KR101372887B1 - 미생물로부터 분리한 디펩타이드를 유효성분으로 포함하는항암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 속 (Bacillus sp.)에 속하는 BA34 균주로부터 분리한 물질인 디펩타이드를 유효성분으로 하는 항암 조성물에 대한 발명으로, 이 물질은 암세포 억제 능력이 우수하므로 암 예방제로서 유용하게 사용될 수 있다.

바실러스, 디펩타이드, 항암 조성물

Description

미생물로부터 분리한 디펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 조성물{ANTI-CANCER COMPOSITION COMPRISING DIPEPTIDE ISOLATED FROM MICROORGANISM}

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 그의 제조 방법 및 그의 항암제로서의 용도에 관한 것이다.

[화학식 1]

일반적으로 암이 발병하는 이유는 여러 가지가 있는데 그 이유 중 하나는 세 포 내에서 암이 발생하는 경로가 다양하기 때문이다. 암의 발생과 관련된 세포 내 단백질 중 하나가 Akt이다.

Akt (일명 Protein Kinase B; PKB)는 phosphatidylinositol 3'-OH kinase (PI3K) 신호전달계에 의해 활성되는 인산화 효소 단백질이다. 정상 세포 표면에 성장인자 (growth factors) 자극이 도달되면, PI3K가 활성화되고, PI3K는 PDK 효소를 활성화시키며, PDK는 Akt를 활성화시키게 된다. 활성화된 Akt는 Glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3 beta), Bad, FOXO3A, NOS, TSC 등과 같은 기질 단백질의 세린(serine)이나 쓰레오닌(threonine)잔기를 인산화시켜 세포의 성장은 촉진시키면서 세포 사멸 유도는 억제시키는 기능을 수행하게 된다. 세포 성장 신호가 없어지게 되면 PTEN 탈인산화 효소가 활성되어 Akt 효소 활성이 억제된다. 그러나 어떤 원인에 의해 Akt 유전자의 과발현이 발생되거나 PTEN 탈인산화 효소의 돌연변이가 발생되면, Akt 효소 활성이 비정상적으로 증가하게 된다. Akt 활성이 증가되어 있는 세포에서는 세포 사멸 과정이 억제되어, 통제받지 않는 무한 증식 과정이 촉진되고 결과적으로 암이 발생된다고 알려져 있다. 실제로 유방암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 위암, 신경교세포종 등에서 Akt 활성이 과잉 증가되어 있으며, Akt 활성을 억제하면 이들 암을 치료하는데 유용하다고 보고된 바 있다(Redaelli, C., F. Granucci, L. De Gioia, and L. Cipolla. 2006. Synthesis and Biological Activity of Akt/PI3K Inhibitors. Mini - Rev . Med . Chem. 6: 1127-1136.; Sun , M., G. Wang , J. E. Paciga, R. I. Feldman , Z. Q. Yuan, X. L. Ma , S. A. Shelley, R. Jove, P. N. Tsichlis, S. V. Nicosia, and J. Q. Cheng. 2001. AKT1/PKBalpha kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is required for oncogenic transformation in NIH3T3 cells. Am . J. Pathol . 159: 431-7).

따라서 본 발명에서는 Akt를 저해하는 물질을 찾고자 하였다. 암을 치료하기 위한 물질을 찾기 위해 가장 널리 사용되는 방법으로는 기존에 알려진 물질의 유도체들의 항암효과를 시험하고 이들의 약효를 향상시키는 것이다. 또한 이와 같은 유도체들이 보이는 독성을 감소시키기 위한 방향으로 구조 변형을 많이 시도하고 있다. 그러나 천연으로부터 항암효과를 보이는 화합물을 찾게 되면 기존의 항암효과를 보이는 화합물들과는 다른 모핵을 가진 선도물질을 도출할 수 있기 때문에 시도할 만한 가치가 있는 방법이다. 항암효과를 보이는 물질을 천연자원으로부터 얻기 위한 방법의 하나로 미생물 배양액을 사용할 수 있다. 미생물은 삶을 유지하기 위한 일차 대사물 이외에 이차 대사물을 생산하는데 많은 이차 대사물이 항균효과를 보이는 물질로 발견되어 왔다. 특히 토양 방선균으로부터 수십 종 이상의 항균성 물질이 현재까지 발견되어 졌다.

본 발명자들은 바실러스의 일종인 BA34 배양액으로부터 암세포를 억제할 수 있는 물질을 추출, 분리하였고, 이의 구조를 규명하였다. 이 물질은 알려진 디펩타이드로 규명되었으나 현재까지 이 물질이 Akt저해를 보인다는 선행 연구도 없을 뿐만 아니라 본 연구에서는 암세포 억제 효과를 보임으로써 암 예방제로 활용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 바실러스로부터 분리한 디펩타이드를 새로운 암 예방제로 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Akt에 대한여 저해 효과를 보이는 하기 화학식 1의 디펩타이드를 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 제공하고 하는 디펩타이드를 생산하는 균주 BA34는 그 생산 방법이 이미 보고된 것으로서, BA34는 16S rDNA 분석 결과 바실러스 아밀로리퀘화시 엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)와 99%의 상동성을 보인다. 이 결과는 Journal of Microbiology and Biotechnology, 16권 487-490 논문에 상세하게 나와 있다.

본 발명은 또한 상기한 화학식 1의 화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 BA34균 배양액으로부터 용매를 사용하여 추출하는 단계, 추출액을 여과하고 농축시키는 단계 및 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한다.

상기 방법에 사용할 수 있는 용매의 종류는 화학식 1의 화합물을 효과적으로 추출할 수 있는 용매이면 특별히 제한되지 아니한다. 그 예로는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜 등을 포함하는 알콜, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등을 포함하는 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류, 테트라히드로푸란, DMF. DMSO, 에틸아세테이트 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에서는 메탄올을 사용하여 추출하였으나, 이것은 예시에 불과할 뿐, 화학식 1의 화합물이 다른 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 테트라히드로푸란 등에도 잘 용해되므로 이들을 사용하는 것을 제한하는 것은 아니다.

용매로 추출하여 얻어진 추출액은 여과 및 용매의 증류에 의해 농축된다. 용매의 증류는 통상 감압 증류에 의해 성취되나, 대기압 하에서 증류하는 것을 배제하는 것은 아니다.

감압 증류된 농축액은 크로마토그래피에 의해 순수한 화합물로 정제된다. 본 발명에서는 농축액을 역상의 분리 수지인 씨-에이틴(C-18)관 크로마토그래피 및 분취 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Phenomenex C18, 10mm X 250mm, 유속:4mL/분, 이동상 20% 아세토나이트릴, 검출파장: UV 254nm, 머무름 시간(RT): 13.3분)에 순 차 적용하였으나. 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 크로마토그래피에 사용되는 물질 및 전개 용매를 다양하게 변형할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 필요할 경우, 재결정에 의해 보다 순수한 화합물, BA1을 얻을 수 있다.

분리한 물질, BA1의 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과, 분자량이 260이고 C₁₄H₁₆N₂O₃의 분자식으로 표시되는 상기 화학식 1의 고리탄화수소 구조를 갖는 물질임을 확인하였다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여(근육내, 피하, 정맥내, 좌약 등)에 의해 투여된다. 적당한 투여량은 환자의 상태, 예를 들면 연령, 나이 및 증상의 정도 등에 따라 적절히 조절할 수 있지만, 통상 성인의 경우 100 내지 500 mg의 용량 범위에서 일반적으로 일회 또는 수 회로 나누어 1일당 100 내지 1,000 mg의 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 1일 300 - 1,000 mg의 양으로 투여되는 것이다.

또한, 본 발명의 조성물을 경구용 제제로서 조제하는 경우에는 부형제, 또한 필요에 따라서 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미교취제 등을 가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복 정제, 과립제, 캡슐제 등으로 한다. 부형제로서는 예를 들면 젖당, 옥수수 전분, 백당, 포도당, 솔비트, 결정 셀룰로스 등이, 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알콜, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 아라비아 고무, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로 필스타치, 폴리비닐피리돈 등이, 붕괴제로서는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트란, 펙틴 등이, 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화 식물유 등이, 착색제로서는 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이, 교미교취제로서는 예를 들면 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 계피 분말 등이 사용된다. 이들의 정제는, 과립제에는 당의, 젤라틴의, 기타 필요에 따라 적절히 코팅하는 것을 배제하는 것은 아니다. 주사제로 조제하는 경우에는 필요에 따라, pH 조정제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 첨가하고, 통상적인 방법에 의해, 피하, 근육내, 정맥 주사제로 한다. 본 발명의 화학식 1의 화합물은 필요에 따라, 염산, 황산, 인산 등의 무기염, 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등, 약학적으로 허용할 수 있는 산부가염으로서도 약효를 충분히 발휘시킬 수 있다.

본 발명자들은 상기 화학식 1의 화합물이 Akt 저해제로 작용한다는 사실을 확인하였고, 이러한 결과로부터 본 발명의 화학식 1의 화합물이 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 바실러스속에 속하는 BA34 균주로부터 분리한 디펩타이드가 보이는 Akt 저해효과에 관한 것으로, 이 물질은 암세포 억제 능력이 우수하므로 암예방제로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세하게 기술할 것이나, 이러한 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니며, 특허청구범위에 기재된 발명의 정신 및 보호범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능하다는 것은 자명할 것이다.

<실시예 1> 화학식 1을 갖는 화합물 BA1의 제조방법

BA34의 배양액 500mL를 동량의 메탄올로 12시간동안 추출하여 얻은 추출물을 역상의 분리 수지인 씨-에이틴(C-18)관 크로마토그래피 및 분취 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Phenomenex C18, 10mm X 250mm, 유속:4mL/분, 이동상 20% 아세토나이트릴, 검출파장: UV 254nm, 머무름 시간(RT): 13.3분)에 순차 적용하였으나. 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 크로마토그래피에 사용되는 물질 및 전개 용매를 다양하게 변형할 수 있음을 자명할 것이다. 또한, 필요할 경우, 재결정에 의해 보다 순수한 화합물을 얻을 수 있다. 화학식1의 화합물은 도 1에 도시한 것과 같은 과정에 의하여 분리, 정제하였다.

분리한 물질 BA1은 양성자 핵자기공명 스텍트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과, 분자량이 260이고 C₁₄H₁₆N₂O₃의 분자식으로 표시되는 상기 화학식 1의 고리탄화수소 구조를 갖는 물질임을 확인하였다. 구체적인 물성 테스트 데이터는 다음과 같다.

물성 테스트

(1) 분취 고성능액체크로마토그라피 상의 특징을 도 2에 도시하였다. 도 2에서 위에 표시된 그림은 1차원적 크로마토그램을, 아래에 표시된 그림은 3차원적 크로마토그램을 보여주는데, 3차원적 크로마토그램에서 보듯이 본 화합물은 단일성분을 가진 화합물임이 자명하다.

(2) 용해성: 상기 화학식 1의 화합물은 메탄올, 에탄올, 디메틸설폭사이드, 이소프로판올, 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 테트라히드로푸란 등에 잘 용해되었다.

(3) 질량분석

측정기기는 Agilent 6890 GC/5973N MSD (Agilent Co., Palo Alto, CA, USA)이었으며 GC/MS를 위한 용매는 메탄올을 사용하였고 질량(m/z)은 260으로 관찰되었다. 질량분석 스펙트럼은 도 3과 같다.

(4) 핵자기공명 스펙트럼

측정기기는 브루커(Bruker, Germany)사의 Avance 400(9.4 T)이었으며 용매는 중수소디메틸설폭사이드이었다.

가) 양성자 핵자기공명 스펙트럼

양성자 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 4에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹H-NMR(400MHz) δ: 1.40 (m), 1.71 (m), 1.99 (m), 2.92 (dd, 2.8, 4.8), 3.33 (m), 4.04 (dd, 7.0, 8.8), 4.24 (dd, 4.8, 4.8), 6.63 (d, 8.5), 7.04 (d, 8.5), 7.84 (s), 9.23 (s) 여기서 m, s, d는 커플링상태를 각각 multiplet, singlet, doublet으로 나타내며 ( ) 내의 숫자는 커플링상수를 나타낸다.

나) 탄소 핵자기공명 스펙트럼

탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 5에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹³C-NMR(100MHz) δ: 21.8 (t), 27.8 (t), 34.7 (t), 44.5 (t), 56.0 (d), 58.4 (d), 114.7 (d), 114.7 (d), 120.7 (s), 130.8 (d), 130.8 (d), 155.9 (s), 165.1 (s), 168.9 (s) 여기서 s, d, t는 탄소의 다중도를 나타내며 각각 siglet, doublet, triplet을 표시한다. 또한 114.7과 130.8의 첨두는 다른 첨두에 비해 두배의 세기를 가지면서 서로 다른 수소들과 연결되어 있다.

(5) 화학식 1을 갖는 화합물 BA1의 전체적 구조

모든 핵자기공명분광법 실험은 Bruker Avance 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany) system을 사용하였고 온도는 298K로 하였다.

수소 핵자기공명분광법 (¹H-NMR), 탄소핵자기공명분광법 (¹³C-NMR), 데프트 (DEPT), 코지 (COSY), 톡시 (TOCSY), 노지 (NOESY), 에이치엠큐씨 (HMQC), 에이치엠비씨 (HMBC) 실험을 하였고, 용매는 중수소디메틸설폭사이드 (DMSO-d ₆)를 사용하였다.

수소핵자기공명분광법의 경우 1 초 간격으로 32번 scan을 하였고 32K의 데이타포인트를 사용하였다. 90도 펄스는 9.5초로 하였고 스펙트럼넓이는 4789 Hz로 하여 기록을 하였다.

탄소핵자기공명분광법과 데프트 스펙트럼의 경우는 64K의 데이타포인트를 사용하였고 90도 펄스는 10.5초로 하였으며 스펙트럼넓이는 22371 Hz로 하였다. 모든 이차원스펙트럼의 경우 f2 dimension의 경우 2048개의 데이타포인트를 사용하였으며 f1 dimension의 경우는 256을 사용하였다.

에이치엠비씨의 경우 long range 결합상수를 70 밀리초로 하였다.

톡시와 노지의 경우 mixing time을 각각 60 밀리초와 1초로 하였다. 우선은 수소핵자기공명분광법에서 7 ppm 근처의 첨두들로부터 방향족이 있음을 알 수 있었다. 6.63과 7.04 ppm의 이중 (doublet) 커플링이 4개의 수소를 나타내므로 para-치환된 AB 스핀시스템의 방향족링이 있다. 탄소핵자기공명분광법에서 12개의 첨두들이 관찰되었고 데프트 실험을 통해 이들이 4개의 일차탄소, 4개의 이차탄소, 그리고 4개의 3차탄소로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 이중에서 165.1과 168.9 ppm의 탄소는 카보닐 탄소이며, 수소스펙트럼에서 보여주었던 para-치환된 벤젠링의 4개의 탄소 (2개는 중첩되어 나타남)가 114.7, 127.0, 130.8, 155.9 ppm에서 나타났다. 또한 2개의 이차 (methine) 탄소가 56.0과 58.4 ppm에서, 4개의 삼차 (methylene) 탄소가 21.8, 27.8, 34.7, 44.5 ppm에서 존재함을 알 수 있었다. 에이치엠큐씨 실험을 통해 각각의 탄소와 연결되는 수소를 찾을 수가 있었고, 연결되지 않는 7.93와 9.23 ppm의 두개의 수소는 양성자교환 수소임을 알수 있었다. 코지 실 험을 통하여 4.24 ppm의 이차 (methine) 수소가 2.92 ppm의 삼차 (methylene) 수소와 이웃함을 알 수 있고, 4.04 ppm의 또 다른 이차 (methine) 수소는 1.40과 1.99, 1.71, 그리고 3.33 ppm의 삼차 (methylene) 수소와 이웃함을 알 수 있었다. 그리고 3.33 ppm의 삼차 (methylene) 수소는 화학적이동 (chemical shift)으로 보아 전기음성도가 큰 원자가 연결되어 있음을 예측할 수 있었다. 그러므로 한 개의 para-치환된 벤젠과 위의 두 그룹이 서로 어떻게 연결 되어 있는가는 에이치엠비씨를 통해서 알 수 있었다. 에이치엠비씨에 대한 해석을 통해 4.24 ppm의 수소와 127.0 ppm의 벤젠링 탄소 그리고 165.1 ppm의 카보닐 탄소와 장거리커플링을 하는 것이 보이고, 7.84 ppm의 양성자교환 수소가 165.1 ppm의 카보닐 탄소 그리고 58.4 ppm의 탄소와 장거리커플링이 일어나는 것을 통해 세 개의 그룹이 서로 연결되어 있음을 확인 할 수 가 있었다. 결과적으로, F2의 화학 구조는 cyclo(prolyltyrosyl)로 확인 되었다. 확정된 화합물의 구조는 화학식 1과 같으며, 그것을 도 6에 나타내었다.

< 실시예 2> 화학식 1로 표시되는 화합물 BA1 에 의한 Akt 저해 활성

BA1에 의한 암억제 활성 효과를 관찰하기 위하여 U-87MG 사람 신경교세포종 (glioblastoma) 세포에 Ba를 처리한 후 Akt 활성을 측정하였다.

Akt 효소는 serine-473 잔기에서 인산화가 일어나면 효소활성이 증가한다고 알려져있다. 본 실험에서는 면역블롯법을 이용하여 Akt의 serine-473 인산화 정도를 면역블롯법으로 측정하였다.

60-mm 배양접시에 1.5× 10⁶ 개의 U-87MG 세포를 첨가하고 24시간 배양한 후 10 ㎍/ml 농도의 BA1 약물을 처리하였다. 30분 후 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포는 1% Triton X-100, 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol이 함유된 세포용해 완충액으로 4℃에서 30분간 반응시키고 15,000 xg에서 15분간 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 15 ㎍의 단백질을 8% SDS-polyacrylamide에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀루로스막 (nitrocellulose membrane)에 전기적으로 부착시킨 후 5% 탈지 분유를 30분간 반응 하였다. Akt의 인산화된 serine-473 잔기만을 특이적으로 인지하는 항체 [anti-phospho-Akt(ser473); Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA]와 GAPDH 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)를 1 ㎍/ml 농도 되도록 희석한 후 단백질이 부착된 니트로셀루로스막에 각각 첨가하여 상온에서 2시간 이상 반응 시켰다. GAPDH 항체는 SDS-PAGE 젤에 첨가한 시료의 단백질양을 상대적으로 보정하기 위하여 사용하였다.

25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20이 함유된 TTBS 완충액으로 10분간 3회 세척한 후 Horseradish peroxidase가 결합하고 있는 anti-mouse IgG 항체를 가하고 1시간 30분 동안 반응시켰다.

TTBS 완충액으로 10분간 5회 세척한 후 Enhanced chemiluminescence (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) 기질 용액을 1분간 처리한 후 X-ray film에 노출시켜 인산화된 Akt 단백질 밴드와 GAPDH 밴드를 발색하였다 (도 7A 참조). X-ray film에 발색된 단백질 밴드는 quatitative densitometry를 이용하여 양적으로 변화되는 양을 측정하였다 (도 7B 참조).

본 실험 결과 BA1은 유의성있게 Akt의 serine-473 인산화를 감소시켰으므로 항암 효과가 우수할 것으로 판단되었다.

도 1은 본 발명의 화학식 1의 디펩타이드를 분리 정제하는 방법을 나타냄.

도 2는 본 발명의 화학식 1의 분취 고성능액체크로마토그라피.

도 3은 본 발명의 화학식 1의 질량분석 스펙트럼.

도 4는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 양성자핵자기공명스펙트럼(400MHz).

도 5는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 탄소핵자기공명스펙트럼 (100MHz).

도 6은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 구조.

도 7은 본 발명의 화학식 1에 의한 Akt 저해 활성을 나타냄.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1에 기재된 화합물을 인 비트로에서 신경교세포종에 처리하여 인 비트로에서 이들 세포 내 단백질 카이네이즈 B를 저해하는 방법.

   [화학식 1]

   
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