BRPI0706850A2

BRPI0706850A2 - Sistema de cultura de células, sistema de vedação para um sistema de cultura de células, método de cultura de células e sistema para o cultivo de células

Info

Publication number: BRPI0706850A2
Application number: BRPI0706850-6A
Authority: BR
Inventors: Robert Peyton Wilkes; Amy Kathleen Mcnulty; Kristine Kieswetter; Teri D Feeley; Marisa Schmidt
Original assignee: Kci Licensing Inc
Priority date: 2006-01-18
Filing date: 2007-01-18
Publication date: 2011-04-12
Also published as: EP1974008B1; WO2007084677A3; IL192699A0; CA2633984C; HK1132301A1; WO2007084677A2; KR20080088637A; US7981668B2; RU2008128548A; EP1974008A2; JP2009523448A; US20070166817A1; EP1974008A4; CA2633984A1; AU2007207472B2; KR101105534B1; AU2007207472A1; JP5204667B2; RU2447142C2

Abstract

SISTEMA DE CULTURA DE CéLULAS, SISTEMA DE VEDAçAO PARA UM SISTEMA DE CULTURA DE CéLULAS, MéTODO DE CULTURA DE CéLULAS E SISTEMA PARA O CULTIVO DE CéLULAS Trata-se de um método e sistema de cultura de células, que tem um invólucro substancialmente hermético configurado para o cultivo de células. O método e o sistema também têm um primeiro conduto configurado para prover uma pressão reduzida ao invólucro substancialmente hermético e um segundo conduto configurado para prover um meio de cultura ao invólucro substancialmente hermético.

Description

SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, SISTEMA DE VEDAÇÃOPARA UM SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, MÉTODO DE CULTURA DECÉLULAS E SISTEMA PARA O CULTIVO DE CÉLULAS

CAMPO TÉCNICO

A presente descrição refere-se de maneira geral amétodos e aparelhos utilizados para prover a pressão reduzidaa culturas de células. Mais particularmente, a presentedescrição refere-se a métodos e aparelhos utilizados paraprover pressão reduzida a culturas de células em um invólucrosubstancialmente hermético com um fluxo controlado do meio decultura.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Foi mostrado que as aplicações de pressão negativatópica (PNT) são benéficas no tratamento de feridas,promovendo a formação de tecido de granulação, removendo ofluido intersticial, extraindo as feridas fechadas einduzindo microdeformações na superfície da ferida. Nasaplicações de PNT típicas, determinados parâmetros podem servariados, tais como o diferencial de pressão ou as vazões defluidos. No entanto, não é sempre possível correlacionarvariações em um parâmetro particular a uma resposta naterapia de feridas durante as aplicações in vivo, devido àfalta de um ambiente controlado. É, portanto, desejável aobtenção de um método e aparelho para prover pressão reduzidaa culturas de células, e medir os efeitos de parâmetrosdiferentes em aplicações de PNT em um ambiente in vitrocontrolado.

Também é desejável a obtenção de um método eaparelho para aplicar a PNT, a qual provê vazões controladasdo meio de cultura e reduz a probabilidade de que o ar sejaextraído na cultura de células. Tal indução de ar podeconduzir à dessecação da matriz, impedindo desse modo quedados significativos sejam adquiridos.DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Era determinadas realizações, ura sistema de culturade células compreende um invólucro substancialmente herméticoconfigurado para o cultivo de células; um primeiro conduto emcomunicação fluida com o invólucro substancialmentehermético, em que o primeiro conduto é configurado paraprover uma pressão reduzida ao invólucro substancialmentehermético; e um segundo conduto em comunicação fluida com oinvólucro substancialmente hermético, em que o segundoconduto é configurado para prover um meio de cultura aoinvólucro substancialmente hermético. Era outras realizações,uma matriz de células é localizada dentro do invólucrosubstancialmente hermético e a pressão reduzida é aplicada auma primeira superfície da matriz de células e um meio decultura é aplicado a uma segunda superfície da matriz decélulas durante a utilização. Outras realizações compreendemuma superfície permeável e/ou uma bandagem localizada dentrodo invólucro substancialmente hermético. Ainda outrasrealizações compreendem uma superfície permeável, uma matrizde células e uma bandagem (ou outro material de distribuição)localizadas dentro do invólucro substancialmente hermético,em que o meio de cultura flui do segundo conduto, através dasuperfície permeável, através da matriz de células, atravésda bandagem e rumo ao primeiro conduto. Em determinadasrealizações, a superfície permeável suporta a matriz decélulas e a matriz de células pode ficar localizada entre asuperfície permeável e a bandagem.

Outras realizações compreendem um sistema devedação para um sistema de cultura de células que compreendeum elemento de vedação periférico configurado para acoplaruma cavidade de placa e configurado para acoplar um enxertode cultura de células, de uma maneira tal que uma primeiravedação seja formada entre o elemento de vedação periférico ea cavidade de placa e uma segunda vedação seja formada entreo elemento de vedação periférico e o enxerto de cultura decélulas. Um conjunto de vedação de enxerto também pode serconfigurado para acoplar o enxerto de cultura de células deuma maneira tal que uma terceira vedação seja formada entre oconjunto de vedação de enxerto e o enxerto de cultura decélulas. Em determinadas realizações, o elemento de vedaçãoperiférico pode ser configurado para acoplar uma paredeinterna da cavidade de placa e uma parede externa do enxertode cultura de células e o conjunto de vedação de enxerto podeser configurado para acoplar uma parede interna do enxerto.Em determinadas realizações, um primeiro conduto pode seestender através do elemento de vedação periférico e umsistema de suprimento do meio de cultura pode ser acoplado aoprimeiro conduto. Em outras realizações, o segundo condutopode se estender através do elemento de vedação periférico eum terceiro conduto pode se estender através do conjunto devedação de enxerto. Em determinadas realizações, uma fonte debaixa pressão pode ser acoplada ao terceiro conduto e umquarto conduto pode se estender através do conjunto devedação de enxerto. Em determinadas realizações, cada umadentre a primeira e a segunda vedações pode ser criada por umencaixe de interferência e o elemento de vedação periféricopode ser formado através de moldagem a injeção. Emdeterminadas realizações, o conjunto de vedação de enxertopode compreender um elemento de vedação de enxerto, um anelde vedação de enxerto, um elemento de vedação lateral e umdistribuidor de enxerto. Em determinadas realizações, oelemento de vedação de enxerto e/ou o distribuidor de enxertopodem ser pressionados no enxerto. Em outras realizações, odistribuidor de enxerto é rosqueado no elemento de vedação deenxerto. Em determinadas realizações, o anel de vedação deenxerto pode ser comprimido entre o elemento de vedação deenxerto e o distribuidor de enxerto e o elemento de vedaçãode enxerto pode ser formado através de moldagem a injeção. Emdeterminadas realizações, o elemento de vedação periférico épressionado na cavidade de placa.

Outras realizações compreendem um método para ocultivo de células que compreende: a provisão de um invólucrosubstancialmente hermético; a provisão de uma matriz decélulas dentro do invólucro substancialmente hermético; aprovisão de uma pressão reduzida ao invólucrosubstancialmente hermético; e a provisão de um meio decultura ao invólucro substancialmente hermético. Emdeterminadas realizações, o invólucro substancialmentehermético compreende uma primeira superfície e uma segundasuperfície e a pressão reduzida é aplicada à primeirasuperfície e um meio de cultura é aplicado à segundasuperfície. Em determinadas realizações, a pressão reduzida éprovida através de um primeiro conduto acoplado a uma fontede baixa pressão e o primeiro conduto fica em comunicaçãofluida com o invólucro substancialmente hermético. Emdeterminadas realizações, a fonte de baixa pressão é umabomba a vácuo. Em determinadas realizações, o meio de culturapode ser provido através de um segundo conduto acoplado a umsistema de suprimento do meio de cultura e o segundo condutofica em comunicação fluida com o invólucro substancialmentehermético.

Outras realizações compreendem um sistema decultura de células que compreende: uma cavidade de placa; umenxerto de cultura de células; um elemento de vedaçãoperiférico configurado para acoplar uma cavidade de placa econfigurado para acoplar o enxerto de cultura de células, deuma maneira tal que o elemento de vedação periférico formeuma primeira vedação com a cavidade de placa e forme umasegunda vedação com o enxerto de cultura de células; e umconjunto de vedação de enxerto configurado para acoplar oenxerto de cultura de células de uma maneira tal que oconjunto de vedação de enxerto forme uma terceira vedação como enxerto de cultura de células. Determinadas realizaçõescompreendem um primeiro conduto que se estende através doelemento de vedação periférico e uma fonte de baixa pressãoacoplada ao primeiro conduto. Em determinadas realizações, osegundo conduto pode se estender através do conjunto devedação de enxerto e um sistema de suprimento do meio decultura pode ser acoplado ao segundo conduto. Determinadasrealizações também compreendem uma matriz de células noenxerto de cultura de células e uma bandagem entre a matrizde células e o conjunto de vedação de enxerto.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIGURA 1 ilustra uma vista em seção transversalde uma primeira realização de um sistema de cultura decélulas;

a FIGURA 2 ilustra uma vista em perspectiva de umenxerto de cultura de células;

a FIGURA 3 ilustra uma vista em perspectiva de umarealização de um elemento de vedação periférico;

a FIGURA 4 ilustra uma vista esquemática de umarealização de um sistema de cultura de células;

a FIGURA 5 ilustra uma vista detalhada de umarealização de um conduto;

a FIGURA 6 ilustra uma vista em perspectiva de umarealização de um sistema de cultura de células que incorporaa realização da Figura 1;

a FIGURA 7 ilustra uma vista explodida de umarealização de um sistema de cultura de células;

a FIGURA 8 ilustra uma vista em seção transversalda realização da Figura 7;

a FIGURA 9 ilustra uma vista em seção transversaldetalhada da realização da Figura 7;

a FIGURA 10 ilustra umaperspectiva da realização da Figura 7;

a FIGURA 11 ilustra umaperspectiva de uma realização de umperiférico;

a FIGURA 12 ilustra umaperspectiva da realização da Figura 11;

a FIGURA 13 ilustra uma vista em seção transversalda realização da Figura 11;

a FIGURA 14 ilustra uma vista superior emperspectiva de uma realização de um elemento de vedação deenxerto;

a FIGURA 15 ilustra uma vista inferior emperspectiva da realização da Figura 14;

a FIGURA 16 ilustra uma vista em seção transversalda realização da Figura 14;

a FIGURA 17 ilustra uma vista superior de umarealização de um anel de vedação de enxerto;

a FIGURA 18 ilustra uma vista em seção transversalda realização da Figura 17;

a FIGURA 19 ilustra uma vista superior emperspectiva de uma realização de um distribuidor de enxerto;

a FIGURA 2 0 ilustra uma vista inferior emperspectiva da realização da Figura 19;

a FIGURA 21 ilustra uma vista em seção transversalda realização da Figura 20;

a FIGURA 22 ilustra uma vista explodida de umarealização de um conjunto de vedação de enxerto;

a FIGURA 23 ilustra uma vista superior emperspectiva de uma realização de um sistema de cultura decélulas; e

a FIGURA 24 ilustra uma vista em seção transversalvista superior em

vista superior emelemento de vedação

vista inferior emda realização da Figura 23.

MELHOR MODO PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Com referência inicialmente às FIGURAS 1 a 4, umsistema de cultura de células 100 compreende uma cavidade deplaca 10, um recipiente de cultivo de células 20 para ocultivo de culturas de células e um elemento de vedaçãoperiférico 30 entre a cavidade de placa 10 e o recipiente decultivo de células 20. Nesta realização, a cavidade de placa10 compreende uma parede interna periférica 11 entre uma base12 e uma extremidade aberta 13. Na realização mostrada, orecipiente de cultivo de células 2 0 compreende um corpoafunilado 21 com uma parede externa 19 e um volume interno 28ligado por uma membrana permeável 22 em uma extremidade, umaextremidade aberta 23 que é oposta à membrana permeável 22 eum perímetro interno 29. Nesta realização, a extremidadeaberta 23 compreende um flange 24 com um par de entalhes 25 eum par de abas 26 que se estendem do corpo afilado 21 emalinhamento axial com os entalhes 25. Durante a utilização, arealização descrita também compreende uma matriz de células40 entre a membrana permeável 22 e uma bandagem 45. Emdeterminadas realizações, a matriz de células 40 encapsulamúltiplas camadas de células. Além disso, uma tampa 55 quecompreende os furos 53 e 54 pode ser utilizada para fixar orecipiente de cultivo de células 20 na cavidade de placa 10durante a utilização. Em determinadas realizações, orecipiente de cultivo de células 20 pode ser um enxerto deseis cavidades BD Falcon™, a cavidade de placa 10 pode seruma placa de cultura de seis cavidades BD Falcon™ e abandagem 4 5 pode ser uma espuma de células abertas ou umagaze.

Na realização da FIGURA 3, o elemento de vedaçãoperiférico 30 compreende um corpo 31 que é substancialmentecilíndrico e compreende uma superfície interna 32, umasuperfície externa 33, uma extremidade entalhada 34 e umaextremidade canalizada 35. Nesta realização, a extremidadeentalhada 34 compreende um par de entalhes 3 6 configuradospara se alinhar com as abas 26 do recipiente de cultivo decélulas 20. Na realização descrita, um canal 37 se estendeatravés da extremidade canalizada 35 da superfície externa 33à superfície interna 32. Conforme mostrado, a superfícieexterna 33 compreende um relevo 39 e a superfície internacompreende um relevo 38. Nesta realização, o relevo 38 é

configurado para receber um elemento de vedação flexível 58 eo relevo 3 9 é configurado para receber um elemento de vedaçãoflexível 59. Em determinadas realizações, os elementos devedação flexíveis 58 e 59 podem ser anéis em O. Em outrasrealizações, os elementos de vedação flexíveis podem ser

juntas, anéis em V ou outros dispositivos apropriados. Nestarealização, o elemento de vedação periférico 3 0 tambémcompreende uma cavidade 56 que se estende através do corpo 31da extremidade entalhada 34 ao relevo 39 e de uma cavidade 57que se estende do relevo 39 ao canal 37.

Durante a utilização, a realização das FIGURAS 1 a4 também compreende um elemento de vedação lateral ou umacolgadura 50 (com um elemento de reforço 51) que se estendeatravés do perímetro interno 29. Nesta realização, um condutode sucção 60 se estende através do furo 53, do elemento dereforço 51, da colgadura 50 e rumo à bandagem 4 5 durante aoperação. O conduto de sucção 60 fica, portanto, emcomunicação fluida com os componentes em cada lado dacolgadura 50.

Além disso, um conduto do meio de cultura 7 0 provêum meio de cultura à matriz de células 4 0 durante autilização desta realização. Na realização mostrada, oconduto do meio de cultura 70 se estende através do furo 54,do entalhe 25, da cavidade 56, do relevo 39, do elemento devedação flexível 59 e rumo à cavidade 57. 0 conduto do meiode cultura de células 70 fica, portanto, em comunicaçãofluida com os componentes em cada lado do elemento de vedaçãoperiférico 30. Conforme mostrado no diagrama esquemático naFIGURA 4, o conduto de sucção 60 pode ser acoplado a umafonte de baixa pressão 65 e o conduto do meio de cultura 7 0pode ser acoplado a um sistema de suprimento do meio 66 quecompreende uma bomba 67. Em determinadas realizações, a bomba67 pode compreender uma bomba peristáltica e a fonte de baixapressão 65 pode compreender uma bomba a vácuo. Na realizaçãomostrada na FIGURA 4, o material (tal como o ar e fluido)extraído através do conduto de sucção 60 pode ser armazenadoem um recipiente de armazenagem 68.

Durante a utilização, o sistema de cultura decélulas 100 provê pressão negativa tópica (PNT) à matriz decélulas 40 e provê o meio de cultura 71 para a matriz decélulas 40. Em uma realização, o elemento de vedaçãoperiférico 30 (com os elementos de vedação flexíveis 58 e 59)é colocado na cavidade de placa 10 de modo que o elemento devedação flexível 59 acople a cavidade de placa 10. Nestarealização, o recipiente de cultivo de células 20 (quecompreende a matriz de células 40) é colocado no recipienteperiférico para o cultivo de células 2 0 do elemento devedação 3 0 de modo que o elemento de vedação flexível 58acople e as abas 26 fiquem alinhadas com os entalhes 36. Emdeterminadas realizações, a bandagem 4 5 é colocada na matrizde células 4 0 e a colgadura 50 é colocada através daextremidade aberta 23 do recipiente de cultivo de células 20.Conforme mostrado na FIGURA 6 e discutido de maneira maisampla a seguir, a tampa 55 pode ser montada com o conduto desucção 60 e o elemento de reforço 51 para formar um conjuntode tampa 75. O conjunto de tampa 75 pode ser posicionado demodo a cobrir a colgadura 50, a cavidade de placa 10 e aextremidade aberta 23 do recipiente de cultivo de células 20.Em determinadas realizações, à medida que o conjunto de tampa7 5 é abaixado no lugar, o conduto de sucção 60 penetra nacolgadura 5 0 e o elemento de reforço é empurrado para baixona colgadura 50. Em determinadas realizações, a colgadura 50é uma folha de poliuretano, com aproximadamente 0,002 - 0,004polegada de espessura, com um adesivo na bandagem proximallateral 45. Conforme montado, o conduto de sucção 60 seestende para a bandagem 45. O conduto do meio de cultura 70pode ser inserido através do furo 54, do entalhe 25, dacavidade 56, do relevo 38, do elemento de vedação flexível58, e para a cavidade 57 ou o canal 37 (que fica emcomunicação fluida com a cavidade 56).

Conforme mostrado na FIGURA 1, o sistema de culturade células 100 é configurado para prover pressão negativatópica (PNT) e o meio de cultura 71 à matriz de células 40.Na realização mostrada, o sistema de suprimento do meio 66pode prover o meio de cultura 71 para o conduto do meio decultura 7 0 durante a utilização. 0 meio de cultura 71 podesair do conduto 70 e se deslocar através do canal 37 emdireção ao recipiente de cultivo de células 20. Nestarealização, o meio de cultura 71 se desloca então através deuma abertura 72 entre a membrana permeável 22 e a base 12.Conforme mostrado, o meio de cultura 71 passa então atravésda membrana permeável 22 rumo à matriz de células 40,provendo desse modo nutrientes para a matriz de células 4 0 àsculturas de células durante a utilização.

Além disso, o sistema de cultura de células 100também pode prover pressão negativa tópica (PNT) à matriz decélulas 40. Durante a operação, a fonte de baixa pressão 65pode criar uma pressão negativa ou de sucção através doconduto de sucção 6 0 e para a bandagem 45. Uma vez que abandagem 4 5 é um material poroso (tal como a espuma decélulas abertas ou a gaze de algodão), a matriz de células 4 0também é exposta à pressão de sucção. A matriz de células 4 0é exposta, portanto, a um diferencial de pressão queincentiva a porção superior da matriz de células 4 0 a seconformar à superfície inferior da bandagem 45, que pode teruma superfície irregular que compreende recortes e porçõeslevantadas. Tal processo de deformação da matriz de células40 pelo contato com uma superfície não-planar (conhecida comomicrodeformação) pode estimular a atividade celular na matrizde células através da indução de tensão mecânica (conhecidacomo mecanotransdução). Além disso, o diferencial de pressãoatravés da matriz de células 4 0 também promove a migração domeio de cultura 71 para a matriz de células 40, que promoveum crescimento adicional das células na matriz de células 40.Além disso, o diferencial de pressão através da colgadura 50pode fazer com que a colgadura 50 se deforme no recipiente decultivo de células e na bandagem 45.

Conforme mostrado na FIGURA 1, o sistema de culturade células 100 incorpora as características que propiciam aaplicação eficaz de PNT à matriz de células 40. Por exemplo,os elementos de vedação flexíveis 58 e 59 restringem aquantidade de ar que pode ser extraído entre o recipiente decultivo de células 20 e a cavidade de placa 10 e para oconduto de sucção 60. Além disso, a colgadura 50 forma umavedação ao longo da parede interna do recipiente de cultivode células 2 0 e através da bandagem 45, restringindoadicionalmente o fluxo de ar para o conduto de sucção 60.Além disso, a vazão do meio de cultura 71 pode ser controladaao ajustar o diferencial de pressão criado através damembrana permeável 22, da matriz de células 40 e da bandagem45. Ao controlar os parâmetros tais como a quantidade defluxo de ar através do conduto de sucção 6 0 e a queda depressão através da matriz de células 40, a probabilidade deque as células da matriz de células 4 0 entrem no conduto desucção 6 0 e sejam removidas do recipiente de cultivo decélulas 20 é reduzida. O sistema de cultura de células 100provê, desse modo, um método eficaz de aplicação de PNT àmatriz de células 4 0 enquanto minimiza o risco de perda decélulas.

Na realização descrita nas FIGURAS 1 a 4, o condutode sucção 6 0 compreende uma agulha hipodérmica de 25 GA comuma ponta sem núcleo defletida 61, tal como mostrado naFIGURA 5. A ponta sem núcleo 61 pode reduzir a probabilidadede que o material obstrua a ponta à medida que penetra em umasuperfície tal como o elemento de vedação flexível 58 ou oelemento de reforço 51. Em determinadas realizações, oconduto do meio de cultura 7 0 também pode compreender umaagulha hipodérmica de 25 GA com uma ponta sem núcleodefletida. Nas realizações descritas, o elemento de reforçocompreende um dispositivo de borracha em formato de cúpulacom um lado liso aderente. Em determinadas realizações, oelemento de reforço é um produto comercializado pela 3M sob amarca registrada Bumpon™. As realizações descritas tambémcompreendem os elementos de vedação flexíveis 58 e 59 que têmum valor durômetro de aproximadamente 70. Outras realizaçõespodem compreender características individuais comespecificações diferentes daquelas providas acima, que sãoprovidas apenas para a finalidade de exemplificação.

Em determinadas realizações, o sistema de culturade células 100 pode fazer parte de um conjunto maior.Conforme mostrado na FIGURA 6, o conjunto de cultura decélulas 150 compreende uma placa de seis cavidades 160 comseis cavidades de placa individuais 10. Cada sistema decultura de células 100 compreende um conduto do meio decultura 70 perto do perímetro da cavidade de placa 10 e umconduto de sucção 60 perto do centro da cavidade de placa 10.Para finalidades de clareza, somente um sistema de cultura decélulas 100 é etiquetado na FIGURA 6. Na realização mostrada,cada conduto do meio de cultura 70 é acoplado a um anteparo85 através da tubulação flexível 86. 0 anteparo 85 pode ser5 então acoplado aos sistemas de suprimento do meio múltiplos66 (mostrados na FIGURA 4) . Nesta realização, os parâmetrosde controle, tais como a vazão ou o tipo de meio, podem sercontrolados individualmente para cada sistema de cultura decélulas.

Além disso, cada conduto de sucção 60 é acopladoconjuntamente através da tubulação flexível 87 a um conectorcomum 88. O conector comum 8 8 pode ser então acoplado a umafonte de baixa pressão tal como a bomba a vácuo 65 (mostradana FIGURA 4) . Em outras realizações, cada conduto de sucção60 pode ser individualmente acoplado para separar fontes debaixa pressão, de modo que a pressão possa ser controladaindividualmente para cada sistema de cultura de células 100.Também são visíveis na realização mostrada na FIGURA 6 osprendedores 89 utilizados para fixar o conjunto de tampa 75 àplaca de seis cavidades 160. Em determinadas realizações, oscomponentes do conjunto de cultura de células 150 (tais comoo conjunto de tampa 75 e a placa de cavidade 16 0) compreendemum material que permite que a luz passe através dos mesmos.Em tais realizações, a matriz de células 4 0 pode serobservada durante o processo de cultura de o 6lulas parafinalidades de avaliação (incluindo, por exemplo, respostasfluorescentes a estímulos).

Em determinadas realizações, a matriz de células 4 0é suficientemente porosa para permitir que o meio de cultura71 flua através da mesma, e suficientemente resistente parasuportar a PNT sem proliferação de células. Um exemplo de talmatriz compreende sangue suíno integral em citrato de sódiogirado de modo a separar as células do plasma. Nestarealização, o plasma pode ser testado quanto ao fibrinogênioe 2 mL de 9,8 mg/mL são colocados em cada recipiente decultivo de células 20. As células podem ser então semeadas noplasma a aproximadamente 20.000 células por recipiente decultivo de células 20, e 0,5 mL de trombina (1083 unidadespor mL no meio de cultura 71) pode ser adicionado porgotejamento na mistura de plasma/células. Depois que a matrizde células 140 tiver sido estabelecida, o meio de cultura 71pode ser adicionado à parte inferior do recipiente de cultivode células 20 e à parte superior da matriz de células 140.Nesta realização, as células podem ser levadas a proliferarpor aproximadamente duas semanas antes de uma experimentaçãoadicional. Em determinadas realizações, imediatamente antesda experimentação, 1 mL de um ágar (tal como o ágar TrypticSoy a uma concentração de 4 0 g/L) pode ser adicionado à partesuperior da matriz. A camada fina de ágar pode ser utilizadapara estabilizar a matriz de células 14 0 durante a PNT aindaassim sendo porosa o bastante para permitir o fluxo defluidos.

Uma outra realização de um sistema de cultura decélulas 200 é mostrada nas FIGURAS 7 a 22. Na vista explodidada FIGURA 7, o sistema de cultura de células 200 compreende acavidade de placa 10 na placa de seis cavidades 160. Narealização mostrada, na cavidade de placa 10 são inseridos umelemento periférico de vedação lateral 23 0, um recipiente decultivo de células 20, uma bandagem 245, um elemento devedação de enxerto 254, um anel de vedação de enxerto 252, umelemento de vedação lateral ou colgadura 250 e umdistribuidor de enxerto 260. Com referência agora à vista emseção transversal montada da Figura 8, o elemento de vedaçãoperiférico 23 0 foi orientado radialmente e pressionado nacavidade de placa 10 e o recipiente de cultivo de células 2 0foi orientado radialmente e pressionado no elemento devedação periférico 230 nesta realização. Durante autilização, a matriz de células 240 é colocada na partesuperior da membrana permeável 22. A bandagem 245 pode serentão colocada na parte superior da matriz de células 240 e oelemento de vedação de enxerto 254 pode ser orientadoradialmente e pressionado no recipiente de cultivo de células20. Na realização mostrada, a colgadura 250 pode ser entãocolocada no anel de vedação de enxerto 252, que pode serentão colocado em uma tampa 253 do elemento de vedação deenxerto 254. O distribuidor de enxerto 260 pode ser rosqueadono elemento de vedação de enxerto 254.

Com referência agora à seção transversal detalhadada FIGURA 9, um corpo 231 do elemento de vedação periférico230 acopla a parede interna 11 da cavidade de placa 10 paracriar uma vedação substancialmente hermética (através de umencaixe de interferência) entre a cavidade de placa 10 e oelemento de vedação periférico 230. Embora o elemento devedação periférico 230 entre em contato direto com a cavidadede placa 10 nesta realização, outras realizações podemcompreender componentes adicionais entre o elemento devedação periférico 230 e a cavidade de placa 10. Nestarealização, múltiplas vedações são formadas através dosencaixes de interferência; em outras realizações, vedaçõessubstancialmente herméticas podem ser formadas através deoutros mecanismos tais como anéis em O, juntas, selantes,etc. As vedações substancialmente herméticas adicionais sãoformadas onde o elemento de vedação periférico 230 acopla orecipiente de cultivo de células 20 na região 232 e onde orecipiente de cultivo de células 20 entra em contato com oelemento de vedação de enxerto 254 na região 233. Narealização mostrada, a colgadura 250 é colocada no anel devedação de enxerto 252, que é colocado na tampa 253 doelemento de vedação de enxerto 254. Nesta realização, o anelde vedação de enxerto 252 compreende uma ou mais aberturas255 e a colgadura 250 pode ser puncionada para criar asaberturas (não mostradas) que são alinhadas com as aberturas255, permitindo que o espaço diretamente acima das aberturas255 fique em comunicação fluida com o espaço abaixo dasaberturas 255. O distribuidor de enxerto 260 pode ser entãorosqueado no elemento de vedação de enxerto 254, fixandodesse modo a colgadura 250 contra o anel de vedação deenxerto 252 e o anel de vedação de enxerto 252 contra a tampa253.

Conforme mostrado nas FIGURAS 8 e 9, um conduto 270se estende através do elemento de vedação periférico 23 0,formando uma passagem para o meio de cultura 271 alcançar amatriz de células 24 0 através da membrana permeável 22(similarmente à maneira descrita na realização precedente).Também mostrado nesta realização, o distribuidor de enxerto260 compreende um conduto 262 em comunicação fluida com asaberturas 255 do anel de vedação de enxerto 252 e todas asaberturas providas na colgadura 250. Portanto, uma fonte debaixa pressão (tal como a bomba a vácuo 65 na FIGURA 4) podeser acoplada ao conduto 262 e prover baixa pressão ou sucçãoà bandagem 24 5 para causar microdeformação e mecanotransduçãoda matriz de células 240 de uma maneira similar à realizaçãodescrita anteriormente.

Uma vista superior do sistema de cultura de célulasmontado 200 é mostrada na FIGURA 10. Mostrado de modoestendido a partir da cavidade de placa 10 nesta realização,o elemento de vedação periférico 23 0 compreende as abas 232 e234, o recipiente de cultivo de células 20 compreende osflanges 24 e o elemento de vedação de enxerto 2 54 compreendeas abas 256. Nesta realização, as abas 232, 234 e 256compreendem marcas relativas ao alinhamento dos componentes,bem como marcas para denotar se uma porta está aberta(discutido mais detalhadamente a seguir).

Com referência agora às FIGURAS 11 a 13,características mais detalhadas do elemento de vedaçãoperiférico 230 ficam visíveis. Nesta realização, o elementode vedação periférico 230 compreende um corpo 231 que ésubstancialmente cilíndrico com um par de entalhes 236, asabas 232 e 234, o conduto 270 e um conduto vedado 273. Osentalhes 236 são configurados para serem alinhados com asabas 26 que se estendem do recipiente de cultivo de células20 (mostrado na FIGURA 2). O conduto vedado 273 compreende umsepto 272 que pode ser puncionado, caso desejado, para abriro conduto vedado 273, para que possa ser utilizado para umapassagem secundária para o meio de cultura 271 ou uma portade detecção de pressão. Uma esfera 235 na aba 232 indica queo conduto 270 que se estende da aba 232 é aberto em vez devedado e as marcas 22 9 fornecem a orientação para oalinhamento durante a montagem. Na extremidade oposta docorpo 231 das abas 232 e 234 é disposta uma porção afunilada239 que se estende para um colar 238 com os canais 237.

Similarmente aos canais 37 da realização descritaanteriormente, os canais 237 formam uma passagem para que omeio de cultura 271 flua do conduto 270 à membrana permeável22 e ã matriz de células 240, fornecendo desse modonutrientes para a matriz de células 240.

Com referência agora às FIGURAS 14 a 16,características mais detalhadas do elemento de vedação deenxerto 254 são visíveis. Nesta realização, o elemento devedação de enxerto 254 compreende um corpo 2 51 que ésubstancialmente cilíndrico e tem uma porção internamentesulcada 259. Nesta realização, as abas 256 se estendem parafora de uma extremidade do corpo 251, sendo que a tampa 253se estende para dentro da extremidade oposta ao corpo 251. Asabas 256 também compreendem marcas de alinhamento 258 e umpar de relevos 257 para formar um espaçamento sobre a bordaafiada 300 (FIGURA 2) do recipiente de cultivo de células 20.

Com referência agora às FIGURAS 17 e 18,características mais detalhadas do anel de vedação de enxerto252 são visíveis. Nesta realização, o anel de vedação deenxerto 252 compreende uma pluralidade de aberturas 255. Alémdisso, esta realização do anel de vedação de enxerto 252compreende um sulco 242 de modo que a seção transversal tenhaum formato ligeiramente em "V", conforme mostrado na FIGURA18.

Com referência agora às FIGURAS 19 a 21,características mais detalhadas do distribuidor de enxerto260 são visíveis. Nesta realização, o distribuidor de enxerto260 compreende um corpo geralmente cilíndrico 261 com umaporção externamente sulcada 269. Esta realização tambémcompreende um conduto vedado 264 que compreende um septo 2 68que pode ser puncionado, caso desejado, para abrir o condutovedado 264. Se for aberto, o conduto vedado 264 pode serutilizado para um conduto adicional de baixa pressão ou parauma porta de detecção de pressão. Nesta realização, odistribuidor de enxerto 260 compreende uma esfera 263 queindica que o conduto 262 está aberto em vez de vedado. NasFIGURAS 20 e 21 são visíveis o canal 267 (que fica emcomunicação fluida com o conduto 262 e o conduto vedado 264,se estiver aberto) e as bordas arredondadas 265 e 266.Conforme mostrado na FIGURA 9, as bordas arredondadas 265 e266 podem acoplar com o anel de vedação de enxerto 252 de umamaneira tal que o canal 267 fique em comunicação fluida comas aberturas 255 do anel de vedação de enxerto 252.

Com referência agora à FIGURA 22, o distribuidor deenxerto 26 0, a colgadura 250, o anel de vedação de enxerto252 e o elemento de vedação de enxerto 254 são mostrados emuma vista explodida como uma realização de um conjunto deenxerto interno 275. Deve ficar compreendido que, em outrasrealizações, determinados componentes separados do conjuntode enxerto interno 275 podem ser combinados. Por exemplo, oanel de vedação de enxerto 2 52 pode ser integral ao elementode vedação de enxerto 254 ou ao distribuidor de enxerto 260.Durante a utilização, o conjunto de enxerto interno 275 éconfigurado para formar uma vedação através do perímetrointerno 29 do recipiente de cultivo de células 20. Durante amontagem da realização mostrada na FIGURA 22, a colgadura 250é colocada sobre o anel de vedação de enxerto 252 e omaterial adicional é aparado da colgadura 250 em torno doperímetro do anel de vedação de enxerto 252. Os furos podemser então criados dentro da colgadura 2 50, os quais sãoalinhados com as aberturas 255 do anel de vedação de enxerto252. Na realização mostrada, o distribuidor de enxerto 260pode ser então rosqueado no elemento de vedação de enxerto254 de uma maneira tal que as bordas arredondadas 275 e 266acoplem a colgadura 250 e comprimam a mesma contra o anel devedação de enxerto 252 para formar uma vedaçãosubstancialmente hermética com a tampa 253 do elemento devedação de enxerto 254, conforme mostrado na FIGURA 9. Alémdisso, o corpo 251 do elemento de vedação de enxerto 254acopla no perímetro interno 2 9 do recipiente de cultivo decélulas 20, criando desse modo uma vedação substancialmentehermética através do perímetro interno 29. Conforme mostradona realização da Figura 9, o conjunto de enxerto interno 275pode, portanto, ser combinado com o elemento de vedaçãoperiférico 23 0 para formar um sistema de vedação que formevedações substancialmente herméticas com o perímetro interno29 e a parede externa 19 do recipiente de cultivo de células20. Na realização mostrada, a porção afunilada 239 doelemento de vedação periférico 230 acopla na parede externa19 em um encaixe de interferência, e o corpo 251 (perto dainterface com a tampa 253) acopla no perímetro interno 29 dorecipiente de cultivo de células 20. O recipiente de cultivode células 20 é eficazmente vedado, portanto, externa einternamente; permitindo que uma PNT eficaz seja aplicada auma matriz de células contida dentro do recipiente de cultivode células 20. Além disso, o sistema de cultura de células200 pode ser combinado com sistemas de cultura de célulasadicionais de uma maneira similar àquela do sistema decultura de células 100 mostrado na FIGURA 6.

Em outras realizações, o recipiente de cultivo decélulas pode ser qualquer dispositivo apropriado para ocultivo de células e pode ser um dispositivo com exceção deum enxerto de cultura de células. Com referência agora àsFIGURAS 23 e 24, uma outra realização de um sistema decultura de células 400 é mostrada, a qual compreende umrecipiente de cultivo de células 410 que compreende asparedes periféricas 419 e o piso 420. Nesta realização, orecipiente de cultivo de células 410 compreende uma matriz decultura de células 440 entre um suporte permeável 422 e umabandagem 445. Na realização mostrada, uma tampa 450 cobre abandagem 44 5 e um conduto de sucção 4 60 (acoplado a uma fontede baixa pressão, não mostrada) pode prover pressão negativaa uma bandagem 445 e à matriz de cultura de células 440.Nesta realização, um conduto do meio de cultura 470 éacoplado ao recipiente de cultivo de células 410 e provê omeio de cultura 471, que pode fluir através do suportepermeável 422 à matriz de cultura de células 440.

Durante a utilização, esta realização é operada deuma maneira equivalente às realizações descritasanteriormente, e o conduto de sucção 460 aplica pressãonegativa a uma primeira superfície 441 (mostrada aqui comouma superfície superior) da matriz de células 440. Alémdisso, o conduto do meio de cultura 4 70 provê o meio decultura 470 a uma segunda superfície 442 (mostrada aqui comouma superfície inferior) da matriz de células 440. Conformemostrado, as paredes periféricas 419, o piso 420 e a tampa450 formam um invólucro substancialmente hermético 421 queveda eficazmente a matriz de cultura de células 440 (comexceção do conduto de sucção 460 e do conduto do meio decultura 470). Nesta realização, o conduto de sucção 460 seestende através da tampa 450 (quando acoplado a uma fonte debaixa pressão) e pode ser utilizado para controlar aquantidade de pressão negativa que é aplicada à matriz decultura de células 440. Similarmente, o conduto do meio decultura 470 se estende através da parede periférica 419 epode ser utilizado para controlar a quantidade do meio decultura 471 provida à matriz de cultura de células 440.

Na realização mostrada, o recipiente de cultivo decélulas 410 não requer um elemento de vedação periféricoseparado entre o mesmo e um conjunto maior (tal como umaplaca de cavidade) porque o conduto do meio de cultura decélulas 470 se estende através da parede periférica 419 dorecipiente de cultivo de células 410. O sistema de cultura decélulas 400 pode ser operado com um único recipiente decultivo de células 410 ou como múltiplos recipientes para ocultivo de células 410. Na realização mostrada, o suportepermeável 422 pode compreender qualquer uma de uma série deconfigurações diferentes. Por exemplo, o suporte permeável422 pode compreender um material de tela, uma barreiraperfurada, ou uma membrana. Nesta realização, a tampa 450pode ser uma colgadura flexível similar àquelas nasrealizações previamente descritas ou a tampa 450 pode ser umelemento mais rígido que acopla nas paredes periféricas 419de uma maneira vedante. A realização descrita é provida parafinalidade de exemplo somente, e modificações e variações darealização descrita estão dentro do âmbito da invenção.Em toda esta descrição, a referência a uma "vedaçãoentre" dois componentes não requer que os dois componentesfiquem em contato um com o outro. Componentes adicionaispodem ficar localizados entre dois ou mais componentes quetêm uma vedação entre si. A referência nesta descrição àpressão "baixa", "reduzida", "negativa" ou "de sucção"refere-se a qualquer pressão menor do que a pressãoatmosférica.

Em determinadas realizações, o elemento de vedaçãoperiférico 230, o elemento de vedação de enxerto 254 e odistribuidor de enxerto 260 (e outros componentes) podem sermanufaturados através de moldagem a injeção. Outrasrealizações podem compreender peças moldadas, tamanhos deanel em O não-padronizados ou materiais alternativos. Emdeterminadas realizações, o enxerto 20 e a cavidade de placa10 (bem como outros componentes) podem ser os componentespadrão que são artigos facilmente disponíveis ou "produzidosem série". A utilização de tais componentes padrão podeminimizar a quantidade de esterilização que deve serestabelecida, uma vez que tais componentes podem ser tratadoscomo componentes descartáveis ou consumíveis.

Em determinadas realizações, o fluxo do meio podeser controlado automaticamente ao utilizar um sistema derealimentação de circuito fechado que incorpora a pressão, ofluxo ou outros sensores de parâmetros, e o fluxo do meiopode ser inclinado, invertido, ciclado ou reciclado. Emdeterminadas realizações, as cavidades da placa podem seracopladas em paralelo ou em série, e um dispositivo deinjeção de gás ou de controle de temperatura pode seradicionado. Em determinadas realizações, a radiação óptica(UV a IR) pode ser adicionada ao incorporar LEDs ou outrosaparelhos microeletrônicos ao sistema, bem como sensoresópticos ou dispositivos para a geração de imagens. Os camposeletromagnéticos, eletrostáticos e magnéticos podem serinduzidos ao incorporar estes geradores de campo nascavidades da placa ou em torno das cavidades da placa.Determinadas realizações podem compreender dispositivos deindução de estiramento mecânico, tais como MEMS oumicrofluídicos, e o sistema pode ser utilizado para o estudode nematódeos, parasitas, micróbios ou de pequenos insetos.

Em determinadas realizações, as amostras de tecidoque têm formas irregulares podem ser vedadas ao enxerto pormeio de vazamento de cera ou um meio similar. Em determinadasrealizações, as porções da membrana 22 podem ser obturadas ea superfície apical da cultura pode ter uma tampaparcialmente obturada a fim de controlar a direção e avelocidade do fluxo através da cultura. Por exemplo, aoclusão de todas as margens, com exceção da margem externa damembrana 22 e a oclusão de todos os furos com exceção de umfuro central em uma tampa apical poderiam induzir o fluxoradial.

Em determinadas realizações, a matriz de células140 pode compreender fibrinogênio bovino e trombina em vez deplasma. As realizações também podem compreender vários outrospolímeros biocompatíveis e/ou componentes da matrizextracelular tais como Puramatrix™, quitosana, amido oucolágeno, contanto que a matriz de células 140 possa suportara PNT sem se decompor. Em outras realizações, a matriz decélulas 140 pode compreender materiais reabsorvíveis,misturas implantáveis, amostras de tecidos tais como enxertosde pele com espessura rachada ou fatias finas de tecido taiscomo da dentina ou do osso.

Embora a presente invenção tenha sido mostrada edescrita em detalhes acima, deve ficar claro a um técnico noassunto que alterações e modificações podem ser feitas semque se desvie do âmbito da invenção. Como tal, o que édeterminado na descrição antecedente e nos desenhos em anexoé apresentado para ilustração somente e não como umalimitação. 0 âmbito real da invenção deve ser definido pelasseguintes reivindicações, juntamente com a faixa completa deequivalentes aos quais tais reivindicações são designadas.

Além disso, um técnico no assunto deve apreciar coma leitura e compreensão desta descrição que outras variaçõespara a invenção aqui descrita podem ser incluídas dentro doâmbito da presente invenção. Por exemplo, em determinadasrealizações, os elementos de vedação periféricos 30 e 230podem constituir um componente. Em outras realizações, oselementos de vedação periféricos 3 0 e 23 0 podem compreendermúltiplos componentes.

Na Descrição Detalhada das Realizações Descritasacima, várias características são agrupadas umas às outras emdiversas realizações para a finalidade de enfatizar adescrição. Este método de descrição não deve ser interpretadocomo refletindo uma intenção que as realizações da invençãorequerem mais características do que é declaradoexpressamente em cada reivindicação. Em vez disso, tal comoas seguintes reivindicações refletem, o objetivo da presenteinvenção reside em menos do que todas as características deuma única realização descrita. Desse modo, as seguintesreivindicações são aqui incorporadas na Descrição Detalhadadas Realizações Descritas, sendo que cada reivindicação é, emsi, como uma realização separada.

Claims

1. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, caracterizadopelo fato de compreender:um invólucro substancialmente hermético configuradopara o cultivo de células;um primeiro conduto em comunicação fluida com oinvólucro substancialmente hermético, em que o primeiroconduto é configurado para prover uma pressão reduzida aoinvólucro substancialmente hermético; eum segundo conduto em comunicação fluida com oinvólucro substancialmente hermético, em que o segundoconduto é configurado para prover um meio de cultura aoinvólucro substancialmente hermético.

2. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, durante autilização, uma matriz de células é localizada dentro doinvólucro substancialmente hermético e em que, durante autilização, a pressão reduzida é aplicada a uma primeirasuperfície da matriz de células e um meio de cultura éaplicado a uma segunda superfície da matriz de células.

3. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que umasuperfície permeável é localizada dentro do invólucrosubstancialmente hermético.

4. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma bandagemou outro material de distribuição é localizada dentro doinvólucro substancialmente hermético.

5. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente:uma superfície permeável localizada dentro doinvólucro substancialmente hermético;uma matriz de células localizada dentro doinvólucro substancialmente hermético; euma bandagem ou um outro material de distribuiçãolocalizado dentro do invólucro substancialmente hermético, emque o meio de cultura flui do segundo conduto, através dasuperfície permeável, através da matriz de células, atravésda bandagem ou outro material de distribuição e rumo aoprimeiro conduto.

6. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS, de acordo coma reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que asuperfície permeável suporta a matriz de células e a matrizde células fica localizada entre a superfície permeável e abandagem ou um outro material de distribuição.

7. SISTEMA DE VEDAÇÃO PARA UM SISTEMA DE CULTURADE CÉLULAS, caracterizado pelo fato de compreende:um elemento de vedação periférico configurado paraacoplar uma cavidade de placa e configurado para acoplar umenxerto de cultura de células, de uma maneira tal que umaprimeira vedação seja formada entre o elemento de vedaçãoperiférico e a cavidade de placa e uma segunda vedação sejaformada entre o elemento de vedação periférico e o enxerto decultura de células; eum conjunto de vedação de enxerto configurado paraacoplar o enxerto de cultura de células de uma maneira talque uma terceira vedação seja formada entre o conjunto devedação de enxerto e o enxerto de cultura de células.

8. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o elemento devedação periférico é configurado para acoplar em uma paredeinterna da cavidade de placa e uma parede externa do enxertode cultura de células.

9. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjunto devedação de enxerto é configurado para acoplar em uma paredeinterna do enxerto.

10. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um primeiro conduto que se estende através doelemento de vedação periférico.

11. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um sistema de suprimento do meio de culturaacoplado ao primeiro conduto.

12. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um segundo conduto que se estende através doelemento de vedação periférico.

13. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um terceiro conduto que se estende através doconjunto de vedação de enxerto.

14. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente uma fonte de baixa pressão acoplada aoterceiro conduto.

15. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um quarto conduto que se estende através doconjunto de vedação de enxerto.

16. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a primeiravedação é criada por um encaixe de interferência.

17. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a segundavedação é criada por um encaixe de interferência.

18. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a terceiravedação é criada por um encaixe de interferência.

19. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o elemento devedação periférico é formado através de moldagem a injeção.

20. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjunto devedação de enxerto compreende um elemento de vedação deenxerto, um anel de vedação de enxerto, um elemento devedação lateral e um distribuidor de enxerto.

21. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o elementode vedação de enxerto é pressionado no enxerto.

22. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que odistribuidor de enxerto é rosqueado no elemento de vedação deenxerto.

23. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anel devedação de enxerto é comprimido entre o elemento de vedaçãode enxerto e o distribuidor de enxerto.

24. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o elementode vedação de enxerto é formado através de moldagem ainjeção.

25. SISTEMA DE VEDAÇÃO, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o elemento devedação periférico é pressionado na cavidade de placa.

26. MÉTODO DE' CULTURA DE CÉLULAS, sendo que ométodo é caracterizado pelo fato de compreender:a provisão de um invólucro substancialmentehermético;a provisão de uma matriz de células dentro doinvólucro substancialmente hermético;a provisão de uma pressão reduzida ao invólucrosubstancialmente hermético; ea provisão de um meio de cultura ao invólucrosubstancialmente hermético.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o invólucro substancialmentehermético compreende uma primeira superfície e uma segundasuperfície e em que a pressão reduzida é aplicada à primeirasuperfície e um meio de cultura é aplicado à segundasuperfície.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a pressão reduzida é providaatravés de um primeiro conduto acoplado a uma fonte de baixapressão e o primeiro conduto fica em comunicação fluida com oinvólucro substancialmente hermético.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a fonte de baixa pressão é umabomba a vácuo.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é providoatravés de um segundo conduto acoplado a um sistema desuprimento do meio de cultura e o segundo conduto fica emcomunicação fluida com o invólucro substancialmentehermético.

31. SISTEMA PARA O CULTIVO DE CÉLULAS, sendo que osistema é caracterizado pelo fato de compreender:uma cavidade de placa;um enxerto de cultura de células;um elemento de vedação periférico configurado paraacoplar uma cavidade de placa e configurado para acoplar oenxerto de cultura de células, de uma maneira tal que oelemento de vedação periférico forme uma primeira vedação coma cavidade de placa e forme uma segunda vedação com o enxertode cultura de células; eum conjunto de vedação de enxerto configurado paraacoplar o enxerto de cultura de células de uma maneira talque o conjunto de vedação de enxerto forme uma terceiravedação com o enxerto de cultura de células.

32. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umprimeiro conduto que se estende através do elemento devedação periférico.

33. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umafonte de baixa pressão acoplada ao primeiro conduto.

34. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umsegundo conduto que se estende através do conjunto de vedaçãode enxerto.

35. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umsistema de suprimento do meio de cultura acoplado ao segundoconduto.

36. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umamatriz de células no enxerto de cultura de células e umabandagem entre a matriz de células e o conjunto de vedação deenxerto.