細胞生存を促進する。第１に、ｐ−ＡＫＴは、Ｂａｄ／Ｂｃｌ−ｘｌ複合体のＢａｄ成分をリン酸化することによってアポトーシスを阻害する。リン酸化されたＢａｄは、１４−３−３と結合し、Ｂａｄ／Ｂｃｌ−ｘｌ複合体の解離を引き起こし、それによってＢｃｌ−ｘｌを遊離させ細胞生存を可能にする。第２に、Ｉカッパ−Ｂ（Ｉκ−Ｂ）ファミリーの阻害タンパク質との結合によって細胞質において不活性で保たれているＮＦ−κＢを、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）との相互作用によって活性化できるか、またはＡＫＴシグナル伝達経路によって活性化できる。このように、活性化ＡＫＴ（すなわち、ｐ−ＡＫＴ）は、Ｉκ−Ｂキナーゼ多タンパク質複合体（ＩＫＫ−α／β）の中間体リン酸化を介して、Ｉκ−Ｂファミリー（例えば、Ｉκ−Ｂα）のＮＦ−κＢ阻害分子を活性化し、Ｉκ−Ｂの活性化は、その分解およびそれまでに結合していたＮＦ−κＢの放出をもたらし、これがこの転写因子の活性化をもたらす。次いで、ＮＦ−κＢの活性型は核に移動し、数百の遺伝子の発現を調節してアポトーシスに対抗することができる。ＡＫＴが細胞生存を促進し、アポトーシスに対抗するもう１つの手段は、プロテアーゼカスパーゼ９またはフォークヘッド転写因子、例えば、ＦＫＨＲＬ１をリン酸化することによってである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックするか、干渉する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する被験体を同定するための本発明の方法は、ＡＫＴおよびＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介してＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果をモニターするためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。このように、候補被験体から採取した試験生体サンプルを、注目する抗ＣＤ４０治療薬と、本明細書において以下に記載されるＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、そのサンプルを、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＰＩ３Ｋ（ｐ−ＰＩ３Ｋ）、リン酸化ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）、リン酸化ＩＫＫ−α／β（ｐ−ＩＫＫ−α／β）、リン酸化Ｉκ−Ｂ（ｐ−Ｉκ−Ｂ、例えば、ｐ−Ｉκ−Ｂα）および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される少なくとも１種のＣＤ４０シグナル伝達バイオマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。対照生体サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーションに応じた、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプル中のこれらのリン酸化バイオマーカーの発現レベルの低下の検出は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、ひいては、その抗ＣＤ４０治療薬を用いた正の治療転帰を示す。いくつかの実施形態では、ＡＫＴおよびＮＦ−κＢシグナル伝達経路によるＣＤ４０シグナル伝達の任意の所与のバイオマーカーの発現レベルが、対照生体サンプルにおいて検出されるものと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用はまた、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路およびＭＥＫＫ／ＪＮＫＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路を含むＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの活性化ももたらす。すべてのＭＡＰＫ経路は、逐次リン酸化事象によって働き、転写因子をリン酸化し、遺伝子発現を調節する。それらはまた、細胞質標的をリン酸化し、細胞内事象を調節できる。これらのカスケードは、細胞増殖、分化、発達、細胞周期および発癌性シグナルの伝達の調節にかかわっている。本発明の方法にとって特に興味深いことは、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路の活性化である。
ＭＡＰキナーゼ（細胞外シグナル調節プロテインキナーゼまたはＥＲＫとも呼ばれる）は、３キナーゼカスケード中の終末酵素であり、各酵素は、シークエンス中の次のメンバーをリン酸化することによって活性化する。各ＭＡＰＫモジュールは、３種のプロテインキナーゼ：次いで、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する、ＭＡＰＫキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化するＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫＫ）からなる。ＭＥＫＫは、１種以上のＭＥＫ酵素を、触媒コア内のＳｅｒまたはＴｈｒ残基（Ｓｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）で二重リン酸化することによって活性化するセリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼである。ＭＥＫは、ＭＡＰＫのＴＸＹコンセンサス配列内のＴｈｒおよびＴｙｒ双方をリン酸化することによってＭＡＰＫを活性化するセリン／トレオニン／チロシン特異的プロテインキナーゼである。この二重リン酸化が活性化には必要である。ＥＲＫ１（ｐ４４）、ＥＲＫ２（ｐ４２）、ｐ３８／ＨＯＧおよびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路中の関連しているが別個の末端ＭＡＰＫを表す。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する被験体を同定するための本発明の方法は、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８経路を介してＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果をモニターするためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。このように、候補被験体から採取した試験生体サンプルを、注目する治療薬と、以下に記載されるＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、そのサンプルを、リン酸化ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）、例えば、ｐ−ＭＥＫ１、ｐ−ＭＥＫ２、ｐ−ＭＥＫ３およびｐ−ＭＥＫ６、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）、例えば、ｐ−ＥＲＫ１またはｐ−ＥＲＫ２ならびにリン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）からなる群から選択される少なくとも１種のＣＤ４０シグナル伝達バイオマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。対照生体サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーションに応じた、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む生体サンプル中のこれらのリン酸化バイオマーカーの発現レベルの低下の検出は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、ひいては、その抗ＣＤ４０治療薬を用いた正の治療転帰を示す。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８経路によるＣＤ４０シグナル伝達の任意の所与のバイオマーカーの発現レベルは、対照生体サンプルにおいて検出されるものと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。
ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックするか、干渉する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対する候補被験体の反応性はまた、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の任意のサイトカインマーカーの発現レベルに対する治療薬のｅｘ ｖｉｖｏ効果をモニターすることによって評価できる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＣＤ４０の、その天然リガンドによる結合が、ＣＤ４０発現細胞の種類に応じていくつかの炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションをもたらす。本明細書において後述されるように、正常Ｂ細胞のＥｘ ｖｉｖｏ ＣＤ４０Ｌ刺激は、いくつかのサイトカイン、例えば、それだけには限らないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）の産生のアップレギュレーションをもたらすが、腫瘍性Ｂ細胞、例えば、慢性リホシティック（ｌｙｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病細胞のｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ４０Ｌ刺激は、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１の産生のアップレギュレーションをもたらす。
本発明のスクリーニング方法に従って、候補被験体から採取した試験生体サンプルを、注目する抗ＣＤ４０治療薬と、本明細書において以下に記載されるＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、そのサンプルを、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＭｌＰ−１βからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。本明細書において後述されるように、サイトカインの発現レベルは当技術分野で公知の任意の検出方法を用いて達成できる。対照生体サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーションに応じた、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプル中のこれらのサイトカインマーカーの発現レベルの低下の検出は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、ひいては、その抗ＣＤ４０治療薬を用いた正の治療転帰を示す。いくつかの実施形態では、任意の所与のサイトカインの発現レベルは、対照生体サンプルにおいて検出されるものと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。
ＡＫＴ、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路は、すべて細胞増殖および生存に関与している。免疫系では、アポトーシスは、Ｔ細胞レパートリーの選択、自己反応性ＴおよびＢリンパ球の欠失、免疫応答の終結後の末梢エフェクターＴ細胞の除去、インムノロジカル（ｉｎｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）記憶の調節において、およびＣＴＬおよびＮＫ細胞による標的細胞の細胞傷害性において重要な役割を果たしている。Ｂ細胞系統の悪性腫瘍については、Ｂ細胞増殖とアポトーシス間のバランスの異常な調節が、腫瘍性Ｂ細胞の制御されない増殖をもたらす。腫瘍性Ｂ細胞に対してＣＤ４０生存シグナル伝達をブロックし、細胞アポトーシスプロセスを促進できるる治療薬は、Ｂ細胞系統の前癌状態および悪性腫瘍の治療において有益である。
したがって、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する被験体を同定するための本発明の方法は、腫瘍性細胞に対するＣＤ４０シグナル伝達をモニターすることに加え、１種以上のアポトーシスのバイオマーカー、特に、細胞アポトーシス促進性タンパク質、例えば、それだけには限らないが、切断されたカスパーゼタンパク質および切断されたポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の発現に対する抗ＣＤ４０治療の効果をモニターするｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。アッセイできるさらなるアポトーシスのバイオマーカーとして、それだけには限らないが、細胞表面の原形質膜の変化、例えば、細胞表面ホスファチジルセリン（ＰＳ）の存在およびゲノムＤＮＡの切断または断片化が挙げられる。ＰＳは通常、もっぱら原形質膜の内側に局在するが、細胞膜が無傷のままであるアポトーシス細胞死の初期相の間に細胞の外表面に移動される。本明細書において後述されるように、細胞表面ＰＳの存在およびゲノムＤＮＡ断片化は、例えば、それぞれ、アネキシンＶ染色およびＴＵＮＥＬ染色によって検出できる。対照生体サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーションに応じた、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプルにおけるこれらのアポトーシスのバイオマーカーのうち１種以上の発現レベルの増大の検出は、抗ＣＤ４０治療薬を用いた正の治療転帰を示す。いくつかの実施形態では、任意の所与のアポトーシスのバイオマーカーの発現レベルは、対照生体サンプルにおいて検出されるものと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％以上増大する。
あるいは、本発明の方法は、上記のｅｘ ｖｉｖｏアッセイと組合せて、細胞増殖および／または細胞生存のバイオマーカーである１種以上のタンパク質、例えば、それだけには限らないが、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）の発現に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果をモニターするｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。対照生体サンプルにおいて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーションに応じた、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプル中のこれらの細胞増殖および／または細胞生存のバイオマーカーの発現レベルの低下の検出は、その抗ＣＤ４０治療薬を用いた正の治療転帰を示す。いくつかの実施形態では、任意の所与の細胞増殖および／または細胞生存のバイオマーカーの発現レベルは、対照生体サンプルにおいて検出されるものと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。
カスパーゼファミリーのメンバーのタンパク質は、細胞アポトーシスの主要なエフェクターである。カスパーゼは、不活性のプロ型またはいわゆる「チモーゲン（ｚｙｍｏｇｅｎｓ）」として細胞内に存在するシステインプロテアーゼである。チモーゲンは、アポトーシスの死受容体により媒介される経路またはミトコンドリア経路のいずれかによるアポトーシスの誘導後に切断されて活性酵素を形成する。例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１５−２０参照のこと。アポトーシス経路に応じて、種々のカスパーゼがアポトーシスプロセスを開始し、カスパーゼ−８および−１０は死受容体経路を開始し、カスパーゼ−９はミトコンドリア経路を開始する。活性イニシエーターカスパーゼは、次いで、エフェクターカスパーゼ、例えば、カスパーゼ−３、−６および−７を活性化（すなわち、切断）し、アポトーシスを誘導する。これらのエフェクターカスパーゼは、重要な細胞タンパク質を切断し、アポトーシスを受けている細胞において観察される典型的な形態変化を導く。
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵をうける、癌または前癌状態を有する被験体を同定するための本発明の方法は、アポトーシスに関連する特異的細胞タンパク質のタンパク質分解をモニターするためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイの使用を含む。例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ−１）は、アポトーシスの間に特異的に切断される。ＰＡＲＰ−１は、いくつかの核タンパク質へのポリ（ＡＤＰ−リボース）鎖の付加を触媒するＤＮＡ結合タンパク質であり、ＤＮＡ損傷修復において重要な役割を果たしていると考えられている。ＰＡＲＰ−１は、細胞ストレス、例えば、熱ショック、電離放射線、発癌物質に対する曝露および化学療法薬での治療の際に迅速に活性化される（Ｓｃｏｖａｓｓｉ ａｎｄ Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：１２５−１３７； Ｗｙｌｌｉｅ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３：１８９−１９７）。アポトーシスの間に、活性化された（すなわち、切断された）カスパーゼ−３は、次いで、ＰＡＲＰ−１を切断する。実際、８９ｋＤａおよび２４ｋＤａのタンパク質分解断片の分離が、アポトーシスの特徴として認められている（Ｓｃｏｖａｓｓｉ ａｎｄ Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９９９）前掲； Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）前掲。本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、かつ／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬に応じた、候補被験体から採取した試験生体サンプルにおける、１種以上の切断されたカスパーゼタンパク質、例えば、切断されたカスパーゼ−３、切断されたカスパーゼ−７および切断されたカスパーゼ−９のレベル、ならびに、場合により、切断されたＰＡＲＰ−１、細胞表面ＰＳおよび／またはゲノムＤＮＡ断片化のレベルの変化をモニターする。生体サンプル内のアポトーシスバイオマーカーのレベルの上昇は、本明細書において以下に記載されるものをはじめとする当業者に公知の任意の方法を用いて検出できる。
細胞生存および増殖のバイオマーカーとしては、それだけには限らないが、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーのタンパク質である抗アポトーシスタンパク質が挙げられる。Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、少なくとも１６メンバーを含み、細胞アポトーシスの調節に関与している。いくつかのファミリーメンバー、例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ、ＭｃＩ−１、Ｂｃｌ−ｗおよびＡ１は抗アポトーシス性、ひいては、細胞生存のバイオマーカーであり、その他のもの（例えば、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｍｆ、Ｂａｄ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＢｏｋ）はアポトーシス促進性、ひいては、アポトーシス活性のバイオマーカーである。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、多数の異なる機序、例えば、それによってシトクロムｃ（Ｃｙｔ ｃ）およびその他の膜間タンパク質が脱出し得るミトコンドリア外膜における孔形成によって、およびアポトーシス促進性および抗アポトーシス性ファミリーメンバー間のヘテロ二量化によって作用すると示唆されている。
ＣＤ４０シグナル伝達およびアポトーシスの調節に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果は、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて評価し、これらの細胞生存／アポトーシスのバイオマーカーのうち１種以上をモニターすることができる。特に注目される細胞生存のバイオマーカーとして、それだけには限らないが、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘｌおよびＭｃｌ−１が挙げられる。
ミトコンドリア膜タンパク質Ｂｃｌ−２をコードするｂｃｌ−２遺伝子は、Ｂ細胞リンパ腫において最初に同定され（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１０９７）、これでは原因遺伝子病変は、ｂｃｌ−２遺伝子を免疫グロブリンプロモーターの制御下に置く染色体転座（ｔ（１４：１８））として特性決定されている。得られたＢｃｌ−２の過剰発現は、そうでなければＢ細胞ホメオスタシスを維持するアポトーシス細胞死の正常な経過を遅らせ、Ｂ細胞蓄積および濾胞性リンパ腫をもたらす（Ａｄａｍｓ ａｎｄ Ｃｏｒｙ、１９９８； Ｃｏｒｙ（１９９４）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３４５：２８９）。この知見は、癌は無制限の細胞増殖に厳密に起因するわけではなく、不十分なアポトーシスによるターンオーバーによる場合もあることを示した。Ｂｃｌ−２レベルは、濾胞性リンパ腫の他、広範なその他のヒト癌において上昇しており、このことは、この分子が、広範囲の癌性障害におけるアポトーシス閾値の上昇において役割を有している可能性があることを示す。Ｂｃｌ−２は、ホモ二量体として存在する場合があり、またはｂａｘとヘテロ二量体を形成する場合がある。ｂａｘは、ホモ二量体として機能し、アポトーシスを誘導する。しかし、ｂａｘ−Ｂｃｌ−２複合体の形成はアポトーシスをブロックする。Ｂｃｌ−２発現はまた、薬剤耐性の発生において役割を果たし得る。Ｂｃｌ−２の発現は、ｐ５３によって負に調節される。Ｂｃｌ−２の過剰発現は前腫瘍性病変には存在せず、このことは、Ｂｃｌ−２の変化は腫瘍進行において比較的遅くに生じることを示唆する。
ｂｃｌ−２遺伝子に対して相同性を有するいくつかの遺伝子、例えば、以下のものがその後特性決定された：ＧＭ−ＣＳＦまたはＬＰＳに応じてマクロファージにおいて迅速に誘導される８０アミノ酸のＡ１タンパク質をコードするａｌ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１９７９−１９８８）；ｍｃｌ−１、マクロファージ分化を起こす骨髄系細胞株における初期応答遺伝子（Ｋｏｚｏｐａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５１６−３５２０）およびｂａｋ、アポトーシスを増強し得るｂｃｌ−２相同体（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：７３３； Ｋｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：７３６）。ｂｃｌ−２遺伝子産物と相互作用し、かつ／またはそれと構造的に関連しているその他のタンパク質、例えば、Ｂｃｌ−ｘｌおよびＢｃｌ−ｘｓ（Ｂｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：５９７）、Ｃｅｄ−９（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１９５５）なども同定されている。
ｂｃｌ−ｘ遺伝子産物、Ｂｃｌ−ｘはＢｃｌ−２タンパク質と密接に関連しており、同様に細胞をアポトーシスから保護する。ヒトＢｃｌ−ｘの選択的スプライシングの結果、少なくとも２種の別個のＢｃｌ−ｘ ｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘｌおよびＢｃｌ−ｘｓが生じ得る。より大きなｂｃｌ−ｘ ｍＲＮＡの主要なタンパク質産物（２３３アミノ酸）、Ｂｃｌ−ｘｌは、増殖因子の除去の際に細胞死を阻害し（Ｂｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：５９７−６０８）、そのトランスジェニック発現は胸腺細胞成熟を変更し、成熟胸腺細胞数の増大をもたらす（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：８２１−８２８； Ｇｒｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９７３−１９８３）。
骨髄系細胞白血病関連遺伝子ｍｃｌ−１は、骨髄系細胞白血病における分化のプログラミングの際に初期に発現されるタンパク質、ＭｃＩ−１をコードする（例えば、米国特許出願公開第２００２００８６３２１号参照のこと）。Ｍｃｌ−１のカルボキシル部分は、Ｂｃｌ−２と相同性を共有する。Ｍｃｌ−１は、Ｂｃｌ−２ファミリーのその他のメンバー同様、生存力から死または増殖から分化などの細胞運命における移行のプログラミングとの関連を特徴とする。報告によれば、ｍｃｌ−１遺伝子の高発現は、非ホジキンスリンパ腫における予後不良と関連している（Ｋｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１６：１５８−１６１）。さらに、報告によれば、比較的高レベルのｍｃｌ−１遺伝子発現は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）における高悪性度形態、高増殖状態およびｐ５３過剰発現と相関している（Ｋｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９：９０−９７）。
Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーに加え、本発明の方法において使用するための細胞生存バイオマーカーとして、バキュロウイルスＩＡＰ遺伝子と関連しているアポトーシスの阻害剤の遺伝子ファミリーのメンバーが挙げられる（Ｂｉｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２５２１−２５２８； Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：５２１２−５２２２； Ｄｕｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９６）１５：２６８５−２６９４； Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８３：１２５３−１２６２； Ｌｉｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９：３４９−３５３； Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８３：１２４３−１２５２； Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８０：１６７−１７８）。少なくとも８種のヒトＩＡＰが同定されている（Ｓａｌｖｅｓｅｎ ａｎｄ Ｄｕｃｋｅｔｔ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：４０１−４１０）。
ＩＡＰは、進化的に高度に保存されている。それらは１〜３個の約７０アミノ酸のアミノ末端Ｃｙｓ／ＨｉｓバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）に、またＲＩＮＧフィンガーと呼ばれるカルボキシ末端亜鉛結合ドメインによって組織される類似の構造を共有している。ＩＡＰファミリータンパク質はアポトーシスおよび腫瘍形成の調節において重要な役割を有する可能性があると認識されている（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ａｎｄ Ｒｅｅｄ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３：２３９−２５２； Ｔａｍｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：１７９６−１８０３）。スルビビン、ＩＡＰファミリータンパク質の１種の発現は、いくつかのヒト癌において大幅に増大している（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２４７−３２５７）。また、ｃ−ＩＡＰ２は粘膜関連リンパ組織リンパ腫の原因遺伝子として、また、発癌および腫瘍進行において役割を有すると示唆されている（Ｄｉｅｒｌａｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：３６０１−３６０９）。
ＩＡＰは、上流および末端カスパーゼを阻害することによって細胞死を抑制する（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５６参照のこと）。カスパーゼ−３および−７の活性な（すなわち、切断された）形は、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ１およびｃ−ＩＡＰ２によって直接阻害され（例えば、Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、前掲参照のこと）、これはまた、プロカスパーゼ−３、−６および−７のタンパク質分解によるプロセシングも、プロカスパーゼ−９のシトクロムｃ誘導性活性化をブロックすることによって妨げ得る（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２２１５−２２２３）。ＩＡＰファミリーのメンバーと関連しているアポトーシスの種々の阻害剤をコードする核酸の治療上および診断上の使用は特許文献に記載されている。例えば、国際特許出願ＷＯ９７／０６２５５、ＷＯ９７／２６３３１およびＷＯ９７／３２６０１参照のこと。細胞生存のバイオマーカーとして使用できるＩＡＰタンパク質の例として、それだけには限らないが、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰｌ、ｃＩＡＰ２およびスルビビンが挙げられる。
ＸＩＡＰは、カスパーゼの最も広く発現され、最も強力なカスパーゼの阻害剤である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７７８７； Ｒｅｅｄ（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２４：１参照のこと）。報告によれば、このＩＡＰの発現は特定の癌および癌細胞株において高められている（Ｋｏｒｎｂｌａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１７５８； Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：３３７９； Ｔａｍｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：１７９６−１８０３）。ＸＩＡＰのダウンレギュレーションは、化学耐性ヒト卵巣癌細胞においてアポトーシスを誘導することがわかっている（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６：８２９）。
スルビビンは、単一のＢＩＲと、ＲＩＮＧフィンガーの代わりに高度に帯電したカルボキシル末端コイルドコイル領域とを含有する約１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質であり（例えば、米国特許出願公開２００３０１００５２５参照のこと）、これは、Ｂ細胞前駆体に導入した場合に、増殖因子（ＩＬ−３）除去によって誘導されるアポトーシスを阻害する（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：９１７−９２１）。スルビビンは、Ｂｃｌ−２またはその他のＩＡＰタンパク質とは異なり、成体組織では検出不可能であるが、肺、結腸、胸部、膵臓および前立腺の最もよく見られるヒト癌すべてにおいて、また、ｉｎ ｖｉｖｏで高悪性度非ホジキンスリンパ腫の約５０％において顕著に発現されるようになる。報告によれば、スルビビンは、野生型ｐ５３によって負に調節される。外因性スルビビンタンパク質の過剰発現は、細胞をｐ５３誘導性アポトーシスから用量依存的に救出し、このことはスルビビンの喪失が少なくとも幾分か、ｐ５３依存性アポトーシス経路を媒介することを示唆する（Ｍｉｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１ ：２６１３−２６２２）。
本発明の方法において使用するためのもう１つの代表的な細胞生存のバイオマーカーとして、ＴＲＡＦ−１がある。ＴＲＡＦファミリーメンバーはＣＤ４０の細胞質ドメインと結合し、Ｂ細胞生存、増殖、分化、アイソタイプスイッチ、胚中心の発達および体液性記憶応答を調節する複数のシグナル伝達経路の活性化を媒介する（例えば、Ｐｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４２４６−１４２５４参照のこと）。ＣＤ４０受容体の活性化がＴＲＡＦ−１遺伝子の転写をもたらし得るということが報告されている（Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２７）：１９３６８−１９３７４）。ＣＤ４０受容体活性化の結果としてのＴＲＡＦ−１遺伝子発現の増大は、正常Ｂ細胞および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞において差別的に調節され得る（Ｇｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４（１３）：４００２−４００９）。したがって、ＴＲＡＦ−１遺伝子発現に対する効果は正常Ｂ細胞におけるＣＤ４０活性を示すものである場合も示すものでない場合もあるが、腫瘍性血液細胞におけるＣＤ４０受容体活性化に応じたＴＲＡＦ−１遺伝子発現の変化は薬物有効性を予測するものであり得、これによってＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果および細胞生存／アポトーシスの調節を評価かつ／またはモニターするための適したバイオマーカーを提供する。ＴＲＡＦ−１発現の変化は、本明細書において後述されるように、ノーザンブロットまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの技術によってｍＲＮＡレベルで、または例えば、ウエスタンブロットによってタンパク質レベルでのいずれかで容易に検出できる。
前述の細胞生存のバイオマーカーは、これらのバイオマーカーのうち１種またはすべてを含む任意の組合せで、ならびに、その他の細胞増殖のバイオマーカーと組合せて、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいてモニターできる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイはまた、候補被験体から得た試験生体サンプルにおいて細胞増殖バイオマーカーＫｉ６７の発現をモニターするために用いられる。
Ｋｉ６７は、分裂細胞のＧ１、Ｓ、ＭおよびＧ２相にある細胞の核に存在するが、静止状態の細胞のＧ０相には存在しない細胞周期関連核タンパク質である（Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３、１７１０−１７１５）。これらの理由のために、細胞増殖マーカーとして用いられる。また、侵襲性乳癌（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１８：３７４−８１）および肺腺癌（Ｈａｇａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７５：１７２７−３２）において予後良好および予後不良カテゴリーを階層化するために用いられてきた。Ｋｉ６７の高発現はまた、卵巣癌における不良予後と関連している（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．５３：３０１−６； Ｈｅｎｚｅｎ−Ｌｏｇｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７：４６８−７２； Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ（１９８９）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．９６：７２０−４）。さらに、Ｋｉ６７タンパク質発現のアンチセンス抑制は細胞増殖を妨げることがわかっている（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２３：５１３−５２２）。
したがって、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイにおいてモニターされるバイオマーカーとしては、上記の細胞生存およびアポトーシスタンパク質および本明細書において先に記載されるＣＤ４０シグナル伝達経路に関与するタンパク質が挙げられる。モニタリングはタンパク質レベルであっても、核酸レベルであってもよい。したがって、バイオマーカーとしては、これらのタンパク質およびこれらのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。検出がタンパク質レベルである場合には、バイオマーカータンパク質は、全長ポリペプチドまたはその任意の検出可能な断片を含み、これらのタンパク質配列の変異体を含み得る。同様に、検出がヌクレオチドレベルである場合には、バイオマーカー核酸としては、全長コード配列、全長コード配列の断片、これらの配列の変異体、例えば、天然に存在する変異体もしくはスプライス変異体またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡが挙げられる。バイオマーカー核酸としてまた、ＲＮＡ、例えば、注目するバイオマーカータンパク質をコードする全長配列を含むｍＲＮＡ、注目する全長ＲＮＡ配列の断片またはこれらの配列の変異体が挙げられる。バイオマーカータンパク質およびバイオマーカー核酸はまた、これらの配列の変異体を含む。「断片」とは、ポリヌクレオチドの一部またはアミノ酸配列の一部、ひいては、それらによってコードされるタンパク質を意味する。バイオマーカーヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、通常、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００または１，４００の隣接するヌクレオチドまたは、最大、本明細書に開示される全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド数を含む。バイオマーカーポリヌクレオチの断片は、通常、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００または２５０の隣接するアミノ酸、または、最大、本発明の全長バイオマーカータンパク質中に存在する全アミノ酸数をコードする。「変異体」とは、実質的に類似の配列を意味するものとする。通常、本発明の個々のバイオマーカーの変異体は、そのバイオマーカーに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有することが、当技術分野で公知の配列アラインメントプログラムによって調べられる。これらのマーカー各々のタンパク質および対応するコード配列は当技術分野で公知である。本明細書において以下、実施例５中表６参照のこと。
その他の予後アッセイにおいて使用するためのＣＤ４０関連因子および臨床的に有用な診断マーカー
本発明の方法に従って、１種以上のＣＤ４０関連因子の有無またはそのレベルの上昇もしくは低下を探す予後アッセイを用いて、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵をうける、癌または前癌状態を有する個体または患者の下位個体群も同定できる。これらのＣＤ４０関連因子に基づいて、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に反応性であると同定される被験体を、抗ＣＤ４０治療薬を用いて治療できる。あるいは、例えば、癌または前癌状態が、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックするか、ＡＤＣＣ活性を調節するか、これらの作用様式の両方を有する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対してより反応性であるかどうかを同定するための、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療からの利益の可能性についてそれらをさらにスクリーニングできる。
注目するＣＤ４０関連因子としては、それだけには限らないが、細胞表面ＣＤ４０抗原の発現レベル、細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベル、可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）の循環レベルおよび可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の循環レベルが挙げられる。このように、候補被験体から採取した生体サンプルを、少なくとも１種のこれらのＣＤ４０関連因子の発現レベルについて分析する。これらのＣＤ４０関連因子の発現レベルを、ＣＬＬおよびＢ細胞系統のその他の癌の予後マーカーとして使用できる。それらは抗ＣＤ４０治療薬に応答する、または応答しない被験体の診断薬として有用であり得る。
当技術分野で公知の任意の方法をこれらのマーカーの分析に使用できる。例えば、候補被験体から得られた血液サンプル中のｓｓＣＤ４０またはｓＣＤ４０Ｌの循環レベルを、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫測定法、放射免疫分析（ＲＩＡ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、ウエスタンブロット、多重化技術またはその他の同様の方法によって測定できる。ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌの細胞表面発現は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロット、免疫沈降、磁性ビーズ選択およびこれらの細胞表面マーカーのいずれかを発現する細胞の定量化によって測定できる。ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ ＲＮＡ発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑｔ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはその他の同様の技術によって測定できる。ＣＤ４０抗原、ＣＤ４０Ｌおよび可溶性ＣＤ４０Ｌの配列は、当技術分野で公知である。例えば、本明細書において、以下実施例５中表７参照のこと。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０を単離し、配列決定し、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞によって分泌されるｓＣＤ４０と、これらの細胞の表面からタンパク質分解によって切断されたｓＣＤ４０の間の差異を確認する。分泌されたｓＣＤ４０および／またはタンパク質分解によって切断されたｓＣＤ４０の発現レベルを、病状および／または注目する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対する疾患の反応性と関連づけることができる。
本発明のその他の実施形態では、候補被験体を、当技術分野で公知の１種以上の臨床的に有用な予後マーカーについてスクリーニングすることによって、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、癌または前癌状態を有する患者の下位個体群を同定する。任意の当業者に公知の臨床的に有用な予後マーカーを使用できる。いくつかの実施形態では、下位個体群は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者を含み、特に注目される臨床的に有用な予後マーカーとして、それだけには限らないが、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８、β２ミクログロブリンおよび細胞遺伝学的マーカー、例えば、ｐ５３突然変異状態、ＡＴＭ突然変異状態、染色体欠失、例えば、染色体１７ｐ欠失および染色体１１ｑ欠失が挙げられ、そのすべてがこの疾患の臨床的に有用な予後マーカーである。したがって、一実施形態では、候補被験体の下位個体群は、治療の最新治療法が治癒的ではないが、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療が有益であるＣＬＬを有する患者に相当する。
ＺＡＰ−７０は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）のζサブユニットと結合しており、Ｔ細胞活性化および発達において極めて重要な役割を果たすチロシンキナーゼである（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６４９−６６２）。ＺＡＰ−７０はチロシンリン酸化を受け、ＴＣＲ刺激後のシグナル伝達の媒介において必須である。チロシンキナーゼの過剰発現または構成的活性化がいくつかの悪性腫瘍、例えば、白血病および数種の充実腫瘍に関与していることが実証されている。例えば、ＺＡＰ−７０ＲＮＡ発現レベルの増大は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の予後マーカーである（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１６３９−１６４７）。ＺＡＰ−７０は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞において発現されるが、正常Ｂ細胞において発現されることは知られていない。しかし、ＺＡＰ−７０は慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）患者、より詳しくは、突然変異していないＩｇ遺伝子を有するＣＬＬ／ＳＬＬ患者において見られる、より侵攻性の臨床経過を有する傾向のある一部のＣＬＬ患者のＢ細胞では高レベルで発現される（Ｗｉｅｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：４９４４−４９５１；米国特許出願公開第２００３０２０３４１６）。ＺＡＰ−７０発現レベルとＩｇ遺伝子突然変異状態の間の相関関係のために、ＺＡＰ−７０を、重篤な疾患を有する可能性が高く（高ＺＡＰ−７０、突然変異していないＩｇ遺伝子）、従って積極的治療の候補である患者を同定するための予後指標として使用できる。
ＣＤ３８はシグナル伝達分子ならびにサイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）の合成および分解を触媒する外酵素である。ＣＤ３８発現は、骨髄前駆体Ｂ細胞において高レベルで存在し、休止正常Ｂ細胞ではダウンレギュレートされ、次いで、最終分化した形質細胞において再度発現される（Ｃａｍｐａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１６９−１８８）。ＣＤ３８は、Ｂ−ＣＬＬにおける信頼できる予後指標であり、通常、ＣＤ３８の発現はあまり良好でない転帰を示す（Ｄ’Ａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ４２：１０９； Ｄｅｌ Ｐｏｅｔａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：２６３３； Ｄｕｒｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：３０； Ｉｂｒａｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：１８１； Ｄｅａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：２１４６−２１５５）。ＣＤ３８発現が関連している好ましくない臨床的適応として、進行した段階の疾患、化学療法に対する反応性低下、初期治療が必要とされる前の短い時間および短い生存時間が挙げられる（Ｄｅａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：２１４６−２１５５）。最初に、ＣＤ３８発現とＩｇＶ遺伝子突然変異の間の強力な相関関係が観察され、突然変異していないＶ遺伝子を有する患者は、突然変異したＶ遺伝子を有するものよりも高いパーセンテージのＣＤ３８＋Ｂ−ＣＬＬ細胞を示す（Ｄａｍｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９４：１８４０−１８４７）。しかし、その後の研究により、ＣＤ３８発現はＩｇＶ遺伝子の再配列と常に相関しているわけではないということが示された（Ｈａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９：１０２３； Ｔｈｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：１８９２）。
ｐ５３は、腫瘍サプレッサーとして作用する核リンタンパク質である。野生型ｐ５３は、細胞増殖および分裂の調節に関与している。ｐ５３はＤＮＡと結合し、細胞分裂刺激性タンパク質（ｃｄｋ２）と相互作用するタンパク質（ｐ２１）の産生を刺激する。ｐ２１がｃｄｋ２と結合している場合には、細胞は細胞分裂の次の段階へ入ることからブロックされる。突然変異ｐ５３はＤＮＡと効率的に結合できないために、ｐ２１が細胞分裂の停止シグナルとして作用するのを妨げ、その結果、制御されない細胞分裂および腫瘍形成がもたらされる。ｐ５３はまた、ＤＮＡ損傷、細胞ストレスまたはいくつかの癌遺伝子の異常発現に応じてプログラム細胞死（アポトーシス）の誘導を調節する。いくつかの癌細胞株における野生型ｐ５３の発現は増殖抑制コントロールを回復させることがわかっている（Ｃａｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１７９１−１７９７； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：７３４−７３６）。ｐ５３の突然変異は、ほとんどの腫瘍の種類、例えば、結腸、胸部、肺、卵巣、膀胱および多数のその他の臓器の腫瘍において見られる。ｐ５３突然変異は、バーキットリンパ腫、Ｌ３型Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病と関連していることがわかっている（Ｇａｉｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５４１３−５４１７）。ｐ５３異常性は、Ｂ細胞前リンパ球性白血病と関連していることもわかっている（Ｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２０１５−２０２３）。ｐ５３の遺伝子は、染色体１７の短腕上、ｌ７ｐｌ３．１０５−ｐｌ２に位置する。
β２ミクログロブリンは、クラスＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣ）のα鎖と非共有結合している細胞外タンパク質である。血清において検出可能であり、ＣＬＬ（Ｋｅａｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ８６：６０６ａ）およびホジキンスリンパ腫（Ｃｈｒｏｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９５：２５３４−２５３８）における有害な予後指標である。血清β２−ミクログロブリンレベルが腫瘍細胞負荷、予後および疾患活性と関連している、リンパ球増殖性疾患、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫のために臨床的に使用されている（Ｂａｔａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ ５５：４３９−４４７； Ａｖｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｒｅｖ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｃｌｉｎ．４４：２１５−２２０）。β２ミクログロブリンはまた、骨髄腫患者のステージングにおいても有用である（Ｐａｓｑｕａｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２７：１１２３−１１２６）。
細胞遺伝学的異常はまた、現在の癌療法に対する不良な反応を予測するためのマーカーとして使用できる。染色体異常が大部分のＣＬＬ患者に見られ、ＣＬＬの経過を予測するのに役立つ。例えば、１７ｐ欠失は侵攻性の疾患進行を示す。さらに、染色体１７ｐ欠失またはｐ５３における突然変異、または両方を有するＣＬＬ患者は、化学療法薬およびリツキシマブに対して不良にしか反応しないことがわかっている。染色体１７ｐでの対立遺伝子欠失もまた、結腸直腸癌における有用な予後マーカーであり得、これでは、１７ｐが欠失している患者は結腸直腸癌における疾患の広がりやすさの増大と関連している（Ｋｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ ７３：２８−３５）。
染色体１１（１１ｑ）の長腕の欠失は、種々の種類のリンパ球増殖性障害において最も頻繁に起こる構造的染色体異常の１種である。染色体１１ｑが欠失しており、おそらくはＡＴＭ突然変異を有するＣＬＬ患者は、この欠陥または１７ｐ欠失のいずれかを有さない患者と比較して生存率が低い。さらに、１１ｑ欠失は広範なリンパ節合併症を伴うことが多い（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２５１６−２５２２）。また、この欠失により、高用量療法および自己移植後に疾患持続の危険の高い患者が同定される。
毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）遺伝子は、細胞周期停止、アポトーシスおよびＤＮＡ二本鎖破損の修復と関与している腫瘍サプレッサー遺伝子である。染色体１１上に見られる。ＡＴＭ突然変異は、乳癌（Ｃｈｅｎｅｖｉｘ−Ｔｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９４：２０５−２１５； Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３３２５−３３３３）および／または若年性乳癌（Ｉｚａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２６：２８６−２９４； Ｔｅｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ ９２：４７９−４８７）の家族歴を有する女性の間の乳癌の危険の増大と関連している。また、横紋筋肉腫も、ＡＴＭ遺伝子突然変異／欠失と高頻度の関係がある（Ｚｈａｎｇ ｅｔａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：８７−９１）。
患者において染色体異常を検出する方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｃｕｎｅｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：１３７２−１３８０； Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２５１６−２５２２参照のこと）。突然変異したタンパク質、例えば、ＡＴＭを測定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｕｔｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：２３０２−２３０８参照のこと）。
したがって、既存の治療に対して反応の良くない癌患者の下位個体群を、現在用いられるアッセイ法、例えば、これらの臨床的に有用な予後マーカーのうち１種以上を用いる本明細書に開示される予後アッセイによって容易に同定できる。これらの臨床的に有用な予後マーカーに基づいて、これらの下位個体群の１つに入る被験体を同定すると、本明細書において上記で同定された１種以上のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、この被験体をさらにスクリーニングし、この被験体の、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣ活性を調節する抗ＣＤ４０治療薬での治療の利益を評価できる。
予後アッセイ
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、ＡＤＣＣを調節する、または両方である抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療的有用性の可能性を、ＣＤ４０発現細胞に対するＣＤ４０シグナル伝達の刺激によって媒介される、癌または前癌状態のための治療介入を必要とする候補被験体から採取される生体サンプルにおける細胞の増殖および生存、細胞アポトーシスおよびＣＤ４０シグナル伝達経路の１種以上の前記バイオマーカーの発現レベルの変化をモニターするｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて評価する。「ＣＤ４０発現細胞」とは、ＣＤ４０抗原を発現する、正常細胞、前癌細胞および悪性細胞を意味する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０発現細胞は悪性Ｂ細胞である、「悪性」Ｂ細胞は、任意の腫瘍性Ｂ細胞、例えば、それだけには限らないが、リンパ腫に由来するＢ細胞、例えば、低、中および高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、ホジキン病、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）誘導性リンパ腫およびＡＩＤＳ関連リンパ腫ならびにＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病などを意味する。その他の実施形態では、ＣＤ４０発現細胞は癌腫または肉腫細胞である。「ＣＤ４０発現癌腫細胞」またはＣＤ４０発現肉腫細胞」とは、任意の、ＣＤ４０細胞表面抗原を発現する、充実腫瘍の悪性（すなわち腫瘍性）または前癌性の癌腫または肉腫細胞を意味する。本発明の目的上、ＣＤ４０抗原を発現する、癌細胞および前癌性細胞または前癌状態の細胞は、「ＣＤ４０発現腫瘍性細胞」を指す。細胞におけるＣＤ４０発現を検出する方法は当技術分野では周知であり、それだけには限らないが、ＰＣＲ技術、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイから、生体サンプル内の注目する１種以上のバイオマーカーの発現レベルにおいて好都合な変化が得られる場合には、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入が正当化される。さらに、本明細書において論じられるバイオマーカー、サイトカインマーカーおよびＣＤ４０関連因子を用いて、本明細書において開示されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いてスクリーニングされている場合もされていない場合もある被験体における抗ＣＤ４０治療薬の治療有効性をモニターし、ひいては、同じ抗ＣＤ４０治療薬を用いるさらなる治療が正当化されるかどうか、または代替治療プロトコールが必要であるか、もしくは望ましいかどうかを調べることができる。抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療が正当化されると本発明の方法によって調べられる場合は、この治療薬を任意の適した投与経路によって投与できる。
ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、ＡＤＣＣを調節する、または両方である抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入が考慮されている候補被験体は、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞でのＣＤ４０シグナル伝達によって媒介される、いずれかの癌または前癌状態に苦しんでいるか、それを発症する危険にあるか、または再発する危険にある可能性がある。このような癌および前癌状態の例として、それだけには限らないが、Ｂ細胞系統の癌、非Ｂ細胞血液悪性腫瘍、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞でのＣＤ４０シグナル伝達によって媒介されることがわかっている充実腫瘍のいずれかが挙げられる。
ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含むＢ細胞系統の癌の例として、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患およびリンパ腫、例えば、それだけには限らないが、びまん性小リンパ球性リンパ腫、濾胞性、ＤＬＢＣＬ、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内リンパ腫症、免疫芽球性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫などがある。
したがって、本発明の方法は、異常な、制御できないＢ細胞増殖または蓄積と関連している非ホジキンスリンパ腫を有する被験体の同定および治療に用途が見出せる。本発明の目的上、このようなリンパ腫は、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ分類スキームに従って、低悪性度、中悪性度および高悪性度として分類されるＢ細胞リンパ腫を指す（「Ｔｈｅ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ」 Ｃａｎｃｅｒ ４９（１９８２）：２１１２−２１３５参照のこと）。したがって、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫は小リンパ性、濾胞性小開裂細胞および濾胞性小開裂混合型および大細胞型リンパ腫を含み、中悪性度リンパ腫は濾胞性大細胞、びまん性小開裂細胞、びまん性小細胞および大細胞混合型ならびにびまん性大細胞型リンパ腫を含み、高悪性度リンパ腫は大細胞型免疫芽球性、リンパ芽球性リンパ腫およびバーキット型および非バーキット型の小非切断細胞型リンパ腫を含む。
本発明の方法は、Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ分類（ＲＥＡＬ）システムに従って分類されるＢ細胞リンパ腫の同定および治療的処置において有用であるということは認識される。このようなＢ細胞リンパ腫としては、それだけには限らないが、前駆体Ｂ細胞新生物として分類されるリンパ腫、例えば、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、末梢Ｂ細胞新生物、例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）（例えば、びまん性小細胞型、びまん性小細胞および大細胞混合型ならびにびまん性大細胞型リンパ腫）、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、節外性、節性および脾性）、形質細胞腫／骨髄腫、サブタイプ縦隔原発のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（胸腺）、バーキットリンパ腫およびバーキット様高悪性度Ｂ細胞リンパ腫および分類できない低悪性度または高悪性度Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる。
また、これらのアッセイを用いて、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のモジュレーターを用いる治療から恩恵を受ける、ＭＧＵＳ（意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症）として知られる前癌状態の被験体を同定できる。ＭＧＵＳの患者の約２５％が、最終的に、多発性骨髄腫（ＭＭ）または関連形質細胞障害を発生する（Ｋｙｌｅ（１９９３）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ．Ｐｒｏｃ．６８：２６−３６）。骨髄における悪性形質細胞の増殖、血清または尿モノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）の検出、貧血、高カルシウム血症、腎不全および溶解性骨病変は、ＭＭの臨床症状であるが、ＭＧＵＳは臨床的に、ＭＭのその他の臨床特徴を伴わない血清または尿におけるＭタンパク質の存在として認識される（例えば、Ｋｙｌｅ ａｎｄ Ｌｕｓｔ（１９８９）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２６：１７６−２００； Ｇｒｅｉｐｐ ａｎｄ Ｌｕｓｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（１９９５）１３：１０−２１参照のこと）。ＭＧＵＳ患者は無症候性であり、Ｍタンパク質の安定な測定値を有する（Ｋｙｌｅ（１９９３）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ．Ｐｒｏｃ．６８：２６−３６）。被験体においてＭＧＵＳが同定されると、適当な抗ＣＤ４０治療薬、例えば、本明細書に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いた維持療法によって、これらの被験体における多発性骨髄腫の発生をブロックできる。したがって、本明細書に開示されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受けるＭＧＵＳの被験体を同定できる。あるいはまたはさらに、本明細書において他の場所に記載されるように、本明細書に記載されるバイオマーカー、サイトカインマーカーおよびＣＤ４０関連因子を用いて、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性をモニターできる。
特に、本発明の方法は、一次腫瘍治療性治療に対して不応性である（すなわち、耐性である、または耐性になった）Ｂ細胞リンパ腫、例えば、上記で列挙されるものの同定および治療にとって有用である。用語「腫瘍治療性」とは、癌の治療、例えば、化学療法、手術、放射線療法、単一抗癌抗体治療およびそれらの組合せを意味するものとする。ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、ＡＤＣＣを調節する、または両方である、１種以上の抗ＣＤ４０治療薬を用いた治療介入が望ましい患者の下位個体群を同定できる。
本発明の方法はまた、非Ｂ細胞関連血液悪性腫瘍の同定および治療にとって有用である。このような悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｅｓ）としては、それだけには限らないが、急性白血病、骨髄芽球白血病、急性骨髄性白血病、前骨髄球白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、顆粒球性白血病（慢性骨髄性白血病）、真性赤血球増加症などが挙げられる。
ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む充実腫瘍としては、それだけには限らないが、卵巣癌、肺癌（例えば、扁平上皮癌の非小細胞肺癌、腺癌および大細胞癌の種類および小細胞肺癌）、乳癌、結腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌をはじめとする）、膀胱癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌をはじめとする）、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、上咽頭癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌）、皮膚癌、例えば、黒色腫ならびに例えば、骨肉腫およびユーイング肉腫をはじめとする肉腫が挙げられる。
用語「予後」は当技術分野では認識されており、治療介入に対する反応のあり得る経過および疾患または疾患進行あり得る経過についての、特に、疾患寛解、疾患再発、腫瘍再発、転移および死亡の可能性に関する予測を包含する。本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、ＡＤＣＣを調節する、または両方である、個々の抗ＣＤ４０治療薬、または抗ＣＤ４０治療薬の種類に対する候補被験体の反応を予測できる。「候補被験体の反応を予測すること」とは、問題の被験体が個々の抗ＣＤ４０治療薬を用いて正のまたは負の転帰を経験する可能性の評価を意味する。本発明の目的上、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイに関連して「正の治療転帰を示す」とは、候補被験体が検討中の抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に応じて有益な結果を経験し、したがって、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入が正当化される可能性の増大を意味するものとする。対照的に、「負の治療転帰を示す」とは、患者が、検討中である抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入から恩恵を受けず、したがって、抗ＣＤ４００治療薬を用いる治療介入が正当化されない可能性の増大を意味するものとする。
ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入を用いて達成できる有益な結果として、何らかの正の治療反応が挙げられる。癌治療に関連して「正の治療反応」とは、疾患における改善、抗ＣＤ４０治療薬の抗腫瘍活性と関連した疾患の改善および／または注目する疾患に伴われる症状における改善を意味する。すなわち、抗増殖性効果、さらなる腫瘍の増殖の阻止、腫瘍の大きさの減少、癌細胞数の減少および／またはＣＤ４０発現細胞の刺激によって媒介される１以上の症状の減少を観察できる。したがって、例えば、正の治療反応とは、疾患における以下の改善のうち１以上を指す：（１）腫瘍の大きさの減少、（２）癌（すなわち、腫瘍性）細胞数の減少、（３）腫瘍性細胞死の増加、（４）腫瘍性細胞生存の阻害、（４）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（５）末梢臓器への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（７）さらなる腫瘍増殖の阻止、（８）患者生存率の増大および（９）癌と関連している１以上の症状のある程度の軽減。任意の所与の悪性腫瘍における正の治療反応は、その悪性腫瘍に特異的な標準化反応基準によって決定できる。
腫瘍反応は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線画像、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像、内視鏡検査および骨髄穿刺（ＢＭＡ）をはじめとする腫瘍生検サンプリングおよび循環中の腫瘍細胞の計数などのスクリーニング技術を用いて腫瘍形態（すなわち、全腫瘍量、腫瘍の大きさなど）の変化について評価できる。抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療を受けている被験体は、これらの正の治療反応に加え、疾患と関連している症状の改善について有益な効果を経験し得る。したがって、被験体は、Ｂ細胞腫瘍について、いわゆるＢ症状、すなわち、寝汗、発熱、体重減少および／またはじんま疹の減少を経験し得る。前癌状態については、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療薬は、関連する悪性腫瘍状態の発生、例えば、意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を患っている患者における多発性骨髄腫の発生前の時間をブロックおよび／または延長できる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用するためのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは、本明細書に記載される抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入のための予後を必要とする候補被験体から試験生体サンプルおよび対照生体サンプルを提供することと（試験および対照生体サンプルは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかでＣＤ４０リガンドで刺激されているＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む）、試験生体サンプルを、有効量の注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させることと、この試験生体サンプルにおいて、注目する抗ＣＤ４０治療薬の作用様式に応じて、細胞アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーおよび細胞生存のバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを検出するステップと、試験生体サンプル中のバイオマーカー（類）のレベルを、抗ＣＤ４０治療薬と接触していない対照生体サンプル中のバイオマーカー（類）のレベルと比較することとを含む。抗ＣＤ４０治療薬は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックもしくは干渉するか、またはこのシグナル伝達をブロックもしくは干渉し、またＡＤＣＣを調節するアンタゴニストである場合、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対して反応性である、癌または前癌状態を有する被験体同定するために、細胞の増殖および生存、アポトーシスおよびＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のこれらのバイオマーカーのいずれかまたはすべてについての本明細書に開示されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、治療薬の有益な効果の可能性を、単独で、またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達によってアップレギュレートされるサイトカインマーカーのアッセイおよび／または本明細書に記載される１種以上のＣＤ４０関連因子のアッセイと組合せて評価できる。抗ＣＤ４０治療薬がＡＤＣＣ活性の調節を介してその作用様式を有する場合、例えば、抗ＣＤ４０抗体は、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対して反応性である、癌または前癌状態を有する被験体を同定するために、１種以上のアポトーシスのマーカーについてのｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、治療薬の有益な効果の可能性を、単独で、または本明細書に記載される１種以上のＣＤ４０関連因子についてのアッセイと組合せて評価できる。
本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイに従って、注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させる試験生体サンプル中の１種以上のバイオマーカーおよび場合により１種以上のサイトカインマーカーの発現レベルを、対照生体サンプル中のバイオマーカー（類）および場合によりサイトカインマーカー（類）の発現レベルと比較する。「試験生体サンプル」とは、候補被験体から得られたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む生体サンプルを意味し、これを候補被験体の治療のために検討中の抗ＣＤ４０治療薬と接触させる。「対照生体サンプル」とは、同様に、ほぼ同じ数および同じ種類のＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含み、同一時間枠において、試験生体サンプルを得るために用いたものと同等の方法で候補被験体から得られたという点で試験生体サンプルに同等である生体サンプルを意味し、これを、注目する抗ＣＤ４０治療薬とは接触させないが、試験サンプルと同一実験条件に付す。試験生体サンプルおよび対照生体サンプルは、被験体から得られサブサンプルに分けられる単一の生体サンプルから提供されたものであってもよく、その一方が試験生体サンプルと呼ばれ、もう一方が対照生体サンプルと呼ばれる。あるいは、試験生体サンプルおよび対照生体サンプルは、２種以上の生体サンプルから提供されたものであってもよく、これはプールされ、次いで上記のサブサンプルに細分割される場合もあるし、または試験および対照生体サンプルに個別に相当する場合もある。
候補被験体から得られたＣＤ４０発現腫瘍性細胞は、生体サンプルの採取の先立ってｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４０Ｌによって構造的に刺激されている場合があるということは認識されるが、試験および対照生体サンプルのＣＤ４０発現腫瘍性細胞をｅｘ ｖｉｖｏで刺激し、その結果、ＣＤ４０関連活性に対する抗ＣＤ４０治療薬のアンタゴニスト効果、例えば、細胞増殖およびＣＤ４０シグナル伝達の刺激を効率的に評価できることが好ましい。
このように、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞の試験生体サンプルを、注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させる前に、候補被験体から採取した任意の所与の生体サンプル内のＣＤ４０発現腫瘍性細胞を、例えば、ＣＤ４０Ｌで刺激し、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイに用いられる、試験および対照生体サンプルのＣＤ４０発現腫瘍性細胞でのＣＤ４０シグナル伝達を確実にアップレギュレーションさせることができる。ＣＤ４０Ｌの供給源はいずれを使用してもよいが、例えば、それだけには限らないが、可溶性ＣＤ４０Ｌが挙げられる。その他の適したＣＤ４０刺激分子としては、例えば、ＣＤ４０の細胞外ドメインと特異的に結合するアゴニスト抗体が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、適したＣＤ４０刺激分子として、それだけには限らないが、膜結合型ＣＤ４０Ｌ（例えば、細胞の原形質膜と結合しているＣＤ４０Ｌ、例えば、ＣＤ４０Ｌを発現するホルムアルデヒドで固定されたＣＨＯ細胞形質転換体またはリポソームまたはミセルなどの合成脂質ベースの基質に組み込まれたＣＤ４０Ｌ）、可溶性ＣＤ４０Ｌ、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｇ２８−５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）およびそれらの混合物が挙げられる。１種以上のＣＤ４０シグナル伝達経路を刺激するために、採取した生体サンプルまたはそのサブサンプルの細胞と接触させる刺激分子の有効量は、用いるリガンドの種類（例えば、単量体または多量体、溶解度および透過性など）およびＣＤ４０発現腫瘍性細胞上のＣＤ４０受容体の存在量などの因子に応じて変わる。ＣＤ４０シグナル伝達を刺激するために、約１．０ｎＭと約１ｍＭの間のＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌが用いられることが好ましい。
いくつかの実施形態では、接触ステップの前に、生体サンプルまたはそのサブサンプルを可溶性ＣＤ４０ＬとともにＣＤ４０シグナル伝達を刺激するのに十分な時間インキュベートすることによって、生体サンプルまたはそのサブサンプル内のＣＤ４０発現腫瘍性細胞を可溶性組換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｎｇｈａｍ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて刺激する。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は約１０分〜約４時間である。インキュベーション期間の間に存在する可溶性ＣＤ４０Ｌの量は、滴定によって容易に求められる。このような一実施形態では、可溶性ＣＤ４０Ｌの量は約１μｇ／ｍｌである。試験生体サンプルを注目する抗ＣＤ４０治療薬と接触させるために許容されるプロトコールはいずれも、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイに使用できる。考慮されるべき因子として、それだけには限らないが、試験生体サンプルを含む容器内の、接触させる予定の細胞数；試験生体サンプルと接触させる予定の抗ＣＤ４０治療薬の濃度；抗ＣＤ４０治療薬の、試験生体サンプル中の細胞とのインキュベーション時間；適用される場合には、試験生体サンプルと接触させる予定の刺激分子、例えば、ＣＤ４０Ｌ、可溶性ＣＤ４０Ｌまたはその刺激性断片もしくは変異体の濃度、ならびに、適用される場合には、刺激分子の、試験生体サンプル中の細胞とのインキュベーション時間が挙げられる。このような因子の決定は、当業者ならば、試験されている生体サンプルの種類、保持容器の大きさ、容器中の液体の容量および試験される抗ＣＤ４０治療薬の化学組成（すなわち、大きさ、電荷など）などの変量に基づいて達成できる。
一実施形態では、適した数のＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプルまたはそのサブサンプルを９６ウェル組織培養ディッシュに加える。適した数の細胞とは、本明細書において他で記載される１種以上の検出方法用いて、ＣＤ４０により媒介される活性（すなわち、細胞増殖および細胞生存、アポトーシスのレベル、ＣＤ４０シグナル伝達経路）のうち１種以上の変化を検出するのを可能にするいくつかの細胞である。いくつかの実施形態では、適した数の細胞とは、９６ウェル組織培養ディッシュのウェルあたり約１〜約１×１０６個細胞の間である。細胞を組織培養ディッシュに加えた後、細胞を約０〜約９６時間の間プレインキュベートし、その後、細胞を抗ＣＤ４０治療薬と接触させてもよい。いくつかの実施形態では、細胞を本明細書において先に記載されるＣＤ４０刺激分子とともにプレインキュベートする。
抗ＣＤ４０治療薬の有効量を、試験生体サンプルの細胞に加え、注目するＣＤ４０により媒介される活性（すなわち、ＣＤ４０と結合する物質のＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達、ＡＤＣＣ活性、または両方）の調節を、本明細書において他で開示される１種以上の検出方法を用いて調節が検出可能であるように提供する。有効量は、当然ながら、試験されている抗ＣＤ４０治療薬に応じて変わる。一般に、抗ＣＤ４０治療薬の有効量は、９６ウェルプレートのウェルあたり約１ｎＭ〜約１０ｍＭの間である。一実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であり、有効量は約０．０１μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌおよび約０．０１μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌの間のその他のこのような値である。試験生体サンプルまたはそのサブサンプル内の細胞を、抗ＣＤ４０治療薬が細胞と相互作用し、１種以上の生体学的応答が生じるのを可能にするのに適した期間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬と試験生体サンプルまたはそのサブサンプルの細胞の間の好ましいインキュベーション時間は、約１分〜４８時間の間である。その他の実施形態では、インキュベーション時間は、約２０分、約３０分、約１時間、約４時間、約１２時間、約２２時間または約２４時間である。
試験および対照生体サンプルとして働く生体サンプル（類）は、ＣＤ４０抗原を発現する腫瘍性細胞を含む細胞、組織また体液の任意の収集物から提供されるものであり得る。このような生体サンプルの例として、それだけには限らないが、血液、リンパ、生検、塗布標本などが挙げられる。生体サンプルは、当技術分野で許容される任意の手順を用いて、例えば、体液の針吸引、組織サンプルの採取（すなわち、生検、例えば、細針吸引生検、コア針生検または切除生検）などによって候補被験体から採取できる。生体サンプルをアッセイの前に保存しなくてはならない場合には、生体サンプルをガラススライドに移し、その後、アッセイすることができ、または後の調製のために凍結させてもよいし、または固定液中に直ちに入れてもよい。
先に記載したように、タンパク質またはヌクレオチドレベルでの注目するバイオマーカーの検出は、当業者に公知の任意の検出方法を用いて達成できる。「発現を検出する」または「のレベルを検出する」とは、生体サンプル中のバイオマーカータンパク質または遺伝子の量または存在を調べることを意味する。したがって、「発現を検出する」は、バイオマーカーが、発現されない、検出可能に発現されない、低レベルで発現される、正常レベルで発現されるまたは過剰発現されると調べられる場合を包含する。ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療薬の効果を調べるために、ＣＤ４０リガンドを用いて刺激されている（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで）ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む試験生体サンプルを、抗ＣＤ４０治療薬と、治療薬が細胞反応を引き起こすのを可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、その試験生体サンプル中の１種以上の注目するバイオマーカーの発現レベルを、抗ＣＤ４０治療薬と接触させていない対照生体サンプルにおける発現レベルと比較する。いくつかの実施形態では、腫瘍性細胞の対照生体サンプルを、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を干渉しない中立物質または陰性対照と接触させる。例えば、一実施形態では、非特異的免疫グロブリン、例えば、ＣＤ４０と結合しないＩｇＧ１が、陰性対照として役立つ。検出を経時的推移にわたって行い、経時的なバイオマーカーの変化のモニタリングを可能にすることができる。また、検出を種々の濃度の抗ＣＤ４０治療薬に対する曝露を用いて行い、任意の所与の注目するバイオマーカーの「用量−反応」曲線を作製することもできる。
試験および対照生体サンプル内の、本発明のバイオマーカー、および場合によりサイトカインマーカーの発現を検出する方法は、これらのマーカーの量または存在を、核酸またはタンパク質レベルのいずれかで調べる任意の方法を含む。このような方法は当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫組織化学、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法および核酸増幅法が挙げられる。特定の実施形態では、バイオマーカーの発現を、例えば、特異的バイオマーカータンパク質に対する抗体を用いてタンパク質レベルで検出する。これらの抗体は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、多重化技術、免疫沈降または免疫組織化学技術など、種々の方法で使用できる。いくつかの実施形態では、サイトカインマーカーの検出は電気化学発光（ＥＣＬ）によって達成される。バイオマーカーおよび場合によりサイトカインマーカーのためのこれらの検出方法のいずれも、臨床情報の評価、従来の予後の方法、その他のＣＤ４０関連因子の発現、特に、細胞表面ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの発現および可溶性ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの循環レベルならびに当技術分野で公知の臨床的に有用な予後マーカー、例えば、それだけには限らないが、ＣＬＬ患者について本明細書において先に記載したもの（例えば、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８、β２ミクログロブリン、可溶性ＣＤ５２および細胞遺伝学的マーカー、例えば、ｐ５３突然変異状態、ＡＴＭ突然変異状態および染色体欠失、例えば、染色体１７ｐ欠失および染色体１１ｑ欠失の発現または存在と組合せることができる。このように、開示される方法は、癌または前癌状態が本明細書に開示される抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療介入から恩恵を受ける候補被験体のより正確な決定を可能にし得る。
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞と関連している癌または前癌状態を有する候補被験体を、注目する抗ＣＤ４０治療薬に対する反応性について、本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて試験し、１種以上のＣＤ４０により媒介される活性に対する治療薬の効果を評価する。ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイのさらなる改良が望ましい場合には、本明細書において上記で同定される１種以上のＣＤ４０関連因子、１種以上の臨床的に有用な予後マーカー、例えば、ＣＬＬ患者について本明細書において上記で同定されるもの、または両方の発現レベルまたはその発現がないことについて候補被験体を調べることができる。このように、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む生体サンプルを候補被験体から採取し、注目するＣＤ４０関連因子（類）および／または臨床的に有用な予後マーカー（類）の発現レベルまたはそれらの発現がないことについて評価することができる。本明細書において先に記載されるＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む生体サンプルはいずれも、これらの予後アッセイのために採取することができる。さらに、当業者に公知の任意の検出方法を用いて、本明細書において他で記載される注目するＣＤ４０関連因子（類）および／または臨床的に有用な予後マーカー（類）の発現レベルまたはそれらの発現がないことを検出できる。
抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に反応性である、癌または前癌状態を有する被験体を同定するために、１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルが評価される場合には、生体サンプルを被験体から採取し、そのサンプル中の発現のレベルを、対照または参照標準中のその因子（または複数の因子）の発現のレベルと比較する。細胞表面ＣＤ４０および／または細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベルについては、本明細書において先に記載される、ＣＤ４０発現および／またはＣＤ４０Ｌ発現腫瘍性細胞を含む任意の生体サンプルを使用できる。ｓＣＤ４０および／またはｓＣＤ４０Ｌの循環レベルについては、血液サンプルまたは血漿もしくは血清などの血液成分を含むサンプルを、候補被験体から得ることができる。「対照」または「参照標準」とは、同一の生物学的供給源（すなわち、組織または体液）のものである標準を意味し、これにより癌または前癌状態を有する被験体が、疾患に罹患していない健常な被験体と区別される。当業者ならば、年齢、性別、人種などについて制御した、疾患を有していない健常な被験体および疾患を有している被験体においてこれらのＣＤ４０関連因子（すなわち、細胞表面ＣＤ４０、細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０、ｓＣＤ４０Ｌ）の発現レベルの測定値をとることと、発現レベルを比較して、健常な被験体において予測される発現の標準レベルを求めることとによって参照標準を提供できる。いくつかの実施形態では、癌または前癌状態を有する候補被験体における発現レベルは、参照標準における発現レベルよりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％高い。抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の適用性は、１種以上のこれらのＣＤ４０関連因子の発現レベルを検出することによって評価でき、参照標準と比較した生体サンプルにおける発現のレベルの増大は、ＣＤ４０により媒介される活性、例えば、細胞生存および増殖ならびに／またはＡＤＣＣ活性に対する抗ＣＤ４０治療薬のｅｘ ｖｉｖｏ効果についてさらなるスクリーニングを行わなくとも、被験体が、注目する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対して反応性である癌または前癌状態を有することを証明するのに十分であるということは認識される。
本発明はまた、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを実施するためのキットを包含する。例えば、本キットは、生体サンプルにおいて本明細書に記載されるバイオマーカー、例えば、アポトーシス、細胞増殖または生存、またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーを、タンパク質または核酸レベルのいずれかで検出できる標識化合物または物質と、サンプルの、注目する抗ＣＤ４０治療薬ととものインキュベーション後にサンプル中のバイオマーカーの量を調べる手段（例えば、注目するバイオマーカーをコードするＲＮＡと結合する抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）とを含む。キットは、注目する個々のバイオマーカー各々を検出できる個別に標識された化合物または物質と、サンプル中の各バイオマーカーの量を検出するための手段とを含むことによって注目する複数のバイオマーカーの検出を可能にするようパッケージングできる。
キットはまた、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイから抗ＣＤ４０治療薬を用いて正の治療転帰を示す結果が得られる場合に、被験体を治療するための説明書を含み得る。
本キットは、抗体ベースのキットについて、例えば、以下のものを含み得る：（１）注目するバイオマーカーと結合する第１の抗体（例えば、固相支持体と結合している）と、場合により（２）バイオマーカーまたは第１の抗体と結合し、検出可能な物質とコンジュゲートしている第２の異なる抗体。本キットは、オリゴヌクレオチドベースのキットについては、例えば、以下を含み得る：（１）バイオマーカーをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能なように標識されたオリゴヌクレオチドまたは（２）注目するバイオマーカーをコードする核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマー。本キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質分解防止剤を含み得る。本キットはまた、検出可能な物質を検出するために必要な成分（例えば、酵素または基質）を含み得る。本キットはまた、アッセイされ、含まれる試験サンプルと比較され得る、対照サンプルまたは一連の対照を含み得る。キットの各成分は、通常、個別の容器内に入れられ、種々の容器のすべては、試験される被験体が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療のための候補であるかどうかを観察するための説明書とともに単一パッケージ内にある。
検出方法
候補被験体の生体サンプルにおいて、注目するバイオマーカー、サイトカインマーカーまたはＣＤ４０関連因子タンパク質（例えば、細胞生存または増殖のバイオマーカー、アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、循環可溶性ＣＤ４０もしくはＣＤ４０Ｌ、細胞表面ＣＤ４０もしくはＣＤ４０Ｌまたは臨床的に有用な予後マーカー、例えば、ＣＬＬ患者のＺＡＰ−７０、ＣＤ３８およびβ２ミクログロブリン）を特異的に同定し、定量する手段はいずれも考慮される。したがって、いくつかの実施形態では、バイオマーカータンパク質またはその生物学的に活性な変異体と特異的に相互作用できる結合タンパク質によって、生体サンプル中のその注目するバイオマーカータンパク質の発現レベルを検出する。標識抗体、その結合部分またはその他の結合パートナーを使用できることが好ましい。単語「標識」とは、本明細書において用いられる場合、「標識化された」抗体が生じるよう抗体と直接的または間接的にコンジュゲートされた、検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自身で検出可能（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）である場合もあり、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学変換を触媒することができる。
バイオマーカータンパク質の検出のための抗体は、起源はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、合成によってまたは組換えによって作製したものであってもよい。複合タンパク質の量、例えば、結合タンパク質、例えば、バイオマーカータンパク質と特異的に結合する抗体と結合しているバイオマーカータンパク質の量は、当業者に公知の標準タンパク質検出方法論を用いて求める。免疫学的アッセイ設計、理論およびプロトコールのについての詳細な総説は、当技術分野における多数の教本に見ることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ））； Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照のこと）。
標識抗体を用いてタンパク質を検出するために種々のアッセイが利用可能である。一段階アッセイでは、検出しようとする注目する標的タンパク質を、存在する場合には、固定化し、標識抗体とともにインキュベートする。標識抗体は、固定化された標的タンパク質分子と結合する。結合していない分子を除去するために洗浄した後、サンプルを標識の存在についてアッセイする。標準形式では、サンプルあたり単一のタンパク質をアッセイする。より新しいマルチプレックス技術を用いれば、単一のサンプルにおいて各検出抗体に対して種々の標識を用いることによって複数のタンパク質をアッセイできる。
二段階アッセイでは、固定化された、注目する標的タンパク質分子を、標識化されていない抗体とともにインキュベートする。標的タンパク質−標識化されていない抗体複合体が存在すれば、次いで、これを標識化されていない抗体に特異的である二次標識抗体と結合させる。サンプルを洗浄し、標識の存在についてアッセイする。
抗体を標識するために用いるマーカーの選択は適応に応じて変わる。しかし、当業者ならば、マーカーの選択は容易に決定することができる。これらの標識抗体は、イムノアッセイにおいて、ならびに組織学的適用において使用し、注目する任意のバイオマーカーまたはタンパク質の存在を検出することができる。標識抗体はポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。さらに、注目するタンパク質の検出に用いる抗体は、本明細書において他で記載される、放射性原子、酵素、発色団部分もしくは蛍光部分または比色定量タグを用いて標識できる。タギング標識の選択はまた、望ましい検出限界に応じて変わる。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、通常、酵素タグがついた複合体の、酵素基質との相互作用によって形成された着色した生成物の検出を可能にする。検出可能な標識として役立ち得る放射性核種として、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２およびＰｄ−１０９が挙げられる。検出可能な標識として役立ち得る酵素の例として、それだけには限らないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発色団部分としては、それだけには限らないが、フルオレセインおよびローダミンが挙げられる。抗体は、当技術分野で公知の方法によってこれらの標識とコンジュゲートさせることができる。例えば、酵素および発色団分子を、カップリング剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどによって抗体とコンジュゲートさせることができる。あるいは、コンジュゲーションはリガンド−受容体対によって起こる場合がある。適したリガンド−受容体対の例として、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンおよび抗体−抗原がある。
いくつかの実施形態では、本発明は、血清および生物学的液体において、本明細書において上述される、注目する、１種以上のバイオマーカーまたはその他のタンパク質を検出するためのサンドイッチ技術の使用を考慮する。国際公開番号ＷＯ９３／０９４３７に記載されるように、このような技術は、注目するタンパク質と結合できる２種の抗体、例えば、その一方が溶液中で遊離しているが検出可能な化合物で標識されており、そのもう一方が固相支持体上に固定化されているものを用いる。二次抗体に使用できる化学標識の例として、それだけには限らないが、反応物質または酵素基質に対して曝露されると着色生成物または電気化学的に活性な生成物を生じる、放射性同位体、蛍光化合物および酵素またはその他の分子が挙げられる。注目する、バイオマーカーまたはその他のタンパク質を含有するサンプルをこの系に入れる場合、注目する、バイオマーカーまたはその他のタンパク質は固定化抗体および標識抗体の両方と結合する。この結果が、支持体の表面上の「サンドイッチ」免疫複合体である。複合タンパク質は、結合していないサンプル成分および過剰の標識抗体を洗浄除去することと、支持体表面上のタンパク質と複合体を形成している標識抗体の量を測定することとによって検出する。サンドイッチイムノアッセイは、良好な検出限界を有する標識が用いられれば、高度に特異的であり、極めて感度が高い。
生体サンプルは個別に、スクリーニングしてもよいし、あるいは、例えば、広く用いられ、容易に自動化できる、従来の９６ウェルマイクロタイター形式を用いて、生体液の多数のサンプルを同時にスクリーニングしてもよい。また、９６ウェルプレートを熱量測定によって分析するためのいくつかの市販の分光計（「プレートリーダー」）がある。さらに、生体サンプルは、当技術分野で公知の方法を用いて、１種のバイオマーカー、または複数のマーカー、例えば、バイオマーカーのパネルについてスクリーニングできる。
好ましい実施形態では、生体サンプル、例えば、体液のサンプル内の、注目する、１種以上のバイオマーカーまたはその他のタンパク質の発現を、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、競合結合酵素結合免疫測定法、ドットブロット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ（２ｎｄ ｅｄ．； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９１）参照のこと、ウエスタンブロット（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ．３、Ｃｈａｐｔｅｒ １８（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）、クロマトグラフィー、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または当技術分野で公知のその他のアッセイによって検出する。したがって、検出アッセイは、それだけには限らないが、免疫ブロット法、免疫拡散法、免疫電気泳動法または免疫沈降などのステップを含み得る。
任意の所与のタンパク質検出アッセイのために、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む生体サンプルまたはそのサブサンプルを、結合パートナー、例えば、注目するバイオマーカーまたはその他のタンパク質についての、抗体または検出可能に標識された抗体と、抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、抗体結合を、例えば、本明細書において上記で示される任意の手段によって検出する。本明細書に記載される、バイオマーカー、ＣＤ４０関連因子および臨床的に有用な予後マーカーに対する抗体および検出可能に標識された抗体は、当技術分野では周知であり、市販されている。例えば、アポトーシス、細胞生存およびＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーならびに臨床的に有用な予後マーカー、例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ； ＤＡＫＯ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋなどから入手可能なＺＡＰ−７０およびｐ５３参照のこと。あるいは、抗体またはこれらの抗体の検出可能に標識された抗体は、当技術分野で周知である、さらに、本明細書において以下に記載される抗体作製法を用いて作製できる。
カスパーゼのバイオマーカーのためのいくつかのアッセイキットは市販されている。例えば、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅｓ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）は、マイクロプレートにおけるカスパーゼ活性の定量的ｉｎ ｖｉｔｒｏ測定のための蛍光定量的分析である。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングにとって、例えば、９６ウェルプレートでの１００試験、および３８４ウェルプレート（カタログ番号３００５３７２）での４００試験にとって特に有用である。このアッセイにより、生体サンプル、例えば、血清または血漿における、いくつかのカスパーゼ、例えば、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７の検出が、より低い程度で、カスパーゼ−６、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０の検出が可能である。Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアッセイ（カタログ番号１７７４４２５； Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）は、ＤＮＡおよびヒストン、それぞれに対するマウスモノクローナル抗体を用いる、定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ原則に基づいている。このアッセイにより、アポトーシスによって死滅した細胞の細胞質に放出されたモノおよびオリゴヌクレオソームの特異的検出および定量化が可能である。種々のサンプル、例えば、細胞溶解物、血清、培養上清などに使用できる。
細胞表面ＰＳは、任意の市販のアネキシンＶ染色試薬を用いて検出でき、これはＰＳに対するアネキシンＶの高親和性に基づいている。例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅから市販されているアネキシンＶ染色試薬参照のこと。ＦＩＴＣをアネキシンＶにコンジュゲートすることによって、フローサイトメトリーによって単細胞ベースでアポトーシス細胞を同定および定量することが可能である。ＦＩＴＣ−アネキシンＶ（緑色蛍光）および非生体染色色素ヨウ化プロピジウム（赤色蛍光）を用いて細胞を同時に染色することにより、無傷の細胞（ＦＩＴＣ−ＰＩ−）、初期アポトーシスの細胞（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）および後期アポトーシスまたは壊死細胞（ＦＩＴＣ＋ＰＩ＋）の識別を提供できる。
さらに、生体サンプル内でのアポトーシスの上昇は、アポトーシスの特徴であるＤＮＡ断片化を検出する核酸ベースの方法を用いて確認できる。アガロースゲルでの電気泳動を用いて分離すると、例えば、壊死またはその他の非特異的ＤＮＡ分解において観察される核酸のスメアと対照的に、アポトーシスＤＮＡは、まず特徴的な「ラダー」パターンを有する。ＤＮＡ断片化を検出するための一般的な組織学的技術は、末端標識ＤＮＡを用いる。ＡＰＯＬＥＲＴ ＤＮＡ断片化キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）など、そのためのキットは市販されている。このアッセイは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）媒介性ｄＵＴＰニック末端標識に基づいており、これではアポトーシスを起こしている細胞において、Ｔｄｔが、断片化されたＤＮＡの遊離３’−ヒドロキシル末端でのフルオレセイン−ｄＵＴＰの組み込みを触媒する。
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、サイトカインマーカーの産生を検出できる。標準アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含み、これではサンプルあたり１種のサイトカインを測定する。あるいは、より高感度の技術は、電気化学発光（ＥＣＬ）である。一実施形態では、サイトカイン産生を、例えば、市販されている高性能サイトカイン分析用Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）システム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）などのマルチアレイシステムを用いてＥＣＬを用いてアッセイする。サンプル内の複数のサイトカイン（またはその他の分析物）の一度での測定を考慮するその他の形式としては、マルチプレックス技術が挙げられる。１種のこのような製品として、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）があり、これでは、個々のバイオアッセイに特異的な試薬（サイトカインに対する抗体など）で被覆された、最大１００色に色分けされたミクロスフェアを一緒に混合し、ラサル（ｌａｓａｒ）技術を用いて分析できる。
候補被験体から得られた生体サンプル内の、本明細書に記載される、１種以上のバイオマーカー、サイトカイン、ＣＤ４０関連因子および臨床的に有用な予後マーカーの存在はまた、核酸レベルで調べることができる。発現を評価するための核酸ベースの技術は当技術分野で周知であり、例えば、生体サンプルにおけるバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを調べることが挙げられる。多数の発現検出法は、単離ＲＮＡを用いる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、ＲＮＡの精製のために利用できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．（１９８７−１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照のこと。さらに、当業者に周知の技術、例えば、米国特許第４，８４３，１５５号に開示される一段階ＲＮＡ単離法などを用いて、多数の組織サンプルを容易に処理できる。
したがって、いくつかの実施形態では、注目するバイオマーカーまたはその他のタンパク質の検出は、核酸プローブを用いて核酸レベルでアッセイする。用語「核酸プローブ」とは、特に意図される標的核酸分子、例えば、ヌクレオチド転写物と選択的に結合できる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できるか、または適当な生物学的調製物に由来するものであり得る。プローブは例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色定量タグまたは上記論じられるか、当技術分野で公知のその他の標識もしくはタグで標識されるよう特別に設計できる。プローブとして利用できる分子の例として、それだけには限らないが、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる。
例えば、単離ｍＲＮＡはハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイ、例えば、それだけには限らないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイにおいて使用できる。ｍＲＮＡレベルを検出するための１つの方法は、単離ｍＲＮＡを、検出される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡまたはその一部、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で本明細書において上述されるバイオマーカー、ＣＤ４０関連因子または臨床的に有用な予後マーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドであり得る。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、注目するバイオマーカーまたはその他の標的タンパク質が発現されていることを示す。
一実施形態では、ｍＲＮＡを、固体表面上に固定化し、例えば、単離したｍＲＮＡをアガロースゲルに流すことおよびｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどのメンブレンにトランスファーすることとによってプローブと接触させる。代替実施形態では、プローブ（類）を固体表面上に固定化し、例えば、遺伝子チップアレイにおいてｍＲＮＡをプローブ（類）と接触させる。当業者ならば、注目するバイオマーカーまたはその他のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの検出において使用するための既知ｍＲＮＡ検出法を容易に適合させることができる。
サンプル中の注目するｍＲＮＡのレベルを調べるための代替方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自律的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３）による核酸増幅法または任意のその他の核酸増幅法と、それに続く、当業者に周知の技術を用いる増幅さされた分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数で存在する場合にはこのような分子の検出にとって特に有用である。本発明の特定の態様では、バイオマーカー発現またはＣＤ４０関連因子もしくはその他の臨床的に有用な予後マーカーの発現を定量的蛍光発生的ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム）によって評価する。
注目するＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に用いられるような）またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を用いてモニターできる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、同５，８７４，２１９号、同５，７４４，３０５号、同５，６７７，１９５号および同５，４４５，９３４号参照のこと。発現の検出はまた、溶液において核酸プローブを用いることを含み得る。
本発明の一実施形態では、マイクロアレイを用いて１種以上のバイオマーカー、ＣＤ４０関連因子および／または臨床的に有用な予後マーカーの発現を検出する。マイクロアレイは、種々の実験間の再現性のためにこの目的に特によく適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時測定するための１つの方法を提供する。各アレイは、固相支持体と結合している捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識ＲＮＡまたはＤＮＡを、アレイ上の相補的プローブとハイブリダイズさせ、次いで、レーザースキャニングによって検出する。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度を調べ、相対的遺伝子発現レベルを表す定量的値に変換する。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０４０，１３８号、同５，８００，９９２号および同６，０２０，１３５号、同６，０３３，８６０号および同６，３４４，３１６号参照のこと。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを調べるために特に有用である。
機械的合成法を用いるこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面アレイ表面が好ましいが、アレイは実質的に任意の形の表面、さらには多様な表面で作製されてもよい。アレイはビーズ、ゲル、高分子表面、ファイバー、例えば、光ファイバー、ガラスまたは任意のその他の適当な基板上のペプチドまたは核酸であり得る。各々、あらゆる目的のために参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，３５８号、同５，７８９，１６２号、同５，７０８，１５３号、同６，０４０，１９３号および同５，８００，９９２号参照のこと。アレイは、診断または含まれる全装置のその他の操作を可能にするような方法でパッケージングされていもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８５６，１７４号および同５，９２２，５９１号参照のこと。
一アプローチでは、サンプルから単離された全ｍＲＮＡを、標識ｃＲＮＡに変換し、次いで、オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせる。各サンプルを別個のアレイとハイブリダイズさせる。相対転写物レベルは、アレイ上およびサンプル中に存在する適当な対照に対する参照によって算出できる。
抗ＣＤ４０治療薬
本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、注目する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞と関連している癌または前癌状態を有する被験体を同定できる。特に注目されるものは、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を調節する、かつ／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬である。このような抗ＣＤ４０治療薬としては、それだけには限らないが、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト、例えば、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４０と結合できるがＣＤ４０シグナル伝達を誘発しないＣＤ４０Ｌの突然変異型、可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０を含む融合タンパク質の可溶性型およびＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用を混乱させ、もしくは干渉する、かつ／またはＣＤ４０シグナル伝達を干渉する薬理作用のある物質、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４００６７９８２号に開示される、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ結合妨害化合物と結合すると、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるシグナル伝達をブロックまたは干渉する、かつ／またはＡＤＣＣ活性を調節するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が挙げられる。特に注目されるものとして、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達をブロックするために役立つアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療薬、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性断片ならびにＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療薬、例えば、抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合性断片がある。
抗ＣＤ４０抗体
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は当技術分野で公知である。例えば、すべて、参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ｅｄ．（１９８７； １９８９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ ａｎｄ ＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中、Ｂ細胞抗原に対して設けられた項；米国特許第５，６７４，４９２号、同５，８７４，０８２号、同５，６７７，１６５号、同６，０５６，９５９号、ＷＯ００／６３３９５、国際公開公報ＷＯ０２／２８９０５およびＷＯ０２／２８９０４、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５、Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：１４６３、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：４４９４、Ｐａｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２：５９０； Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５、Ｊａｂａｒａ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６、Ｇａｓｃａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ３：８およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７０参照のこと。その他の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体としては、それだけには限らないが、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、例えば、マウス抗ＣＤ４０抗体ＳＧＮ−１４（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２２５−３１）のヒト化型であるＳＧＮ−４０（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２８４６−５２、米国特許第６，８３８，２６１号）ならびに参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１２０９４８号に開示されるアゴニストおよびアンタゴニスト抗体が挙げられる。
一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いてアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いる治療の適合性または有効性を調べる。本発明の方法に用いられるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として、ヒト細胞の表面に発現されるヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合できるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法において用いられるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０細胞表面抗原に対して強力な単一部位結合親和性を示す。このようなモノクローナル抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）などの標準アッセイを用いて測定された、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３×１０−５Ｍ、好ましくは、少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、より好ましくは、少なくとも１０−８Ｍ〜約１０−１２ＭというＣＤ４０の解離平衡定数（ＫＤ）を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は当技術分野で公知であり、詳細は「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ」に提供されている。ＷＯ０１／２７１６０に記載された方法を用いて結合親和性を調節できる。
特に注目されるものとして、本明細書において上記で定義される、顕著なアゴニスト活性がないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体があるが、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原と結合すると、特に、腫瘍性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原と結合すると、アンタゴニスト活性を示す。本発明の一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１種のＢ細胞反応で顕著なアゴニスト活性がない。本発明のもう１つの実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、２種以上のＢ細胞反応（例えば、増殖および分化または増殖、分化および抗体産生）のアッセイにおいて顕著なアゴニスト活性がない。適したモノクローナル抗ＣＤ４０抗体は、ヒト定常領域を有し、それらはまたヒト化フレームワーク領域を全体的にまたは部分的に有することが好ましく、完全ヒト抗体またはその抗原結合性断片が最も好ましい。このようなモノクローナル抗体の例として、本明細書においてＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２と呼ばれる抗体がある。
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、本発明の方法に用いるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に相当する。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体は、ハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書において細胞株５．９と呼ばれる）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書において細胞株１２．１２と呼ばれる）から産生されるＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。これらの細胞株は、免疫化した、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座とヒトκ鎖遺伝子座とを含む異種型マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術；Ａｂｇｅｎｉｘ； Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た脾細胞を用いて作成した。脾臓細胞をマウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞（Ｓｉｅｒｒａ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）と融合した。得られたハイブリドーマを数回サブクローニングし、安定なモノクローナル細胞株５．９および１２．１２を作製した。本発明のその他の抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座についてトランスジェニックであるマウスを用いて、または当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されるその他の方法によって同様に調製できる。
ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにＣＨＩＲ−５．９抗体の可変領域のアミノ酸配列は開示されている。より詳しくは、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖のリーダー、可変および定常領域のアミノ酸配列は、配列番号２（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖の完全配列）、配列番号４（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の完全配列）および配列番号５（配列番号４に示されるｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体の完全配列；ここで変異体は配列番号４の１５３位のアラニン残基のセリン置換を含む）に示される。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖のコード配列）および配列番号３（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のコード配列）に示されている。ＣＨＩＲ−５．９ｍＡｂの軽鎖および重鎖のリーダー、可変および定常領域のアミノ酸配列は、配列番号６（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖の完全配列）、配列番号７（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の完全配列）および配列番号８（配列番号７に示されるｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体の完全配列、ここで、変異体は配列番号７の１５８位のアラニン残基のセリン置換を含む）に示されている。さらに、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体を発現するハイブリドーマは、それぞれ、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３でＡＴＣＣに寄託されている。
本発明の方法において用いる抗ＣＤ４０抗体は、アンタゴニスト活性に加え、腫瘍細胞に対して別の作用機序を有する場合がある。例えば、天然ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体はＡＤＣＣ活性を有する。あるいは、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域は、ＡＤＣＣ活性を有する別の抗体アイソタイプで発現され得る。本明細書において後述されるように、ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２の天然型、組換え型または抗原結合性断片を、細胞毒素、治療薬または放射性金属イオンもしくは放射性同位元素とコンジュゲートすることも可能である。
ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて可溶性ＣＤ４０と結合し、ＣＤ４０リガンドの、細胞表面ＣＤ４０との結合を妨げ、予め結合しているＣＤ４０リガンドを置換することが、フローサイトメトリーによるアッセイによって調べられた。抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０との結合について互いに競合するが、双方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０００年１０月２日に出願された「Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と題された米国仮出願番号第６０／２３７，５５６号および２００１年１０月２日に出願された同様に「Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と題されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０ｌ／３０８５７（代理人整理番号ＰＰｌ６０９２．００３）に記載される１５Ｂ８抗ＣＤ４０モノクローナル抗体とは競合しない。正常ヒト被験体から得たＢ細胞の増殖に対する効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験すると、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として作用する。さらに、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は正常被験体から得たヒトリンパ球の強力な増殖を誘導しない。これらの抗体は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によってＣＤ４０発現標的細胞を死滅させることができる。ヒトＣＤ４０に対するＣＨＩＲ−５．９の結合親和性は、１．２×１０−８Ｍであり、ＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５×１０−１０Ｍであると、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって求められた。
上記のモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２に特徴的な結合を共有するその他のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：（１）それぞれ、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２および特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託された、１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書では細胞株５．９と呼ばれる）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書では細胞株１２．１２と呼ばれる）と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両配列、配列番号２および配列番号５に示される両配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、（３）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両配列ならびに配列番号６および配列番号８に示される両配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、（４）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１および配列番号３に示される両配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体、（５）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体と結合できるエピトープと結合するモノクローナル抗体、（６）配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープと結合するモノクローナル抗体、（７）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体ならびに（８）ヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合する能力を保持する、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体または前記の項（１）〜（７）における前述のモノクローナル抗体の抗原結合性断片であるモノクローナル抗体。
当業者ならば、本明細書に記載される抗体およびこれらの抗体の抗原結合性断片は、当技術分野で周知であり、本明細書において以下に記載される方法を用いて組換えによって製造された抗体およびこれらの抗原結合性断片を含むことは認識しており、これとして、例えば、組換えによって製造されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２が挙げられる。
さらなるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として、それぞれ、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３３９、ＨＢ１２０２４およびＨＢ１１３４０を有するハイブリドーマから分泌される５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６と呼ばれるモノクローナル抗体が挙げられる。例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１５，９９８号参照のこと。
その他のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２０１４２３５８号および同２００３００５９４２７号において開示されるＦ４−４６５と呼ばれるハイブリドーマによって産生されるヒト抗ＣＤ４０抗体参照のこと。Ｆ４−４６５は、ＨＡＣマウス（Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：１０８６（２０００））から得、したがって、ヒトλ軽鎖を発現する。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体
ＣＤ４０Ｌと結合し、それによって、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を干渉する抗体は当技術分野で公知である。例として、それだけには限らないが、国際特許公報ＷＯ９５／０６６６６に開示されるものが挙げられ、その内容は参照によりその全文が本明細書にある。特別な例として、それだけには限らないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎａ ２０１１０−２２０９に寄託され、それぞれ、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７１３およびＨＢ１１７１２を割り当てられた、８９−７６および２４−３１ハイブリドーマによってそれぞれ産生される８９−７６および２４−３１と呼ばれるアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体が挙げられる。
抗体の製造
本発明の方法に使用するための抗体、例えば、本明細書に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体および注目するバイオマーカーまたはその他の臨床的に有用な予後マーカーと特異的に結合する任意の抗体は、当業者に公知の任意の抗体製造法を用いて製造できる。したがって、ポリクローナル血清は、従来法によって調製できる。一般に、まず、注目する抗原、例えば、ＣＤ４０抗原またはＣＤ４０Ｌ抗原を含む溶液を用いて適した動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギまたはヤギを免疫化する。得られる血清の容積ならびに標識抗ウサギおよび抗ヤギ抗体が入手可能であることのために、ポリクローナル血清の調製にはウサギまたはヤギが好ましい。
ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物、好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおいて調製できる。好ましい実施形態では、注目するタンパク質、例えば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌを発現するＳｆ９細胞を免疫原として用いる。免疫化はまた、生理食塩水に、好ましくは、フロイントの完全アジュバントなどのアジュバントに抗原含有溶液を混合することまたは乳化することと、混合物またはエマルションを非経口的に（通常、皮下に、または筋肉内に）注射することとによって実施できる。５０〜２００μｇ／注射という用量は通常十分である。免疫化は、通常、好ましくはフロイントの不完全アジュバントを用いて、生理食塩水中のタンパク質の１回以上の注射によって２〜６週間後にブーストする。あるいは、当技術分野で公知の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化によって抗体を作製でき、これは、本発明の目的上、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化と同等と考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫化した動物からガラスまたはプラスチック容器中に放血させることと、２５℃で１時間血液をインキュベートすること、続いて、４℃で２〜１８時間インキュベートすることとによって得る。血清は遠心分離（例えば、１０００×ｇで１０分間）によって回収する。ウサギから放血あたり約２０〜５０ｍｌを得ることができる。
Ｓｆ９（ヨトウガ）細胞の製造は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，００４，５５２号に開示されている。手短には、ＣＤ４０の場合には、ヒトＣＤ４０をコードする配列を、トランスファーベクターを用いてバキュロウイルス中に組換えた。このプラスミドを、Ｓｆ９細胞に野生型バキュロウイルスＤＮＡと同時トランスフェクトした。組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を同定し、クローニングによって精製した。
抗体は本来モノクローナルであることが好ましい。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、集団を含む個々の抗体が、微量で存在し得る天然に存在する突然変異の可能性を除いて同一であることを意味する。この用語は、抗体の種または供給源に関して制限されない。この用語は全免疫グロブリンならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび抗体の抗原結合機能を保持するその他のものなどの断片を包含する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位、例えば、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の場合には、それぞれ、ＣＤ４０細胞表面抗原またはＣＤ４０Ｌ細胞表面抗原に対するものである。さらに、通常、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られている抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されたものであってもよいし、組換えＤＮＡ法によって作製したものであってもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７および米国特許第５，５１４，５４８号に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離できる。
「エピトープ」とは、それに対して抗体が作製され、それと抗体が結合する抗原性分子の一部を意味する。エピトープは、線形のアミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基は線状様式に次々連続して配列している）、非線形のアミノ酸残基（本明細書において「非線形エピトープ」と呼ばれ、これらのエピトープは連続して配列していない）または線形および非線形アミノ酸残基双方を含み得る。
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９６の方法またはその改良版を用いて調製できる。通常、マウスを抗原を含有する溶液を用いて免疫化する。免疫化は、生理食塩水に、好ましくは、フロイントの完全アジュバントなどのアジュバントに抗原含有溶液を混合することまたは乳化することと、混合物またはエマルションを非経口的に注射することとによって実施できる。当技術分野で公知の任意の免疫化方法を用いて本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。動物を免疫化した後、脾臓（および場合により、いくつかの大きなリンパ節）を採取し単細胞に解離する。細胞懸濁液を注目する抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに適用することによって脾臓細胞をスクリーニングできる。抗原に特異的な膜結合型免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートと結合し、リンスによって除去されない。次いで、得られたＢ細胞またはすべての解離された脾臓細胞を誘導し、骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成し、選択培地で培養する。得られた細胞を段階希釈によってプレーティングし、注目する抗原と特異的に結合する（かつ、無関係の抗原と結合しない）抗体の産生についてアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応器において）またはｉｎ ｖｉｖｏ（マウスにおける腹水のような）のいずれかで培養する。
本発明の方法において使用するための抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体が組換えＤＮＡ法を用いて調製される場合は、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。本明細書に記載されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡは単離すると、発現ベクターに入れることができ、次いで、これを宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌における組換え発現に関する総説として、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１が挙げられる。あるいは、抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５４５，４０３号、同５，５４５，４０５号および同５，９９８，１４４号に開示されるようにＣＨＯ細胞株などの細胞株において産生され得る。手短には、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現できるベクターを用いて細胞株をトランスフェクトする。２種のタンパク質を別個のベクターにトランスフェクトすることによって、キメラ抗体を作製することができる。もう１つの利点は抗体の正しいグリコシル化である。
いくつかの実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体またはその抗原結合性断片を、マーカーとしてグルタミン合成酵素を用いるＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を用いてＣＨＯ細胞において製造する。内容が参照により本明細書に全文で組み込まれる、米国特許第５，１２２，４６４号、同５，５９１，６３９号、同５，６５８，７５９号、同５，７７０，３５９号、同５，８２７，７３９号、同５，８７９，９３６号、同５，８９１，６９３号および同５，９８１，２１６号も参照のこと。
さらに、本発明の方法に用いるための抗体は、望ましい結合特性を有するキメラ抗体であり得る。したがって、例えば、本発明の方法に用いるためのキメラ抗ＣＤ４０抗体は、本明細書に記載されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合特性を有し得る。「キメラ」抗体とは、最も好ましくは、組換えデオキシリボ核酸技術を用いて誘導され、ヒト（例えば、免疫学的に「関連する」種、例えば、チンパンジー）および非ヒト成分の両方を含む抗体を意味する。したがって、キメラ抗体の定常領域は、天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一であることが最も好ましい。キメラ抗体の可変領域は非ヒト供給源から誘導され、注目する抗原、例えば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ抗原に対して所望の抗原特異性を有することが最も好ましい。非ヒト供給源は、ヒト抗原またはヒトＣＤ４０抗原を含む物質に対する抗体を作製するために使用できる任意の脊椎動物供給源であり得る。このような非ヒト供給源としては、それだけには限らないが、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど；例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号参照のこと）、および非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など；例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，１０５号および同５，７５６，０９６号参照のこと）が挙げられる。本明細書において、語句「免疫学的に活性」とは、例えば、キメラ抗ＣＤ４０抗体またはキメラ抗ＣＤ４０Ｌ抗体に関連して用いられる場合、それぞれ、ヒトＣＤ４０またはヒトＣＤ４０Ｌと結合するキメラ抗体を意味する。
「ヒト化」とは、非ヒト免疫グロブリン配列由来の最小配列を含む抗体の形を意味する。ヒト化抗体は、大部分はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても知られる）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換されている。語句「相補性決定領域」とは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を同時に規定するアミノ酸配列を指す。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）参照のこと。語句「定常領域」とは、エフェクター機能を付与する抗体分子の一部を指す。ヒト疾患の治療に用いるための非免疫原性抗体の製造に向けられたこれまでの研究では、マウス定常領域をヒト定常領域で置換した。主題ヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリンに由来するものであった。しかし、これらのヒト化抗体は、ヒトにおいて、不要な、危険になりかねない免疫応答を依然として惹起し、親和性の喪失があった。本発明の方法に用いるためのヒト化抗体、例えば、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、注目する親抗体、例えば、本明細書に記載されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示されるものと同様の結合特性を有する。
ヒト化は、原則的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）の方法に従い、げっ歯類または突然変異げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施できる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６１号、同５，６９３，７６２号、同５，８５９，２０５号も参照のこと。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンの１以上の可変領域のフレームワーク領域内の残基を、対応する非ヒト残基によって置換する（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６１号、同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号参照のこと）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに高めるために（例えば、所望の親和性を得るために）行う。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメインの実質的にすてべを含み、これでは、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、通常、ヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も場合により含む。さらなる詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒトよりもかなり少ない可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている抗体を含み得る。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基と、ことによるといくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６１号、同５，６９３，７６２号、同５，８５９，２０５号参照のこと。所定の抗原に対する親和性が改良されたヒト化抗体およびヒト化抗体を製造するための技術が開示されている、米国特許第６，１８０，３７０および国際公開番号ＷＯ０１／２７１６０も参照のこと。
本発明はまた、不活化内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を特徴とする、非ヒト哺乳類宿主、より詳しくは、トランスジェニックマウスにおいて製造した異種抗体または改変抗体を用いて実施できる。このようなトランスジェニック動物では、宿主免疫グロブリンのライトサブユニットおよびヘビーサブユニットの発現のための適格な内因性遺伝子が非機能的にされており、類似のヒト免疫グロブリン遺伝子座で置換されている。これらのトランスジェニック動物は、ライトまたはヘビー宿主免疫グロブリンサブユニットの実質的に不在下で、ヒト抗体を産生する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７７，３９７号および同５，９３９，５９８号参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４０に対する完全ヒト抗体を、例えば、トランスジェニックマウスを免疫化することによって得る。１種のこのようなマウスは、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ； Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて得られ、すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０７５，１８１号、同６，０９１，００１号および同６，１１４，５９８号に開示されている。本明細書に開示される抗体を製造するために、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座についてトランスジェニックなマウスを、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞を用いて免疫化した。マウスはまた、その他のアイソタイプについてトランスジェニックであってもよい。本発明の方法において有用な完全ヒト抗ＣＤ４０抗体は、本明細書において開示されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示されるものと同様の結合特性を特徴とする。
注目する特定の抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の断片は、それらが全長抗体の所望の親和性を保持する限り、本発明の方法において使用するのに適している。したがって、例えば、抗ＣＤ４０抗体の断片は、ＣＤ４０Ｂ細胞表面抗原と結合する能力を保持する。このような断片は、対応する全長抗体と同様の特性を特徴とする。したがって、例えば、全長アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の断片は、ヒト細胞の表面に発現され、顕著なアゴニスト活性がないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原と結合するとアンタゴニスト活性を示すヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合する。このような断片は、本明細書において「抗原結合性」断片と呼ばれる。
抗体の適した抗原結合性断片は、全長抗体の一部、通常、その抗原結合領域または可変領域を含む。
抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片および一本鎖抗体分子が挙げられる。「Ｆａｂ」は、軽鎖と重鎖の一部とからなる免疫グロブリンの一価の抗原結合性断片を意味する。Ｆ（ａｂ’）２は、両軽鎖および両重鎖の一部を含む免疫グロブリンの二価の抗原結合性断片を意味する。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片とは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する断片を意味する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４６，７７８号、同５，２６０，２０３号、同５，４５５，０３０号および同５，８５６，４５６号参照のこと。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓＦｖが抗原結合のために望まれる構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２６９−３１５参照のこと。本明細書に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の抗原結合性断片は、本明細書において後述されるように、細胞毒素とコンジュゲートさせ、標的癌細胞の死滅を達成することができる。
抗体または抗体断片は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号に記載される技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７には、ファージライブラリーを用いるマウスおよびヒト抗体、それぞれの単離が記載されている。続報には、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３）による高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の製造ならびに極めて大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換えが記載されている（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替案である。
抗体断片を製造するために種々の技術が開発されている。従来、これらの断片は無傷の抗体のタンパク質分解による消化を介して誘導した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１参照のこと）。しかし、現在、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、抗体断片は、上記で論じられる抗体ファージライブラリーから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７）。もう１つのアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体断片を製造するためのその他の技術は、当業者には明らかである。
本発明の方法に用いるためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として、本明細書に開示されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、ならびにこの抗体とは異なるがＣＤＲを保持している抗体および１以上のアミノ酸付加、欠失または置換を含む抗体が挙げられ、これでは、アンタゴニスト活性はＢ細胞増殖および／または分化の阻害によって測定される。本発明はまた、脱免疫された（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、特に、脱免疫されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を包含し、これは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００３４３１７に記載されるように製造できる。このように、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体内の残基を、抗体を、ヒトＣＤ４０発現細胞に向けたそのアンタゴニスト活性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性をなくさせるよう、または免疫原性が少なくなるよう改変するが、これでは、このような活性は本明細書において他で記載されるアッセイによって測定する。また、注目する抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその断片を含む融合タンパク質も本発明の範囲内に含まれ、当技術分野で公知のように、この融合タンパク質は対応するポリヌクレオチドベクターから合成または発現させることができる。このような融合タンパク質は、本明細書において他で記載されるように、抗体のコンジュゲーションに関連して記載されている。
注目する結合特異性を有する任意の既知抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、特許公報ＥＰ０９８３３０３Ａ１、ＷＯ００／３４３１７およびＷＯ９８／５２９７６に記載される方法を用いて生じた配列変動を有し得る。例えば、ＣＤＲ内の配列は抗体をＭＨＣクラスＩＩと結合させ、不要なヘルパーＴ細胞応答を誘発できることがわかっている。保存的置換は抗体が結合活性を保持するが、不要なＴ細胞反応を誘発するその能力を失うのを可能にすることができる。任意のこのような保存的または非保存的置換は、当技術分野で認められた方法、例えば、本明細書において他で記載されるものを用いて行うことができ、得られた抗体もまた本発明の方法に使用できる。変異体抗体は、特定の活性、例えば、アンタゴニスト活性、親和性および特異性について本明細書に記載される方法を用いてごく普通に試験できる。
抗ＣＤ４０治療薬がアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である場合には、上記の方法のいずれか、または本明細書に開示されない任意のその他の方法によって製造されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体と類似の方法で使用でき、これでは、以下の生物活性のうち少なくとも１つを有する：Ｔ細胞によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害、ジャーカットＴ細胞によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害、ＣＤ４０Ｌ発現細胞または可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害、ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌによって刺激された任意の細胞における「生存」抗アポトーシス性細胞内シグナルの阻害、ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとの連結の際の任意の細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の阻害および以下に記載されるようなヒト悪性Ｂ細胞の増殖の阻害。このような生物活性のアッセイは、本明細書に、および２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））および同６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））に割り当てられた「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された仮出願および同様に「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された、２００４年１１月４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））に記載されるように実施できる。なお、これらの各々の内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８２００−８２０４、Ｄｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７、Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２、Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１２、Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７９：４３９−４４４および米国特許第５，６７４，４９２号および同５，８４７，０８２号に記載されるアッセイも参照のこと。
本明細書において同定される、ＣＤ４０抗原エピトープに対して特異的であるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を検出するための代表的なアッセイとして、「競合結合アッセイ」がある。競合結合アッセイは、未知のものが検出され、標識された既知リガンドの、その特異的抗体との結合を阻害するその能力によって定量化される血清学的アッセイである。これは、競合阻害アッセイとも呼ばれる。代表的な競合結合アッセイでは、標識ＣＤ４０ポリペプチドを、例えば、本発明のモノクローナル抗体の１種以上のエピトープに対するモノクローナル抗体と組合せた、サンプル中の候補抗体によって沈降させる。注目するエピトープと特異的に反応する抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質または注目するＣＤ４０タンパク質の特定のエピトープを含むタンパク質の断片に対して調製した一連の抗体をスクリーニングすることによって同定できる。例えば、ヒトＣＤ４０については、注目するエピトープとして、ヒトＣＤ４０の短いアイソフォーム（配列番号９に示される配列によってコードされる配列番号１０に示される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６９０５９３参照のこと、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５２８５４も参照のこと）の、またはヒトＣＤ４０の長いアイソフォーム（配列番号１１に示される配列によってコードされる配列番号１２に示される、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ４３０４５およびＮＰ＿００１２４１参照のこと、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０も参照）の線形および／または非線形アミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。あるいは、これまでに同定された、適したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いる競合結合アッセイを用いて、これまでに同定された抗体に匹敵するモノクローナル抗体を選択できる。
このようなイムノアッセイに用いられる抗体は標識されていても、標識されていなくてもよい。標識されていない抗体を凝集に使用でき、標識抗体は、さまざまな標識を用いるさまざまなアッセイにおいて使用できる。抗ＣＤ４０抗体と注目するエピトープ間の抗体抗原複合体の形成の検出は、検出可能な物質を抗体に結合させることによって容易になり得る。適した検出手段は、放射性核種、酵素、コエンザイム、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、色原体、酵素基質または補助因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素など標識の使用を含む。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてルミノールがあり、生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、適した放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。このような標識試薬は、種々の周知のアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイなどにおいて使用できる。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号、同３，７９１，９３２号、同３，８１７，８３７号および同４，２３３，４０２号参照のこと。
これまでに記載された抗体はいずれも、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗体断片は、本発明の方法において使用する前にコンジュゲートさせることができる。コンジュゲートしている抗体を製造する方法は当技術分野では公知である。したがって、抗体は、間接標識化または間接標識化アプローチを用いて標識できる。「間接標識化」または「間接標識化アプローチ」とは、キレート剤が抗体と共有結合していることおよび少なくとも１種の放射性核種がキレート剤に挿入されていることを意味する。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｒｉｖａｇｔａｖａ ａｎｄ Ｍｅａｓｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３に記載されるキレート化剤および放射性核種を参照のこと。適した標識としては、フルオロフォア、発色団、放射性原子（特に、３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、通常、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’、５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青色色素に変換する能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合におけるように、リガンド分子と高い特異性で結合できるタンパク質を指す。その他の特異的結合パートナーとして、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡおよび当技術分野で公知の多数の受容体−リガンド対が挙げられる。同一の標識がいくつかの異なる様式で働く場合があるので、上記の記載は種々の標識を別個のクラスに分類することを意味するものではないということは理解されなくてはならない。例えば、１２５Ｉは放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは酵素としてまたはｍＡｂの抗原として役立ち得る。さらに、種々の標識を所望の効果のために組合せることができる。例えば、ｍＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において標識を必要とし、したがって、ｍＡｂをビオチンで標識し、１２５Ｉで標識したアビジンを用いて、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂを用いてその存在を検出する。その他の順列および可能性は、当業者には容易に明らかとなり、本発明の範囲内の同等物として考慮される。
あるいは、注目する抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体を「直接標識化」または「直接標識化アプローチ」を用いて標識でき、ここで、放射性核種は共有結合によって（通常、アミノ酸残基を介して）抗体と直接結合されている。好ましい放射性核種はＳｒｉｖａｇｔａｖａ ａｎｄ Ｍｅａｓｅ（１９９１）前掲において提供されている。関節標識アプローチは特に好ましい。例えば、リンカーが放射線標識を抗体と結合するために用いられている、国際公開公報ＷＯ００／５２０３１およびＷＯ００／５２４７３、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１５，５４２号に記載される、抗ＣＤ４０分子の標識化された形も参照のこと。
抗体の変異体
本発明の方法は、当技術分野で公知の抗体の変異体を用いて実施できる。このような変異体は、親抗体の所望の結合特性を保持する。したがって、例えば、試験される抗ＣＤ４０治療薬がアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である場合、変異体抗体は、親アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体の結合特性を保持する。抗体変異体を作製する方法は、通常、当技術分野で入手可能である。以下の議論はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の変異体を指すが、本方法は注目する任意の抗体、例えば、本明細書に開示されるバイオマーカーまたは臨床的に有用な予後マーカーと特異的に結合する抗体に一般に適用可能である。
例えば、本明細書に記載されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体のアミノ酸配列変異体は、注目する抗体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列における突然変異によって調製できる。突然変異誘発法およびヌクレオチド配列変更方法は、当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ、ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２； Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； 米国特許第４，８７３，１９２号および本明細書に列挙される参照文献を参照のこと。注目するポリペプチドの生体活性に影響を及ぼさない適当なアミノ酸置換に関する指針は、参照により本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルに見ることができる。保存的置換、例えば、あるアミノ酸を類似の特性を有する別のものと交換することが好ましいものであり得る。保存的置換の例として、それだけには限らないが、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｓｎ−ＧｌｎおよびＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒが挙げられる。
注目する抗体、例えば、注目するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドの変異体の構築では、変異体が所望の活性、すなわち、同様の結合親和性を保持し続けるよう、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の場合には、ヒト細胞の表面に発現されたヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合でき、顕著なアゴニスト活性がないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原と結合している場合にはアンタゴニスト活性を示すよう改変を行う。変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ中になされる突然変異はいずれも、リーディングフレーム外に配列を置いてはならないことは明らかであり、二次ｍＲＮＡ構造を生じることができる相補領域が生じないことが好ましい。ＥＰ特許出願公開第７５，４４４号参照のこと。
さらに、抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定常領域を突然変異させて、いくつかの方法でエフェクター機能を変更することができる。例えば、Ｆｃ受容体との抗体結合を最適化するＦｃ突然変異を開示する、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号参照のこと。
参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の変異体は、少なくとも７０％または７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、例えば、本明細書に記載されるＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して、または参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも８０％または８５％の配列同一性が好ましく、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性が最も好ましい。分子が少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することがより好ましい。本発明の目的上、パーセント配列同一性は、ギャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２でアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて求められる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に教示されている。変異体は、例えば、参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と、わずか１〜１５個のアミノ酸残基で、わずか１個〜１０個のアミノ酸残基、例えば、６〜１０個の、わずか５個の、わずか、４、３、２個または実に１個のアミノ酸残基で異なり得る。
２つのアミノ酸配列の最適アラインメントについては、変異体アミノ酸配列の連続するセグメントが、参照アミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸残基またはアミノ酸残基の欠失を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に用いられる連続するセグメントは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０またはそれより多いアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップと関連している配列同一性の補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム参照のこと）。治療法
本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイはまた、ＣＤ４０発現腫瘍性細胞に関連する癌または前癌状態に対する治療を必要としている被験体のための治療法において使用できる。したがって、いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを候補被験体で実施でき、アッセイの結果から抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の好ましい反応が予測される場合には、その被験体を抗ＣＤ４０治療薬で治療する。本明細書において先に記載したように、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイから得られた情報は、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の利益に関する判定を下すために単独で用いることができる。あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイは、本明細書において同定される１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベル、または発現の有無についてスクリーニングを行う予後アッセイ、特定の癌または前癌状態の１種以上の臨床的に有用な予後マーカーの発現レベル、または発現の有無、例えば、ＣＬＬの被験体に関して、臨床的に有用な予後マーカー、例えば、本明細書において上記で同定される、ＺＡＰ−７０発現レベル、ＣＤ３８発現レベル、β２ミクログロブリン発現レベル、ｐ５３突然変異状態、ＡＴＭ突然変異状態、染色体１７ｐ欠失、および染色体１１ｑ欠失についてスクリーニングを行う予後アッセイ、またはその両方と組合せて使用できる。
このように、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを単独で、または本明細書に記載される他の予後アッセイと組合せて用いて同定された被験体は、候補被験体において疾患の治療のために有益であると、スクリーニング過程において確認された、１種以上の治療上有効な用量の抗ＣＤ４０治療薬を用いてさらに治療することができる。本明細書において「治療」とは、患者への抗ＣＤ４０治療薬の適用または投与、あるいは患者が疾患、疾患の症状または疾患になりやすい素因を有する場合の、患者由来の摘出組織または細胞株への抗ＣＤ４０治療薬の適用または投与であり、その目的は疾患、疾患の症状または疾患になりやすい素因を治療する、癒す、緩和する、軽減する、変化させる、救済する、改善する、好転させるまたは影響を及ぼすことであると定義される。「治療」はまた、患者への抗ＣＤ４０治療薬を含む薬剤組成物の適用または投与、あるいは疾患、疾患の症状または疾患になりやすい素因を有する患者由来の摘出組織もしくは細胞株への抗ＣＤ４０治療薬を含む薬剤組成物の適用もしくは投与も意味し、その目的は疾患、疾患の症状または疾患になりやすい素因を、治療する、癒す、緩和する、軽減する、変化させる、救済する、改善する、好転させるまたは影響を及ぼすことである。
「抗腫瘍活性」は、悪性のＣＤ４０発現細胞増殖または蓄積の速度の低減、ひいては、既存の腫瘍または治療中に生じる腫瘍の成長速度の低下および／あるいは既存の腫瘍性（腫瘍）細胞または新しく形成された腫瘍性細胞の破壊、ひいては、治療中の腫瘍の全体的な大きさの減少を意味する。本明細書に記載されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて同定される少なくとも１種の抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療は、ヒトにおいてＣＤ４０発現細胞でのＣＤ４０シグナル伝達の刺激に関連する癌および前癌状態の治療に対して有益な生理反応を引き起こす。
「治療上有効な用量または量」あるいは「有効な量」とは、投与されるとＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含む疾患の患者の治療に関して正の治療反応をもたらす抗ＣＤ４０治療薬の量を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０治療薬は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性断片であり、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその断片の治療上有効な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。治療の方法は、抗ＣＤ４０治療薬、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合性断片の治療上有効な用量の単回投与または治療上有効な用量の複数回投与を含み得ることは認識される。
いくつかの実施形態では、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、特定の抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に対する反応性または反応性の欠如の生理的根拠を確認することができる。したがって、被験体における癌または前癌状態が、病初では抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に反応性であり、癌または前癌状態のＣＤ４０発現腫瘍性細胞がこの種の治療法に対し耐性を生じる場合、ｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイを用いて、どのＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用がこれらのＣＤ４０発現腫瘍性細胞の不応性の一因となっているのかを明確にすることができる。
ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のバイオマーカー、すなわち、アポトーシス、細胞の増殖および生存のバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のサイトカインマーカーならびに本明細書に記載されるＣＤ４０関連因子を、単独またはそのいずれかの組合せで使用し、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性をモニターすることもできる。このように、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療後に、先に抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の適合性について上記の予後アッセイを用いてスクリーニングされている場合もそうでない場合もある、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療を受けている被験体を、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存および／または１種以上のＣＤ４０シグナル伝達経路のうち少なくとも１種のバイオマーカーの発現におけるｉｎ ｖｉｖｏの変化をモニターし、場合により、サイトカイン産生をモニターする（抗ＣＤ４０治療薬の作用様式に応じて）。あるいは、またはさらに、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療後に、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０抗原、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０の循環レベル、およびＣＤ４０Ｌ循環レベルからなる群から選択される１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルのｉｎ ｖｉｖｏの変化に関して被験体をモニターしてもよい。
このように、第１の生体サンプルは、注目する抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の前に被験体から採取し、１種以上のこれらのバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子の発現レベルについてアッセイし、分析される各因子の発現レベルのベースラインを得る。この第１の生体サンプルは「ベースライン生体サンプル」と呼ぶ。同一組織種または体液の１以上の次の生体サンプルを被験体から採取し、同一バイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子についてアッセイするが、次の生体サンプルは、注目する抗ＣＤ４０治療薬の少なくとも１用量の投与後に採取する。モニタリングは、抗ＣＤ４０治療薬が被験体に投与される任意の所与の治療プロトコールの有効性を確かめるために、単一時点で行ってもよいし、複数時点で行ってもよい。アッセイされているバイオマーカーに応じて、任意の２時点間のバイオマーカーレベルの低下または増大が、癌または前癌状態の治療における抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示す。モニタリングが、１種以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルの低下を示す場合には、このような結果は癌または前癌状態の治療における抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示す。
したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉する抗ＣＤ４０治療薬を用いる被験体の治療の有効性を、被験体由来のベースライン生体サンプルを得ることと、本明細書において上述される細胞の生存および／またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路の１種以上のバイオマーカーの発現レベルを検出することと、被験体に、治療薬、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはＣＨＩＲ−５．９などのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片の少なくとも１用量を投与することと、例えば、約３０分〜約２４時間、例えば、約３０分〜約１２時間、約３０分〜約６時間、約３０分〜約４時間、および約１時間〜約４時間のうちに被験体から次の生体サンプルを採取することと、次の生体サンプルにおいて細胞生存および／またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの発現レベルを検出することとによってモニターし、ベースライン生体サンプル中の発現レベルと比較した、次の生体サンプルにおける発現レベルの低下が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す。検出は、本明細書において他で開示される方法などの、当技術分野で公知の任意の方法を用いて達成できる。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ベースライン生体サンプルにおいて検出されたものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。ベースラインからの少なくとも２５％のパーセント変化（すなわち、ベースライン生体サンプルに対し少なくとも２５％の低下）が、抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示し、中間の反応性は、少なくとも３０％または少なくとも４０％のパーセント変化により示される。ベースラインからのパーセント変化は少なくとも５０％（すなわち、ベースライン生体サンプルに対し少なくとも５０％の低下）またはそれより高いことが好ましい。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉する抗ＣＤ４０治療薬を用いる被験体の治療の有効性を、被験体由来のベースライン生体サンプルを得ることと、本明細書において上述されるＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達のサイトカインマーカーの発現レベルを検出することと、被験体に、治療薬、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはＣＨＩＲ−５．９などのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片を少なくとも１用量を投与することと、例えば、投薬後約２４時間〜約３週間、例えば、約４８時間、約７２時間、約１週間または約２週間のうちに被験体から次の生体サンプルを採取することと、次の生体サンプル中の細胞の生存および／またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの発現レベルを検出することとよってモニターし、ベースライン生体サンプル中の発現レベルと比較した、次の生体サンプル中の発現レベルの低下が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す。検出は、本明細書において他で開示される方法などの、当技術分野で公知の任意の方法を用いて達成できる。さらに、データを正規化するために、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の影響を受けないサイトカイン（例えば、ＩＬ−ＩｂおよびＩＬ−１２；本明細書にける、以下の実験の項を参照）を対照として使用できる。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ベースライン生体サンプルで検出されたものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下する。ベースラインからの少なくとも２０％（すなわち、ベースライン生体サンプルに対し少なくとも２０％の低下）以上のパーセント変化が、抗ＣＤ４０治療薬の有効性を示す。いくつかの実施形態では、血清または血清抽出物を含むベースライン生体サンプルを、サイトカインマーカーの次の分析のために凍結する。
他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックもしくは干渉する、またはその作用様式としてＡＤＣＣを有する抗ＣＤ４０治療薬を用いる被験体の治療の有効性を、被験体由来のベースライン生体サンプルを得ることと、本明細書に上述されている１種以上のアポトーシスのバイオマーカーの発現レベルを検出することと、被験体に、治療薬、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはＣＨＩＲ−５．９などのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片の少なくとも１用量を投与することと、例えば、投薬後約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間または７２時間のうちに、および場合により投与後約１週間、約２週間または約３週間に再度、被験体から次の生体サンプルを採取することと、次の生体サンプル中の、アポトーシスのバイオマーカーの発現レベルを検出することとによってモニターし、ベースライン生体サンプル中の発現レベルと比較した次の生体サンプル中の発現レベルの増大が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す。検出は、本明細書において他で開示される方法などの、当技術分野で公知の任意の方法を用いて達成できる。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ベースライン生体サンプルで検出されたものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％以上増大する。ベースラインからの少なくとも２０％（すなわち、ベースライン生体サンプルに対し少なくとも２０％の増大）以上のパーセント変化が、抗治療薬の有効性を示す。
さらに他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは干渉する、ＡＤＣＣを調節する、またはその両方である抗ＣＤ４０治療薬を用いる被験体の治療の有効性を、被験体由来のベースライン生体サンプルを得ることと、本明細書に上述されている１種以上のＣＤ４０関連因子（すなわち、腫瘍性細胞上の細胞表面ＣＤ４０および／もしくはＣＤ４０Ｌ、ならびに／またはｓＣＤ４０および／もしくはｓＣＤ４０Ｌの循環レベル）の発現レベルを検出することと、被験体に、治療薬、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはＣＨＩＲ−５．９などのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片の少なくとも１用量を投与することと、例えば、約１日（すなわち２４時間）、２日、３日、４日、または１週間のうちに被験体から次の生体サンプルを採取することと、ＣＤ４０関連因子の発現レベルを検出することとによってモニターし、ベースライン生体サンプルの発現レベルと比較した、次の生体サンプルの発現レベルの低下が、抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ベースライン生体サンプルで検出されたものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下する。
これらのアッセイのいずれか１つまたは組合せを実施し、癌または前癌状態の被験体の、注目する抗ＣＤ４０治療薬を、その作用様式に応じて用いる治療の有効性をモニターできることは認識される。有効性が証明される場合は、例えば、毎日、隔日、週３回、週２回、週１回、隔週、月１回など、推奨される投与計画に従って、抗ＣＤ４０治療薬の次の用量を投与できる。あるいは、注目するマーカー（すなわち、細胞の増殖および生存のバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、サイトカインマーカー、ＣＤ４０関連因子ならびにそのいずれかの組合せのｉｎ ｖｉｖｏ発現レベルを投薬頻度の指針とすることができ、また、投与されるべき治療上有効な用量に関する指標とすることもできる。このように、次の生体サンプルが、注目するそれぞれのマーカーの発現レベルの許容される低下または増大を引き続き示す場合は、それぞれのマーカーの発現レベルがベースライン生体サンプルで観察された発現レベルに近づくような時点まで、抗ＣＤ４０治療薬を用いるさらなる投与を延長してもよい。一部のバイオマーカーは、治療薬の作用とは独立して変動する可能性があり、また半減期および滞留時間も異なるため、マーカー（すなわち、アポトーシス、細胞の生存、ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、サイトカインマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子）の発現レベルを投薬頻度の指針として用いる場合は、少なくとも２回の連続測定（例えば、２４〜４８時間以内に）を考慮することが好ましい。
これらのアッセイ結果が、１種以上の細胞の生存のバイオマーカー、１種以上のＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーおよび／または１種以上のＣＤ４０関連因子の発現の低下、ならびに、１種以上の細胞アポトーシスのマーカーの発現の増大に関して、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の望ましいダウンレギュレーションを引き続き示す場合は、抗ＣＤ４０治療薬を用いるさらなる治療が正当化される。本明細書において上述したように、治療の有効性を経時的にモニターすることを考慮するために治療期間にわたってさまざまな時間間隔で生体サンプルを採取し、治療を継続すべきかやめるべきかを決定することができる。
以下の実施例は、例示の目的で示されるものであって、限定を注目するものではない。
実験
緒言
以下の実施例で使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨｌＲ−１２．１２である。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座を有しているトランスジェニックマウス（ゼノマウス（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ； Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を免疫化することにより作製されたヒトＩｇＧ１サブタイプ抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）である。ＣＤ４０細胞外ドメインを発現するＳＦ９昆虫細胞を免疫原として使用した。
手短には、Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１３：１４３により先に記載されたように、免疫化したマウス由来の脾臓細胞を、ＳＰ２／０またはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と１０：１の割合で５０％ポリエチレングリコールを用いて融合させた。ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を補給した完全ＩＭＤＭ培地中に融合細胞を再懸濁した。次いで、各ウェルに平均して１つの増殖ハイブリドーマが含まれるように、この融合細胞を９６ウェル組織培養プレートのウェルに分配した。
１０〜１４日後、特異的抗体の生成についてハイブリドーマ集団の上清をスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の生成のスクリーニングのために、各ウェルの上清をプールし、最初にＥＬＩＳＡにより抗ＣＤ４０活性特異性の検査を行った。次いで、陽性であったものを標準ＦＡＣＳアッセイを用いるＥＢＶトランスフォームＢ細胞の蛍光細胞染色に使用した。陽性ハイブリドーマ細胞を、０．５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６を含有するＩＭＤＭ／ＦＢＳでの制限希釈により２回クローニングした。
合計で３１のマウス脾臓をマウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞と融合させ、ＥＬＩＳＡにおいて組換えＣＤ４０を認識する８９５の抗体を作製した。Ａｂｇｅｎｉｘ ゼノマウス（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ； Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて作製されるハイブリドーマの、平均して約１０％が、ヒトκ鎖の代わりにマウスλ軽鎖を含み得る。マウスλ軽鎖を含む抗体を選び出した。細胞表面ＣＤ４０への結合も示す２６０の抗体サブセットをさらなる分析のために選択した。一連のサブクローニング手順の間に選択された安定なハイブリドーマを、結合および機能分析におけるさらなる特性決定のために使用した。選択方法のさらなる詳細に関しては、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））に割り当てられた、「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された同時係属仮出願および同様に「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された、２００４年１１月４日に出願され、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））を参照のこと。なお、それぞれの内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
７つの他のハイブリドーマ由来のクローンが、アンタゴニスト活性を有することが確認された。それらの相対的アンタゴニスト効果およびＡＤＣＣ活性に基づいて、２つのハイブリドーマクローンをさらなる評価のために選択した（以下の表１）。それらを１３１．２Ｆ８．５．９（５．９）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（１２．１２）と名付けた。
Figure 0005208730
 マウスハイブリドーマ系統１３１．２Ｆ８．５．９（ＣＭＣＣ番号１２０４７）およびハイブリドーマ系統１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ番号１２０５６）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９ （ＵＳＡ））に、それぞれ特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３で寄託されている。
候補抗体の可変領域をコードしているｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定した。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖）および配列番号４（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖）に示されている。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体は配列番号５に示されており、これは配列番号４の１５３位でアラニン残基の代わりにセリン残基を有するという点で、配列番号４とは異なっている。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖のコード配列）および配列番号３（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のコード配列）に示されている。ＣＨＩＲ−５．９抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、配列番号６（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖）および配列番号７（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖）に示されている。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体は配列番号８に示されており、配列番号７の１５８位でアラニン残基の代わりにセリン残基を有するという点で、配列番号７とは異なっている。
無関係のハイブリドーマ由来の抗体に関して予想されるように、相補性決定領域（ＣＤＲ）のヌクレオチド配列はかなり変化に富んでいる。ＶＨのＣＤＲ３領域の多様性は、抗体特異性を最も大きく左右すると考えられている。
ＦＡＣＳ分析により示されるように、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はヒトＣＤ４０と特異的に結合し、ＣＤ４０−リガンド結合を阻止することができる。両ｍＡｂとも、細胞表面ＣＤ４０と先に結合していたＣＤ４０−リガンドと競合して除去することができる。ＣＨＩＲ−５．９のヒトＣＤ４０に対する結合親和性は１．２×１０−８Ｍであり、ＣＨＩＲ−１２．１２のヒトＣＤ４０に対する結合親和性は５×１０−１０Ｍである。ＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体は強力なアンタゴニストであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで正常Ｂ細胞のＣＤ４０リガンドにより媒介される増殖を阻害し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＨＬおよびＣＬＬ患者由来の癌細胞のＣＤ４０リガンドにより媒介される増殖を阻害する。ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体は、正常ヒトＢリンパ球において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により媒介される生存およびシグナル伝達経路を直接阻害する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、両抗体とも、ＮＨＬ患者由来の原発性癌細胞を、ＡＤＣＣによって死滅させた。異種移殖ヒトリンパ腫モデルでは、用量依存性の抗腫瘍活性が見られた。これらの結果およびそれらを得るために用いたアッセイの、より詳細な説明に関しては、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））に割り当てられた、「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された仮出願および同様に「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ」と題された、２００４年１１月４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））を参照のこと。なお、それぞれの内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
実施例１：ＣＨＩＲ−１２．１２はヒトＢ−ＣＬＬ細胞においてＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０の生存およびシグナル伝達経路をブロックする
以下に説明する研究は、ＣＨＩＲ−１２．１２もまた、Ｂ−ＣＬＬにおけるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により媒介される生存およびシグナル伝達経路を直接阻害することを実証する。ＣＤ４０Ｌは、Ｂリンパ球を活性化し、様々な機能的反応、例えば、生存の増強ならびにＮＦｋＢ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化を誘発する。さらに、ＣＤ４０Ｌ刺激は、ＰＡＲＰの切断の減少および抗アポトーシスタンパク質、Ｂｃｌ−ｘｌ、ＸＩＡＰおよびｃＩＡＰの誘導により示される生存シグナルをもたらす。これとは対照的に、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＢ−ＣＬＬのＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、時間および用量依存的な切断されたカスパーゼ−３および切断されたＰＡＲＰの誘導ならびにＢｃｌ−ｘｌ、ＸＩＡＰ、およびｃＩＡＰの減少を引き起こした。ＣＤ４０Ｌの刺激なしに、ＣＨＩＲ−１２．１２単独ではアポトーシスを引き起こさなかった。本発明者らは、リガンドによるＣＤ４０活性化によって誘発されるシグナル伝達事象を検討した。ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの結合は、ＮＦκＢ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ｐ３８およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路など、複数のシグナル伝達経路の活性化をもたらした。ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ＣＤ４０Ｌにより媒介される、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびβ（ＮＦκＢ経路）、ＥＲＫならびにＡｋｔのリン酸化を阻害した。本発明者らは、ＰＩ３Ｋ（ＬＹ２９４００２）およびＭＥＫ（ＰＤ９８５９５）の薬理学的阻害剤を用いて、ＣＬＬ細胞の生存が少なくともある程度はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に依存していることを示した。ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＣＬＬ細胞のＣＨＩＲ−１２．１２処理はまた、サイクリンＤ１も阻害した。これらの結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２が、Ｂ−ＣＬＬにおいてＣＤ４０Ｌにより媒介される生存および複数のシグナル伝達経路、例えば、ＮＦκＢ、ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔをブロックしたことを実証する。
完全ヒトアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であるＣＨＩＲ−１２．１２は、上述のようにゼノマウス（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．）において作製した。Ｂ−ＣＬＬ細胞を購入し（Ｃｕｒｅｌｉｎｅ， Ｉｎｃ．； Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、ＣＤ４０リガンドにより媒介される生存およびシグナル伝達経路に対する抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の効果を評価するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。これらの実験では、ＮＦκＢ、ＥＲＫ、およびＡｋｔ経路を検討した。
Ｂ−ＣＬＬ細胞においてＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を阻害する
これらの実験では、１μｇ／ｍｌのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｉｎｇｈａｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて、１．０×１０６個の患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞を刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）および対照ＩｇＧを加えた。ＣＨＩＲ−１２．１２処理後２４時間に、細胞を回収した。アポトーシスのバイオマーカーである切断されたＰＡＲＰ、生存のバイオマーカーである、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｂｃｌ−２およびｃＩＡＰ１を、これらのバイオマーカーに特異的な市販の抗体を用いるウエスタンブロット解析によって、細胞溶解物において検出した。
図１で示されるように、ＣＨＩＲ−１２．１２を用いる処理は、２人の患者（４番および２１番）由来のＢ−ＣＬＬ細胞サンプルにおいて切断されたＰＡＲＰの誘導ならびにＢｃｌ−ｘ１、ＸＩＡＰおよびｃＩＡＰ１の減少をもたらした。対照とＣＨＩＲ−１２．１２処理細胞との間で、Ｂｃｌ−２およびＴＲＡＩＬレベルの変化はなかった。
３０番の患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞のウエスタンブロット解析を図２に示す。対照ＩｇＧ処理群と比較して、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、切断されたＰＡＲＰの発現を誘導し、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−２発現を減少させた。
３１番の患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞のウエスタンブロット解析を図３に示す。対照ＩｇＧ処理群と比較して、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、切断されたＰＡＲＰの発現を誘導し、サイクリンＤ１およびＢｃｌ−ｘ１発現を減少させた。
ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、Ｂ−ＣＬＬにおいてＣＤ４０リガンドにより媒介されるＮＦκＢ、ＥＲＫ、ＰＩ３／Ａｋｔおよびｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する
これらの実験では、１μｇ／ｍｌのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｉｎｇｈａｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて、１．０×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）および対照ＩｇＧを加えた。０分および２０分に細胞を回収した。ウエスタンブロットにより、細胞溶解物において、リン酸化ＩＫＫα（Ｓｅｒｌ８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）（ｐ−ＩＫＫα／β；ＮＦκＢ経路）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）、リン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ−ｐ３８）を検出した。
図４に示されるように、ｓＣＤ４０Ｌは、対照ＩｇＧ処理Ｂ−ＣＬＬ細胞において２０分以内にＩＫＫα／β、ＥＲＫ、およびＡｋｔのリン酸化を刺激し、また、ＣＨＩＲ−１２．１２処理Ｂ−ＣＬＬ細胞では、ＩＫＫα／β、ＥＲＫおよびＡｋｔのリン酸化の有意な阻害があった。興味深いことに、これらのＢ−ＣＬＬ患者サンプルでは、恒常的に活性化されたｐ３８ＭＡＰＫが存在し、ＣＨＩＲ−１２．１２はｐ３８ＭＡＰＫの活性化を有意には阻害しなかった。
Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＣＤ４０リガンドにより媒介される生存に対するＣＨＩＲ１２．１２の用量依存効果
これらの実験では、１μｇ／ｍｌのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．， Ｂｉｎｇｈａｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて、１．０×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（０、０．０１、０．１、１．０、１０、および２０μｇ／ｍｌ）および対照ＩｇＧを加えた。２２〜２４時間に細胞を回収した。切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ−３およびＢｃｌ−ｘ１に対する抗体を用い、細胞溶解物でウエスタンブロット解析を行った。同等のローディングおよびトランスファー効率を検出するために、β−アクチンに対する抗体を用いた。
図５および６で示されるように、ｓＣＤ４０Ｌにより刺激されたＢ−ＣＬＬ細胞のＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、０．０１μｇ／ｍｌという低用量で用量依存的な、切断されたＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３の誘導ならびにＢｃｌ−ｘ１の減少をもたらした。
Ｂ−ＣＬＬ細胞では、アポトーシスに対するＣＨＩＲ−１２．１２の効果は、ＣＤ４０Ｌ刺激が無ければ現れない
この実験では、ＣＤ４０Ｌで刺激していない、１．０×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）または対照ＩｇＧで処理した。１、４および２４時間に細胞を回収した。切断されたＰＡＲＰ（アポトーシスタンパク質）およびＸＩＡＰ（抗アポトーシスタンパク質）に対する抗体を用い、細胞溶解物でウエスタンブロット解析を行った。
図７に示された結果は、ＣＤ４０リガンド刺激がＢ−ＣＬＬ細胞の生存に必要であり、ＣＨＩＲ−１２．１２単独ではＢ−ＣＬＬ細胞のさらなるアポトーシスを誘発しなかったことを示す。
ＣＬＬ細胞の生存に必要なシグナル伝達経路
ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）およびＭＥＫ阻害剤（ＰＤ９８５９５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用い、ＣＬＬ細胞の生存に必要な経路を精査した。これらの実験では、１．０×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を１％ＦＢＳ含有培地中で４時間、血清飢餓培養した。次いで、血清飢餓細胞をＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤、３０μＭ）またはＰＤ９８５９５（ＭＥＫ阻害剤、１０μＭ）を用いて前処理した。次いで、ＣＤ４０Ｌ刺激前および刺激後２０分に細胞溶解物を回収した。ｐ−ＩＫＫα／β、ｐ−ＥＲＫ、ｐ−Ａｋｔに対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を行い、総ＥＲＫおよびβ−アクチンに対する抗体を探索することにより同等のローディングを評価した。
図８に示されるように、予想通り、ＰＤ９８５９５はＣＤ４０Ｌ処理により誘発されたＥＲＫの活性化を阻害し、ＬＹ２９４００２はＣＤ４０Ｌ処理により誘発されたＡｋｔの活性化を阻害した。いずれの阻害剤によってもＩＫＫ／ＮＦκＢの活性化に変化は起こらなかった。
しかし、ＰＩ３阻害剤であるＬＹ２９４００２で処理されたＢ−ＣＬＬ細胞のみが、切断されたＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３の誘導ならびに抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−ｘ１の減少を示した（図９）。ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８５９５では、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存に変化は無かった。このことは、Ｂ−ＣＬＬ細胞の生存はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路によって媒介されているという知見を支持する。
フローサイトメトリー分析を用いて、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、Ｂ−ＣＬＬ患者の細胞においてＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を阻害する
この実験では、１μｇ／ｍｌのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．， Ｂｉｎｇｈａｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて、０．４×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を刺激した。次いで、ＣＨＩＲ１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）または対照ＩｇＧを加えた。ＣＨＩＲ−１２．１２処理後２４時間に細胞を回収した。固定および透過処理後に、切断されたＰＡＲＰおよびＴＵＮＥＬ法のために細胞を染色した。
ＣＨＩＲ１２．１２を用いて処理された細胞のフローサイトメトリー分析が図１０および１１に示されている。アポトーシスを評価するために、切断されたＰＡＲＰおよびＴＵＮＥＬ法を用いた。ｓＣＤ４０Ｌの不在下で、細胞を２４時間培養した後、細胞はアポトーシスのサインを示し始め、切断されたＰＡＲＰおよびＴＵＮＥＬに対する細胞の染色結果は陽性となった。ｓＣＤ４０Ｌの添加は、これら２つのマーカーに対して陽性に染色される細胞の割合の低下を引き起こした。ＣＨＩＲ−１２．１２をｓＣＤ４０Ｌと共に加えた場合、切断されたＰＡＲＰまたはＴＵＮＥＬについて陽性細胞の割合は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激が無い場合にみられるレベルに戻った。このことは、ｓＣＤ４０Ｌにより誘導される生存が、ＣＨＩＲ−１２．１２の添加により阻害されることを示している。
Ｂ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０リガンドにより媒介されるシグナル伝達事象に対するＣＨＩＲ−１２．１２処理の転写物レベルでの効果
Ｂ−ＣＬＬ細胞においてＣＨＩＲ−１２．１２がどのように転写調節を媒介するかを調べるために、ＣＨＩＲ−１２．１２を経時的に用いた。この実験では、ＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）またはＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）およびｓＣＤ４０Ｌを用いて、１．０×１０６個の患者由来のＢ−ＣＬＬ細胞を同時に処理した。細胞ペレットを０時間（ＣＤ４０Ｌなし）、１、４および２４時間に回収し、最後に同時に溶解させた。ＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを単離し、ＡＢＩ ＲＴキットを用いてｃＤＮＡを調製した。各セットのオリゴのＴＭ値に基づき、２つの別々の反応において示された遺伝子を用いてツーステップＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＩｇＧ１対照サンプルと比較した場合に、様々な遺伝子が特定の時点においてＣＨＩＲ−１２．１２により媒介される転写の変化を示した（図１２）。ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＶＥＧＦ、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３はすべてＲＮＡ発現の阻害を示し、ＴＲＡＦ６およびＭｃｌ−１はわずかなダウンレギュレーションを示した。ＩＬ−６は転写の変化を示さなかった。
Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＨＩＲ−１２．１２処理はＣＤ４０リガンドにより媒介されるｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害する
ＣＤ４０シグナル伝達におけるｐ３８ＭＡＰＫ経路の役割を精査するために、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）およびＣＨＩＲ−１２．１２を、４時間および２４時間の２つの異なる時点で使用した。４時間の実験では、１ウェルあたりおよそ０．８×１０６個のＢ−ＣＬＬ細胞を１％ＦＢＳ含有培地中で４時間、血清飢餓培養した。細胞は、ＳＢ２０３５８０（３０および６０μＭ）ならびにＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）を用いて前処理した。ＣＤ４０Ｌ刺激前および刺激２０分後に細胞溶解物を回収した。示された特異的タンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を行い、総ｐ３８（ｔ−ｐ３８）およびβ−アクチンに対する抗体を探索することにより同等のローディングを評価した。
２４時間の実験では、１ウェルあたりおよそ０．８×１０６個のＢ−ＣＬＬ細胞を、完全血清（１０％ＦＢＳ）含有培地中に２４時間入れた。細胞は、ＳＢ２０３５８０（３０および６０μＭ）またはＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかを用いて同時に２４時間、前処理し、ＣＤ４０Ｌで刺激した。示された特異的タンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を行い、β−アクチンに対する抗体を探索することにより同等のローディングを評価した。
図１３は、この患者ではｐ３８は恒常的にリン酸化されていなかったことを示すが、しかしながら、恒常的活性は患者間で変化するものであった。ＣＤ４０Ｌによるその活性化は、４時間では、ＳＢ２０３５８０阻害剤によってわずかに阻害され、ＣＨＩＲ−１２．１２により完全に阻害された。ＣＤ４０Ｌによるホスホ−ＩＫＫα／β活性化もまた、ＣＨＩＲ１２．１２により阻害された。
図１４で示されるように、切断されたＰＡＲＰはＳＢ２０３５８０およびＣＨＩＲ．１２．１２両方により顕著に誘導され、それによって、ＣＤ４０Ｌにより媒介される刺激を阻害したが、切断されたカスパーゼ−３はより少ない程度にしか誘導されなかった。Ｂｃｌ−ｘ１の発現もまた、特に６０μＭのＳＢ２０３５８０の濃度および１０μｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２でブロックされ、ｐ３８のリン酸化は、４時間の実験において見られたと同様に、ブロックされた。ＣＤ４０の発現もまた、ＣＨＩＲ−１２．１２によって阻害された。
図１５は、ｐ３８の基礎リン酸化状態が、試験されたＣＬＬ患者サンプルの間で異なることを示す。基礎ｐ−ｐ３８活性の低い患者は、基礎発現が高い患者よりも、ＣＤ４０Ｌ刺激によりリン酸化がより強く誘導される。ＣＨＩＲ−１２．１２は、その基礎レベルの高低にかかわらず基礎リン酸化にまでｐ−ｐ３８レベルを低下させた。
実施例２：抗ＣＤ４０ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株を溶解させる能力
ヒトＭＭ細胞株、ＫＭＳ−１２−ＢＭ、ＩＭ−９およびＡＲＨ−７７を、Ｒ２培地（２％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ）を用いて３回洗浄し、Ｒ１０培地（１０％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ）に１×１０６個／ｍＬの密度で再懸濁した。カルセインＡＭ（終濃度５ｍＭ）を加えて５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞を標識した。精製ヒトＮＫ細胞およびカルセイン標識された標的細胞を、Ｒ１０培地に１０対１の割合で混合し（２００ｍＬ中５×１０４個のＮＫ細胞および５×１０３個の標的細胞）、Ｕ底の９６ウェルプレート（Ｐａｃｋａｒｄ’ｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴ）中に加えた。ＣＨＩＲ−１２．１２を所望の濃度に段階希釈し、ＮＫ／標的細胞混合物を含むウェル中に３連で加えた。細胞溶解を最大にするために１％ＮＰ−４０を３つのウェルに加えた。５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で４時間、かく乱することなく細胞をインキュベートした。次いで、このプレートを３００ｒｐｍでブレーキをかけずに５分間遠心分離した。上清１００ｍＬを新しい９６ウェルプレートに移した。上清中に放出されたカルセインを、励起４８５ｎｍにて、放出５３５ｎｍにて、Ｔｅｃａｎ ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ （Ｔｅｃａｎ Ｕ．Ｓ．， Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ，ＮＣ）を用いて任意蛍光単位（ＡＦＵ）で測定した。特異的な溶解のパーセントは以下のように計算した：１００×（ＡＦＵ試験−ＡＦＵ自然放出）／（ＡＦＵ最大放出−ＡＦＵ自然放出）。
抗体濃度の対数に対して特異的溶解パーセントをプロットすることにより、各細胞株のＥＤ５０を求めた（図１６参照）。ＫＭＳ−１２−ＢＭ細胞に対するＣＨＩＲ−１２．１２のＥＤ５０は１７．９ｍＭであり、ＩＭ−９細胞に対するＣＨＩＲ−１２．１２のＥＤ５０は５．９ｐＭであり、ＡＲＨ−７７細胞に対するＣＨＩＲ−１２．１２のＥＤ５０は２３．９ｐＭであった。
実施例３：多発性骨髄腫動物モデルにおけるＣＨＩＲ−１２．１２の抗腫瘍活性
ＣＨＩＲ−１２．１２は、合計３用量について週１回腹膜内投与（ｉ．ｐ．）された場合、いくつかの腫瘍モデルにおいて多発性骨髄腫の腫瘍の成長を用量依存的に有意に阻害した。ＣＨＩＲ−１２．１２とボルテゾミブ（ベルケード（登録商標））を組合せた場合、観察された有効性は相加的なものであった。
ＩＭ−９多発性骨髄腫異種移殖モデル
ＳＣＩＤマウスの皮下に、マウス一匹あたり５０％ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）中、５×１０６個のＩＭ−９腫瘍細胞（ＣＤ４０およびＣＤ２０両方を発現するヒト多発性骨髄腫細胞株）を接種した。第１の研究では、腫瘍移植後５、１２および１８日に、腫瘍担持マウスに１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１、１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂ、または１０ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂを腹膜内注射した。あるいは、腫瘍移植後５、８、１２および１５日に１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブ投与を静脈内に行った。第２の研究では、腫瘍担持マウスに、１ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を腹膜内に、１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂを腹膜内に、または１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを静脈内に注射した。抗体の投与は腫瘍移植後８、１４および２１日に行ったのに対し、ボルテゾミブの投薬は腫瘍移植後８、１１、１４および１８日に行った。あるいは、腫瘍担持マウスに、腫瘍移植後８、１４および２１日に１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂを腹膜内に、さらに腫瘍移植後８、１１、１４および１８日に１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを静脈内注射した。データは、ログランク検定を用いて分析した。
１および１０ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２の投与は、腫瘍移植後１５、１８および２１日において腫瘍の成長を阻害した（図１７参照）。ボルテゾミブも、腫瘍移植後５、８、１２および１５日に１ｍｇ／ｋｇを投与された場合に、腫瘍移植後１５、１８、および２１日において腫瘍の成長を阻害した（図１７参照）。第２の研究では、１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブは統計学的に有意な成長阻害を示さなかった。ＣＨＩＲ−１２．１２（１ｍｇ／ｋｇ）を最大耐量のボルテゾミブと組合せて投与した場合、腫瘍容積の減少が１３、１６、２０、２３、および２６日に観察された（図１８参照）。
要約すると、抗ＣＤ４０ｍＡｂの投与は、ＣＨＩＲ−１２．１２の週１回の１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、実験的多発性骨髄腫モデルにおいて腫瘍の成長を阻害した。腫瘍成長阻害としては境界線の活性を示した１ｍｇ／ｋｇの週２回でのボルテゾミブの投与は、ひとつの実験では統計学的に有意であり（図１７）、第２の研究では有意ではなかった（図１８）。さらに、ＣＨＩＲ−１２．１２とボルテゾミブ治療の組合せることによって、腫瘍成長阻害が増強された。これらのデータは、抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２は強力な抗腫瘍活性を有し、単独または他の化学療法薬との組合せのいずれかで多発性骨髄腫の治療にとって臨床的に有効である可能性があることを示唆する。
ＣＨＩＲ−１２．１２はＩＭ−９異種移植片において増殖速度を低減し、細胞死を増加させる
ＣＨＩＲ−１２．１２を皮下ＩＭ−９異種移殖モデルにおいて試験した際に、ＣＨＩＲ−１２．１２単回投与後５日に組織学的検査を行った。ＣＨＩＲ−１２．１２治療はＫｉ６７＋増殖細胞数を有意に減少させ、２種のアポトーシスマーカーである、切断されたカスパーゼ３および切断されたＰＡＲＰのレベルを増加させたが、これはＣＨＩＲ−１２．１２治療によりもたらされた細胞増殖阻害および細胞死の誘導を実証している。
ＣＨＩＲ−１２．１２は病期分類されていないまたは病期分類された同所性（静脈内投与）ＩＭ−９異種移殖モデルの生存を延長する
ＳＣＩＤマウスの皮下に、マウス一匹あたり５０％ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）中５×１０６個のＩＭ−９腫瘍細胞（ＣＤ４０およびＣＤ２０両方を発現するヒト多発性骨髄腫細胞株）を接種した。病期分類されていないモデルでは、腫瘍移植後１日から治療を開始した。腫瘍担持マウスに１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１または０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２を週１回腹膜内注射した。あるいは、腫瘍担持マウスに０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを週１回静脈内注射した。データは、ログランク検定を用いて分析した。
病期分類されていない条件の生存モデルでは、ＣＨＩＲ−１２．１２は腫瘍担持マウスの生存を延長した（図２０）。病期分類されたモデルでは、腫瘍細胞移植後７日から治療を開始した。腫瘍担持マウスに１ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１または０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２を週１回腹膜内注射した。あるいは、腫瘍担持マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを静脈内注射した。データは、ログランク検定を用いて分析した。この病期分類された同所性モデルでも、ＣＨＩＲ−１２．１２は腫瘍担持マウスの生存を延長した（図２１）。
ＣＨＩＲ−１２．１２はヒトＫＭＳ−１２−ＢＭ皮下異種移殖モデルの成長を阻害する
メスのＳＣＩＤマウスを、腫瘍細胞移植の１日前に３Ｇｙの照射で治療した。移植の日、細胞を５０％ｍａｔｒｉｇｅｌ中５×１０７個細胞／ｍｌの濃度に調製した。細胞を、５×１０６細胞／１００μｌ／マウスで右脇腹の皮下に移植した。腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３に達した時に、マウスを無作為化して１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２または１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブのいずれかで治療した。抗体は、週１回、４週間にわたって腹膜内投与した。ボルテゾミブは、週２回、２週間にわたって静脈内投与した。
原発腫瘍の成長は、細胞移植後４２日においてＣＨＩＲ−１２．１２投与により用量依存的に阻害された。ＫＭＳ−１２−ＢＭの腫瘍容積は１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ群でそれぞれ３２％（Ｐ＞０．０５，分散分析と、それに続くテューキー多重比較検定）および３５％（Ｐ＜０．０５）減少していた。ボルテゾミブは１ｍｇ／ｋｇの最大耐量で腫瘍容積の減少が２２％（Ｐ＞０．０５）であり、阻害傾向のみを示した。
実施例４：ＣＤ４０＋細胞における、ＣＤ４０リガンドにより誘導されるサイトカイン分泌の評価
ＣＤ４０は、Ｂ細胞性悪性腫瘍において高度に発現される。リガンドによるＣＤ４０の刺激は、正常および悪性Ｂ細胞に対して生存および増殖シグナルをもたらす。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、ヒト末梢血リンパ球の増殖は誘導しないが、ＣＤ４０Ｌにより誘導されるリンパ球の増殖を阻害する。ＣＤ４０シグナル伝達はまた、細胞がさまざまなサイトカインを産生するように誘導する。本実施例では、ＣＨＩＲ−１２．１２の、正常Ｂ細胞および原発性患者ＣＬＬ細胞によるサイトカイン産生調節能を調べた。
細胞（ウェルあたり１×１０５細胞）を、９６ウェルプレート中でＣＤ４０Ｌの存在下または不在下で培養した（ＣＤ４０をトランスフェクトした、ホルムアルデヒドで固定したＣＨＯ細胞、ウェルあたり２×１０５個細胞）。細胞をｈｕＩｇＧ１（対照）または１０μｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２と共に３７℃で２４時間インキュベートし、上清を回収した。ｈＩＬ−６、ｈＩＬ−８、ｈＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＩＬ−１ｂ、ｈＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βの産生を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）マルチ−アレイシステム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）により測定した。
ＣＤ４０Ｌの不在下でＣＨＩＲ−１２．１２のみと共に培養した細胞は、バックグラウンドレベルを超えるサイトカインをいずれも産生しなかったことは、ＣＨＩＲ−１２．１２がサイトカイン産生に対してアゴニスト活性を持っていないことを示唆している。その一方で、ＣＤ４０Ｌは正常Ｂ細胞において、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦ−α、ｈＩＬ−８、ｈＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βの産生を誘導した（ｎ＝３）（表２）。これらの培養物へのＣＨＩＲ−１２．１２の添加は、すべてのサイトカインの産生を阻害した（表３参照）。
Figure 0005208730
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 ＣＬＬ患者の細胞を用いる予備実験では、ＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０Ｌにより誘導されるｈＩＬ−１０、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＴＮＦ−α、ｈＩＬ−８およびＭＣＰ−１（ｎ＝１）の産生を阻害した（表４対表５）。
Figure 0005208730
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 同時に、これらのデータはＣＨＩＲ−１２．１２がＣＤ４０リガンドにより媒介される生存、増殖、およびサイトカイン産生の強力なアンタゴニストであることを示す。
ＣＤ４０の結合はまた、正常細胞（Ｍｅｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｂｌｏｏｄ ９６（１２）：３８０１−３８０８）および腫瘍性細胞（Ｆａｒａｈａｎｉ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９（４）：５２４−５３０； Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８−５９０６）においてＶＥＧＦの発現も誘導し得る。ＶＥＧＦは多発性骨髄腫の細胞では、細胞の成長および遊走を促進し（Ｐｏｄａｒ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｂｌｏｏｄ ９８（２）：４２８−４３５）、ＣＬＬ細胞では細胞生存を促進する（Ｆａｒａｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５），前掲）ことがわかっている。そのようなものとして、ＶＥＧＦレベルの変化は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達の有用なサイトカインマーカーを提供し得る。ＶＥＧＦは分泌タンパク質であるため、ＶＥＧＦタンパク質発現の変化は、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの技術を用いて細胞培養上清において、または患者血液サンプルから得た血漿において容易に検出できる。あるいは、ノーザンブロットまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲなど、いくつかの技術のいずれかを用いて、腫瘍細胞から得られたｍＲＮＡから検出することができる。
もうひとつの実験において、正常Ｂ細胞およびＣＬＬ患者から得られたＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより誘導されるＶＥＧＦの産生を、上述の方法に類似した方法で検討した。ＣＨＩＲ−１２．１２のこれらの細胞培養物への添加は、ＣＤ４０Ｌにより誘導されるＶＥＧＦの産生を阻害することがわかった。
実施例５：バイオマーカーおよび予後指標
本発明の方法において使用されるｅｘ ｖｉｖｏ予後アッセイおよびさらなる予後アッセイは、その成熟タンパク質配列およびヌクレオチド配列が当技術分野で公知の、バイオマーカーの発現レベルについて生体サンプルをスクリーニングすることを必要とする。例えば、以下の表３に示される情報を参照のこと。これらのバイオマーカーを検出するためのプローブは、タンパク質（例えば、抗体プローブ）または核酸レベル（例えば、ＰＣＲプローブ）のいずれであっても、この配列情報に基づいて設計することができ、また、そのプローブは本明細書で開示された配列の変異体を検出するように設計できることは認識される。
Figure 0005208730
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 実施例６：抗ＣＤ４０治療薬のアンタゴニスト活性についてのアッセイ
以下に示すアッセイは、抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト活性を評価するために使用できる。これらのアッセイのためのヒトＢ細胞は、基本的にＤｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９０） ９：３２１に記載のとおり、例えば扁桃摘出術を受けている個人から採取した扁桃腺からの単離により得ることができる。手短には、手術用メスの刃を用いて組織を分散させ、食細胞およびＮＫ細胞は５ｍＭのＬ−ロイシンメチルエステルを用いた処理により枯渇させ、Ｔ細胞は、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウムを用いて処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を用いる１サイクルのロゼット形成により除去する。得られたＢリンパ球調製物の純度は、抗（ＣＤ２０）ｍＡｂ Ｂ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｌｏｎｅ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＡ）または抗（ＣＤ３）ｍＡｂ ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）およびウサギ抗（マウスＩｇ）のＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いる間接免疫蛍光標識、およびＦＡＣＳ分析によりチェックすることができる。
Ｂ細胞増殖アッセイ
Ｂ細胞（ウェルあたり４×１０４個）を、平底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０％ウシ胎児血清を補給した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養する。Ｂ細胞は、固定化抗（ＩｇＭ）抗体（イムノビーズ；５μｇ／ｍｌ；ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を加えることにより刺激する。所望により、１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を加える。微小培養の開始時に様々な濃度の試験モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を加え、３日目に、１８時間のパルシング後の（３Ｈ）−チミジンの取り込みを測定することにより増殖を評価する。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、固定化抗ＩｇＭ存在下または固定化抗ＩｇＭおよびＩＬ−２存在下で、ヒトＢ細胞の増殖を有意に共刺激しない。
バンチェロー様Ｂ細胞の増殖アッセイ
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５１：７０により記載されたものに類似した培養系中で、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体がＢ細胞の増殖を刺激する能力を試験するために、ヒトＦｃγＲＩＩのＨＲ対立遺伝子型を発現するマウス３Ｔ６形質転換体細胞を使用する。Ｂ細胞（ウェルあたり２×１０４個）を、平底マイクロウェルにおいて、１×１０４個の形質転換体細胞（５０００Ｒａｄを照射）存在下、１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−４を補給した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養する。Ｂ細胞を加える前に、３Ｔ６細胞を培養プラスチックへ少なくとも５時間付着させる。抗ＣＤ４０ｍＡｂを、１５ｎｇ／ｍｌ〜２０００ｎｇ／ｍｌの様々な濃度で加え、７日目に、［３Ｈ］チミジンと共に１８時間パルシングしてチミジン取り込みを測定することによりＢ細胞の増殖を評価する。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂ、Ｓ２Ｃ６により刺激されたＢ細胞の増殖の阻害
アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はまた、上記のＢ細胞増殖アッセイを用いて、Ｓ２Ｃ６（ＳＧＮ−１４としても知られ、正常Ｂ細胞増殖のＣＤ４０刺激のアゴニストとして報告されている；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２２５−３２３１）などの抗ＣＤ４０抗体によるＢ細胞増殖の刺激を阻害する能力によっても特徴づけることができる。ヒト扁桃腺のＢ細胞（ウェルあたり４×１０４個）を、セファロースビーズと結合している抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ４０ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６（１．２５μｇ／ｍｌ）の存在下、マイクロウェルにおいて２００μｌで培養する。３日後に、様々な濃度の、注目する抗ＣＤ４０ｍＡｂを加え、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを評価する。対照として、抗（グルコセレブロシダーゼ）ｍＡｂ ８Ｅ４を同様の濃度で加えることができる。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４：５８５。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖のｍＡｂ Ｓ２Ｃ６による共刺激を、例えば、少なくとも７５％以上阻害できる（すなわち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体存在下でＳ２Ｃ６により刺激された増殖は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下で観察されたもののせいぜい２５％である）。その一方で、β−グルコセレブロシダーゼに対する同じ量の非関連ｍＡｂ ８Ｅ４では有意な阻害は見られないであろう。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，前掲。このような結果は、抗ＣＤ４０ｍＡｂはヒトＢ細胞の増殖のための刺激性のシグナルは伝えないが、しかし、逆に、別のｍＡｂによるＣＤ４０誘発によってもたらされる刺激性シグナルを阻害できることを示す。
ＥＬ４Ｂ５細胞を用いるＢ細胞の活性化アッセイ
Ｚｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５） １３４：３６６２は、ＥＬ４Ｂ５として知られているマウス胸腺腫ＥＬ−４細胞株の変異株サブクローンが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてネズミおよびヒト起源両方のＢ細胞を免疫グロブリン分泌形質細胞へと増殖および分化するよう強力に刺激できることを観察した。この活性化は、抗原依存性であり、ＭＨＣ制限されないことがわかった。ヒトＢ細胞の最適な刺激のためには、活性化されたヒトＴ細胞由来の上清の存在が必要であるが、Ｂ細胞の反応はまた、ＥＬ４Ｂ５細胞がホルボール−１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）またはＩＬ−１でプレ活性化された場合にも起こった。Ｚｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９９：２８１およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：２９５５。この培養系におけるＢ細胞の活性化は効率的である−制限希釈実験から、ヒトＢ細胞の大多数が抗体分泌細胞へと増殖および分化するように活性化され得ることがわかった。Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７．
Ｂ細胞（ウェルあたり１０００個）を、放射線を照射した（５０００Ｒａｄ）ＥＬ４Ｂ５細胞（ウェルあたり５×１０４個）と共に、平底マイクロタイタープレートにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌホルボール−１２−ミリスチン酸１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）および５％ヒトＴ細胞上清を補給した、２００μｌのＩＭＤＭ中で培養する。培養開始時に様々な濃度のｍＡｂを加え、６日目に［３Ｈ］−チミジンと共に１８時間パルシングした後にチミジン取り込みを評価する。Ｔ細胞上清調製のためには、精製されたＴ細胞を１０６個／ｍｌの密度で１μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ存在下で３６時間培養する。Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７） １７：８８７。Ｔ細胞上清は、細胞の遠心分離によって得、−２０℃で保存する。ＥＬ４Ｂ５−Ｂ細胞培養物中での、ヒトＢ細胞の増殖促進におけるＴ細胞上清の有効性を試験し、最も有効な上清を実験で使用するためにプールする。ＥＬ４Ｂ５誘発ヒトＢ細胞増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の効果を評価する場合、ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）などのモノクローナル抗体を対照として加えることができる。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＥＬ４Ｂ５細胞株により刺激されたＢ細胞増殖を、例えば、少なくとも７５％以上阻害することができる（すなわち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体存在下でのＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の不在下で観察されたものの２５％にすぎない）。その一方で、ＭＯＰＣ−１４１などの対照抗体は、ＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖に対して有意な効果を持たない。
Ｂ細胞による抗体産生に対するヒトＴ細胞のヘルパーアッセイ
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生のアンタゴニストとして機能できる。抗ＣＤ４０抗体は、この種のアンタゴニスト活性について、Ｔ細胞ヘルパーアッセイにおいて、活性化されたＴ細胞との接触に依存して刺激されたＢ細胞による免疫グロブリン産生を阻害する抗体の能力を評価することにより試験することができる。このように、９６ウェル組織培養プレートを抗ＣＤ３ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ３／３（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の腹水の１：５００希釈液で被覆する。示されるように、共刺激性ｍＡｂを加える：抗ＣＤ２ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ１１．１／１およびＣＬＢ−Ｔ１１．２／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、共に腹水１：１０００および抗ＣＤ２８ｍＡｂ ＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。続いて、扁桃のＴ細胞（３０００Ｒａｄ照射；ウェルあたり１０５個）、扁桃のＢ細胞（ウェルあたり１０４個）、およびｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を加える。各細胞培養物の最終容量は２００μｌとする。８日後、細胞を遠心して沈降させ、細胞を含まない上清を回収した。（希釈された）サンプル中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を、以下に記載されるようにＥＬＩＳＡにより推定する。
一実施形態では、抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびＴ細胞を共刺激するための別のｍＡｂ使用または不使用で被覆した９６ウェルプレート中で、ヒト扁桃のＢ細胞（１０４個／ウェル）を、放射線照射し精製したＴ細胞（３０００ｒａｄ、１０５個／ウェル）と共に培養する。８日間の培養後、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生測定のために上清を回収する。Ｂ細胞による免疫グロブリン産生は、以下に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにより評価する。注目する抗ＣＤ４０抗体を、培養開始時から、様々な濃度で加える。対照として、ｍＡｂ ＭＯＰＣ−１４１を加えることができる。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＴ細胞により刺激されたＢ細胞のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体産生を、少なくとも５０％あるいはそれ以上阻害できる（すなわち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体存在下でのＴ細胞により誘導されるＢ細胞の抗体産生は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体不在下で観察されたものの５０％にすぎない）。その一方で、ＭＯＰＣ−１４１などの対照抗体は、Ｔ細胞により誘導されるＢ細胞の抗体産生に対し、有意な効果を持たない。
免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度は、ＥＬＩＳＡにより推定する。０．０５Ｍ炭酸塩バッファー（ｐＨ＝９．６）中、４μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧｍＡｂ ＭＨ１６−０１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または１．２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ４１０２（Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、４℃で１６時間インキュベートすることにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆する。プレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて３回洗浄し、ＢＳＡで１時間飽和させる。２回の洗浄後、試験サンプルの様々な希釈液とともにプレートを３７℃で１時間インキュベートする。３回の洗浄後、１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ ＭＨ１６−０１（ＣＬＢ）またはマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ ＭＨ１５−０１（ＣＬＢ）とともに３７℃で１時間インキュベートすることにより、結合しているＩｇを検出する。プレートを４回洗浄し、基質としてＯ−フェニレンジアミンを加えることにより、結合しているペルオキシダーゼ活性を示す。各アッセイに対して標準曲線を作成するためにヒト標準血清（Ｈ００，ＣＬＢ）を用いる。
実施例７：正常Ｂ細胞およびＢ慢性リンパ性白血病細胞における、ＣＤ４０リガンドにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達に対するＣＨＩＲ−１２．１２の効果の比較
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）によるＣＤ４０の活性化は、正常Ｂリンパ球の生存、増殖および分化を調節できる。Ｂ細胞では、ＣＤ４０の結合は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）との結合と、それに続く、細胞の増殖および生存に関与する多数の下流シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。この経路の活性化は、ｅｘ ｖｉｖｏで示すことができ、培養正常Ｂ細胞へのＣＤ４０Ｌの添加はそれらの生存および増殖を促進する。ＣＤ４０Ｌは、培養正常Ｂ細胞におけるその活性と同様に、患者サンプルから得られたＢ慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞の生存および増殖を促進し、この経路は薬理学的介入に反応する。
以下に記載する追加研究は、正常ヒトＢ細胞およびヒトＢ−ＣＬＬ細胞において、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路に対するＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の効果をさらに特徴決定するために行った。これらの研究では、上記に概説された所見が裏付けられた。したがって、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０との結合をブロックし、正常ヒトＢ細胞および原発性Ｂ−ＣＬＬ細胞のＣＤ４０Ｌにより誘導される増殖／生存を阻害した。ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存は、アポトーシスマーカーであるｃＰＡＲＰレベルの減少および抗アポトーシスタンパク質Ｍｃｌ−１およびＢｃｌ−ｘ１の誘導に関連していた。さらに、ＣＤ４０Ｌにより誘導される生存は、Ａｋｔ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ならびにＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびβのリン酸化に関連していた。その一方で、ＣＤ４０Ｌにより刺激された原発性Ｂ−ＣＬＬ細胞のＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ｅｘ ｖｉｖｏでこれらの抗アポトーシスタンパク質の発現および下流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化を阻害し、最終的にはＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを引き起こした。本研究で分析されたＣＬＬサンプルの大多数は、ＣＤ４０Ｌ刺激および抗体阻害に対して反応性であるように見えた。不応性であった少数のＣＬＬサンプルは、これらのサンプルにおけるその不応性の原因となる経路を同定するために調査中である。
正常ヒトＢ細胞においてＣＨＩＲ−１２．１２処理はＣＤ４０リガンドにより媒介されるＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路をブロックする
正常ヒトＢ細胞を、ＭＡＣＳ Ｂ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＩＮＣ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて陰性選択により末梢血から精製し、１０μｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２またはアイソタイプ対照ｈｇＧ１の存在下で、２μｇ／ｍｌの組換えヒト可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｒｈｓＣＤ４０Ｌ）添加あるいは非添加で２４時間培養した。細胞を溶解し、全細胞溶解物を、ヒトｃＰＡＲＰ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘ１、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ｐ３８ＭＡＰＫに特異的な抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分離した。すべてのメンブレンをストリップにし、必要に応じてβ−アクチンまたはＡＫＴまたはｐ３８ＭＡＰＫ総タンパク質のいずれかについて再び探索した。結果は図２３に示されている。
正常Ｂ細胞のＣＤ４０Ｌ刺激は、アポトーシスマーカー（ｃＰＡＲＰ）のレベルを低下させ、抗アポトーシスマーカー（Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘ１）の発現を増加させ、シグナル伝達マーカー（ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｐ３８）のリン酸化を活性化した。ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、正常Ｂ細胞に対するこれらのＣＤ４０Ｌにより媒介される効果をブロックし、これらの細胞のアポトーシスを引き起こした。
Ｂ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０リガンドにより媒介される生存およびシグナル伝達経路に対するＣＨＩＲ−１２．１２による処理の効果
Ｂ−ＣＬＬ細胞における、生存およびシグナル伝達経路に対するＣＨＩＲ−１２．１２の効果をさらに評価するために、クエン酸ナトリウムを含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製試験管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてＣＬＬ患者の末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＣＤ５、ＣＤ１９およびＣＤ４０（マウス抗ヒトＣＤ５−ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ（Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）およびＦＩＴＣ−標識マウス抗ヒトＣＤ４０抗体（ＦＩＴＣ−ＣＨＩＲ−１２．１２，Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ））について染色し、固定し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。患者およびＰＢＭＣ発現の特性は表８に要約されている。
Figure 0005208730
 Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＨＩＲ−１２．１２処理はＣＤ４０リガンドにより媒介される生存経路をブロックする
ＰＢＭＣ（２連のウェルでの５０，０００個／ウェル）を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ単独または２μｇ／ｍｌのｒｈｓＣＤ４０Ｌ＋４μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌエンハンサー存在下、１０μｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２または対照ヒトＩｇＧ１のいずれかと共に接種した。細胞のＡＴＰを測定し、相対発光量（ＲＬＵ）として表すＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存力キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、細胞の生存力を７２時間後に測定した。ブロックパーセントは、以下のように計算した：
Figure 0005208730
 培養２４時間後にフローサイトメトリーによるｃＰＡＲＰ分析を行った。細胞をＦＡＣＳＬｙｓｉｓバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて処理し、凍結した。１％ホルムアルデヒド中で４５分間固定した後、細胞を洗浄してＰＥ−コンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ１９と共に室温（ＲＴ）にて３０分間インキュベートした。次いで、７０％エタノールを用いて氷上で３０分間、細胞を透過処理し、ウサギ抗ヒトｃＰＡＲＰ抗体またはアイソタイプ対照ウサギＩｇＧをＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識マウス抗ヒトＣＤ５と共に用いて、室温にて３０分間染色した。続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と共に室温にて３０分間インキュベーションし、１％ホルムアルデヒドで固定して、フローサイトメトリーにより分析した。ブロックパーセントは、以下のように計算した：
Figure 0005208730
 培養Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＤ４０Ｌを用いる刺激は、生存を促進し／アポトーシスを防ぐことができ、これらの効果はＣＨＩＲ−１２．１２によりブロックされ得る（図２４）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイでは７／７サンプル、ｃＰＡＲＰフローサイトメトリーアッセイでは６／７サンプルにおいて、ＣＤ４０ＬはＢ−ＣＬＬ細胞の生存を促進し、いずれの場合にも、これらの効果はＣＨＩＲ−１２．１２によりブロックされた（表９）。
Figure 0005208730
 抗アポトーシスタンパク質の発現に対するＣＨＩＲ−１２．１２処理の効果
ＰＢＭＣ単離後、２×１０６個細胞／ｍｌを、図２４に示されているデータに関して上述されたように培養した。全細胞溶解物は、ＲＩＰＡ溶解バッファー（１×リン酸緩衝生理食塩水中、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で調製した。サンプルあたり１０〜２０μｇのタンパク質を、１０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で分離し、ニトロセルロースメンブレンへトランスファーし、ヒトｃＰＡＲＰ、Ｍｃｌ−１、またはＢｃｌ−ｘ１に特異的なｍＡｂを用いてメンブレンを探索した。このメンブレンをストリップにし、β−アクチンに関して再び探索し、ＥＣＬを用いて発現させた。結果は図２５に示されている。原発性Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるｃＰＡＲＰレベルの低下およびＣＤ４０Ｌにより媒介されるＭｃｌ−１およびＢｃｌ−ｘ１発現の増大をブロックした。
Ｂ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０リガンドにより媒介されるシグナル伝達経路に対するＣＨＩＲ−１２．１２処理の効果
ＡＫＴおよびｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路におけるＣＤ４０リガンドにより媒介されるシグナル伝達に対するＣＨＩＲ−１２．１２の効果を、Ｂ−ＣＬＬ細胞について評価した。リン酸化されたＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）を評価するために、ＰＢＭＣを、図２４に示されているデータに関して上述されたように培養した。ｐ３８ＭＡＰＫを検出するために、前述の条件を用い、インキュベーションの最後２０分にｒｈｓＣＤ４０Ｌを加え、細胞を３時間培養した。図２５に示されているデータに関して上述されたように、細胞を処理した。ヒトｐ−Ａｋｔおよびｐ−ｐ３８ＭＡＰＫに特異的なモノクローナル抗体を用いて、得られたメンブレンを探索し、これをＡＫＴおよびｐ３８総タンパク質に関してそれぞれ再び探索した。結果は図２６に示されている。一部のサンプルにおいては、ＣＤ４０ＬはＡＫＴのリン酸化を刺激するようには見えなかったものの、いくつかのサンプルではＣＤ４０ＬはＡＫＴ経路を活性化し、ＣＨＩＲ−１２．１２はこの効果をブロックした。未処理細胞におけるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化レベルは様々であったものの、ｒｈｓＣＤ４０Ｌを用いる処理はｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を促進し、ＣＨＩＲ−１２．１２はこの効果をブロックした。
ＩＫＫα／βおよびＥＲＫ１／２に対する、ｒｈｓＣＤ４０ＬおよびＣＨＩＲ−１２．１２の効果を評価するために、図２６のｐ３８の検出に関して上述されたようにＰＢＭＣを培養し、処理した。ヒトｐ−ＩＫＫα／βおよびｐ−ＥＲＫに特異的なモノクローナル抗体を用いて、得られたメンブレンを探索した。結果は図２７に示されている。Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ＩＫＫα／βおよびＥＲＫ１／２の、ＣＤ４０Ｌにより誘導されるリン酸化を阻害した。
要約
正常Ｂリンパ球は、培養に置かれると、自発的アポトーシスを起こすが、これはＣＤ４０Ｌを培養物に加えることにより食い止めることができる。本明細書に記載されている研究では、正常Ｂリンパ球へのＣＤ４０Ｌの添加は、結果としてＭｃｌ−１およびＢｃｌ−ｘ１などの生存タンパク質のアップレギュレーションを引き起こし、ＡＫＴおよびｐ３８経路を活性化した。慢性リンパ性白血病患者サンプルから得られたＢ−ＣＬＬ細胞は、記載されたアッセイにおいてＣＤ４０Ｌに対し同様の反応性を示した。さらに、ＣＤ４０ＬはＢ−ＣＬＬ細胞においてＩＫＫαおよびβならびにＥＲＫ１／２のリン酸化を刺激した。これらの経路はＢ細胞生存のために重要であることがわかっており、またＢ−ＣＬＬ細胞のジスレギュレートされた（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）生存の一因である可能性があるため、Ｂ−ＣＬＬ細胞においてこれらの経路を評価した。ＣＤ４０Ｌ刺激に対し反応性を有する正常Ｂ細胞およびＢ−ＣＬＬ細胞サンプル双方において、記載されたそれぞれの効果は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＨＩＲ−１２．１２によりブロックすることができた。
前述の説明および関連する図面に示される教示の利益を有する、本明細書において示された、本発明の多くの改変および他の実施形態は、これらの発明が関わる技術分野の当業者ならば思いつくであろう。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に制限されるべきではないこと、ならびに、改変および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるよう意図されることは理解されなくてはならない。本明細書において、具体的な用語が使用されているが、それらは一般的、説明的な意味のみで用いられており、制限のために用いられるものではない。
明細書中で言及されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関わる技術分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が各々、具体的にかつ個別に参照により本明細書に組み込まれると示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により媒介される生存の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるシグナル伝達経路の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 ＣＤ４０Ｌ刺激を伴わず、アポトーシスを誘発しないＣＨＩＲ−１２．１２を実証する図である。 ｐ−ＥＲＫ、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ＩＫＫα／βの減少をもたらす、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路に対するＰＩ３Ｋ（ＬＹ２９４００２）およびＭＥＫ（ＰＤ９８５９５）の阻害の効果を示す図である。 ＣＤ４０とのＣＤ４０Ｌ相互作用によって媒介される生存に対する、ＰＩ３Ｋ（ＬＹ２９４００２）およびＭＥＫ（ＰＤ９８５９５）の阻害の効果を示す図である。 フローサイトメトリーによって測定される、Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存（ＴＵＮＥＬ）の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 フローサイトメトリーによって測定される、Ｂ−ＣＬＬ患者から得たＢ−ＣＬＬ細胞における、ＣＤ４０Ｌにより媒介される生存（切断されたＰＡＲＰ）の、ＣＨＩＲ−１２．１２による阻害を示す図である。 転写レベルでＢ−ＣＬＬ細胞マーカーに対するＣＨＩＲ−１２．１２の効果を示す図である。 ４時間でのｐ３８経路ＣによるＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達に対するＣＨＩＲ−１２．１２およびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０の効果を示す図である。 ２４時間でのＭＥＫ／ｐ３８経路によるＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達に対するＣＨＩＲ−１２．１２およびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０の効果を示す図である。 複数のＢ−ＣＬＬ患者におけるｐ−ｐ３８状態を示す図である。 図１６Ａ、ＢおよびＣは、ヒト多発性骨髄腫細胞系統ＫＭＳ−１２−ＢＭ（図１６Ａ）、ＩＭ−９（図１６Ｂ）またはＡＲＨ−７７（図１６Ｃ）に対するＣＨＩＲ−１２．１２により媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す図である。 １０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１をｉ．ｐ．投与された（●）、１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂをｉ．ｐ．投与された（○）、１０ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂをｉ．ｐ．投与された（＊）または１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブをｉ．ｖ．投与された動物における、経時的な多発性骨髄腫動物モデル中の腫瘍量を示す図である。上向き矢印はボルテゾミブ投与を示し、下向き矢印はＣＨＩＲ−１２．１２投与を示す。 １ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１を投与された（■）、１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂを投与された（▲）、１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを投与された（□）または１ｍｇ／ｋｇ のＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂおよび１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブを投与された（○）動物における、経時的な多発性骨髄腫動物モデル中の腫瘍量を示す図である。 Ｋｉ６７発現について免疫組織化学染色によってアッセイされた、ヒト多発性骨髄腫異種移殖モデルＩＭ−９における腫瘍細胞増殖に対するＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂの効果およびアポトーシスバイオマーカー切断された−カスパーゼ３および切断された−ＰＡＲＰのレベルの増大によって証明される細胞死の誘導を示す図である。 １０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１（●）、０．１ｍｇ／ｋｇの（◇）、１ｍｇ／ｋｇの（○）、１０ｍｇ／ｋｇの（＊）抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２、または０．５ｍｇ／ｋｇの（−▲−）、１ｍｇ／ｋｇの（・・・▲・・・）ボルテゾミブを投与された動物における、病期分類されていない同所ＩＭ−９異種移殖モデルにおける経時的な条件付き生存率を示す図である。斜線をつけた矢印は、ボルテゾミブ投与を示し、塗りつぶされた矢印は抗体投与を示す。 １ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１をｉ．ｐ．投与された（■）、０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２をｉ．ｐ投与された（●）、１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２をｉ．ｐ投与された（−◇−）または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２をｉ．ｐ投与された（Δ）または０．５ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブをｉ．ｖ．投与された（□）動物における、病期分類された同所ＩＭ−９異種移殖モデルにおける経時的な条件付き生存率を示す図である。 １０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１をｉ．ｐ．投与された（●）、１ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂをｉ．ｐ．投与された（◇）、１０ｍｇ／ｋｇのＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０ｍＡｂをｉ．ｐ．投与された（◆）または１ｍｇ／ｋｇのボルテゾミブをｉ．ｖ．投与された（・・・●・・・）動物における経時的な、ヒト多発性骨髄腫皮下異種移殖モデル中の腫瘍量を示す図である。大きな矢印はＣＨＩＲ−１２．１２投与を示し、小さい矢印はボルテゾミブ投与を示す。 正常ヒトＢ細胞のシグナル伝達および生存はＣＤ４０Ｌによって誘導され、ＣＨＩＲ−１２．１２によってブロックされることを示す図である。 ＣＤ４０ＬはＢ−ＣＬＬ細胞をアポトーシスから救出し、ＣＨＩＲ−１２．１２はこの効果をブロックすることが、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ生存力（Ａ）およびｃＰＡＲＰフローサイトメトリー（Ｂ）アッセイによって調べられることを示す図である。 ＣＨＩＲ−１２．１２が、Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるｃＰＡＲＰの減少ならびにＢｃｌ−ｘｌおよびＭｃＩ−１発現の増大をブロックすることを示す図である。 ＣＨＩＲ−１２．１２が、Ｂ−ＣＬＬ細胞において、Ａｋｔおよびｐ３８ＭＡＰＫのＣＤ４０Ｌ誘導性リン酸化を阻害することを示す図である。 ＣＨＩＦ−１２．１２が、Ｂ−ＣＬＬ細胞における、ＩＫＫα／βおよびＥＲＫ１／２のＣＤ４０Ｌ誘導性リン酸化を阻害することを示す図である。

Claims (39)

  1. 抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療に反応性である、癌または前癌状態を有する被験体を同定するのを補助する方法であって、該前癌状態は、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）であり、該方法は、
    ａ）試験生体サンプルを、有効量の該抗ＣＤ４０治療薬と接触させるステップ、
    ｂ）該試験生体サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを検出するステップであって、該バイオマーカーが、
    （ｉ）切断されたカスパーゼタンパク質、切断されたポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面発現、ＴＮＵＥＬ染色によって検出されるゲノムＤＮＡ断片化およびいずれかのそれらの組合せからなる群から選択される、細胞アポトーシスのバイオマーカー、
    （ｉｉ）ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーであって、該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路からなる群から選択され、該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路の該バイオマーカーが、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＰＤＫ１、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−ｐ３８、ホスホ−ＩＫＫα／β、ホスホ−ＩκＢタンパク質および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、および
    （ｉｉｉ）Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）からなる群から選択される、細胞生存のバイオマーカーからなる群から選択されるステップと、
    ｃ）該試験生体サンプル中の該少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを、対照生体サンプルにおいて検出される該少なくとも１種のバイオマーカーのレベルと比較するステップであって、該対照生体サンプルが該抗ＣＤ４０治療薬と接触されていないステップとを含み、
    ここで、該試験生体サンプルおよび該対照生体サンプルは、該被験体に由来し、該試験生体サンプルおよび該対照生体サンプルが、ＣＤ４０リガンドで刺激されたＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含み、
    該対照生体サンプルと比較した、該試験生体サンプル中の
    （ｉ）少なくとも１種の該アポトーシスのバイオマーカーのレベルの増大、および／または
    （ｉｉ）少なくとも１種の該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路の少なくとも１種の該バイオマーカーのレベルの低下、および／または
    （ｉｉｉ）細胞生存の少なくとも１種の該バイオマーカーのレベルの低下
    が、該抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける被験体を示す
    方法。
  2. 前記接触ステップに先立って、前記ＣＤ４０発現腫瘍性細胞は、ＣＤ４０のリガンドを用いてｅｘ ｖｉｖｏで刺激されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＤ４０のリガンドが、可溶性ＣＤ４０Ｌおよび膜結合型ＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. ＣＤ４０発現腫瘍性細胞に関連する癌または前癌状態についての被験体の治療において、抗ＣＤ４０治療薬の有効性をモニターするのを補助する方法であって、該前癌状態は、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）であり、該方法は、
    ａ）ベースライン生体サンプル中の少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを検出するステップであって、該ベースライン生体サンプルは、該抗ＣＤ４０治療薬の用量を投与する前の該被験体に由来し、該ベースライン生体サンプルはＣＤ４０発現腫瘍性細胞を含み、該バイオマーカーが、
    （ｉ）切断されたカスパーゼタンパク質、切断されたポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面発現、ＴＮＵＥＬ染色によって検出されるゲノムＤＮＡ断片化およびいずれかのそれらの組合せからなる群から選択される、細胞アポトーシスのバイオマーカー、
    （ｉｉ）ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーであって、該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路からなる群から選択され、該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路の該バイオマーカーが、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＰＤＫ１、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−ｐ３８、ホスホ−ＩＫＫα／β、ホスホ−ＩκＢタンパク質および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される、ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、および
    （ｉｉｉ）Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）からなる群から選択される、細胞生存のバイオマーカー
    からなる群から選択されるステップと、
    ｂ）少なくとも１種の次の生体サンプル中の該少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを検出するステップであって、該少なくとも１種の次の生体サンプルは、該抗ＣＤ４０治療薬が投与された後の該被験体に由来するものである、ステップと、
    ｃ）該少なくとも１種の次の生体サンプル中の該少なくとも１種のバイオマーカーのレベルを、該ベースライン生体サンプル中の該少なくとも１種のバイオマーカーのレベルと比較するステップおよび該少なくとも１種のバイオマーカーの該レベルの変化を治療の有効性と関連づけるステップと
    を含み、該ベースライン生体サンプルと比較した、該次の生体サンプル中の
    （ｉ）少なくとも１種の該アポトーシスのバイオマーカーのレベルの増大、および／または
    （ｉｉ）少なくとも１種の該ＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路の少なくとも１種の該バイオマーカーのレベルの低下、および／または
    （ｉｉｉ）細胞生存の少なくとも１種の該バイオマーカーのレベルの低下
    は、該抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す
    方法。
  5. 前記被験体は前記抗ＣＤ４０治療薬の単回用量を投与された被験体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記被験体は前記抗ＣＤ４０治療薬の複数回用量を投与された被験体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  7. 前記抗ＣＤ４０治療薬が、ヒトＢ細胞の表面に発現されたヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合できるアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体が、該Ｂ細胞の表面に発現されたＣＤ４０抗原と結合した場合に顕著なアゴニスト活性がない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記抗ＣＤ４０治療薬が、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）相互作用またはＣＤ４０Ｌにより媒介されるＣＤ４０シグナル伝達を阻害するＣＤ４０Ｌアンタゴニストである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＣＤ４０Ｌアンタゴニストが、ＣＤ４０Ｌと特異的に結合する抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体、ＣＤ４０の可溶性型、ＣＤ４０を含む融合タンパク質の可溶性型、および薬剤物質からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記切断されたカスパーゼタンパク質が、切断されたカスパーゼ−３、切断されたカスパーゼ−７および切断されたカスパーゼ−９からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 細胞表面ＰＳがアネキシンＶ染色によって検出される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＭＡＰＫシグナル伝達経路がＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路およびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーがＢｃｌ−ｘｌおよびＭｃｌ−１からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質が、スルビビン、ＸＩＡＰおよびｃＩＡＰ１からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記試験生体サンプルおよび前記対照生体サンプルにおいて、ＣＤ４０シグナル伝達の少なくとも１種のサイトカインマーカーのレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法、または前記次の生体サンプルおよび前記ベースライン生体サンプルにおいて、ＣＤ４０シグナル伝達の少なくとも１種のサイトカインマーカーのレベルを検出するステップをさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記サイトカインマーカーが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記対照生体サンプルと比較した、前記試験生体サンプル中の少なくとも１種の前記サイトカインマーカーのレベルの低下が、前記抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療から恩恵を受ける被験体を示すか、または前記ベースライン生体サンプルと比較した、前記次の生体サンプル中の少なくとも１種の前記サイトカインマーカーのレベルの低下が、該抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記抗ＣＤ４０治療薬が、ＣＤ４０発現細胞の表面に発現されたヒトＣＤ４０抗原と特異的に結合し、それによって抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を調節する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、前記バイオマーカーがアポトーシスのバイオマーカーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記被験体の生体サンプルにおいて、該生体サンプル内のＣＤ４０発現腫瘍性細胞上の、細胞表面ＣＤ４０の発現レベル、細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベルまたは両方を検出するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  20. 被験体から採取した生体サンプルにおいて、循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌのレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記バイオマーカーのレベルを検出するステップが、バイオマーカータンパク質発現を検出するために抗体を用いることを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記バイオマーカーのレベルを検出するステップが、核酸ハイブリダイゼーションを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記バイオマーカーのレベルを検出するステップが、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記次の生体サンプルおよび前記ベースライン生体サンプルにおいて、該次の生体サンプルおよびベースライン生体サンプル内のＣＤ４０発現腫瘍性細胞上の、細胞表面ＣＤ４０、細胞表面ＣＤ４０Ｌならびに細胞表面ＣＤ４０および細胞表面ＣＤ４０Ｌの双方からなる群から選択される少なくとも１種のＣＤ４０関連因子の発現レベルを検出するステップをさらに含み、該ベースライン生体サンプルと比較した、該次の生体サンプル内の少なくとも１種の該ＣＤ４０関連因子の発現レベルの低下が、前記抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記患者から採取された血液または血液成分のベースラインサンプルおよび血液または血液成分の次のサンプルにおいて、循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌのレベルを検出するステップをさらに含み、該ベースラインサンプルと比較した、該次のサンプル内の、少なくとも１種の該循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌの発現レベルの低下が、前記抗ＣＤ４０治療薬を用いる治療の有効性を示す、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記抗ＣＤ４０治療薬が、
    ａ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープと結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片、
    ｂ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープと結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片、および、
    ｃ）競合結合アッセイにおいて、特許受託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９または特許受託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片、
    からなる群から選択されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗ＣＤ４０治療剤が、
    （ａ）配列番号２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む重鎖可変ドメインとを含むモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片、または
    （ｂ）配列番号６の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む重鎖可変ドメインとを含むモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片
    である、方法。
  28. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、
    ａ）配列番号２；
    ｂ）配列番号４
    ｃ）配列番号５
    ｄ）配列番号２および配列番号４
    ｅ）配列番号２および配列番号５；
    ｆ）配列番号６；
    ｇ）配列番号７；
    ｈ）配列番号８；
    ｉ）配列番号６および配列番号７；ならびに
    ｊ）配列番号６および配列番号８
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、
    ａ）配列番号２の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｂ）配列番号４の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｃ）配列番号５の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｄ）配列番号２の可変および定常領域配列、ならびに配列番号４の可変および定常領域配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｅ）配列番号２の可変および定常領域配列、ならびに配列番号５の可変および定常領域配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｆ）配列番号６の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｇ）配列番号７の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｈ）配列番号８の可変および定常領域配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；
    ｉ）配列番号６の可変および定常領域配列、ならびに配列番号７の可変および定常領域配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片；ならびに
    ｊ）配列番号６の可変および定常領域配列、ならびに配列番号８の可変および定常領域配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片
    から選択される、請求項２６または２７に記載の方法。
  30. 前記抗ＣＤ４０治療剤が、特許受託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９、またはその抗原結合性断片、あるいは、特許受託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２、またはその抗原結合性断片である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記断片がＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および一本鎖Ｆｖ断片からなる群から選択される、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記癌が腫瘍性Ｂ細胞増殖によって特徴付けられる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記癌が、非ホジキンスリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、中悪性度Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、形質細胞腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性小開裂型リンパ腫、濾胞性大細胞型リンパ腫、濾胞性小開裂混合型リンパ腫、びまん性小開裂細胞型リンパ腫、びまん性小リンパ球性リンパ腫、前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内リンパ腫症、びまん性細胞混合型リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記被験体が慢性リンパ性白血病を有する、請求項３３に記載の方法。
  35. ＺＡＰ−７０発現レベル、ＣＤ３８発現レベル、β２ミクログロブリン発現レベル、ｐ５３突然変異状態、ＡＴＭ突然変異状態、染色体１７ｐ欠失および染色体１１ｑ欠失からなる群から選択される少なくとも１種の臨床的に有用な予後マーカーについて、前記被験体由来の生体サンプルを分析するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記癌が、非Ｂ細胞血液悪性腫瘍である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記悪性腫瘍が、急性白血病、骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄性白血病および真性赤血球増加症からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記癌が、ＣＤ４０抗原を発現する腫瘍性細胞を含む充実腫瘍である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記充実腫瘍が、肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、結腸癌、膀胱癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、上咽頭癌、扁平上皮癌、甲状腺乳頭癌、子宮頸癌および肉腫からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
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