CN117015598A - 用于模拟血迷路屏障的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于模拟人耳的血迷路屏障的装置(1)，包括：第一流体通道(10)和第二流体通道(20)，以及将第一和第二流体通道分隔开的膜(30)，其中膜具有在第一流体通道(10)中的腔侧和在第二流体通道(20)中的远腔侧；附着至膜的腔侧的内皮细胞(15)；附着至膜的远腔侧的周细胞(25)；被置于第二流体通道(20)中的血管周巨噬细胞型黑素细胞(26)。本发明还涉及制造这种装置的方法。本发明还涉及具有如上所述的两个流体通道和膜的装置，其中内皮细胞、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞布置在两个流体容器中。

Description

用于模拟血迷路屏障的装置
技术领域
本发明涉及一种用于模拟人耳的血迷路屏障的装置，以及制造该装置的方法。
背景技术
听力障碍是一个全球性的健康问题，具有高度的社会经济影响，并与高度未满足的医疗需求相关。由于衰老、听觉损伤或暴露于抗生素或化疗导致的内耳听觉毛细胞损伤是大多数感音神经性听力损失病例的基础。听力损失是全球10大残疾原因之一。不幸的是，没有药物疗法可保护或恢复听力。
人耳的内耳听觉毛细胞和血迷路屏障BLB对正常听力至关重要。BLB包括内皮细胞、ECs、周细胞、PCs和血管周巨噬细胞，如黑素细胞、PVM/Ms，它们是维持BLB完整性所必需的。体循环和血管纹之间的BLB对于维持耳蜗和前庭稳态、促进营养物和代谢物向耳蜗的转运以及保护耳蜗免受炎症和疾病的影响至关重要。BLB缺陷与导致听力损失的内耳疾病有关，包括血管畸形、梅尼埃病和阿尔波特综合征。
将治疗剂输送至内耳的耳蜗和前庭系统因其难以接近的位置而变得复杂。特别难以避免由于脱靶结合引起的副作用，例如来自抗生素和化疗的耳毒性。向耳蜗系统递送治疗剂涉及许多挑战。
因此，鉴于内耳的复杂性和不可接近性，需要一种代表人耳血迷路屏障的血迷路屏障模型，从而代替人耳或动物的血迷路屏障在其上进行医学评估和诊断以及实验。医学评估之一可以是例如上述对内耳的耳蜗和前庭系统的治疗递送。
发明内容
根据本发明，这一需求通过独立权利要求的特征所限定的装置、套件和用于制造装置的方法来解决。优选实施例是从属权利要求的主题。由于该装置的形式、结构和预期应用，该装置也可被称为芯片或微流体芯片。
在一个方面中，本发明涉及一种用于模拟人耳的血迷路屏障的装置。该装置包括第一流体通道、第二流体通道和将第一流体通道和第二流体通道分隔开的膜。该膜具有在第一流体通道中的腔侧(luminal side)和在第二流体通道中的远腔侧(abluminal side)。该装置还包括内皮细胞、周细胞和血管周巨噬细胞样黑素细胞。下文中，血管周巨噬细胞样黑素细胞也可称为血管周巨噬细胞型黑素细胞。
在一个优选实施例中，内皮细胞附着在膜的腔侧，周细胞附着在膜的远腔侧，血管周巨噬细胞样黑素细胞布置在第二流体通道中。
在另一优选实施例中，该装置包括第一容器和容器布置结构，其中第一容器包含第一培养基和内皮细胞。容器布置结构包括第二培养基、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞。容器布置结构可包括第二容器，该第二容器包含第二培养基、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞。或者，套件的容器布置结构可包括含有第二培养基和周细胞的第二容器，和含有第三培养基和血管周巨噬细胞型黑素细胞的第三容器。
该装置可以是微流体细胞培养系统，其可孵育和/或培养血迷路屏障的细胞，从而提供血迷路屏障模型。血迷路屏障细胞培养物的微工程三维模型可用于医学评估和诊断以及实验。祖细胞可取自尸体解剖得到的成人颞骨。使用血迷路屏障模型，可检查细胞表型的所有重要特征，这有助于成功地将它们置于装置上，并利用流动建立网络。
人耳的血迷路屏障(BLB)通常由毛细血管网组成，其在耳蜗和体循环之间形成结构和化学屏障。BLB的血管由特化的内皮细胞组成，所述内皮细胞缺乏开窗，例如允许血管和组织之间快速交换分子的孔，并且具有严重限制细胞渗透性的广泛紧密连接。有限的渗透性限制了物质从体循环向耳蜗内部的移动，这缓冲了内淋巴和外淋巴在离子或代谢条件下的快速变化。有限的BLB渗透性还保护听觉毛细胞免于暴露于对周围器官无害但对耳蜗毛细胞有毒的分子。BLB渗透性受细胞外基质、周细胞和血管周巨噬细胞样黑素细胞的影响。这些细胞与细胞外基质一起，作为一个空间单位调节BLB渗透性，并且维持耳蜗的完整性和稳态。
术语“流体通道”可特指微流体腔室，其中腔室的主要部分为细长形，可为基本上矩形棱柱/长方体。流体通道可填充或灌注培养基，使得细胞可在腔室中孵育和培养。
术语“膜”可特指由薄箔片形成的选择性屏障，并且可为多孔的。该膜可允许一些分子、离子或其他小颗粒通过，但同时可阻止其他分子、离子或其他小颗粒通过。该膜可由玻璃或聚合物制成，例如聚碳酸酯或聚二甲基硅氧烷、PDMS。取决于制造工艺，聚碳酸酯可具有约0.4μm至1μm的孔径和1.6×106cm-2的孔密度。由于膜是多孔的，化学或培养基可穿过膜，同时细胞可与膜接触，其附着在膜上但不穿过膜。
根据本发明，该装置不仅包括无机部件，如膜，还包括形成血迷路屏障模型的细胞。这样，该装置可用于医学诊断或分析中的特定用途，例如用于筛选例如活性药物化合物的耳毒性，以及与人耳BLB相关的其他实验。特别地，该装置的BLB模型结构包括内皮细胞和周细胞以及血管周巨噬细胞型黑素细胞，使得该装置是开箱即用的，并且可有效地和立即地用于医学诊断或分析和实验。
在另一方面中，本发明涉及一种套件，包括用于模拟人耳血迷路屏障的装置、第一容器和容器布置结构。该套件中的所述装置具有第一流体通道和第二流体通道以及膜，该膜将第一流体通道和第二流体通道分隔开，使得该膜具有在第一流体通道中的腔侧和在第二流体通道中的远腔侧。第一容器包括第一培养基和内皮细胞。容器布置结构包括第二培养基、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞。
根据本发明的套件允许有效提供将根据本发明的装置投入操作所需的所有部件。更具体地，它允许以适当的方式提供细胞，使得它们在装置开始操作之前不会受到损害。例如，在拆开套件后，可将容器中培养的细胞加入装置中。特别地，内皮细胞可被加入第一流体通道，周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞可被加入第二流体通道，从而形成BLB模拟结构。这样，细胞可安全地存活，特别是与已经附着在膜上的细胞相比，可存活相当长的时间。
在一个优选实施例中，套件的容器布置结构包括第二容器，该第二容器包含第二培养基、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞。周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞的这种组合提供允许细胞的有效处理和接种。
在另一优选实施例中，套件的容器布置结构包括含有第二培养基和周细胞的第二容器，以及含有第三培养基和血管周巨噬细胞型黑素细胞的第三容器。周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞的这种分离提供允许周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞的分离/分开接种。
套件中包括的任何容器优选是密封的。优选地，细胞在容器内的干冰中冷冻运输或提供/设置。容器内的细胞的这种设置允许在装置操作之前保护细胞。
在以下根据本发明的装置的和根据本发明的套件的装置的优选实施例中，描述了：
膜优选具有允许第一和第二流体通道之间化学物质传输的渗透性。
优选地，膜的腔侧涂有胶原蛋白。优选地，膜的远腔侧涂有纤维蛋白原。涂层可使细胞更好地附着在膜上，并且还可促进细胞的发展/生长。
优选地，内皮细胞可形成在单个层中，并可附着于膜的腔侧，周细胞可形成在单个层中，并可附着于膜的远腔侧，且血管周巨噬细胞型黑素细胞在第二流体通道中培养。内皮细胞、周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞形成血迷路屏障模型。与“培养”相关的术语“附着”是指细胞直接布置或粘附/附着在膜的腔侧或远腔侧，同时细胞可在流体通道中的膜上培养。血管周巨噬细胞型黑素细胞也可称为血管周驻留巨噬细胞样黑素细胞。
优选地，该装置包括配置为向第一流体通道中选择性地灌注第一培养基的第一入口和第一出口，以及配置为向第二流体通道中选择性地灌注第二培养基的第二入口和第二出口。培养基用于孵育或培养细胞。
有利地，内皮细胞是人内皮细胞，周细胞是人周细胞和/或血管周巨噬细胞样黑素细胞是人血管周巨噬细胞样黑素细胞。包括这种人类细胞允许有效地模拟人类BLB。
特别是当内皮细胞为人内皮细胞时，该装置优选包括第一培养基，其包含内皮基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子(重组人)、碱性成纤维细胞生长因子(重组人)、胰岛素样生长因子(长R3 IGF)、血管内皮生长因子165(重组人)、抗坏血酸、氢化可的松、和青霉素/链霉素。
此外，特别是当周细胞是人周细胞时，该装置优选包括第二培养基，其包含Dulbecco氏改良eagle氏培养基(DMEM)、胎牛血清、周细胞生长补充剂、色素上皮衍生因子(PEDF-重组人)、和青霉素/链霉素溶液。
更进一步，特别是当血管周巨噬细胞型黑素细胞为人类血管周巨噬细胞型黑素细胞时，该装置优选包括第二培养基，该第二培养基包含加有氯化钙(CaCl2)的培养基254CF、胎牛血清、人类黑素细胞生长补充剂、碱性成纤维细胞生长因子(重组人)、胰岛素(重组人)、氢化可的松、和庆大霉素/两性霉素B。
优选地，该装置包括：第一和第二覆盖片；具有至少一个第一开口部分的第一医用胶带，其中第一医用胶带粘附在第一覆盖片上，从而形成第一流体通道；以及具有至少一个第二开口部分的第二医用胶带，其中第二医用胶带粘附在第二覆盖片上，从而形成第二流体通道。在剖视图中，医用胶带可被视为流体通道的壁。因此，第一开口部分形成为第一流体通道，第二开口部分形成为第一第二通道。第一覆盖片形成为第一流体通道的顶部，第二覆盖片形成为第二流体通道的底部，并且膜分隔第一和第二流体通道。
医用胶带中使用的粘合剂可为任何适于提供适当粘合力的粘合剂，如聚硅氧烷基粘合剂。然而，优选地，第一医用胶带和第二医用胶带均包含丙烯酸基粘合剂。这种粘合剂可能是特别有益的，因为它表现出相对较高的防潮性、耐溶剂性和耐化学性。此外，它可承受相当剧烈的温度变化。这样，可实现医用胶带、膜和覆盖片之间的牢固连接，这种连接可经受住装置的生命周期。
此外，第一覆盖片和第二覆盖片中的每一者优选由玻璃和/或聚碳酸酯(PC)组成或构成。与其它材料(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))的覆盖片相比，玻璃和PC覆盖片允许特别合适的粘合。更具体地说，当使用具有丙烯酸基粘合剂的医用胶带时，丙烯酸对玻璃的相对高的粘合性以及由此可实现的胶带和覆盖片之间的牢固连接是高的。然而，对PDMS的粘合强度不够。
此外，含有丙烯酸基粘合剂的第一医用胶带和第二医用胶带均可与聚硅氧烷基粘合剂进行层压。这种层压粘合剂允许增加对由不同于玻璃或PC的材料制成的覆盖片的粘合强度，例如特别是对由PDMS制成的覆盖片的粘合强度。
优选地，第一医用胶带包括多个第一开口部分，第二医用胶带包括多个第二开口部分。因此，在该实施例中，该装置具有多个第一通道和多个第二通道。
开口部分包括细长形式的主要部分，例如，为基本上长方体，由于医用胶带较薄，所述基本上长方体因此可视为狭槽形或长方形/矩形。在三维空间中，从侧视图看，开口部分的主要部分实际上是高度相对较小的细长棱柱或直角棱柱的形式。医用胶带的开口部分的形状对应于流体通道的形状，因为开口部分形成为流体通道。
优选地，第一流体通道包括：矩形棱柱/长方体形状的第一主要部分、与第一入口连接的第一输入部分和与第一出口连接的第一输出部分，优选地，第二流体通道包括：矩形棱柱/长方体形状的第二主要部分、与第二入口连接的第二输入部分和与第二出口连接的输出部分。通常，流体通道的形状由医用胶带的开口限定。
具体而言，主要部分，即第一或第二流体通道，用于孵育或培养细胞，输入和输出部分用于在主要部分内产生流体。入口和出口可安装在第一覆盖片的顶侧。可通过入口向开口的主要部分(即流体通道)供应培养基，并在出口部分离开开口。
优选地，从垂直于医用胶带的角度看，第一输入部分不与第二输入部分重叠，从垂直于医用胶带的角度看，第二输入部分不与第一主要部分重叠。优选地，从垂直于医用胶带的角度看，第一输出部分不与第二输出部分重叠，并且从垂直于医用胶带的角度看，第二输出部分不与第一主要部分重叠。因此，第一和第二入口可布置在同一覆盖片上，并分别向第一和第二输入部分供应培养基。
优选地，该装置包括布置在第一流体通道中的第一电极和布置在第二流体通道中的第二电极。优选地，该装置还包括测量单元，该测量单元配置为测量第一和第二电极之间的电势，从而确定模拟的血迷路屏障的完整性。该完整性可用于确定模拟的血迷路屏障的完整性，其代表人耳的血迷路屏障的渗透性。这在使用血迷路屏障模型检查治疗剂经由人耳的血迷路屏障的渗透时特别有意义。
替代地或附加地，该装置还可包括检测单元，其配置为检测治疗剂通过血迷路屏障模型的进入，例如，治疗剂穿透模型需要多长时间，治疗剂穿透模型的速度以及治疗剂可穿透血迷路屏障模型的量。因此，可检查治疗剂通过人耳的血迷路屏障的递送。
优选地，所述装置包括控制单元或与控制单元连接，所述控制单元配置成能控制施加至所述装置的压力，用于使用所述血迷路屏障模型来模拟疾病，例如炎症和梅尼埃病。在这种情况下，外部压力可施加到装置的覆盖片上，从而模拟疾病下的人体血迷路屏障。这使得能够使用模拟的血迷路屏障代替人或动物的血迷路屏障进行医学诊断、分析和实验，即模拟的血迷路屏障模仿人或动物的血迷路屏障。换句话说，装置中的细胞可如上所述进行设置。当细胞布置或附着在流体通道中时，可用含有各种炎症因子的培养基处理细胞，从而导致屏障完整性减弱。大约三天后，可在细胞上施加恒定的压力来产生额外的转向，这模拟了水肿的情况。
第一和第二流体通道可具有约16毫米(mm)至约21mm的长度和约0.6mm至约1.5mm的宽度。这种尺寸的流体通道允许使用相对较少数量的细胞，这允许应用更广泛的不同工艺和测试更多药物化合物。此外，它允许细胞在相对短的时间内增殖，并在这方面相对早地达到汇合/积聚，以开始BLB的验证，这可缩短新治疗的筛选和优化时间。
第一和第二流体通道内的压力可与人耳迷路内的压力或多或少地对应。为此，该装置可包括泵，例如蠕动泵，以允许足够精确地调节压力。
另一方面，本发明提供一种制造人耳的血迷路屏障模型的方法。该方法包括以下步骤：利用版图掩模分别/对应地在第一医用胶带和第二医用胶带中切割出长方体形状的至少一个第一开口和至少一个第二开口；利用版图掩模对膜进行图案化；利用版图掩模准备第一覆盖片和第二覆盖片；组装该装置；以及对该装置进行固化处理并对该装置进行消毒。组装步骤包括以下步骤：(i)将第一覆盖片与具有所述至少一个第一开口部分的第一医用胶带粘合，从而形成第一流体通道；(ii)将第二覆盖片与具有所述至少一个第二开口部分的第二医用胶带粘合，从而形成第二流体通道；(iii)将膜与第一医用胶带和第二医用胶带粘合。
版图掩模优选包括第一和第二医用胶带、薄膜以及第一和第二覆盖片的电子版图。可使用计算机来准备版图掩模。电子版图是使用指定的文本格式定义的数据集，或者它们可以是诸如绘图的视觉呈现。用于准备诸如医用胶带和覆盖片以及膜的部件的机器可理解电子版图的格式，并在各个部件上执行制造过程。
每个开口可包括细长长方体形状的主要部分、与入口流体连通的入口部分和与出口流体连通的出口部分。针对每个开口的入口和出口可安装在第一覆盖片上。特别地，开口可具有约16mm至约21mm的长度和约0.6mm至约1.5mm的宽度。
优选地，使用激光对膜进行图案化。为了多层微流体带装置或芯片的后续组装，以及为了不阻碍流向底部隔室的流动，聚碳酸酯膜可能需要被图案化。对膜进行图案化所需的小尺寸特征尺寸使得切割绘图仪的使用变得不可企及。因此，优选用激光切割机对膜进行图案化。
优选地，该方法包括分别在第一和第二流体通道中灌注第一和第二培养基的步骤。第一培养基包含内皮祖细胞，第二培养基包含周细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞的祖细胞。
有利地，内皮祖细胞是人类内皮祖细胞。因此，第一培养基可包含内皮基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、抗坏血酸、氢化可的松、和青霉素/链霉素。
此外，有利地，周细胞的祖细胞是人类周细胞的祖细胞。因此，第二培养基可包含Dulbecco氏改良eagle氏培养基、胎牛血清、周细胞生长补充物、色素上皮衍生因子、和青霉素/链霉素溶液。
更进一步，有利地，血管周巨噬细胞型黑素细胞为人类血管周巨噬细胞型黑素细胞。因此，第二培养基可包含加有氯化钙的培养基254CF、胎牛血清、人黑素细胞生长补充剂、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、和庆大霉素/两性霉素B。
优选地，该方法中使用的第一医用胶带和第二医用胶带均包含丙烯酸基粘合剂。此外，第一覆盖片和第二覆盖片中的每一者优选由玻璃和/或聚碳酸酯构成。
优选地，套件中涉及的用于模拟人耳血迷路屏障的装置为上述或下述根据本发明的装置或其优选实施例。
该装置能够生成位于内耳耳蜗血管纹中的血迷路屏障的3D培养物模型。它们的功能是省略正常听觉功能所需的营养和离子等物质，耳蜗电位的稳态，以及药物和耳毒性物质的稳态。
总的来说，该装置为研究血迷路屏障对听力损失背后的生理和病理生理机制的特定作用提供了工具。这项技术也为减少动物试验提供了一个有前途的选择。由该装置创建的模型血迷路屏障模型可用于各种应用，例如：研究血迷路屏障完整性和带传输；使用从人耳蜗产生的屏障成分(新颖)来捕获血迷路屏障特性；使用经典且广为接受的验证模型，如跨上皮或跨内皮电阻，TEER；改善血迷路屏障特性表征的渗透性测量：识别营养成分、有害成分以及治疗成分等(即任何伴随全身循环而来的物质)穿过血迷路屏障的进入机制；来自营养物或类似物的有害化合物穿过血迷路屏障的选择性递送；以及在可模拟炎症和梅尼埃病的第二个血迷路屏障模型中发现屏障成分细胞如何在炎症和梅尼埃病中相互作用。最终，该装置可建立稳定的芯片模型，以为患者发现新的疗法，并在内耳研究领域取得突破性创新。选择性递送可避免止血剂在化疗期间进入耳蜗，因为止血剂在短时间内会导致听力损失。
根据本发明，该装置可由低成本材料制成。根据本发明的微制造策略使用低成本的材料和方法，例如生物医学胶带和切割绘图仪，用于快速、经济和高产量的片上器官制造。相比之下，传统的微制造方法，如光刻和软光刻，决定了这些系统的制造需要稍微次优的材料、冗长的制造过程和对高资源微制造环境的需求。
根据本发明制造的装置相对便宜，但输出信息丰富得多。
此外，本发明可在芯片上建立血迷路屏障的3D培养物，所述芯片首先源自小鼠，然后源自人耳蜗。
在常规方法中，为了研究生理条件下屏障功能的分子机制，可使用大量动物，并且需要进行耗时的实验。相比之下，根据本发明的装置提供了一种芯片上器官系统，该系统提供了平台，该平台(i)需要少量的细胞，(ii)提供快速的结果，以及(iii)更加准确和生理相关。总的来说，当前的体外平台可完善体内实验，减少研究中使用的动物数量。除了用于药理学研究的体外仪器之外，所提出的血迷路屏障的微流体细胞培养系统可用于回答关于内耳中退行性疾病机制的发展和进展的基本问题。它不仅是在相关领域进行基础研究的实验室的一个有价值的工具，而且对于更广泛的药物发现和毒性研究也是有用的。
附图说明
在下文中，通过示例性实施例并参考附图更详细地描述根据本发明的装置和方法，在附图中：
图1示出了根据本发明的装置的示例性实施例；
图2示出了根据本发明的装置的分解图；
图3示出了根据本发明的第一和第二医用胶带；
图4示出了根据本发明的具有多个流体通道的装置的分解图；
图5示出了根据本发明的装置的多个流体通道；
图6示出了使用由根据本发明的装置模拟的血迷路对炎症和梅尼埃病的模拟；
图7示出了根据本发明的示例性制造方法；和
图8示出了来自微流体装置的总RNA或蛋白质裂解物的BLB网络和细胞提取和纯化的示意图，其中膜中央区域包含BLB细胞的网络。
具体实施方式
在以下描述中，某些术语出于方便的原因使用且并非旨在限制本发明。术语“右”、“左”、“上”、“下”、“下方”和“上方”指的是图中的方向。所述术语包括清楚地提到的用语以及它们的派生词和具有相似含义的用语。此外，可能使用诸如“在...之下”、“下方”、“下部”、“上方”、“上部”、“近侧”、“远侧”等空间相对术语以描述如图所示的一个元件或特征结构与另一元件或特征结构的关系。这些空间相对术语旨在除图中所示的位置和取向以外还涵盖使用或操作中的装置的不同位置和取向。例如，如果将图中的装置翻转，则被描述为在其它元件或特征结构“下方”或“在…之下”的元件将在其它元件或特征结构“上方”或“上面”。因此，示例性术语“下方”可以涵盖上方和下方的位置和取向两者。所述装置可以其它方式取向(旋转90度或处于其它取向)，并且文中使用的空间相对描述得以相应地阐释。同样，对于沿着和围绕各种轴线的运动的描述包括各种特殊的装置位置和取向。
为了避免对附图以及对各个方面和示例性实施例的说明的重复，应当理解的是，许多特征是多个方面和实施例共有的。从说明或附图省略一个方面并不意味着该方面从结合了该方面的实施例缺失。相反，该方面可以为了清楚起见而被省略并且避免了冗长的说明。在此上下文中，以下适用于本说明书的其余部分：如果为了使附图清楚，附图包含未在说明书的直接相关部分中阐述的附图标记，则可在之前或之后的说明章节中参照该附图标记。此外，为了清晰起见，如果在一个附图中未对一个部件的所有特征设置附图标记，则参照示出同一部件的其它附图。两个或以上附图中的相似标号表示相同或相似的元件。
图1示出了根据本发明的装置1的示例性实施例，其中装置1包括第一流体通道10、第二流体通道20和将第一流体通道和第二流体通道分隔开的膜。
第一医用胶带11从第一流体通道10的左侧和右侧形成壁。由玻璃或聚合物制成的第一覆盖片12从顶部覆盖第一流体通道。膜30用作第一流体通道的基底。换句话说，第一流体通道10由覆盖片12和第一医用胶带11以及膜30围成。入口17与第一流体通道10连接，第一培养基可通过该入口供应。
类似地，第二医用胶带21从第二流体通道20的左侧和右侧形成壁。由玻璃或聚合物制成的第二覆盖片22从底部覆盖第一流体通道。膜30用作第二流体通道20的顶部。换句话说，第二流体通道20由覆盖片22和第二医用胶带21以及膜30围成。入口27与第二流体通道20连接，第二培养基可通过该入口供应。
在一个示例性实施例中，该装置可包括第一和第二培养基。在另一个示例性实施例中，该装置可包括第一和第二培养基以及血迷路屏障模型，该血迷路屏障模型包括附着至膜30在第一流体通道10中的腔侧的内皮细胞15、附着至膜30在第二流体通道20中的远腔侧的周细胞25和在第二流体通道20中的血管周巨噬细胞型黑素细胞26。
膜30具有在第一流体通道10中的腔侧。换句话说，膜30的上侧是腔侧。内皮细胞15可在第一流体通道10中孵育，特别地，内皮细胞15附着在膜30的腔侧。周细胞25可在第二流体通道20中孵育，特别地，周细胞25附着在膜30的远腔侧。此外，血管周巨噬细胞型黑素细胞26在第二流体通道20中孵育。
因此，由内皮细胞15、周细胞25和血管周巨噬细胞型黑素细胞26形成血迷路屏障模型。该血迷路屏障模型在该装置中培养，并可用于医学诊断和实验，包括疾病建模或向耳蜗和前庭系统递送治疗剂的测试。
内皮细胞15、周细胞25和血管周巨噬细胞型黑素细胞26的祖细胞可取自尸检衍生的人颞骨或小鼠血迷路屏障细胞。
使用细胞分选和抗体标记，可选择纯单细胞类型培养物。此外，血迷路屏障细胞可在多孔膜细胞培养插入物上共培养，并且它们表达紧密连接的标记。特别是，内皮细胞生长在多孔膜的顶面上，血管周巨噬细胞型黑素细胞生长在多孔膜的底面上。在体外生长5天后，细胞可用特异性标记物染色，特异性标记物例如是用于内皮细胞的血管性血友病因子vWF、用于周细胞的血小板衍生生长因子β、PDGFRβ、以及用于血管周巨噬细胞型黑素细胞的F4/80。像这样，如果细胞确实是预期的细胞类型，则可对它们进行识别。血管周巨噬细胞型黑素细胞穿过多孔膜的孔并与内皮细胞形成连接。可进行实时定量聚合酶链反应(PCR或qPCR)来研究共培养的内皮细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞中紧密连接基因的表达。qPCR结果可指示细胞类型特异性基因的表达。这些细胞表达了在血迷路屏障模型中发现的紧密连接的大部分特异性基因。这些结果表明，共培养的细胞可建立一种具有典型血迷路屏障特性的天然屏障。
如上所述，该装置包括布置在第一流体通道中的第一电极和布置在第二流体通道中的第二电极(图1中未示出)。这些电极可用于测量第一和第二电极之间的电势，从而确定模拟的血迷路屏障的渗透性完整性，其代表人耳的血迷路屏障的渗透性。
下文中，本发明仅集中描述了一个电极，用于解释电势测量。TEER是一种广泛接受的定量技术，用于测量内皮和上皮单层细胞培养模型中紧密连接动力学的完整性。为了成功地治疗受生理屏障保护的器官的某些疾病，有必要开发能够将治疗药物运送穿过这些屏障以到达目标组织的方法。BLB功能和屏障的质量依赖于不同BLB细胞类型之间的协同作用。在具有集成电极的BLB芯片中，屏障效率将由TEER评估。根据本发明的具有集成电极的装置能够实现对TEER的实时、非侵入式监测。为了在实验过程中实时收集数据，EVOM2将通过数据采集装置连接到PC机上的LabView。
可使用4点阻抗测量在100kHz至10Hz的频率范围内进行TEER测量，并在接种后第1、4、6和12天记录。在BLB实验过程中，每天测量TEER两次，以监测细胞融合和紧密连接的发展。将确定每个时间点的阻抗和电容值。为了计算TEER，从每个装置的电阻中减去没有细胞时芯片的测量值，然后将这些值乘以内皮单层的与下部通道重叠的表面积。从每个时间点的总电阻RC中减去背景电阻Rb，并对面积进行归一化，如下式所示，以欧姆平方厘米(omcm2)为单位给出TEER值：TEER＝(RC–Rb)。
图2示出了本发明装置1的分解图。该装置包括第一入口17、第一出口18、第二入口27和第二出口28，用于将培养基输送到流体通道10、20中。入口17和出口18、28可安装在第一覆盖片12上。
第一医用胶带11具有至少一个第一开口10。第一医用胶带是双面胶。因此，它可在一侧粘附膜30，在另一侧粘附第一覆盖片12。当第一医用胶带11粘附到第一覆盖片的底侧和膜30的顶侧时，开口10形成为第一流体通道10。
类似地，第二医用胶带21具有至少一个第二开口20。第二医用胶带是双面胶。因此，它可在一侧粘附膜30，在另一侧粘附第二覆盖片22。当第二医用胶带21粘附到第二覆盖片22的顶侧和膜30的底侧时，开口20形成为第二流体通道20。
覆盖片12、22、医用胶带11、21和膜30上设有多个孔，用于培养基穿过。
当装置的部件组装在一起时，如前所述，第一和第二医用胶带11、21的开口10、20分别形成为第一和第二流体通道10、20。特别地，流体即第一培养基可从第一入口17通过第一覆盖片12的角上的多个孔之一灌注到第一流体通道10中，并在第一出口18离开，从而培养内皮细胞15。另一种流体，即第二培养基，可从第二入口27通过第一覆盖片12和第一医用胶带以及膜30上的多个孔之一灌注到第二流体通道20中，并最终在第二出口28离开，从而培养周细胞25和血管周巨噬细胞型黑素细胞26。
图3更详细地示出了根据本发明的第一和第二医用胶带。特别地，第一医用胶带11具有从顶视图看呈矩形的主要部分10，以及可连接到第一入口17的第一输入端口10a和可连接到第一出口18的第一输出部分10b。类似地，第二医用胶带11具有从顶视图看呈矩形的主要部分20，以及可连接到第二入口27的第二输入端口20a和可连接到第二出口28的第二输出部分20b。
如图所示，第一输入部分17和第二输入部分27向不同方向弯曲，即从俯视图看，相对于主要部分的纵向中线具有不同的角度。这使得第一和第二入口能够布置在同一覆盖片上，即第一覆盖片12上。如上所述，第一培养基穿过第一片12、第一医用胶带11和膜30的孔进入第一流体通道10。第二培养基到达第二流体通道的路程稍长，即它穿过第一片12、第一医用胶带11和膜30的孔进入第二流体通道20。类似的构造适用于第一开口10的第一输出部分10b和第二开口20的第二输出部分20b。图3的底部图示出了层叠在一起的第一和第二医用胶带11、21的俯视图。
图4示出了根据本发明的具有多个流体通道的装置的分解图，特别是八个第一流体通道和八个第二流体通道。类似于图2所示，装置1包括多个第一入口17、多个第一出口18、多个第二入口27和多个第二出口28，用于将培养基输送到多个流体通道10、20中。入口17、27和出口18、28可安装在第一覆盖片12上。
第一医用胶带11具有多个第一开口10。第一医用胶带是双面胶。因此，它可在一侧粘附膜30，在另一侧粘附第一覆盖片12。当第一医用胶带11粘附到第一覆盖片的底侧和膜30的顶侧时，这些开口10形成为所述多个第一流体通道10。
类似地，第二医用胶带21具有多个第二开口20。第二医用胶带是双面胶。因此，它可在一侧粘附膜30，在另一侧粘附第二覆盖片22。当第二医用胶带21粘附到第二覆盖片22的顶侧和膜30的底侧时，这些开口20形成为所述多个第二流体通道20。
多个孔13、33设置在覆盖片12、22(未示出孔)、第一医用胶带11(以13示出的孔)、第二医用胶带21(未示出孔)和膜30(以33示出的孔)上，用于供培养基穿过。
图5示出了具有多个第一和第二流体通道10、20的装置1，每个流体通道均具有输入部分和输出部分。在这种配置中，该装置可包括多个血迷路屏障模型，它们中的每一个都可用于医学诊断和实验。
使用该装置培养和孵育血迷路屏障模型的过程如下：
可以为小鼠祖细胞的祖细胞最初被置于流体通道中。具体地，祖内皮细胞附着在膜的腔侧，祖周细胞附着在膜的远腔侧，祖血管周巨噬细胞型黑素细胞布置在第二流体通道中。在附着到膜的表面上并布置在流体通道中之后，流体通道可连接到将输送培养基的泵。
对于宿主细胞，该装置应是可灭菌的、生物相容的，并且在施加的流动下和在约37℃的标准细胞培养温度下长时间稳定。因此，可对用不同类型的胶带构建的装置进行流通/通流实验和光学评估。为了评估所制造的装置的稳定性和泄漏，以便以后在细胞分析中使用，在用水进行流通实验之前，流体通道可暴露于约70％的乙醇中10分钟。
然后可将内皮细胞以1×107细胞每毫升(ml-1)的密度接种到第一通道的中心，并孵育6小时，以使细胞粘附到胶原包被的聚碳酸酯膜上。在将周细胞接种到下层的中心通道中之前，第二流体通道将在37℃下用50μg ml-1的纤连蛋白包被1小时，同时该装置可颠倒放置。然后将悬浮在100μl的Matrigel溶液中的1×106的血管周巨噬细胞型黑素细胞接种到培养周细胞的同一通道中。
Matrigel的最终浓度可计算为5mg ml-1。通过在约37℃下孵育约30分钟使Matrigel在通道中凝胶化后，可将细胞培养基填充到两侧通道中以避免凝胶变干。装置中内皮细胞和周细胞之间的最终细胞数比率可以是1.5:1，内皮细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞之间的比率可以是约2:1，这可针对PVMs进行优化以覆盖内皮的约99％的血管周表面。
在微流体装置中培养24小时以稳定细胞后，可将第一通道连接至具有8个或16个通道的蠕动泵，流速为16μL min-1，以给予细胞4达因每立方厘米(dyne cm-2)的剪切应力，这对应于耳蜗中的剪切应力水平。该泵通过额外的管连接到通道出口，并且位置更高的注射器储器通过额外的管连接到入口。
适用于培养小鼠细胞的培养基可使用如下两种基础培养基进行合成：
三种培养基，即EC培养基、PC培养基和PVM培养基，首先用于在单一培养中培养细胞。当使用根据本发明的微流体装置时，EC培养基将被添加到第一通道中。大约24小时后，当EC附着到膜上时，PC与PC培养基一起可被插入/加入并保持在第二通道中。大约24小时后，基质或水凝胶中的PVM也可加入到第二通道中。然后，可将约50:50比例的PC和VM培养基加入到第二通道中。换句话说，第一培养基可以是EC培养基，第二培养基可以是包含约50％PC培养基和约50％PVM培养基的混合物。
图6示出了使用根据本发明的装置模拟的血迷路对炎症和梅尼埃病的模拟。特别地，压力40可控制地施加到装置上。因此，装置的膜30变形，从而在装置中培养的血迷路屏障模型15、25、26变形，并且可模拟疾病下的血迷路屏障。
图7示出了根据本发明的示例性制造方法。首先，可使用计算机定义电子版图掩模，S1，其中电子版图掩模可定义为不同部件即覆盖片、膜和医用胶带的图。该步骤通常需要大约10到40分钟。其次，医用胶带上的开口利用电子版图掩模由计算机控制的机器切割，S2，这需要大约10分钟。第三，利用电子版图掩模，用激光机对膜进行图案化，S3，这需要大约10到15分钟。然后，将准备好的部件相互层叠，S4，这大约需要10到16分钟。最后，该装置被固化和消毒，S5，这需要大约20分钟到2小时。
图8示出了来自微流体装置的总RNA或蛋白质裂解物的BLB网络和细胞提取和纯化的示意图。包括细胞的BLB模型附着在装置的膜上。可从装置中取出膜，然后进行qPCR试验。如上所述，qPCR结果表明了细胞类型特异性基因的表达，从而可通过qPCR确定BLB模型的性质和特征。
本说明书和图示本发明的方面和实施例的附图不应当被视为限制了限定受保护的发明的权利要求。换言之，虽然已在附图和前面的说明中详细示出和描述了本发明，但这种图示和描述应被看作说明性的或示例性的而不是限制性的。可做出各种机械的、组成的、结构的、电气的和操作上的变更而不脱离此说明书和权利要求书的精神和范围。在一些情形中，未详细示出公知的电路、结构和技术以免使本发明变得难以理解。因此，应理解的是，本领域普通技术人员可以在以下权利要求的范围和精神内作出变更和修改。特别地，本发明涵盖具有上文和下文描述的不同实施例的特征的任意组合的其它实施例。
本公开还涵盖附图所示的所有其它特征，尽管它们在前面或下面的描述中可能未被个别地描述。此外，可从本发明的主题或从所公开的主题放弃附图和说明书中描述的实施例的单一替代方案及其特征的单一替代方案。本公开包括由权利要求或示例性实施例中定义的特征组成的主题以及包含所述特征的主题。
此外，在权利要求书中，用语“包括”不排除其它要素或步骤，并且不定冠词“一”或“一种”不排除多个。单个单元或步骤可实现在权利要求中叙述的多个特征的功能。在相互不同的从属权利要求中叙述特定措施的单纯事实并不表示这些措施的结合不能有利地使用。与定语或值相结合的用语“基本上/大致”、“约”、“大约”等特别是还分别明确地定义该定语或明确地定义该值。给定数值或范围的上下文中的用语“约”指的是例如给定值或范围的20％以内、10％以内、5％以内或2％以内的值或范围。被描述为联接的或连接的构件可电气地或机械地直接联接，或它们可经由一个或多个中间构件间接地联接。权利要求中的任何附图标记均不应被解释为限制保护范围。

Claims (27)

1.一种用于模拟人耳的血迷路屏障的装置(1)，包括：
第一流体通道(10)；
第二流体通道(20)；以及
将所述第一流体通道和所述第二流体通道(10，20)分隔开的膜(30)，
其中所述膜(30)具有在所述第一流体通道(10)中的腔侧和在所述第二流体通道(20)中的远腔侧，
其中内皮细胞(15)附着至所述膜(30)的腔侧，
其中周细胞(25)附着至所述膜(30)的远腔侧，
并且其中血管周巨噬细胞型黑素细胞(26)被置于所述第二流体通道(20)中。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述膜具有允许化学物质在所述第一流体通道和所述第二流体通道之间传输的渗透性。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述膜的腔侧涂覆有胶原蛋白和/或所述膜的远腔侧涂覆有纤维蛋白原。
4.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括：配置成能将第一培养基灌注通过所述第一流体通道的第一入口和第一出口；以及配置成能将第二培养基灌注通过所述第二流体通道的第二入口和第二出口。
5.根据权利要求4所述的装置，包括所述第一培养基，其中所述第一培养基包含内皮基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、抗坏血酸、氢化可的松、和青霉素/链霉素。
6.根据权利要求4或5所述的装置，包括所述第二培养基，其中所述第二培养基包含Dulbecco氏改良eagle氏培养基、胎牛血清、周细胞生长补充剂、色素上皮衍生因子、和青霉素/链霉素溶液。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的装置，包括所述第二培养基，其中所述第二培养基包含加有氯化钙的培养基254CF、胎牛血清、人黑素细胞生长补充剂、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、和庆大霉素/两性霉素B。
8.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括：
第一覆盖片和第二覆盖片；
具有至少一个第一开口部分的第一医用胶带，其中所述第一医用胶带粘附在所述第一覆盖片上，从而形成所述第一流体通道；以及
具有至少一个第二开口部分的第二医用胶带，其中所述第二医用胶带粘附在所述第二覆盖片上，从而形成所述第二流体通道。
9.根据权利要求8所述的装置，其中，所述第一医用胶带和所述第二医用胶带中的每一者均包含丙烯酸基粘合剂。
10.根据权利要求8或9所述的装置，其中，所述第一覆盖片和所述第二覆盖片中的每一者均由玻璃和/或聚碳酸酯构成。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的装置，
其中，所述第一流体通道包括细长形的第一主要部分、和与所述第一入口连接的第一输入部分、以及与所述第一出口连接的第一输出部分，并且
其中，所述第二流体通道包括细长形的第二主要部分、和与所述第二入口连接的第二输入部分、以及与所述第二出口连接的输出部分。
12.根据权利要求11所述的装置，
其中，在垂直于医用胶带的方向上，所述第一输入部分与所述第二输入部分不重叠，并且在垂直于医用胶带的方向上，所述第二输入部分与所述第一主要部分不重叠，并且
其中，在垂直于医用胶带的方向上，所述第一输出部分与所述第二输出部分不重叠，并且在垂直于医用胶带的方向上，所述第二输出部分与所述第一主要部分不重叠。
13.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括布置在所述第一流体通道中的第一电极和位于所述第二流体通道中的第二电极。
14.根据权利要求13所述的装置，包括测量单元，所述测量单元配置成能测量所述第一电极和所述第二电极之间的电势，从而确定所模拟的血迷路屏障的渗透性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括控制单元，所述控制单元配置成能控制施加至所述装置的压力，以便用于使用由所述装置模拟的血迷路屏障来模仿疾病如炎症和梅尼埃病。
16.一种套件，包括：
用于模拟人耳的血迷路屏障的装置；
第一容器；以及
容器布置结构，
其中所述装置具有第一流体通道(10)和第二流体通道(20)以及膜(30)，所述膜将所述第一流体通道和所述第二流体通道(10，20)分隔开，使得所述膜(30)具有在所述第一流体通道(10)中的腔侧和在所述第二流体通道(20)中的远腔侧，
所述第一容器包括第一培养基和内皮细胞(15)，并且
所述容器布置结构包括第二培养基、周细胞(25)和血管周巨噬细胞型黑素细胞(26)。
17.根据权利要求16所述的套件，其中，所述容器布置结构包括第二容器，所述第二容器包含第二培养基、周细胞(25)和血管周巨噬细胞型黑素细胞(26)。
18.根据权利要求16所述的套件，其中，所述容器布置结构包括：包含第二培养基和周细胞(25)的第二容器；以及包含第三培养基和血管周巨噬细胞型黑素细胞(26)的第三容器。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的套件，其中，所述第一培养基包括内皮基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、抗坏血酸、氢化可的松、和青霉素/链霉素。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的套件，其中，所述第二培养基包括Dulbecco氏改良eagle氏培养基、胎牛血清、周细胞生长补充剂、色素上皮衍生因子、和青霉素/链霉素溶液。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的套件，其中，所述第二培养基包括加有氯化钙的培养基254CF、胎牛血清、人黑素细胞生长补充剂、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、和庆大霉素/两性霉素B。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的套件，其中，用于模拟人耳的血迷路屏障的装置是根据权利要求1至13中任一项所述的装置。
23.一种制造用于模拟人耳的血迷路屏障的装置的方法，该方法包括以下步骤：
利用版图掩模在第一医用胶带中切割出至少一个第一开口并且相应地在第二医用胶带中切割出至少一个第二开口，其中所述至少一个第一开口和所述至少一个第二开口中的每一者均包括输入部分和输出部分以及呈细长形长方体形式的主要部分；
利用所述版图掩模对膜进行图案化；
利用所述版图掩模准备第一覆盖片和第二覆盖片；
通过以下方式组装所述装置：
将所述第一覆盖片与具有所述至少一个第一开口部分的所述第一医用胶带粘合，从而形成第一流体通道，
将所述第二覆盖片与具有所述至少一个第二开口部分的所述第二医用胶带粘合，从而形成第二流体通道，
将所述膜与所述第一医用胶带和所述第二医用胶带粘合；以及
对所述装置进行固化处理并对所述装置进行消毒。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述版图掩模包括用于所述第一医用胶带和所述第二医用胶带、所述膜、以及所述第一覆盖片和所述第二覆盖片的电子版图，其中所述膜优选使用激光进行图案化。
25.根据权利要求21或22所述的方法，包括：
在所述第一流体通道中灌注第一培养基并且相应地在所述第二流体通道中灌注第二培养基，
其中所述第一培养基包含内皮祖细胞，并且所述第二培养基包含周细胞祖细胞和血管周巨噬细胞型黑素细胞祖细胞。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，所述第一医用胶带和所述第二医用胶带中的每一者均包含丙烯酸基粘合剂。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，所述第一覆盖片和所述第二覆盖片中的每一者均由玻璃和/或聚碳酸酯构成。
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