JP5204667B2 - 細胞培地に負圧をかけるシステム及び方法 - Google Patents

Description

この記述は、一般に、細胞培地に負圧を提供するために使用する方法及び装置に関する。さらに具体的には、この記述は、調整された培地流動を具えるほぼ気密性の封入容器中の細胞培地に負圧を提供するために使用する方法及び装置に関する。

創傷の治療において、局所的な負圧（ＴＮＰ）の利用は、肉芽組織形成を増進させ、間質液を除去し、閉鎖創傷を引き込み、創傷面にわずかな変形を誘発することから、有益であることが分かっている。一般的なＴＮＰの利用では、圧力差や流体の流量など特定のパラメータを変えることができる。しかしながら、インビボ(in vivo)で使用する際には、環境が十分に調整されないために、特定のパラメータを変化させることと創傷治療の応答が常に相関するわけではない。それゆえ、調整されたインビトロ（in vitro）環境において、ＴＮＰを使用することで細胞培養に負圧を提供し、異なるパラメータの効果を測定する方法及び装置を提供することが望ましい。

また、調整された培地流量を提供し、空気が細胞培地内へ引き込まれる可能性を減らすことができるＴＮＰの使用方法及び装置を提供することが望ましい。このような空気の誘導は、基質を乾燥させてしまい有意なデータを取得することを妨げる。

ある実施例では、細胞培養システムは、細胞を培養するように構成されたほぼ気密性の封入容器と；前記ほぼ気密性の封入容器と連通する第１の導管であって、負圧を前記ほぼ気密性の封入容器に提供するように構成された第１の導管と；前記ほぼ気密性の封入容器と連通する第２の導管であって、培地を前記ほぼ気密性の封入容器に提供するように構成された第２の導管と；を具える。他の実施例では、使用中、細胞基質が前記ほぼ気密性の封入容器内に配置されており、前記負圧が前記細胞基質の第１の面にかけられ、前記培地が前記細胞基質の第２の面に供給される。他の実施例は、前記ほぼ気密性の封入容器内に設けられている浸透面および／またはドレッシングを具える。さらに他の実施例は、前記ほぼ気密性の封入容器内に配置された、浸透面と、細胞基質と、ドレッシング（又は他のマニホルド材料）とを具え、前記培地は、前記第２の導管から前記浸透面を通り、前記細胞基質を通り、前記ドレッシングを通って、前記第１の導管内へ流れる。ある実施例では、前記浸透面は前記細胞基質を支持し、前記細胞基質は前記浸透面と前記ドレッシングの間に配置されている。

他の実施例は、第１の密閉が周縁密閉部材とプレートウェルの間に形成されるとともに第２の密閉が前記周縁密閉部材と細胞培養用挿入具の間に形成されるように、プレートウェルと接合するように構成されるとともに細胞培養用挿入具と接合するように構成された周縁密閉部材を具える密閉システムを具える。また、挿入密閉アセンブリは、第３の密閉が挿入密閉アセンブリと前記細胞培養用挿入具の間に形成されるように、前記細胞培養用挿入具と接合するように構成される。ある実施例では、前記周縁密閉部材が、前記プレートウェルの内壁及び前記細胞培養用挿入具の外壁に接合するように構成され、前記挿入密閉アセンブリが前記挿入具の内壁に接合するように構成される。ある実施例では、第１の導管は前記周縁密閉部材を通って延在し、培地供給システムは前記第１の導管に連結されている。他の実施例では、第２の導管は前記周縁密閉部材を通って延在し、第３の導管は前記挿入密閉アセンブリを通って延在する。ある実施例では、負圧源が前記第３の導管に連結され、第４の導管が前記挿入密閉アセンブリを通って延在する。ある実施例では、第１及び第２の密閉が嵌合によって作り出され、前記周縁密閉部材が射出成形によって形成される。ある実施例では、前記挿入密閉アセンブリは、挿入密閉部材と、挿入密閉リングと、水平密閉部材と、挿入マニホルドとを具える。ある実施例では、前記挿入密閉部材および／または挿入マニホルドは、前記挿入具内へ押入されている。他の実施例では、前記挿入マニホルドが前記挿入密閉部材内へ螺入されている。ある実施例では、前記挿入密閉リングが、前記挿入密閉部材と前記挿入マニホルドの間で圧迫され、前記挿入密閉部材が射出成形によって形成される。ある実施例では、前記周縁密閉部材が前記プレートウェル内へ押入されている。

他の実施例は、ほぼ気密性の封入容器を提供するステップと；前記ほぼ気密性の封入容器内に細胞基質を提供するステップと；前記ほぼ気密性の封入容器に負圧を提供するステップと；前記ほぼ気密性の封入容器に培地を提供するステップと；を具える細胞を培養する方法を具える。ある実施例では、前記ほぼ気密性の封入容器が第１の面と、第２の面とを具え、前記負圧が前記第１の面にかけられ、前記培地が前記第２の面に供給される。ある実施例では、前記負圧が負圧源に連結された第１の導管を介して提供され、前記第１の導管は、前記ほぼ気密性の封入容器と連通している。ある実施例では、前記負圧源が真空ポンプである。前記培地が培地供給システムに連結された第２の導管を介して提供され、前記第２の導管は、前記ほぼ気密性の封入容器と連通している。

他の実施例は、プレートウェルと；細胞培養用挿入具と；周縁密閉部材が、プレートウェルと第１の密閉を形成し、細胞培養用挿入具と第２の密閉を形成するように、プレートウェルと接合するように構成され、前記細胞培養用挿入具と接合するように構成された周縁密閉部材と；挿入密閉アセンブリが、前記細胞培養用挿入具と第３の密閉を形成するように、前記細胞培養用挿入具と接合するように構成された挿入密閉アセンブリと；を具える細胞を培養するためのシステムを具える。ある実施例は、前記周縁密閉部材を通って延在する第１の導管と、前記第１の導管に連結された負圧源とを具える。ある実施例では、第２の導管は前記挿入密閉アセンブリを通って延在し、培地供給システムは前記第２の導管に連結されている。また、ある実施例は、前記細胞培養用挿入具内の細胞基質と、前記細胞基質と前記挿入密閉アセンブリの間のドレッシングとを具える。

はじめに、図１乃至４を参照すると、細胞培養システム１００は、プレートウェル１０と、細胞培養を増殖するための細胞培養容器２０と、プレートウェル１０と細胞培養容器２０の間の周縁密閉部材３０とを具える。この実施例では、プレートウェル１０は、底部１２と開いた端部１３の間の周囲の内壁１１を具える。図示した実施例では、細胞培養容器２０は、外壁１９及び一端部で浸透膜２２によって境界される内部容積２８を具えるテーパ付本体部２１と、浸透膜２２の反対側の開いた端部２３と、内周部２９とを具える。この実施例では、開いた端部２３は一対のノッチ２５を具えるフランジ２４を具え、一対のタブ２６は、ノッチ２５と軸方向に並んでおり、テーパ付本体部２１から延在している。また、開示した実施例は、使用の際に、浸透膜２２とドレッシング４５の間に細胞基質４０を具える。ある実施例では、細胞基質４０は、多層膜の細胞を封入している。さらに、開口５３及び５４を具える蓋５５は、使用中、プレートウェル１０中の細胞培養容器２０を固定するために使用する。ある実施例では、細胞培養容器２０をＢＤＦａｌｃｏｎ（登録商標）６ウェルインサートにし、プレートウェル１０をＢＤＦａｌｃｏｎ（登録商標）６個のウェル培養プレートにし、ドレッシング４５を連続気泡発泡体又はガーゼにしてもよい。

図３の実施例では、周縁密閉部材３０は、ほぼ円筒形の本体部３１と、内側面３２と、外側面３３と、ノッチ付端部３４と、チャネル付端部３５とを具える。この実施例では、ノッチ付端部３４は、細胞培養容器２０のタブ２６と並ぶように構成された一対のノッチ３６を具える。開示した実施例では、チャネル３７は、チャネル付端部３５を横切って外側面３３から内側面３２へ延在している。図示するように、外側面３３はリリーフ３９を具え、内側面はリリーフ３８を具える。この実施例では、リリーフ３８は、フレキシブル密閉部材５８を受けるように構成され、リリーフ３９は、フレキシブル密閉部材５９を受けるように構成される。ある実施例では、フレキシブル密閉部材５８及び５９は、Ｏリングである。その他の実施例では、フレキシブル密閉部材はガスケット、Ｖリング、他の好適な器具にしてもよい。また、この実施例では、周縁密閉部材３０は、本体部３１を通ってノッチ付端部３４からリリーフ３９に延在する空洞５６と、リリーフ３９からチャネル３７へ延在する空洞５７とを具える。

使用中、図１乃至４の実施例は、内周部２９にわたって延在する水平密閉部材又はドレープ５０（強化部材５１を具える）を具える。この実施例では、吸込導管６０は、動作中、穴５３、強化部材５１、ドレープ５０を通ってドレッシング４５内へ延在している。従って、吸込導管６０はドレープ５０の各側部の構成部品と連通している。

さらにこの実施例では、使用中、培地導管７０が培地を細胞基質４０に提供する。図示した実施例では、培地導管７０は、穴５４、ノッチ２５、空洞５６、リリーフ３９、フレキシブル密閉部材５９を通って、空洞５７内へ延在している。従って、細胞培地導管７０は、周縁密閉部材３０の各側部の構成部品と連通している。図４に概略を示すように、吸込導管６０は負圧源６５に連結され、培地導管７０はポンプ６７を具える培地供給システム６６に連結される。ある実施例では、ポンプ６７は蠕動ポンプで構成され、負圧源６５は真空ポンプで構成される。図４に示した実施例では、吸込導管６０を通って引き込まれる材料（空気や流体など）は、貯蔵容器６８に蓄えられる。

使用中、細胞培養システム１００は、細胞基質４０に局所的な負圧（ＴＮＰ）を提供し、細胞基質４０に培地７１を提供する。ある実施例では、周縁密閉部材３０（フレキシブル密閉部材５８及び５９を具える）がプレートウェル１０に配設され、フレキシブル密閉部材５９はプレートウェル１０と接合する。この実施例では、細胞培養容器２０（細胞基質４０を具える）は、周縁密閉部材３０中に配設され、フレキシブル密閉部材５８は細胞培養容器２０に接合し、タブ２６はノッチ３６と合致する。ある実施例では、ドレッシング４５は細胞基質４０上に配設され、ドレープ５０は細胞培養容器２０の開いた端部２３にわたって配設される。図６に示し、以下に十分に記述するように、蓋５５は、吸込導管６０及び強化部材５１と一緒に組み立てられ、蓋アセンブリ７５を形成する。蓋アセンブリ７５は、ドレープ５０、プレートウェル１０、及び細胞培養容器２０の開いた端部２３を覆うように配設される。ある実施例では、蓋アセンブリ７５が所定の位置へ下げられると、吸込導管６０はドレープ５０を突き抜け、強化部材５１はドレープ５０上で下に押される。ある実施例では、ドレープ５０は、隣接するドレッシング４５の側部上で接着されたおよそ０．００２乃至０．００４インチ厚のポリウレタンシートである。組み立てられると、吸込導管６０はドレッシング４５内へ延在する。培地導管７０は、穴５４、ノッチ２５、空洞５６、リリーフ３８、フレキシブル密閉部材５８を通って、空洞５７又はチャネル３７（空洞５６と連通している）内へ挿入される。

図１に示すように、細胞培養システム１００は、局所的な負圧（ＴＮＰ）及び培地７１を細胞基質４０に提供する。図示した実施例では、使用中、培地供給システム６６が培地導管７０に培地７１を供給する。培地７１は、導管７０を出て、チャネル３７を通って細胞培養容器２０の方へ移動する。この実施例では、培地７１は、浸透膜２２と底部１２の間の隙間７２を通って移動する。図示するように、培地７１は、使用中、浸透膜２２を通って細胞基質４０へ通過し、これによって細胞を培養するための栄養物を細胞基質４０に提供する。

さらに、また、細胞培養システム１００は、局所的な負圧（ＴＮＰ）を細胞基質４０に提供する。動作中、負圧源６５は、吸込導管６０を介してドレッシング４５内へ負圧又は吸込圧を作り出すことができる。ドレッシング４５は多孔性材料（連続気泡発泡体又は綿ガーゼなど）であるため、細胞基質４０もまた吸込圧に曝される。従って、細胞基質４０は圧力差に曝され、くぼみ部分及び隆起部分を有する凹凸面を具えるドレッシング４５の下面に細胞基質４０の上部を合わせる。このように非平坦面との接触によって細胞基質４０を変形するプロセス（微小変形(microdeformation)として知られる）は、機械的な変形を誘導することによって細胞基質中の細胞活性を刺激することができる（メカノトランスダクション(mechanotransduction)として知られる）。さらに、細胞基質４０にわたる圧力差は、細胞基質４０内への培地７１の移動を促進させ、また、細胞基質４０中の細胞の成長を促す。さらに、ドレープ５０にわたる圧力差によって、ドレープ５０は細胞培養容器２０及びドレッシング４５に変形する。

図１に示すように、細胞培養システム１００は、細胞基質４０へＴＮＰを有効に使用する特性を組み込んでいる。例えば、フレキシブル密閉部材５８及び５９は、細胞培養容器２０とプレートウェル１０間から吸込導管６０内へ吸い込まれる空気量を抑制する。さらに、ドレープ５０は、細胞培養容器２０の内壁に沿ってドレッシング４５にわたって密閉を形成して、吸込導管６０内への空気流動を抑制する。その上、培地７１の流量は、浸透膜２２、細胞基質４０、ドレッシング４５にわたって作り出される圧力差を調整することによって制御される。導管６０を通る空気の流量や細胞基質４０を横切る圧力降下などのパラメータを制御することによって、細胞が細胞基質４０から吸込導管６０に入って細胞培養容器２０から除去されてしまう可能性を減らす。従って、細胞培養システム１００は、細胞基質４０にＴＮＰを使用する有効な方法を提供しつつ、細胞を損失するリスクを最小限にする。

図１乃至４に開示された実施例では、吸込導管６０は、図５に示されるように湾曲したノンコアリング端部６１を具える２５ＧＡ皮下注射針を具える。ノンコアリング先端部６１によって、これがフレキシブル密閉部材５８又は強化部材５１などの表面を貫通するときに先端部が材料によって詰まる可能性を減らすことができる。ある実施例では、培地導管７０もまた、湾曲したノンコアリング端部を具える２５ＧＡ皮下注射針を具える。開示した実施例では、強化部材５１は、接着用の平坦面を具えるゴム製半球具から構成される。ある実施例では、強化部材５１は、３ＭによってＢｕｍｐｏｎ（登録商標）として販売されている製品である。また、開示した実施例は、およそ７０デュロメータのフレキシブル密閉部材５８及び５９を具える。上記に提供された仕様は単に例示として説明のためのものであるため、他の実施例では異なる仕様を有する個々の特性を具えてもよい。

ある実施例では、細胞培養システム１００は、大きなアセンブリの一部である。図６に示すように、細胞培養アセンブリ１５０は、６個の個別のプレートウェル１０を具える６ウェルプレート１６０を具える。それぞれの細胞培養システム１００は、プレートウェル１０の周部近くに培地導管７０と、プレートウェル１０の中央近くに吸込導管６０とを具える。説明を簡単にするために、１つの細胞培養システム１００のみを図６に示す。図示した実施例では、各培地導管７０は、フレキシブル管８６を介して隔壁８５に連結されている。隔壁８５は、複数の培地供給システム６６（図４に図示）に連結されている。この実施例では、流量や培地の種類などの制御パラメータは、それぞれの細胞培養システムで個別に制御される。

さらに、吸込導管６０はそれぞれ、フレキシブル管８７を介して共通の連結部８８に一緒に連結されている。共通の連結部８８は、真空ポンプ６５（図４に示す）などの負圧源に連結されている。他の実施例では、吸込導管６０はそれぞれ、分離した負圧源に個別に連結され、圧力はそれぞれの細胞培養システム１００用に個別に制御される。図６に示す実施例からも明らかなように、締め具８９を使用して蓋アセンブリ７５を６ウェルプレート１６０に固定している。ある実施例では、細胞培養アセンブリ１５０の構成部品（蓋アセンブリ７５やウェルプレート１６０など）は、これらを光が通過することができる材料で作られる。このような実施例では、細胞培養プロセスの間中、細胞基質４０を評価（例えば、刺激に対する蛍光応答を含む）するために観察することができる。

ある実施例では、細胞基質４０は、培地７１がここを通って流れることができるほどに十分な多孔性であり、細胞拡散なくＴＮＰに耐えることができるほどに十分な強度を有する。このような基質の一例として、血漿から細胞を分離するために遠沈させたクエン酸ナトリウム中のブタの全血から成る。この実施例では、血漿にフィブリノゲン測定が行われ、９．８ｍｇ／ｍＬで２ｍＬがそれぞれの細胞培養容器２０に入れられる。細胞培養容器２０あたりおよそ２０，０００細胞の細胞が血漿中へ接種され、トロンビン０．５ｍＬ（培地７１で１ｍＬあたり１０８３ユニット）を血漿／細胞混合物へ液滴で加える。細胞基質１４０が調整された後、培地７１は細胞培養容器２０の底部の細胞基質１４０上に供給される。この実施例では、さらなる実験を行う前に約２週間細胞を増殖させることができる。ある実施例では、実験前に直接に寒天１ｍL（４０ｇ／Ｌ濃度のトリプシン・ソイ・アガー（Tryptic Soy agar）など）を基質上部に加えてもよい。薄い寒天層を使用することで、ＴＮＰ中に細胞基質１４０は安定しつつ、流体が十分に流れるようになお多孔性であることができる。

細胞培養システム２００の別の実施例を図７乃至２２に示す。図７の分解図では、細胞培養システム２００は、６ウェルプレート１６０中にプレートウェル１０を具える。図示した実施例では、周縁密閉部材２３０、細胞培養容器２０、ドレッシング２４５、挿入密閉部材２５４、挿入密閉リング２５２、水平密閉部材又はドレープ２５０、及び挿入マニホルド２６０がプレートウェル１０内へ挿入されている。ここで、図８の組立品の断面図を参照すると、この実施例では、周縁密閉部材２３０は、半径方向に配向されてプレートウェル１０内へ押入されており、細胞培養容器２０は、半径方向に配向されて周縁密閉部材２３０内へ押入されている。使用中、細胞基質２４０は浸透膜２２の上部に配置される。ドレッシング２４５は、細胞基質２４０の上部に配設され、挿入密閉部材２５４は半径方向に配向されて細胞培養容器２０内へ押入されている。図示した実施例では、ドレープ２５０は、挿入密閉部材２５４のリップ２５３上に位置する挿入密閉リング２５２上に配設される。挿入マニホルド２６０は挿入密閉部材２５４内へ螺入されている。

ここで、図９の詳細な断面図を参照すると、周縁密閉部材２３０の本体部２３１は、プレートウェル１０の内壁１１と接合して、プレートウェル１０と周縁密閉部材２３０の間に（嵌合を介して）ほぼ気密性の密閉を作り出す。この実施例では、周縁密閉部材２３０はプレートウェル１０と直接接触しているが、他の実施例では、周縁密閉部材２３０とプレートウェル１０の間に追加の構成部品を具える。この実施例では、多重の密閉が嵌合を介して形成される；他の実施例では、ほぼ気密性の密閉は、Ｏリング、ガスケット、シーラントなど他の機構によって形成される。さらなるほぼ気密性の密閉が、領域２３２中の周縁密閉部材２３０が細胞培養容器２０に接合する場所や、領域２３３で細胞培養容器２０が挿入密閉部材２５４に接触する場所に形成される。図示した実施例では、ドレープ２５０は、挿入密閉部材２５４のリップ２５３上に位置する挿入密閉リング２５２上に配置される。この実施例では、挿入密閉リング２５２は１又はそれ以上の孔２５５を具え、ドレープ２５０は、孔２５５に一致する穴（図示せず）を形成するように穴をあけられ、孔２５５のすぐ上の空間は孔２５５の下の空間と連通する。挿入マニホルド２６０は挿入密閉部材２５４内へ螺入されており、これによって、ドレープ２５０は挿入密閉リング２５２に対して、挿入密閉リング２５２はリップ２５３に対して固定される。

図８及び９に示すように、導管２７０は、周縁密閉部材２３０を通って延在しており、培地２７１が浸透膜２２を通って細胞基質２４０に達するための通路を提供する（前述の実施例に記載した手段と同じ）。また、この実施例に示すように、挿入マニホルド２６０は、挿入密閉リング２５２の孔２５５およびドレープ２５０に設けられたいくつかの孔と連通している導管２６２を具える。従って、負圧源（図４の真空ポンプ６５など）は、導管２６２に連結されてドレッシング２４５に負圧又は吸込圧を提供し、前述の実施例と同じ方法で細胞基質２４０に微小変形及びメカノトランスダクションを生じさせる。

組み立てられた細胞培養システム２００の上面図を図１０に示す。図示するように、この実施例では、タブ２３２及び２３４を具える周縁密閉部材２３０、フランジ２４を具える細胞培養容器２０、及びタブ２５６を具える挿入密閉部材２５４がプレートウェル１０から延在している。この実施例では、タブ２３２、２３４及び２５６は、構成部品の整列に関する印とポートが開いているかどうかを示す印を具える（以下に詳細を示す）。

ここで図１１乃至１３を参照して、周縁密閉部材２３０のさらに詳細な特性を明らかにする。この実施例では、周縁密閉部材２３０は、一対のノッチ２３６と、タブ２３２及び２３４と、導管２７０と、密閉された導管２７３とを具えるほぼ円筒形の本体部２３１を具える。ノッチ２３６は、細胞培養容器２０から延在するタブ２６と並ぶように構成される（図２に示す）。密閉された導管２７３は、密閉された導管２７３を開くことを所望する場合に穴をあけられる隔膜２７２を具え、これは、培地２７１又は圧力検出ポート用の二次的な通路として使用される。タブ２３２の突起部２３５は、タブ２３２から延在する導管２７０が密閉されているのではなく開いていることを示し、印２２９は組立ての際の配置用の案内を提供する。タブ２３２及び２３４の反対側の本体部２３１の端部に、チャネル２３７を具える環２３８に延在するテーパ部分２３９がある。前述した実施例のチャネル３７と同じく、チャネル２３７は、培地２７１が導管２７０から浸透膜２２及び細胞基質２４０へ流れる通路を提供し、これによって、細胞基質２４０に栄養物を提供する。

ここで図１４乃至１６を参照して、挿入密閉部材２５４のさらに詳細な特性を明らかにする。この実施例では、挿入密閉部材２５４は、ほぼ円筒形の本体部２５１を具え、内部に螺入部分２５９を具える。この実施例では、タブ２５６は本体部２５１の一端部から外側に延在している一方、リップ２５３は本体部２５１の反対側の端部から内側に延在している。また、タブ２５６は、配置用の印２５８と、細胞培養容器２０の鋭いエッジ３００（図２）の上に空間を提供する一対のリリーフ２５７とを具える。

ここで図１７乃至１８を参照して、挿入密閉リング２５２のさらに詳細な特性を明らかにする。この実施例では、挿入密閉リング２５２は複数の孔２５５を具える。さらに、この実施例の挿入密閉リング２５２はリッジ２４２を具えており、図１８に示すように、断面がわずかに「Ｖ」字形となる。

ここで図１９乃至２１を参照して、挿入マニホルド２６０のさらに詳細な特性を明らかにする。この実施例では、挿入マニホルド２６０は、外側に螺入部分２６９を具えるほぼ円筒形の本体部２６１を具える。また、この実施例は、密閉された導管２６４を具え、これは、密閉された導管２６４を開くことが所望される場合に穴をあけられる隔膜２６８を具える。密閉された導管２６４は、開いた場合、追加の負圧導管か圧力検出ポートとして使用されてもよい。この実施例では、挿入マニホルド２６０は、導管２６２が密閉されているのではなく開いていることを示す突起部２６３を具える。図２０及び２１から、チャネル２６７（開くと導管２６２及び密閉された導管２６４に連通する）と丸いエッジ２６５及び２６６が明らかである。図９に示すように、丸いエッジ２６５及び２６６は、チャネル２６７が挿入密閉リング２５２の孔２５５と連通するように挿入密閉リング２５２と接合する。

ここで図２２を参照すると、挿入マニホルド２６０、ドレープ２５０、挿入密閉リング２５２、及び挿入密閉部材２５４が、内挿入アセンブリ２７５の一実施例として分解図で示されている。他の実施例では、内挿入アセンブリ２７５の特定の個々の構成部品が連結されていてもよいと理解される。例えば、挿入密閉リング２５２が、挿入密閉部材２５４又は挿入マニホルド２６０と一体型でもよい。使用中、内挿入アセンブリ２７５は、細胞培養容器２０の内周部２９にわたって密閉を提供するように構成される。図２２に示すように、この実施例を組み立ての際には、ドレープ２５０は挿入密閉リング２５２上に配設され、余分な材料は、挿入密閉リング２５２の周部周りでドレープ２５０から切り取られる。挿入密閉リング２５２の孔２５５に一致するようにドレープ２５０に穴が形成される。図示した実施例では、図９に示すように、挿入マニホルド２６０は挿入密閉部材２５４内へ螺入され、丸いエッジ２７５及び２６６がドレープ２５０と接合し、これを挿入密閉リング２５２に対して圧迫し、挿入密閉部材２５４のリップ２５３にほぼ気密性の密閉を形成する。さらに、挿入密閉部材２５４の本体部２５１は、細胞培養容器２０の内周部２９と接合し、これによって、内周部２９にわたってほぼ気密性の密閉を作り出す。図９の実施例に示すように、内挿入アセンブリ２７５は、細胞培養容器２０の内周部２９と外壁１９にほぼ気密性の密閉を提供する密閉システムを形成するように周縁密閉部材２３０と連結する。図示した実施例では、周縁密閉部材２３０のテーパ部分２３９は、嵌合で外壁１９に接合し、本体部２５１（リップ２５３との接合部近く）は、細胞培養容器２０の内周部２９に接合する。従って、細胞培養容器２０は外と内の両方で有効に密閉され、細胞培養容器２０内に収容された細胞基質に効果的なＴＮＰを加えることができる。さらに、図６に示した細胞培養システム１００と同じ方法で、細胞培養システム２００は追加の細胞培養システムと併用してもよい。

他の実施例では、細胞培養容器は、細胞を培養するための好適な任意の器具にしても、細胞培養用挿入具以外の器具にしてもよい。ここで、図２３及び２４を参照すると、細胞培養システム４００の別の実施例が、周壁４１９及び床４２０を具える細胞培養容器４１０を具えて示されている。この実施例では、細胞培養容器４１０は、透過性支持体４２２とドレッシング４４５の間に細胞培養基質４４０を具える。図示した実施例では、蓋４５０はドレッシング４４５を覆っており、吸込導管４６０（負圧源に連結されており、図示せず）はドレッシング４４５及び細胞培養基質４４０に負圧を提供する。この実施例では、培地導管４７０は細胞培養容器４１０に連結されており、透過性支持体４２２を通って細胞培養基質４４０に流れる培地４７１を提供する。

使用中、この実施例は前述した実施例と同じ方法で動作し、吸込導管４６０は細胞基質４４０の第１の面４４１（ここでは上面として図示）に負圧をくわえる。さらに、培地導管４７０は、細胞基質４４０の第２の面４４２（ここでは下面として図示）へ培地４７０を提供する。図示するように、周壁４１９、床４２０、及び蓋４５０によって、細胞培養基質４４０を効果的に密閉する（吸込導管４６０及び培地導管４７０を除く）ほぼ気密性の封入容器４２１が提供される。この実施例では、吸込導管４６０は、蓋４５０を通って延在しており、（負圧源に連結されているとき）これを使用して、細胞培養基質４４０にかける負圧の量を制御できる。同様に、培地導管４７０は周壁４１９を通って延在しており、これを使用して細胞培養基質４４０に提供される培地４７１の量を制御できる。

図示した実施例では、細胞の培地導管４７０は細胞培養容器４１０の周壁４１９を通って延在しているので、細胞培養容器４１０にはこれと大きいアセンブリ（ウェルプレートなど）の間に別の周縁密閉部材を必要としない。細胞培養システム４００は、単一の細胞培養容器４１０か複数の細胞培養容器４１０で機能してもよい。図示した実施例では、透過性支持体４２２は様々な異なる構成のうちの任意の一つを具える。例えば、透過性支持体４２２には、メッシュ状の材料、穴の開いた隔壁、又は膜が含まれる。この実施例では、蓋４５０は前述した実施例と同じように柔軟なドレープにしてもよいし、蓋４５０は周壁４１９に密閉するように接合するより硬い部材にしてもよい。記述した実施例は、例示のみを目的として提供しており、開示した実施例には本発明の範囲内で修正や改良を加えることができる。

この開示を通して、２つの構成部品の「間の密閉(seal between)」という言葉は、２つの構成部品が互いに接触することを必要としない。追加の構成部品は、密閉を形成している２又はそれ以上の構成部品の間に配設されてもよい。この開示において、「低い(low)」、「減少した（reduced）」、「負(negative)」、又は「吸い込み(suction)」の圧力は、大気圧よりも低い様々な圧力を意味する。

ある実施例では、周縁密閉部材２３０、挿入密閉部材２５４、及び挿入マニホルド２６０（及び他の構成部品）は、射出成形によって製造される。他の実施例は、鋳造部品、非規格サイズのＯリング、又は代替の材料から構成されてもよい。ある実施例では、インサート２０及びプレートウェル１０（及び他の構成部品）は、簡単に入手可能な（又は市販の）部材である標準規格の構成部品でもよい。このような構成部品は使い捨て又は消耗部品として扱うことができるので、このような標準規格の構成部品を使用することによって行われる必要がある殺菌量を最小限にすることができる。

ある実施例では、圧力、流れ、又は他のパラメータのセンサを組み込んだ閉ループフィードバックシステムを使用して、培地流動を自動的に制御し、培地流動は傾けられる、逆向きにされる、循環される、又は再利用される。ある実施例では、プレートウェルは並行に又は連続して連結されてもよく、ガス噴射又は温度調節器が付加されてもよい。ある実施例では、ＬＥＤまたは他の電子機器と同様に、光学センサ又は画像装置をシステムに組み込むことによって光学的放射（ＵＶ乃至ＩＲ）が付加されてもよい。電磁場、静電場、及び磁場が、これらのフィールド発生器をプレートウェル中又は周りに組み込むことによって誘導されてもよい。ある実施例は、ＭＥＭＳ又はマイクロフルイディクスなどの機械的な変形誘導器を具え、システムは、線虫、寄生虫、病原菌、又は小さな虫の研究に使用される。

ある実施例では、凹凸形状の組織試料は、ワックス鋳造又は同様の手段によって挿入具に密閉される。ある実施例では、培養組織を通る流れの方向及び速度を調整するために、膜２２の一部を塞いで、培養組織の端面に部分的に塞がれたカバーを具える。例えば、膜２２の外側縁以外の全てを塞いで、端面のカバーの中央の開口以外の全てを塞ぐことによって、半径方向の流れを誘導することができる。

ある実施例では、細胞基質１４０は、血漿の代わりにウシフィブリノゲンやトロンビンから構成されてもよい。実施例は、また、Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ（登録商標）、キトサン、デンプン又はコラーゲンなどの様々な他の生体適合性ポリマーおよび／または細胞外基質構成要素から構成されてもよく、提供される細胞基質１４０は破壊されることなくＴＮＰに耐えることができるものである。他の実施例では、細胞基質１４０は、再吸収可能な材料、移植可能な混合物、分層植皮片や象牙質又は骨などの組織の薄切片などの組織試料から構成されてもよい。

本発明をこれまで図示し詳細に記述してきたが、当業者が本発明の範囲から外れることなく変更及び改良をなしうることは明らかである。前述した説明や添付した図面は説明のためのものであり限定のためではない。本発明の実際の範囲は、請求の範囲によって与えられる均等物の全範囲とともに以下の請求の範囲によって規定されることを意図している。

さらに、当業者は、この開示を読んで理解することによってここに開示された発明の他の変形例が本発明の範囲内に含まれることを理解する。例えば、ある実施例では、周縁密閉部材３０及び２３０は一の構成部品から成る。他の実施例では、周縁密閉部材３０及び２３０は複数の構成部品から成る。

前記の開示した実施形態の詳細な記述において、合理的に説明するために、様々な特性をいくつかの実施例で一纏めにしている。この開示の方法は、本発明の実施例が各請求項で明確に列挙された特性以上のものを必要とすることを意図するとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の請求の範囲が示すように、発明の主題は単一の開示された実施例の全ての特性よりも少ない。この結果、以下の請求の範囲は、個別の実施例としてこれ自体に基づく各請求項とともに開示した実施形態の詳細な記述内へ組み込まれる。

図１は、細胞培養システムの第１の実施例の断面図である； 図２は、細胞培養用挿入具の斜視図である； 図３は、周縁密閉部材の一実施例の斜視図である； 図４は、細胞培養システムの一実施例の概略図である； 図５は、導管の一実施例の詳細図である； 図６は、図１の実施例を組み込んだ細胞培養システムの一実施例の斜視図である； 図７は、細胞培養システムの一実施例の分解図である； 図８は、図７の実施例の断面図である； 図９は、図７の実施例の詳細な断面図である； 図１０は、図７の実施例の上面斜視図である； 図１１は、周縁密閉部材の一実施例の上面斜視図である； 図１２は、図１１の実施例の下面斜視図である； 図１３は、図１１の実施例の断面図である； 図１４は、挿入密閉部材の一実施例の上面斜視図である； 図１５は、図１４の実施例の下面斜視図である； 図１６は、図１４の実施例の断面図である； 図１７は、挿入密閉リングの一実施例の上面図である； 図１８は、図１７の実施例の断面図である； 図１９は、挿入マニホルドの一実施例の上面斜視図である； 図２０は、図１９の実施例の下面斜視図である； 図２１は、図２０の実施例の断面図である； 図２２は、挿入密閉アセンブリの一実施例の分解図である； 図２３は、細胞培養システムの一実施例の上面斜視図である； 図２４は、図２３の実施例の断面図である。

Claims (18)

1. 細胞基質（４０）に負圧を適用するための密閉システムであって、
   一端の浸透膜（２２）及び開いた端部（２３）を有する本体（２１）を有する細胞容器（２０）であって、前記細胞基質が細胞容器の中の前記浸透膜の近くに置かれた場合に前記浸透膜が前記細胞基質との連通を与える細胞容器（２０）と；
   前記細胞容器の中に置かれた場合に前記細胞基質を覆い且つこれに連通させるための多孔質のドレッシング（４５）と；
   前記本体に延びてこれを密閉し、前記細胞容器の中の前記多孔質のドレッシング及び前記細胞基質を覆い且つこれを密閉するガス不透過性材料で形成されるドレープ（５０）と；
   前記多孔質のドレッシングを通して前記細胞基質に前記負圧を適用するために、前記多孔質のドレッシングに連通するよう前記ドレープを通して延びる吸込導管（６０）と；
   前記浸透膜を通して前記細胞基質に培地（７１）を適用するために、前記浸透膜を覆い且つこれを密閉し開口端（１３）及び底部（１２）を有するプレートウェル（１０）と；
   を具えることを特徴とする密閉システム。
2. さらに、前記多孔質のドレッシングに前記負圧を供給して前記細胞基質に前記負圧を適用するために、前記吸込導管に前記負圧を送出するための、前記吸込導管に連通するポンプ（６５）を具えることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
3. 前記ウェル容器の中に延びて前記細胞基質に前記培地を供給するための培地導管（７０）を具えることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
4. さらに、前記培地導管に前記培地を送出して前記細胞基質に前記培地を適用するために、前記培地導管に連通するポンプ（６７）を具えることを特徴とする請求項３に記載の密閉システム。
5. 前記ドレープがポリウレタンである具えることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
6. 前記多孔質のドレッシングが連続気泡発泡体であることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
7. 前記多孔質のドレッシングがガーゼであることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
8. さらに、前記浸透膜を通して前記細胞基質に培地を適用するために、前記細胞容器の本体を囲む内側面（３２）及びプレートウェルの中で密閉するよう構成された外側面（３３）を有する円筒形の本体部（３１）を有する密閉部材（３０）であって、前記細胞容器の本体と前記密閉部材の前記内側面との間の第１のフレキシブル密閉部材（５８）と、前記プレートウェルで密閉を与えて中に前記培地を収容するための、前記密閉部材の前記外側面の周りの第２のフレキシブル密閉部材（５９）と、を有する密閉部材（３０）と；
   を具えることを特徴とする請求項１に記載の密閉システム。
9. さらに、前記吸込導管に前記負圧を送出して前記多孔質のドレッシングに前記負圧を供給し、前記細胞基質に前記負圧を適用するために、前記吸込導管に連通するポンプを具えることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
10. さらに、前記細胞基質に培地を供給するためのウェルプレートの中に延びる培地導管を具えることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
11. さらに、前記培地導管に前記培地を送出して前記細胞基質に前記培地を供給するために、前記培地導管に連通するポンプを具えることを特徴とする請求項１０に記載の密閉システム。
12. さらに、前記ウェルプレートの中に前記密閉部材を通って延びて前記細胞基質に前記培地を供給するための培地導管を具えることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
13. さらに、前記ウェルプレートの中に前記密閉部材の前記第２のフレキシブル密閉部材を通って延びて前記細胞基質に前記培地を供給するための培地導管を具えることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
14. 前記第１のフレキシブル密閉部材がＯリングであることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
15. 前記第２のフレキシブル密閉部材がＯリングであることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
16. 前記ドレープがポリウレタンであることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
17. 前記多孔質のドレッシングが連続気泡発泡体であることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。
18. 前記多孔質のドレッシングがガーゼであることを特徴とする請求項８に記載の密閉システム。

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