JP5133067B2 - クオラムセンシング細菌におけるコミュニケーション及び毒性を変更するための化合物及び方法 - Google Patents
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Description
本発明に従った方法の様々な例示的な実施態様を、以下の例示的な実施例に記載する。これらの実施例において、アラビア数字(例、1、2、3等)で識別される特定の生成物は、続く記載及びスキームI(図1A)に示す合成経路でそのように識別された特定の構造を指す。本発明は、AHLアゴニスト及びアンタゴニストの両方を含むAI類似体を合成し、それにより組み合わせAHLライブラリーを形成する方法を記載する。加えて、本発明は、新規なクオラムセンシング化合物をスクリーニングし、それらの受容体/活性化因子と相互作用する及び/又は当該因子に結合する能力をアッセイする方法を提供する。
AHLに至る固相経路は、グラム陰性菌からの約15の既知の天然AHL、及びその構造類似体へのアクセスを最初に提供するものであるため重要である。またこの経路は、生物学的研究用に十分な純度及び量で化合物を供給する。本発明者等は、試験として、60分の合計反応時間で、主要な天然AHL(7a〜7f、8a〜8e)を、良好な収率及び卓越した純度で合成した(表2)。AHL8b、N−3−オキソ−オクタノイルL−ホモセリンラクトン、(OOHL)及び8d、N−3−オキソ−ドデカノイルL−ホモセリンラクトン、(ODHL)は、各々、Agrobacterium tumefaciens及びP.aeruginosaを用いた生物学的研究のために、重要な対照分子として必要とされた(実施例38〜42)。この手法を用いて到達可能な高い純度及び短縮された反応時間は、AHL合成におけるマイクロ波支援固相化学反応の価値を強調する。表2に、スキームI(図IA)に示した経路により合成した、天然に存在するAHL、その天然源である生物、純度及び収率百分率を列挙する。
1H NMR及び13C NMRスペクトルを、Bruker AC−300分光器上にて、重水素化溶媒中で、各々300MHz及び75Hzで記録した。テトラメチルシラン(TMS)を内部基準(0.0ppm)として用いて、化学シフトを100万分の一(ppm、δ)で報告する。カップリングは、ヘルツで報告する。エレクトロスプレーイオン化(ESI)MSは、2個のポンプ(LC−10ADvp)、コントローラ(SCL−10Avp)、自動注入装置(SIL−10ADvp)、UVダイオードアレイ検出器(SPD−M10Avp)、及び単一の四重極分析計を備えたShimadzu LCMS−2010システム(Columbia、MD)を使用して得た。Pike Technologies製の単一反射MIRacle Horizontal ATRユニットを装備したBruker Tensor 27分光器を用いて、FT−IR及び全反射型赤外吸収(ATR)−IRスペクトルを記録した。ATR−IR測定のために、スペクトル領域20000〜650cm-1のZnSe結晶を使用した。HP−8452UV可視分光器を使用して、Chemstationソフトウエアを作動させながらUVスペクトルを記録した。QP−5000質量分析計を備えたShimadzu GC−17Aシステム(Columbia、MD)を使用して、GC−MSスペクトルを得た。Restek RTX−5 crossbond 95%ポリシロキサンGCカラムを、以下の一般的GC傾斜と伴に使用した:注入温度300℃;最初の炉温度100℃;保持3分;300℃へ20°C/分で傾斜(ramp);全稼働時間15〜30分において保持2〜15分。光学回転([α]24D)は、Perkin−Elmer241デジタル偏光計上で、25℃にて測定した。
Milestoneマイクロ波反応器内の100mL丸底フラスコ、又はCEMマイクロ波反応器内の10mLガラス製CEMマイクロ波容器(部品番号908035)のいずれか内で、固相反応を実施した。合成工程間で、固相樹脂を、Vac−Man真空マニフォルド(Promega,部品番号:A7231)上で、20μmフリット(Alltech,部品番号:211408)を備えた8mLポリプロピレンサンプルリザーバ(Alltech,部品番号:210208)を使用して、標準的なポリプロピレンNalgeneスカートボトル(squirt bottle)内に保管した溶媒で洗浄した。合成中、使い捨てポリプロピレンピペットチップを備えたBrinkman Eppendorfピペットマン(可変の溶媒供給用に目盛りを付けた)を使用して、液体試薬を分配した。
この試験で使用した1,3−ジオキソラン保護β−ケト酸構成単位(5)は、Barnick及びRathke(Barnick,J.W.F.K.;van der Baan,J.L.;Bickelhaupt,F.Synthesis 1979,79,787-788;Rathke,M.W.;Nowak,M.A.Synth.Commun.1985,15,1039-1049)により報告された方法の変更を用いて調製した。代表的な合成を以下の実施例1〜3に概略し、スキームIV〜VIに示す。
撹拌したビス−トリメチルシリルマロネート(21.6g、71.5mmol)の100mLの無水ジエチルエーテル溶液を−78℃に冷却した。この溶液に、n−ブチルリチウム(エーテル中1.6M、44.7mL、71.5mmol)をゆっくり加え、温度を−60℃未満に維持した。添加が完了した後、反応物を−10℃迄暖め、その時点で塩化ヘキサノイル(5mL、35.75mmol)を迅速に加え、30分撹拌した。次に、150mLの冷5%重炭酸ナトリウム水溶液を加え、得られた溶液を30分激しく撹拌した。水層を分離し、冷4N硫酸でpH=2迄酸性化した。次に、水層を2×50mLのジエチルエーテルで抽出し、MgSO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、白色固体を得た。この固体は、必要であれば、ヘキサンからの再結晶化により更に精製し得た。4.9g、収率87%。1H NMR(300MHz、CDCl3)δ=3.49(s,2H,CH2)、2.59(t,2H,J=7.3Hz,CH2)、1.64(p,2H,J=7.4Hz,CH2)、1.34(m,4H,CH2CH2)、0.92(t,3H,J=6.9Hz,CH3);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ=204.4、182.8、87.9、48.1、43.4、31.3、23.5、14.1ppm。
撹拌した10b(5.5g、35mmol)の150mLのベンゼン及びメタノール4:1混合物中の溶液に、ジエチルエーテル(2M、21mL、42mmol)中のTMSCHN2を10分間かけて加えた。反応物を30分撹拌した後、反応混合物を真空濃縮して、11bを黄色油状物として得た。この材料を、続く工程(スキームIV)で、更に精製することなく使用した;6.1g、収率95%。1H NMR(300MHz、CDCl3)δ=3.73(s,3H,CH3)3.44(s,2H,CH2)、2.55(t,2H,J=7.3Hz,CH2)、1.64(p,2H,J=7.4Hz,CH2)、1.36(m,4H,CH2CH2)、0.91(t,3H,J=6.9Hz,CH3);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ=202.9、167.9、128.5、52.7、49.2、43.2、31.3、23.3、14.0ppm。
撹拌した3−オキソオクタン酸メチル(11b)(5.6g、32.5mmol)の125mLのベンゼン溶液に、エチレングリコール(20.2g、325mmol)及びpTsOH(0.617g、3.25mmol)を加えた。フラスコに冷却器及びDean−Starkトラップを装備して、24時間加熱還流した。反応混合物を真空濃縮し、100mLのジエチルエーテル中で希釈した。有機層を2×25mLの10%NaOH水溶液で洗浄した後、2×25mLの飽和NaCl溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮して、透明な油状物を得た。この油状物を、1N NaOH(150mL)及びMeOH(75mL)で6時間処理して鹸化した。塩基性溶液を真空濃縮し、氷浴内で冷却し、冷濃HClでpH=2に酸性化した。酸性化溶液を2×75mLのジエチルエーテルで抽出し、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮して、3,3−エチレンジオキソオクタン酸5bを、透明油状物として得た;3.3g、収率50%。1H NMR(300MHz、CDCl3)δ=4.06〜3.95(m,4H,OCH2CH2O)、2.70(s,2H,CH2)、1.83(t,2H,J=7.3Hz,CH2)、1.42〜1.18(m,6H,J=7.4Hz,(CH2)3)、0.94(t,3H,J=6.9Hz,CH3);13C NMR(75MHz、CDCl3)δ=175.3、109.5、65.3、37.8、32.0、22.7、14.1ppm。
代表的なn−Fmoc−メチオニン樹脂負荷プロトコール(スキームVII)
アミノメチルポリスチレン樹脂(1、5.2g、6mmol)を、100mL丸底フラスコ内にて40mLのCHCl3中で、室温で10分間、予め膨張させた。別個のフラスコ内で、N−Fmoc−L−メチオニン(2、6.7g、18mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt(2.8g、21mmol))、及びN,N−ジイソプロピル−カルボジイミド(DIC、3.8mL、24mmol)の活性化溶液を、50mLのDMF中で調製した。この活性化溶液を室温で10分間撹拌した後、膨張した樹脂に加えた。反応フラスコにスターラーバーを装備し、Milestone光ファイバー温度プローブを(保護シース内で)挿入できるよう穿孔されているゴム隔壁で封入した。反応フラスコを、Milestone Microsynth Labstation内に配置して、50℃で10分間照射した(最大600Wで50℃まで3分傾斜、最大600Wにて50℃で10分間保持)。次に、樹脂を濾過して、各250mLのDMF、水、EtOH、及びCH2Cl2で洗浄し、真空乾燥した。このカップリング工程を1回繰り返して、N−Fmoc−L−メチオニン樹脂を、UV吸収で定量して0.8〜0.9mmol/g負荷で得た。
約20mgのN−Fmoc−L−メチオニン負荷樹脂を、3mLの4%1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)のDMF溶液に浸し、室温で30分撹拌した。その後,溶液100μLを除去し、DMF中で3.0mLに希釈した。この溶液の1.0mLアリコートを回収して、石英キュベット内でUV吸収を296nmにて読み取り(ε296=9500M-1cm-1);標準的な方法に従って、負荷を算出した。
約300mgのN−Fmoc−L−メチオニン負荷樹脂を、4mLのDMFと共に10mLのCEMマイクロ波バイアル内に配置し、CEM Discover内にて150℃で6分間照射した(最大ワット量300W)。UV Fmoc定量を、上述したように実施した。
N−Fmoc−L−メチオニン負荷樹脂を、適当な大きさの容器内に配置して、20%ピペリジン/DMF溶液と共に30分撹拌した。溶液を排出し、工程を繰り返した。UV Fmoc定量を、上述したように実施した。
スターラーバーを装備した10mLのCEMマイクロ波バイアル内で、メチオニン樹脂3(300mg、0.295mmol)を1.5mLのCHCl3中で、室温で5分、予め膨張させた。カルボン酸4(1.03mmol)及びDIC(1.5mmol)の活性化溶液を、別個のバイアル内で2mLのDMF中で調製し、5分間撹拌した。活性化溶液を膨張した樹脂に加え、反応混合物に50℃で10分間マイクロ波を照射した(傾斜時間30秒、50℃で10分保持、最大ワット量300W)。次に、樹脂を濾過し、各50mLのDMF、H2O、EtOH、及びCH2Cl2で2回洗浄し、真空乾燥した。最良の収率を得るために、この工程を再度繰り返した。化合物を切断するために、樹脂を1.5M CΝBrのCHCl3溶液と、1%TFA水溶液との5:2溶液7mLで処理し、60℃で30分間マイクロ波を照射した(傾斜時間60秒、60℃で30分保持、最大ワット量300W)。AHL生成物を5mLのCHCl3で樹脂から溶離させ、水(3×10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮して、AHLを白色粉末として得た。7a〜7qの純度及び収率を、表2及び表3に記載する。
10mLのCEMマイクロ波バイアル内で、メチオニン樹脂3(300mg、0.295mmol)を1.5mLのCHCl3中で、室温で5分間予め膨張させた。3,3−エチレンジオキソカルボン酸5(1.03mmol)及びDIC(1.5mmol)の活性化溶液を、別個のバイアル内で2mLのDMF中で調製し、5分間撹拌した。活性化溶液を膨張した樹脂に加え、反応混合物に50℃で10分間マイクロ波を照射した(傾斜時間30秒、50℃で10分保持、最大ワット量300W)。次に、樹脂を濾過し、各50mLのDMF、H2O、EtOH、及びCH2Cl2で2回洗浄し、真空乾燥した。最良の収率を得るために、この工程を再度繰り返した。化合物を切断するために、樹脂を1.5M CΝBrのCHCl3溶液と、1%TFA水溶液との5:2溶液7mLで処理し、60℃で30分間マイクロ波を照射した(傾斜時間60秒、60℃で30分保持、最大ワット量300W)。AHLを5mLのCHCl3で樹脂から溶離させ、水(3×10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮した。この材料を5mLの50%TFA/CH2C12中で30分間撹拌して、β−ケト脱保護を行った。溶液を水(2×5mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮して、3−オキソAHL生成物を白色粉末として得た。8a〜8hの純度及び収率を、表2及び表3に記載する。
化合物を切断するために、樹脂を、1.5M CNBrのCHCl3溶液と、50%TFA水溶液との5:2溶液7mL中にて、室温で24時間撹拌した。AHL生成物を5mLのCHCl3で樹脂から溶離させ、水で洗浄し(3×10mL)、MgSO4上で乾燥し、真空濃縮して、3−オキソAHLを白色粉末として得た。
30.7、27.0;GC−MS:期待値m/z=247、実測値[M+]=247;[αD]=+27.9(c=6.7mg/mL;CHCl3);IR(cm-1):3314、2935、2358、2331、1771、1652、1447、1173。
スキームIを介して合成したAHLのエナンチオ純度を、AHL Mosherアミド誘導体の特徴付けにより評価した。この固相経路を用いて、L−及びD−メチオニンの両方を負荷した樹脂(3)から出発して、R−Mosherアミドジアステレオマーを合成した。ジアステレオマーの1H NMR(300MHz、CDCl3)スペクトルの分析は、AHLの光学純度(de)が95%(a、a’、b、b’は、NMRスペクトルの各ピークの統合に基づく部分収率であり、100(a−a’)又は100(b−b’)から算出するように)を超えることを示した。図28A及び図28Bに、各々、D及びLホモセリンエナンチオマーの1H NMRスペクトルを示す。
化合物の取り扱い及び試薬:合成化合物のストック溶液(10mM及び100mM)を酢酸エチル又はCHCl3のいずれかで調製し、密封したバイアル内に−20℃で保管した。アッセイに使用する前に、溶液を室温にした。溶媒耐性ポリプロピレン(Corning Costarカタログ番号3790)又はポリスチレン(Corning Costarカタログ番号3997)96−ウェルプレートを適宜使用した。全生物学的試薬は、Fisherから購入し、封入された指示書に従って使用した。1.0g/L NH4Cl、0.3g/L MgSO4・7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、2.5mg/L FeSO4・7H2O、5.0g/Lグルコース、1.0g/L NaH2PO4、及び3.0g/L K2HPO4を含有するAB最小培地(pH=6.8)を調製した。生物膜アッセイに使用したM9培地は、記載されているように調製した(De Kievit,T.R.、Gillis,R.、Marx,S.、Brown,C.、Iglewski,B.H.、Appl.Environ.Microbiol.2001,67,1865-1873)。Miller吸収アッセイ用の緩衝液及び溶液を、記載されているように調製した(Miller,J.H.、Experiments in Molecular Genetics;Cold Spring,1972)。
上述したスキーマで構成されたAHLライブラリーを、クオラムセンシングの拮抗作用に関して、二種の細菌のレポーター株内でスクリーニングした:1)P.aeruginosa PAO−JP2(plasI−LVAgfp)、(De Kievit,T.R.、Gillis,R.、Marx,S.、Brown,C.、Iglewski,B.H.、Appl.Environ.Microbiol.2001,67,1865-1873)及び2)A.tumefaciens WCF47(pCF372)。これら2種の株の試験は、2つの理由から価値を有する:1)P.aeruginosaの直接的な臨床的関連性、及び2)A.tumefaciens内のTraRに関する生化学的及び構造的データの広範な群。これらレポーター株の両方は、天然のAHLシンターゼを欠くが、活性化LuxR型受容体を保持する(各々、LasR及びTraRタンパク質);外因性リガンドは受容体活性化を要求し、これは蛍光(LasRについては緑色蛍光タンパク質(GFP))又は吸収(TraRについてはβ−ガラクトシダーゼ活性を介して)測定により測定し得る。
表2に同定された合成類似体に関する作動作用/拮抗作用試験を、A.tumefaciens及びP.aeruginosaモデルの両方で実施した。図30及び図31に示したこれら実験の結果は、レポーターアッセイスクリーニングの能力のみならず、クオラムセンシング細菌の属全体の異なる宿主における各リガンドの交差反応性も示している。更に、図32及び図33に示した拮抗作用アッセイは、AHL類似体の濃度範囲全体における有効性を示し、合成リガンドの濃度を変更すると、中間応答を生じることができ、高濃度では事実上シグナルが存在しなくなることを示す。
最終濃度100nMを与える適量の濃縮AHLストック溶液を、空の培養管に加え、溶媒を蒸発させた。A.tumefaciens WCF47(pCF372)の一晩培養物を、400μg/mLオクトピン及び50μg/mLストレプトマイシンを含有する新鮮なAB最小培地中で、OD600(光学密度)0.1に希釈した。AHLを含有する管に、希釈した培地1mL部を加えた。回転振盪インキュベータ(200rpm)内で、管を28℃にて12〜16時間増殖させた。
最終濃度1μMを与える適量の濃縮ストック溶液を、ポリプロピレン96−ウェルプレートに加え、溶媒を蒸発させた。P.aeruginosa PAO−JP2(plasI−LVAgfp)の一晩培養物を、200μg/mLカルベニシリンを含有する新鮮なLB培地中で、OD6000.1に希釈した。200μLの希釈培地をプレートの各ウェルに加え、回転振盪インキュベータ(200rpm)内で、37℃で6時間インキュベートした。培地をポリスチレン96−ウェルプレートに移して、プレートリーダーを使用してGFP発現を測定し、この値を細胞密度に正規化した。使用したAHL類似体の濃度が400μMであり、ODHL(8d)ストック溶液を、その濃度が1μMとなるように、各ウェルに加えたこと以外は、図32に示した拮抗作用アッセイに同様の方法を使用した。次に、400μMにて良好な阻害活性を示した化合物を、1μMのODHL(8d)に対して、400μM〜4nMの濃度範囲で試験した(図33に示す)。全アッセイは、3回実施した。
生物膜形成は、大部分はP.aeruginosa内のLasRの制御下にあるため、本発明者等は、アンタゴニスト7h及び7oがP.aeruginosa生物膜形成を妨害し得ると仮定した。Iglewski及び共同研究者により報告された標準的な手順に従って、アッセイを実施した。
P.aeruginosa PAO1(pTdK−GFP)を使用して、標準的な静的生物膜アッセイを実施した。簡単に言えば、一晩培養物を、200μg/mLカルベニシリンを含有する新鮮なM9培地中で、OD6000.1に希釈した。この希釈培地を、50μMアンタゴニストを含有する管に加えた。生物膜を、リガンドの非存在下で(図35A);合成リガンド7hの存在下で(図35B);及び合成リガンド7oの存在下で(図35C)(両方とも50μM)、48時間成長させ、走査型レーザー共焦点顕微鏡法を用いて可視化した。各管に滅菌したガラス製カバースリップを加え、培養物を、振盪せずに37℃で48時間インキュベートした。カバースリップを除去し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、走査型レーザー共焦点顕微鏡法を用いて検査した。トップダウン(top-down)のZの連続を、約100μmの距離で収集した。図35〜図37の画像は、別々の日に実施したいくつかの実験の代表例である。
上述した方法を用いたが、未処理(図36A);50μM 7o(図36B);25μM 7o(図36C);及び12.5μM 7o(図36D)を含む処理群を使用して、合成クオラムセンシング化合物7oの用量依存的関係性を研究した。P.aeruginosa(PAO1(pLVAgfp))のコンポジットスタックした操作型共焦点レーザー顕微鏡写真は、生物膜の用量依存的破壊を明らかに示している。
上述した方法を用いたが、未処理(図37A);50μM 7h(図37B);25μM 7h(図37C);及び12.5μM 7h(図37D)を含む処理群を使用して、合成クオラムセンシング化合物7hの用量依存的関係性を研究した。P.aeruginosa(PAO1(pLVAgfp))のコンポジットスタックした操作型共焦点レーザー顕微鏡写真は、生物膜の用量依存的破壊を明らかに示している。
Claims (22)
- 前記化合物が、天然のクオラムセンシング化合物のアンタゴニストとして作用する、請求項1記載の化合物。
- 前記化合物が、天然のクオラムセンシング化合物のアゴニストとして作用する、請求項1記載の化合物。
- 前記nが1である、請求項1記載の化合物。
- 前記R 3 および前記R 4 の両方が、−Hである、請求項1記載の化合物。
- in vitroでクオラムセンシング細菌を請求項1又は13に記載の化合物と接触させることを含む、クオラムセンシング細菌の毒性を低下させる方法。
- 前記クオラムセンシング細菌の毒性の低下が、生物膜の生成の阻害又は減少を含む、請
求項14記載の方法。 - 細菌の生物膜汚染を受け易い表面の細菌汚染を低下させる方法であって、in vitroで該表面を、請求項1に記載の化合物と接触させることを含む方法。
- 前記接触が、前記化合物を含有する溶液を、前記表面に噴霧、塗工、はけ塗り、塗布、又は該溶液で表面を処理することを含む、請求項16記載の方法。
- 前記表面を、二種又はそれ以上の前記化合物の混合物と接触させる、請求項16記載の方法。
- 少なくとも一種の請求項1記載の化合物を含有する組成物を用意する工程、及びin vitroで細菌生物膜を該化合物と接触させる工程を含む、細菌生物膜を破壊する方法。
- 前記接触させる工程が、少なくとも一種の前記化合物を含有する組成物を、前記表面に噴霧、塗工、はけ塗り、塗布、又は該組成物で該表面を処理する工程を含む、請求項19記載の方法。
- 細菌感染治療剤の製造のための請求項1に記載の化合物の使用。
- 請求項1に記載の化合物を含む医薬組成物。
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