JP5145338B2 - イミノシクリトールの調製のための化学酵素的方法 - Google Patents
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Description
本発明は、イミノシクリトールの調製のための化学酵素的方法に関する。合成された生成物は、栄養補助食品および食品産業用機能性原料、そして治療薬（例えば糖尿病治療における）として利用可能である。
ポリヒドロキシル化化合物、例えばオリゴ糖、複合糖質、およびその脂質およびタンパク質複合体は、細胞接着、ウイルス感染、器官形成における細胞分化、および転移といった生物学的認識の生化学的方法において非常に重要な分子である（Koeller, K.M., Wong, C. H., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 835）。よって、それらの合成または分解に関与する酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、およびグリコシダーゼはそれぞれ、阻害または活性化標的をなし（Kolter, T., Wendeler, M., Chembiochem 4 (2003) 260による）、それは、これらが代謝異常または疾患、例えばＩＩ型糖尿病、ＢおよびＣ型肝炎、ゴーシェ病、ファブリ病、嚢胞性線維症、結腸癌、またはＨＩＶを含むウイルス感染に関与するためである（Asano, N., J. Enzyme Inhib. 15 (2000) 215；Asano, N., Glycobiology 13 (2003) 93R；Fiaux, H., Popowycz, F., Favre, S., Schutz, C., Vogel, P., Gerber-Lemaire, S., Juillerat-Jeanneret, L., J. Med. Chem. 48 (2005) 4237）。
グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼの阻害剤であるポリヒドロキシル化化合物のうち、代表的な種類のイミノシクリトールは、特にピロリジン、ピペリジン、インドリジジン、ピロリジジン、ノルトロパン、および七員ポリヒドロキシル化イミノシクリトールであり、これらのいくつかはグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤である（Asano, N., J. Enzyme Inhib. 15 (2000) 215; Asano, N., Glycobiology 13 (2003) 93R；Lillelunh, V. H., Jensen, H. H., Liang, X., Bols, M., Chem. Rev. 102 (2002) 515；Compain, P., Martin, O. R., Curr. Top. Med. Chem. 3 (2003) 541；Mehta, G., Lakshminath, S., Tetrahedron Lett. 43 (2002) 331；Moris-Varas, F., Qian, X. -H., Wong, C. -H., J. Am. Chem. Soc. 118 10 (1996) 7647；Fuentes, J., Olano, D., Pradera, M. A., Tetrahedron Lett. 40 (1999) 4063；Li, H. Q., Bleriot, Y., Chantereau, C., Mallet, J. M., Sollogoub, M., Zhang, Y. M., Rodriguez-Garcia, E., Vogel, P., Jimenez-Barbero, J., Sinay, P., Org. Biomol. Chem. 2 (2004) 1492；Lin, C. C., Pan, Y. S., Patkar, L. N., Lin, H. M., Tzou, D. L. M., Subramanian, T., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 3259；Godin, G., Garnier, E., Compain, P., Martin, O.R., Ikeda, K., Asano, N., Tetrahedron Lett. 45 (2004) 579）。
ミグリトールおよびミグルスタットといったいくつかの誘導体は、ＩＩ型糖尿病の治療用に市販されている薬剤である（Platt, F. M., Butters, T. D., Drugs 63 (2003) 2435）。
いくつかの天然のイミノシクリトールまたはそれらを含有する植物抽出物もまた、食品産業における機能性原料または栄養補助食品として記載されている。このように、ＵＳ２００１００１８０９０は、食品または飲料に取り入れられうるカロリー低減剤としての１-デオキシノジリマイシンまたはその類似体の使用を開示；ＵＳ２００６０２２２７２０は、ムラサキムカシヨモギ（Vernonia cinerea）およびクワの水性溶媒抽出物を含有する食欲抑制剤を開示；ＷＯ２００４０３７００１は、血糖値を管理するためのサッカリド含有食品へのクワ抽出物の添加を開示している。
これまでのところ、開示された化学酵素的イミノシクリトール合成スキームは、アルデヒドとケトンの立体選択的アルドール反応を触媒することのできる酵素であるアルドラーゼの使用に基づく（Von der Osten, C.H., Sinskey, A. J., Barbas, C. F., III, Pederson, R. L., Wang, Y. F., Wong, C. H., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924；Romero, A., Wong, C. H., J. Org. Chem. 65 (2000) 8264；Look, G. C., Fotsch, C. H., Wong, C. H., Acc. Chem. Res. 26 (1993) 182；Machajewskif, T. D., Wong, C. H., Angew. Chem. Int. Ed. 39 (2000) 1353；特許ＵＳ００５３２９０５２Ａ）。周知のアルドラーゼのうち、以下の４つの理由からジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）依存アルドラーゼが注目を集めている：
１）いくつかが商業的に入手可能であるか、修飾大腸菌からの調製が比較的容易であることによる、利用可能性；
２）高い立体選択性；
３）受容体アルデヒドに対する幅広い構造的耐性；
４）立体性。
１）いくつかが商業的に入手可能であるか、修飾大腸菌からの調製が比較的容易であることによる、利用可能性；
２）高い立体選択性；
３）受容体アルデヒドに対する幅広い構造的耐性；
４）立体性。
ＤＨＡＰ-依存アルドラーゼ（ＤＨＡＰ-アルドラーゼ）は、受容体アルデヒドでの可逆的ＤＨＡＰアルドール付加を触媒し、２の新しい立体中心を有するα，β-ジヒドロキシケトンを得る。特に興味深いことには、４つの立体補完的（stereocomplementary）ＤＨＡＰ-アルドラーゼ（図１）が周知である：Ｄ-フルクトース-１，６-二リン酸アルドラーゼ（ＦｒｕＡ）；Ｌ-ラムヌロース-１-リン酸アルドラーゼ（ＲｈｕＡ）；Ｌ-フルクトース-１-リン酸アルドラーゼ（ＦｕｃＡ）；およびＤ-タガトース１，６-二リン酸アルドラーゼ（ＴａｇＡ）。有利には、これらの生体触媒は、アルドール付加立体化学、試薬ではなく酵素に依存した新しく生成された立体中心の配置を制御する何らかの能力を有する。
ＤＨＡＰ-アルドラーゼを用いたイミノシクリトールの一般的な化学酵素的合成スキームを図２に示す。当該スキームの重要な段階は、ＤＨＡＰ-アルドラーゼにより触媒されたアミノアルデヒドまたはその合成等価体へのＤＨＡＰのアルドール付加である。この段階において、配置が酵素に依存する２つの立体中心が生成されるが、基質によっては酵素が選択性を喪失し、ジアステレオマー生成物を得る例も数多くある。後続の段階は、酸性ホスファターゼによるアルドール付加物のリン酸部分の加水分解である。最後に、通常、Ｃｂｚ除去およびイミノシクリトールへの転換が一段階で実行される。
ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）の調製は、当該合成の重要な段階である。Jung等（Jung, S. -H., Jeong, J. -H., Miller, P., Wong, C.-H., J. Org. Chem. 59 (1994) 7182）の開示によると、ジヒドロキシアセトンリン酸の化学合成は、５つの段階を通して実行され、全収率は約６０％である。
ＤＨＡＰの「ｉｎ ｓｉｔｕ（インサイチュー）」生成のための多酵素系は代替的なアプローチである。これらは、最終生成物の単離および精製を妨げうる反応混合物中の成分の存在および反応条件の非常に細かい調整を必要とする高度な方法である（Fessner, W. D., Sinerius, G., Angew. Chem. Int. Ed. 33 (1994) 209；Charmantray, F., El Blidi, L., Gefflaut, T., Hecquet, L., Bolte, J., Lemaire, M., J. Org. Chem. 69 (2004) 9310；Sanchez-Moreno, I., Francisco Garcia-Garcia, J., Bastida, A., Garcia Junceda, E., Chem. Commun. (2004) 1634）。
特許（ＵＳ００５３２９０５２Ａ）において、およびVon der Osten等によって開示（Von der Osten, C. H., Sinskey, A. J., Barbas, C. F., III, Pederson, R. L., Wang, Y. F., Wong, C. H., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924）されているように、酵素的アルドール付加のためのＤＨＡＰの代用としてヒ素塩類の存在下でジヒドロキシアセトンが使用される。方法は簡略化されるが、ヒ素塩類の使用は、それらの毒性、したがってそれらの環境的および健康的危険性のため適用できない。
既に開示されたイミノシクリトールの化学酵素的合成は、受容体アルデヒドから約８つの段階を使用する：その２つは酵素的段階である、ＤＨＡＰのアルデヒドへのアルドール付加、およびリン酸エステル加水分解であり；６つはＤＨＡＰ合成、および対応するイミノシクリトールの形成のための化学的段階である。多酵素系を用いて反応が行われる場合、さらに２つの酵素が必要となり、一つは重要な中間体であるＤＨＡＰの形成のためのもので、もう一つは酵素的リン酸化試薬の再生のためのものである。したがって、これらは段階が多いかまたは非常に高度で、よって産業上の利用可能性が限られた方策である。
本発明の目的は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）：
［上式中、
−Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、イソプロピル、イソブチル、２-メチルブチル、およびベンジルからなる群から独立して選択され；
−Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、イソブチル、イソプロピル、イソペンチル、２-メチルブチル、ベンジル、およびフェニルエチルからなる群から選択され；
−ｎは、０または１であり；
−式ＩのイミノシクリトールでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのイミノシクリトールの立体中心（＊）は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択される］
に相当するイミノシクリトールの調製のための酵素化学的方法であって、
ｉ）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）と受容体アミノアルデヒドとの間のＤ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ酵素（ＦＳＡ）により触媒されるアルドール付加工程を具備し、該アミノアルデヒドは、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩ：
［上式中、
−Ｒ１およびＲ２およびｎは、上に定義したとおりであり；
−式ＶでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置、および式ＶＩおよびＶＩＩの立体中心は、同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基を表す］
に相当し；
ｉｉ）金属触媒の存在下でＨ２を用いての工程（ｉ）で得られた付加物の分子内還元的アミノ化工程を具備し、該工程（ｉｉ）は、式Ｒ３-ＣＨＯ（ここでＲ３は上に定義したとおりである）のアルデヒドを用いて実施されてもよく、その結果二重還元的アミノ化が起こる
ことを特徴とする方法である。
−Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、イソプロピル、イソブチル、２-メチルブチル、およびベンジルからなる群から独立して選択され；
−Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、イソブチル、イソプロピル、イソペンチル、２-メチルブチル、ベンジル、およびフェニルエチルからなる群から選択され；
−ｎは、０または１であり；
−式ＩのイミノシクリトールでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのイミノシクリトールの立体中心（＊）は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択される］
に相当するイミノシクリトールの調製のための酵素化学的方法であって、
ｉ）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）と受容体アミノアルデヒドとの間のＤ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ酵素（ＦＳＡ）により触媒されるアルドール付加工程を具備し、該アミノアルデヒドは、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩ：
−Ｒ１およびＲ２およびｎは、上に定義したとおりであり；
−式ＶでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置、および式ＶＩおよびＶＩＩの立体中心は、同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基を表す］
に相当し；
ｉｉ）金属触媒の存在下でＨ２を用いての工程（ｉ）で得られた付加物の分子内還元的アミノ化工程を具備し、該工程（ｉｉ）は、式Ｒ３-ＣＨＯ（ここでＲ３は上に定義したとおりである）のアルデヒドを用いて実施されてもよく、その結果二重還元的アミノ化が起こる
ことを特徴とする方法である。
本発明者等は、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）と式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのアミノアルデヒドとの間のアルドール付加反応のための生物学的触媒としてのＤ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ酵素、以下ＦＳＡ、の使用に基づく方法により、イムノシクリトールを合成することが可能であることを発見した。
ＤＨＡとグリコールアルデヒド、Ｄ，Ｌ-グリセルアルデヒド-３-リン酸、Ｄ-グリセルアルデヒドおよびＤ-エリトロース、との間のアルドール反応を触媒するＦＳＡの能力が知られている（Schurmann, M.; Sprenger, G. A. J. Biol. Chem. (2001) 276 11055）。さらに、ＦＳＡの活性部位が、満足にその天然基質を用いて酵素反応を生じさせるために必須のアルギニン残基を含むことが知られている。酵素的活性部位の性質が、基質として使用される化合物の性質を決定し、そしてSchurman等（上掲）によると、最良の受容体基質は、そこに記載の親水性アルデヒドであると結論付けることができる。
驚いたことに、本発明者等は、式（Ｖ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩ）のアミノアルデヒドは、先行技術で知られている基質と比べて疎水性が高く、極めて異なる物理化学的特性を有するにもかかわらず、アルドール付加が効果的に行われることを発見した。
さらに、Schurmann等（上掲）において、ＦＳＡにより生成されるアルドール付加物は分光技術によって特性化されるわけではなく、付加物の立体化学も解明されていない。したがって、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのアミノアルデヒドがＦＳＡ基質であることも、反応の最終立体化学が本発明の生成物に適切であることも推論することは不可能であった。
ＦＳＡの使用によるさらなる利点は以下のとおりである：
−ＦＳＡが、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）の代わりにアルドール付加反応のためにジヒドロキアセトン（ＤＨＡ）を使用し、上述したようなＤＨＡＰ-アルドラーゼ手順に関連する５つの合成段階が省略されること、
−酸性ホスファターゼによるリン酸基の酵素的加水分解段階が回避され、よって、合成段階および製造コストが削減されること、
−ＦＳＡの調製および精製が単純且つ低コストであること、
−ＦＳＡが活性を失うことなく４℃で少なくとも７か月間、生体触媒として安定であること、そして
−毒性残留物を使用もしくは生成しないこと。上述したように、ＤＨＡＰ-アルドラーゼは、毒性の高い生成物で健康および環境に有害なヒ素塩の存在下でＤＨＡを使用することができる。
−ＦＳＡが、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）の代わりにアルドール付加反応のためにジヒドロキアセトン（ＤＨＡ）を使用し、上述したようなＤＨＡＰ-アルドラーゼ手順に関連する５つの合成段階が省略されること、
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−毒性残留物を使用もしくは生成しないこと。上述したように、ＤＨＡＰ-アルドラーゼは、毒性の高い生成物で健康および環境に有害なヒ素塩の存在下でＤＨＡを使用することができる。
最後に、これらの生体触媒の別の利点は、それらがアルドール付加立体化学を制御する何らかの能力を有していることである。よって、新しく生成された立体中心の配置は、アルドール付加試薬ではなく酵素に依存する。
したがって、本発明の目的は上述したような化学酵素的方法である。
アミン保護基の脱離、および段階（ｉｉ）の分子内還元的アミノ化はワンポット反応で起こりうる。好適には、それはワンポット反応で起こる。
本発明の方法の好ましい実施態様において、イミノシクリトールは、ミグリトール；ミグルスタット；Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；そのＮ-置換誘導体、例えばＮ-ブチル-Ｄ-ファゴミン；および１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトールからなる群から選択される、式Ｉのイミノシクリトールである。好適には、イミノシクリトールは、Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；Ｎ-ブチル-Ｄ-ファゴミン；および１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトールからなる群から選択される。より好適には、イミノシクリトールは、Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；およびＮ-ブチル-Ｄ-ファゴミンからなる群から選択される。
本発明の方法のまた別の好ましい実施態様において、（ｉ）のアミノアルデヒドは、本発明の範囲を限定するものではなく例示として、以下の群：Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノプロパナル、および（Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルに属するＶ型の保護されたアミノアルデヒドである。
本発明の方法の特定の実施態様において、段階（ｉ）で用いられるＦＳＡ酵素は、配列番号２を有する大腸菌ＦＳＡに相当する。本発明で使用するＤ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ（ＦＳＡ）酵素を、大腸菌Ｋ-１２株由来の大腸菌ＭＣ４１００株でクローンし（Schurmann, M.; Sprenger, G. A. J. Biol. Chem. (2001) 276 11055; Casadaban, M. J. (1976) J. Mol. Biol. 104, 541-555）、続いて精製した。このように、使用される好適なＦＳＡ酵素は、配列番号２に相当するアミノ酸配列を有し、前記微生物で自然発生する野生型である。現在の技術分野で知られる情報および方法によって、任意の他の野生型Ｄ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ（ＦＳＡ）酵素を単離し、他の微生物で同定することもできる。したがって、本発明の方法の他の実施態様で、ＦＳＡ酵素は、大腸菌以外の微生物から単離された、配列番号２に類似の配列を有する酵素である。
ここで使用される語「類似」は、微生物から単離でき、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）と式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩの受容体アルデヒドとの間のアルドール付加能力を有しうる任意のアミノ酸配列を含むことを意図する（図４）。通常、類似のアミノ酸配列は、前述のアミノ酸配列に実質的に相同である。ここで使用される表現「実質的に相同」とは、対象となっている複数のアミノ酸配列が、少なくとも３０％、好適には少なくとも８５％、またはより好適には少なくとも９５％の同一性を有することを意味する。
本発明の方法の他の特定の実施態様において、段階（ｉｉ）で用いられる金属触媒は、本発明の範囲を限定するものではなく例示として、以下の群：Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｈ、およびＰｄおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）の化合物に属する。
次に、Ｄ-ファゴミン、Ｎ-ブチル-Ｄ-ファゴミン、１-デオキシノジリマイシン、および１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトール（ＤＡＢ）の調製のための当該方法を使用した５つの実施例を説明する。
実施例１：Ｄ-ファゴミン合成
段階１）アルドール付加物の調製
出発アルデヒド、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノプロパナルを、Espelt等により開示された従来方法により３-アミノプロパノールから得た（Espelt, L., Parella, T., Bujons, J., Solans, C., Joglar, J., Delgado, A., Clapes, P., Chem. -Eur. J. 9 (2003) 4887；Ocejo, M., Vicario, J. L., Badia, D., Carrillo, L., Reyes, E., Synlett (2005) 2110）。
実施例１：Ｄ-ファゴミン合成
段階１）アルドール付加物の調製
出発アルデヒド、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノプロパナルを、Espelt等により開示された従来方法により３-アミノプロパノールから得た（Espelt, L., Parella, T., Bujons, J., Solans, C., Joglar, J., Delgado, A., Clapes, P., Chem. -Eur. J. 9 (2003) 4887；Ocejo, M., Vicario, J. L., Badia, D., Carrillo, L., Reyes, E., Synlett (2005) 2110）。
軌道撹拌機能を備えた容量２５０ｍＬのリアクタで、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノプロパナル（２．１ｇ，２２．９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）で溶解した。ジヒドロキシアセトン（４．７ｇ，２２．９ｍｍｏｌ）およびＦＳＡ酵素の原料粉末（２．０９ｇ，３４４５Ｕ）を、ホウ素ホウ酸塩バッファー ５０ｍＭ ｐＨ７（１５５ｍＬ）で溶解した当該溶液に添加した。混合物を４℃で２４時間、軌道撹拌（１２０ｒｐｍ）して反応させておいた。この時点での反応転換率は９８％以上であった。次に、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）を反応混合物に添加し、現れた沈殿物を遠心分離によって分離した。上清を逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。純粋な分画をプールし、溶媒を蒸発させて４．７ｇの白色固体を得た（収率６９％、ジアステレオマー過剰率９９％）。
ＦＳＡの調製および精製を、４０分間の７５℃での熱処理による発酵および細胞破壊から抽出した粗タンパク質から実行した（Schurmann, M., Sprenger, G. A,, J. Biol. Chem. 276 (2001) 11055；Thorell, S., Schurmann, M., Sprenger, G. A,, Schneider, G., J.Mol. Biol. 319 (2002) 161；Schurmann, M., Sprenger, G. A., J. Mol. Catal. B-Enzym. 19 (2002) 247）。抽出タンパク質は、大腸菌Ｋ-１２株由来の大腸菌ＭＣ４１００株から得て（Casadaban, M. J. J. Mol. Biol. (1976) 104, 541）、これは大腸菌ＦＳＡタンパク質（配列番号１）のコード配列を含むものである。クローン化、プラスミドへのライゲーション、および大腸菌株への形質転換は、Schurmann, M., Sprenger, G. A., J. Biol. Chem. 276 (2001) 11055に詳述されている。こうして得られたＦＳＡタンパク質（配列番号２）は、その活性を保ちながらも、タンパク質不純物沈殿物が単純なろ過または遠心分離により分離される。
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
最終段階で得た付加物（３７３ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を、エタノール／水 １：９（５０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭素（１００ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に維持した。これらの条件で、Ｃｂｚ基の脱離および分子内還元的アミノ化を同時に１２時間続けた。あるいは、最終段階で得た付加物（３７３ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５０ｍｇ）の存在下でエタノール／水１：９（５０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭素（１００ｍｇ）の存在下で、室内圧力でＨ２雰囲気中に維持した。これらの条件で、パラジウム作用によりＣｂｚ基の脱離を、およびＮａＣＮＢＨ３の存在による分子内還元的アミノ化を行った。両方の反応を同時に６時間続けた。次いで、反応混合物を不活性化アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて１６４ｍｇのＤ-ファゴミン固体を得た（収率８９％）。
[α]D 22 + 20.4 (c 1.0 in H20); δH (500 MHz; D2O; 22℃) 3.86 (1H, dd, J 11.8 and 3.0, 7-H), 3.66 (1H, dd, J 11.8 and 6.5, 7-H), 3.56 (1H, ddd, J 11.5, 9.0 and 5.0, 4-H), 3.21 (1H t, J 9.5 and 9.5, 3-H), 3.06 (1H, ddd, J 12.9, 4.4 and 2.3, 6-H), 2.68 (1H, dt, J 12.94, 12.92 and 2.70, 6-H), 2.61 (1H, ddd, J 9.68, 6.44 and 2.97, 2-H), 2.01 (1H, tdd, J 13.0, 4.9, 2.5 and 2.5, 5-H) y 1.48 ppm (1H, dq, J 13.0, 12.9, 11.5 and 4.5, 5-H); δC (101 MHz; D2O; 22℃) 72.9, 72.7, 61.1, 60.9, 42.6 and 32.1.
最終段階で得た付加物（３７３ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を、エタノール／水 １：９（５０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭素（１００ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に維持した。これらの条件で、Ｃｂｚ基の脱離および分子内還元的アミノ化を同時に１２時間続けた。あるいは、最終段階で得た付加物（３７３ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５０ｍｇ）の存在下でエタノール／水１：９（５０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭素（１００ｍｇ）の存在下で、室内圧力でＨ２雰囲気中に維持した。これらの条件で、パラジウム作用によりＣｂｚ基の脱離を、およびＮａＣＮＢＨ３の存在による分子内還元的アミノ化を行った。両方の反応を同時に６時間続けた。次いで、反応混合物を不活性化アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて１６４ｍｇのＤ-ファゴミン固体を得た（収率８９％）。
[α]D 22 + 20.4 (c 1.0 in H20); δH (500 MHz; D2O; 22℃) 3.86 (1H, dd, J 11.8 and 3.0, 7-H), 3.66 (1H, dd, J 11.8 and 6.5, 7-H), 3.56 (1H, ddd, J 11.5, 9.0 and 5.0, 4-H), 3.21 (1H t, J 9.5 and 9.5, 3-H), 3.06 (1H, ddd, J 12.9, 4.4 and 2.3, 6-H), 2.68 (1H, dt, J 12.94, 12.92 and 2.70, 6-H), 2.61 (1H, ddd, J 9.68, 6.44 and 2.97, 2-H), 2.01 (1H, tdd, J 13.0, 4.9, 2.5 and 2.5, 5-H) y 1.48 ppm (1H, dq, J 13.0, 12.9, 11.5 and 4.5, 5-H); δC (101 MHz; D2O; 22℃) 72.9, 72.7, 61.1, 60.9, 42.6 and 32.1.
実施例２：Ｎ-ブチル-Ｄ-ファゴミン合成
段階１）前項と同様のアルドール付加物の調製
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
前段階の結果生じた付加物（１５０ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）およびブタナルを、エタノール／水７：３（１０ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（５０ｍｇ）を当該溶液に添加し、混合物を１２時間、５０ｐｓｉでＨ２下で反応させておいた。次に、実施例１と同じ手順を踏み、溶離液としてＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３混合物を用いたシリカカラムによる粗反応物の精製の後、５２ｍｇのＮ-ブチル-Ｄ-ファゴミン固体を得た。
[α]D 22 = -24.5 (c 1.2 in MeOH); δH (500 MHz, D2O, 22℃) 3.90 (1H, dd, J 12.7, and 2.4, 7-H), 3.82 (1H, dd, J 12.7 and 2.9, 7-H), 3.45 (1H, ddd, J 11.5, 9.1 and 5.1, 4-H), 3.30 (1H, t, J 9.4, 3-H), 2.90 (1H, td, J 12.2, 3.5 and 3.5, 6-H), 2.73 (1H, ddd, J 13.3, 11.2 y 5.4, 8-H), 2.50 (1H, ddd, J 13.3, 11.1 and 5.2, 8-H), 2.36 (1H, dt, J 12.6, 12.6 and 2.4, 6-H), 2.16 (1H, td, J 9.8, 2.6 and 2.6 Hz, 2-H), 1.92 (1H tdd, J 12.7, 5.0, 2.5 and 2.5, 5-H), 1.55-1.35 (3H, m, 5-H and 2 x 9-H), 1.30-1.21 (2H, m, 2 x 10-H) and 0.88 (3H, t, J 7.4 and 7.4, 11-Me); δC, (101 MHz, D2O, 22℃) 73.2, 72.0, 65.8, 58.1, 52.2, 49.1, 30.5, 25.6, 20.4 and 13.3.
段階１）前項と同様のアルドール付加物の調製
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
前段階の結果生じた付加物（１５０ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）およびブタナルを、エタノール／水７：３（１０ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（５０ｍｇ）を当該溶液に添加し、混合物を１２時間、５０ｐｓｉでＨ２下で反応させておいた。次に、実施例１と同じ手順を踏み、溶離液としてＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３混合物を用いたシリカカラムによる粗反応物の精製の後、５２ｍｇのＮ-ブチル-Ｄ-ファゴミン固体を得た。
[α]D 22 = -24.5 (c 1.2 in MeOH); δH (500 MHz, D2O, 22℃) 3.90 (1H, dd, J 12.7, and 2.4, 7-H), 3.82 (1H, dd, J 12.7 and 2.9, 7-H), 3.45 (1H, ddd, J 11.5, 9.1 and 5.1, 4-H), 3.30 (1H, t, J 9.4, 3-H), 2.90 (1H, td, J 12.2, 3.5 and 3.5, 6-H), 2.73 (1H, ddd, J 13.3, 11.2 y 5.4, 8-H), 2.50 (1H, ddd, J 13.3, 11.1 and 5.2, 8-H), 2.36 (1H, dt, J 12.6, 12.6 and 2.4, 6-H), 2.16 (1H, td, J 9.8, 2.6 and 2.6 Hz, 2-H), 1.92 (1H tdd, J 12.7, 5.0, 2.5 and 2.5, 5-H), 1.55-1.35 (3H, m, 5-H and 2 x 9-H), 1.30-1.21 (2H, m, 2 x 10-H) and 0.88 (3H, t, J 7.4 and 7.4, 11-Me); δC, (101 MHz, D2O, 22℃) 73.2, 72.0, 65.8, 58.1, 52.2, 49.1, 30.5, 25.6, 20.4 and 13.3.
実施例３：１-デオキシノジリマイシン合成
出発アルデヒド、（Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルを、De Luca等により開示された方法により（Ｓ）-３-アミノ-２-アミノプロパノールから得た（De Luca, L., Giacomelli, G., Porcheddu, A., Org. Lett. 3 (2001) 3041）。方法は実施例１で述べたものと同様であるが、この場合反応を２５℃で行った点が異なる。
出発アルデヒド、（Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルを、De Luca等により開示された方法により（Ｓ）-３-アミノ-２-アミノプロパノールから得た（De Luca, L., Giacomelli, G., Porcheddu, A., Org. Lett. 3 (2001) 3041）。方法は実施例１で述べたものと同様であるが、この場合反応を２５℃で行った点が異なる。
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
実施例１と同様に実施して、１６４ｍｇの１-デオキシノジリマイシンの白色固体を得た（収率８９％）。
[α]D 22 + 48.0 (C 1.0 at H2O). 1H NMR (500 MHz, D2O. δ ppm 3.74 (dd, J = 11.8, 3.00 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 3.4 (ddd, J = 10.96, 9.06, 5.25 Hz, 1H), 3.24 (t, J = 9.1, 9.1 Hz, 1H), 3.18 (t, J = 9.4, 9.4 Hz, 1H), 3.1 (dd, J = 12.3, 5.2 Hz, 1H), 2.54 (hept, J = 9.4, 6.0, 3.0, 1H), 2.43 (dd, J = 12.3, 11.0 Hz, 1H).
実施例１と同様に実施して、１６４ｍｇの１-デオキシノジリマイシンの白色固体を得た（収率８９％）。
[α]D 22 + 48.0 (C 1.0 at H2O). 1H NMR (500 MHz, D2O. δ ppm 3.74 (dd, J = 11.8, 3.00 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 3.4 (ddd, J = 10.96, 9.06, 5.25 Hz, 1H), 3.24 (t, J = 9.1, 9.1 Hz, 1H), 3.18 (t, J = 9.4, 9.4 Hz, 1H), 3.1 (dd, J = 12.3, 5.2 Hz, 1H), 2.54 (hept, J = 9.4, 6.0, 3.0, 1H), 2.43 (dd, J = 12.3, 11.0 Hz, 1H).
実施例４：１-デオキシノジリマイシンの合成
段階１）アルドール付加による付加物の調製
出発アルデヒド、（Ｒ，Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルを、ＩＢＸ（ｏ-ヨードキシ安息香酸）での酸化により（Ｒ，Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパノール（１ｇ，４．４ｍｍｏｌ）から得た。軌道振とうおよび還流機能を備えた２５０ｍＬのリアクタで、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパノール（１ｇ，４．４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に溶解した。当該溶液にＩＢＸ（２．５ｇ；２当量）を添加して、反応物を３時間還流下に維持した。
段階１）アルドール付加による付加物の調製
出発アルデヒド、（Ｒ，Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルを、ＩＢＸ（ｏ-ヨードキシ安息香酸）での酸化により（Ｒ，Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパノール（１ｇ，４．４ｍｍｏｌ）から得た。軌道振とうおよび還流機能を備えた２５０ｍＬのリアクタで、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパノール（１ｇ，４．４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に溶解した。当該溶液にＩＢＸ（２．５ｇ；２当量）を添加して、反応物を３時間還流下に維持した。
結果として生じた溶液をろ過し、酢酸エチル層を５％（ｐ／ｖ）ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌで洗浄して反応副産物を除去した。（Ｒ，Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルを含む酢酸エチル溶液を、５００ｍＬのリアクタで、ホウ素-ホウ酸塩バッファー ５０ｍＭ ｐＨ８（２５０ｍＬ）中ジヒドロキシアセトン（５１０ｍｇ，５．７ｍｍｏｌ）および粗ＦＳＡ粉末（２３５ｍｇ，３４４５Ｕ）の水溶液に添加した。結果として生じた２相混合物から酢酸エチルを蒸発させ、これによりアルデヒドを水相に拡散させた。続いて反応物を２５℃で２４時間、軌道撹拌（１２０ｒｐｍ）した。この時点で、反応転換率は９８％より高かった。その後、ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）を粗反応混合物に添加し、固体残留物を遠心分離により分離した。上清を逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、白色固体を得た（６００ｍｇ，収率４４％）。
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
前段階で得られた付加物（６００ｍｇ，１．９１ｍｍｏｌ）を、エタノール／水 １：４（８０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭（１７６ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に１２時間維持した。これらの条件下で、Ｃｂｚの脱離および分子内還元的アミノ化を同時に１２時間に亘り続けた。その後、粗反応混合物を中性アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて白色固体を得た（１６４ｍｇ，収率８９％）。
1H NMR (500 MHz, D2O) ) δ ppm 3.74 (dd, J = 11.8, 3.00 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 3.4 (ddd, J = 10.96, 9.06, 5.25 Hz, 1H), 3.24 (t, J = 9.1, 9.1 Hz, 1H), 3.18 (t, J = 9.4, 9.4 Hz, 1H), 3.1 (dd, J = 12.3, 5.2 Hz, 1H), 2.54 (hept, J =9.4, 6.0, 3.0, 1 H), 2.43 (dd, J = 12.3, 11.0 Hz, 1H).
前段階で得られた付加物（６００ｍｇ，１．９１ｍｍｏｌ）を、エタノール／水 １：４（８０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、パラジウム炭（１７６ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に１２時間維持した。これらの条件下で、Ｃｂｚの脱離および分子内還元的アミノ化を同時に１２時間に亘り続けた。その後、粗反応混合物を中性アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて白色固体を得た（１６４ｍｇ，収率８９％）。
1H NMR (500 MHz, D2O) ) δ ppm 3.74 (dd, J = 11.8, 3.00 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 3.4 (ddd, J = 10.96, 9.06, 5.25 Hz, 1H), 3.24 (t, J = 9.1, 9.1 Hz, 1H), 3.18 (t, J = 9.4, 9.4 Hz, 1H), 3.1 (dd, J = 12.3, 5.2 Hz, 1H), 2.54 (hept, J =9.4, 6.0, 3.0, 1 H), 2.43 (dd, J = 12.3, 11.0 Hz, 1H).
実施例５：１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトール（ＤＡＢ）の合成
段階１）アルドール付加による付加物の調製
出発アルデヒド、Ｎ-Ｃｂｚ-２-アミノエタナルを、Espelt, L., Parella, T., Bujons, J., Solans, C., Joglar, J., Delgado, A., Clapes, P., Chem.-Eur. J. 9 (2003) 4887；Ocejo, M., Vicario, J. L., Badia, D., Carrillo, L., Reyes, E., Synlett (2005) 2110に記載のような標準的な手順で２-アミノエタノールから得た。
段階１）アルドール付加による付加物の調製
出発アルデヒド、Ｎ-Ｃｂｚ-２-アミノエタナルを、Espelt, L., Parella, T., Bujons, J., Solans, C., Joglar, J., Delgado, A., Clapes, P., Chem.-Eur. J. 9 (2003) 4887；Ocejo, M., Vicario, J. L., Badia, D., Carrillo, L., Reyes, E., Synlett (2005) 2110に記載のような標準的な手順で２-アミノエタノールから得た。
軌道振とう機能を備えた２５０ｍＬのリアクタで、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノエタナル（１．５１ｇ，７．８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中に溶解した。当該溶液に、ホウ素-ホウ酸塩バッファ ５０ｍＭ ｐＨ７．０（７２ｍＬ）中に溶解したジヒドロキシアセトン（０．７１ｇ，７．９ｍｍｏｌ）およびＦＳＡ活性を有する凍結乾燥標品（０．７ｇ，１１５０Ｕ）を添加した。２５℃で１２０時間、軌道振とう（１２０ｒｐｍ）下で反応を続けた。この時点で、反応転換率は４９％だった。その後、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を添加し、固体残留物を遠心分離により分離した。上清を逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。純粋な分画を回収し、溶媒を蒸発させて白色固体を得た（０．５０ｇ，収率２３％）。
段階２）脱保護および分子内還元的アミノ化
前段階で得た付加物（５００ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）をエタノール／水 １：９（９０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、触媒としてＰｄ／Ｃ（２０４ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に１２時間維持した。その後、粗反応混合物を中性アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて白色固体を得た（２５３ｍｇ）。最終生成物を陽イオン交換クロマトグラフィーにより当該固体から精製し、１０ｍＭのＮＨ３水溶液を得た。純粋な分画をプールし、溶媒を蒸発させて白色固体を得た（１２９ｍｇ，全収率１０％，ジアステレオマー過剰率９９％）。
[α]D 20 + 26.2 (c 1.0 en H2O); [α]D 20 + 35.2 (c 1.0 en MeOH)
1H NMR (500 MHz, D2O, 22℃) δ (ppm): 4.35 (m, 1 H, H4), 4.11 (t, J = 3.3 Hz, 1 H, H3), 3.97 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1 H, H6), 3.85 (dd, J = 12.2, 8.3 Hz, 1 H, 6H), 3.63 (dd, J = 8.3, 4.2 Hz, 1 H, H2), 3.59 (dd, J = 12.6, 4.8 Hz, 1H, H 5), 3.37 (dd, J = 12.6, 2.7 Hz, 1H, H5). 13C NMR (101 MHz, D2O, 22 °C) δ (ppm): 78.37 (C3), 77.00 (C4), 69.30 (C2), 61.66 (C6), 52.68 (C5).
前段階で得た付加物（５００ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）をエタノール／水 １：９（９０ｍＬ）中に溶解した。溶液を、触媒としてＰｄ／Ｃ（２０４ｍｇ）の存在下で、圧力５０ｐｓｉでＨ２雰囲気中に１２時間維持した。その後、粗反応混合物を中性アルミナでろ過し、ろ液を蒸発させて白色固体を得た（２５３ｍｇ）。最終生成物を陽イオン交換クロマトグラフィーにより当該固体から精製し、１０ｍＭのＮＨ３水溶液を得た。純粋な分画をプールし、溶媒を蒸発させて白色固体を得た（１２９ｍｇ，全収率１０％，ジアステレオマー過剰率９９％）。
[α]D 20 + 26.2 (c 1.0 en H2O); [α]D 20 + 35.2 (c 1.0 en MeOH)
1H NMR (500 MHz, D2O, 22℃) δ (ppm): 4.35 (m, 1 H, H4), 4.11 (t, J = 3.3 Hz, 1 H, H3), 3.97 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1 H, H6), 3.85 (dd, J = 12.2, 8.3 Hz, 1 H, 6H), 3.63 (dd, J = 8.3, 4.2 Hz, 1 H, H2), 3.59 (dd, J = 12.6, 4.8 Hz, 1H, H 5), 3.37 (dd, J = 12.6, 2.7 Hz, 1H, H5). 13C NMR (101 MHz, D2O, 22 °C) δ (ppm): 78.37 (C3), 77.00 (C4), 69.30 (C2), 61.66 (C6), 52.68 (C5).
Claims (9)
- 式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）：
［上式中、
−Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、イソプロピル、イソブチル、２-メチルブチル、およびベンジルからなる群から独立して選択され；
−Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、イソブチル、イソプロピル、イソペンチル、２-メチルブチル、ベンジル、およびフェニルエチルからなる群から選択され；
−ｎは、０または１であり；
−式ＩのイミノシクリトールでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのイミノシクリトールの立体中心（＊）は同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択される］
のイミノシクリトールの調製のための酵素化学的方法であって、
ｉ）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）と受容体アミノアルデヒドとの間のＤ-フルクトース-６-リン酸アルドラーゼ酵素（ＦＳＡ）により触媒されるアルドール付加工程を具備し、該アミノアルデヒドは、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩ：
［上式中、
−Ｒ１およびＲ２およびｎは、上に定義したとおりであり；
−式ＶでＲ１およびＲ２置換基が結合する炭素原子の立体配置、および式ＶＩおよびＶＩＩの立体中心は、同一または異なり、ＲおよびＳから独立して選択され；
−Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基を表す］
に相当し；
ｉｉ）金属触媒の存在下でＨ２を用いての工程（ｉ）で得られた付加物の分子内還元的アミノ化工程を具備し、該工程（ｉｉ）は、式Ｒ３-ＣＨＯ（ここでＲ３は上に定義したとおりである）のアルデヒドを用いて実施されてもよく、その結果二重還元的アミノ化が起こる
ことを特徴とする方法。 - イミノシクリトールが、ミグリトール；ミグルスタット；Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；Ｎ-ブチル-Ｄ-ファゴミン；および１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- イミノシクリトールが、Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；Ｎ-ブチル-Ｄ-ファゴミン；および１，４-ジデオキシ-１，４-イミノ-Ｄ-アラビニトールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- イミノシクリトールが、Ｄ-ファゴミン；１-デオキシノジリマイシン；およびＮ-ブチル-Ｄ-ファゴミンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
- （ｉ）のアミノアルデヒドが、Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノプロパナル、および（Ｓ）-Ｎ-Ｃｂｚ-３-アミノ-２-ヒドロキシプロパナルからなる群から選択されるＶ型の保護されたアミノアルデヒドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）で用いられる金属触媒が、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｈ、およびＰｄとシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）の組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ＦＳＡ酵素が、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ＦＳＡ酵素が、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ＦＳＡ酵素が、配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
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