CN109928981B - 洋浦霉素类似物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用小单胞菌Micromonospora yangpuensis（保藏号DSM 45577）制备的新型洋浦霉素类似物及其抗癌及抗菌活性。同时本发明还对两种具体的洋浦霉素类似物的生物活性进行了初步测试，发现YPM F和YPM G展示出极强的体外抗肿瘤及抗菌活性，可用于制备抗肿瘤、抗菌药物。

Description

洋浦霉素类似物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及新型洋浦霉素类似物、制备方法及其抗肿瘤应用。

背景技术

烯二炔类天然产物是目前已知细胞毒性最强的小分子类化合物之一。虽然直接用作化学治疗剂毒性太大，但是烯二炔已被临床试验证实当使用基于聚合物或抗体的药物递送系统时对于抗癌疗法高度有效。抗体偶联药物包括高活性化合物弹头分子，并结合于具有靶向性的单克隆抗体，是目前非常有效的抗肿瘤及抗感染药物。烯二炔类化合物结构新型(含有独特的炔-烯-炔官能团)，且生物活性强，具有针对广泛的人癌细胞系具有亚纳摩尔抑制浓度，是理想的抗体偶联药物弹头分子。烯二炔作用机制独特，并选择性地引起DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。其中，一种十元环烯二炔卡利奇霉素的衍生物用作吉妥单抗和奥英妥珠单抗的弹头分子，已被美国食品药品监督管理局批准分别用于治疗急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病。另外一种烯二炔新制癌菌素作为聚合物药物共轭物用于治疗白血病和肝癌。另外两种烯二炔：力达霉素和Uncialamycin目前正处于不同阶段临床前试验。其中以Uncialamycin类似物作为弹头分子，已成功的与靶向间皮素的抗体结合产生新的一类抗体偶联药物。这一类抗体偶联药物在体外抗肿瘤活性测试中不仅具备了靶向特异性，并针对一系列人肿瘤细胞展示出纳摩尔级的抗肿瘤活性，在将来很有希望成为上市的临床药物。迄今为止,已发现的13种烯二炔类化合物显示出高达33％的成药性。与此同时，随着抗体偶联药物的发展越来越受到极少数可用弹头分子的限制，如阿霉素，奥瑞他汀，美登素和卡利奇霉素这些化合物。因此，发现新的烯二炔作为弹头分子候选物显得尤为迫切。

发明内容

针对以上现有困难和挑战，本发明提供了两种洋浦霉素类似物及其生物活性。具体是通过对 Micromonospora yangpuensis DSM 45577微生物发酵所得次级代谢产物中，在原有洋浦霉素族烯二炔类化合物基础上又分离得到两种新的洋浦霉素类似物。同时本发明还对两种新型洋浦霉素类似物的生物活性进行了初步体外测试。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供洋浦霉素F(YPM F)和洋浦霉素G(YPM G)，不论以其本身还是以缀合物使用，其均为具有抗菌和抗肿瘤效果。在一方面，提供了一种具有下式(Ⅰ)结构式的洋浦霉素类似物：

或者其可药用盐；

其中，R为羟基或氢。

当R为羟基时，结构式如式(II)所示：

此化合物定义为洋浦霉素F(YPM F)。

当R为氢时，结构式如式(III)所示：

此化合物定义洋浦霉素G(YPM G)。

在另一个实施方案中，提供了所述YPM F和YPM G其邻二醇结构作为化学衍生的连接位点在抗菌和抗肿瘤方面中的应用。

在另一个实施方案中，提供了所述YPM F和YPM G的生物活性的初步体外测试，采用4类细胞系，包括结肠肿瘤细胞系Caco-2、急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat、肺癌细胞系A549和乳腺肿瘤细胞系SKBR-3。

所述治疗抗肿瘤药物包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌等，以及恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤。

所述YPM F和YPM G的制备方法，包含以下步骤：

A、发酵：将10vol％的菌株小单胞菌Micromonospora yangpuensis在发酵培养基中发酵48h，加入大孔树脂SP825L；

B、分离：将发酵结束后的树脂过滤、干燥、真空浓缩、萃取，得到可溶部分；然后将可溶部分真空浓缩、洗涤，得到粗提物；将粗提物溶解、过柱、洗脱、真空浓缩，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)；进一步纯化Fr.3，得到9个组分(Fr.3.1-Fr.3.9)；进一步分离Fr.3.9，得到6个组分(Fr.3.9.1-Fr.3.9.6)；进一步分离Fr.3.9.5和Fr.3.9.6得到化合物；

优选的，所述步骤B后还包括检测，所述检测包括圆二色谱、高分辨质谱、核磁共振、高效液相色谱分析。

在本发明的一个实施方案中，所述小单胞菌Micromonospora yangpuensis的保藏号为DSM 45577。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中发酵培养基(每升)中为：可溶性淀粉10g，棉籽粉5g， CuSO₄ 0.05g，NaI5mg，CaCO₃ 2g。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中菌株小单胞菌Micromonosporayangpuensis DSM 45577 预先培养在含有50mL胰蛋白酶大豆肉汤的250mL带挡板的烧瓶中。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中菌株小单胞菌Micromonosporayangpuensis DSM 45577 预先培养物(10vol％)转移至发酵培养基中，并在30℃，230-250rpm下培养9-11天。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中大孔树脂SP825L的加入量为每100mL发酵培养基6g 树脂。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中发酵结束后的树脂通过离心分离或通过金属筛(60目) 过滤富集，用H₂O洗涤并在室温下在空气中干燥。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中干燥后的树脂用MeOH洗脱并在真空下浓缩，再用2 L EtOAc：H₂O(1：1)溶液萃取三次，得到乙酸乙酯可溶部分。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中可溶部分真空浓缩并用MeOH：正己烷(1：1)洗涤，得到粗提物。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中粗提物溶解在MeOH中，并过Sephadex LH-20色谱柱，用MeOH洗脱，得到四个组分。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中Fr.3通过Sephadex LH-20柱色谱法依次进一步纯化，得到9个组分(Fr.3.1-Fr.3.9)。

本发明提供了洋浦霉素类似物及其生物活性，具体是通过对Micromonosporayangpuensis DSM 45577微生物发酵所得次级代谢产物中，在原有洋浦霉素族烯二炔类化合物基础上又分离得到两种新的洋浦霉素类似物。同时本发明还对洋浦霉素类似物的生物活性进行了初步体外测试。更为重要的是， YPM F和YPM G独特的邻二醇结构也是首次在十元环蒽醌类烯二炔中报道。由于存在邻二醇这样一个在有机合成中广泛使用的结构域，意味着更容易成为抗体偶联药物中偶联链化学衍生的连接位点。因此，YPM F和YPM G很有希望成为下一代新型抗体偶联药物的弹头分子。

下面对本发明做进一步的解释和说明：

烯二炔类化合物有着独特的分子结构和生物活性，在所有的烯二炔类化合物中都包含一个由两个与双键共轭的炔基组成九元或十元环核心。烯二炔碳环的电子重排(伯格曼环化反应或Myers-Saito 重排)能产生一种瞬时的1-6苯型双自由基，当位于DNA的小沟内时，可以自由的从双链DNA中的脱氧核糖骨架中提取氢原子。以DNA为中心的自由基可以引起链间交联，或与分子氧反应最终导致DNA双链断裂，从而产生细胞毒性。

抗肿瘤活性测试结果为YPM F的体外抗肿瘤活性与已知的YPM A相当。值得注意的是，在肿瘤细胞系SKBR-3快速杀死实验中，YPM F较已知的YPM A显示出更快的杀伤作用。而YPM F和 YPM A在结肠肿瘤细胞系Caco-2和乳腺肿瘤细胞系SKBR-3的活性比YPMG(YPM G)至少高10 倍以上。YPM F和YPM G之间显著的活性差异再次证明了在蒽醌类烯二炔中，化合物氧化水平的增加与其细胞毒性的增加成正比例。同时，YPM F和YPM G独特的邻二醇结构也是首次在十元环蒽醌类烯二炔中报道。由于存在邻二醇这样一个在有机合成中广泛使用的结构域，意味着更容易成为抗体偶联药物中偶联链化学衍生的连接位点。因此，YPM F和YPM G很有希望成为下一代新型抗体偶联药物的弹头分子。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了新型的洋浦霉素类似物，其中YPM F与已知的YPM A的体外抗肿瘤和体外抗菌活性相当；

2、YPM F和YPM G都含有的邻二醇结构是在十元环烯二炔中首次报道，更容易成为抗体偶联药物中偶联链化学衍生的连接位点；

3、本发明的YPM F和YPM G有望成为一种新型的抗癌药物，特别是作为抗体偶联药物的弹头分子。

附图说明

图1是本发明的YPM F和YPM G的紫外吸收光谱图(UV)；

图2是本发明的YPM F和YPM A的圆二色谱(CD)；

图3是本发明的YPM F和YPM G针对体外肿瘤细胞系SKBR-3的快速杀死曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下所有百分含量均指质量百分含量。

实施例1

YPM F和YPM G的制备：

将菌株小单胞菌Micromonospora yangpuensis DSM 45577培养在含有50mL胰蛋白酶大豆肉汤的 250mL带挡板的烧瓶中。而发酵培养基中每升含有可溶性淀粉10g，棉籽粉5g，CuSO₄ 0.05g，NaI 5mg，CaCO₃ 2g，在高压灭菌前将pH调节至7.2。将种子培养物(10vol％)转移至发酵培养基中并在30℃和230-250rpm下培养9-11天。在发酵24-72小时后，将大孔吸附树脂SP825L加入到发酵培养基中(加入的树脂量为每100mL发酵液中6g)。

通过离心分离树脂或通过金属筛(60目)过滤，用H₂O洗涤并在室温下在空气中干燥。然后分别用3 L MeOH洗脱三次并在真空下浓缩。在2 L EtOAc：H₂O(1：1)之间萃取三次，得到乙酸乙酯可溶部分。然后将乙酸乙酯可溶的萃取物真空浓缩并用1L MeOH：正己烷(1：1)洗涤三次。真空浓缩MeOH萃取物，得到粗提物。将粗提物(4.33g)溶解在20mL MeOH中，并进行Sephadex LH-20 柱色谱，用MeOH洗脱，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)，将其真空浓缩，得到2.5g。分别为1g，0.25g 和14.7mg原料。通过Sephadex LH-20柱色谱法依次进一步纯化Fr.3，得到9个组分(Fr.3.1-Fr.3.9)。进一步分离Fr.3.9，使用半制备型HPLC，得到6个组分(Fr.3.9.1-Fr.3.9.6)。Fr.3.9.5进一步分离，使用半制备型HPLC，得到YPM F(15.5mg)；Fr.3.9.6进一步分离得到YPM G(5.6mg)。

化合物的分析：

CD谱在JASCO的J-815仪器上记录。HRMS谱在LTQ-ORBITRAP-ETD仪器上记录。使用Brucker，500 MHz或600 MHz质谱仪获得NMR谱。对于¹³C NMR谱，acetone-d₆(δ＝29.84，206.26 ppm)，对于¹H NMR于acrtone-d₆(δ＝2.05ppm)的ppm报告化学位移。柱层析在Sephadex LH-20 (GE Healthcare)上进行。在配备有PDA检测器和ACQUITY HPLC(Waters)，C18柱(2.7μm，4.6 mm×50mm，Waters)的Waters高效液相色谱(HPLC)系统上分析化合物1和2。流动相由缓冲液A (含有0.1％HCOOH的H₂O)和缓冲液B(含有0.1％HCOOH的色谱级MeOH)以0.4mL/min的流速施加。线性梯度程序(60％缓冲液A和40％缓冲液B至50％缓冲液A和50％缓冲液B2分钟， 50％缓冲液A和50％缓冲液B至0％缓冲液A和100％缓冲液B5分钟，然后施加60％缓冲液A和 40％缓冲液B 5分钟。使用配备Waters 2489 UV/Visible检测器并使用Welch Ultimate XB-Phenyl (250×10mm，5μm)的Waters 1525二元HPLC泵进行半制备反相高效液相色谱(RP-HPLC)。

YPM F的结构分析说明：

YPM F通过全面的结构分析进行了完整的结构表征。紫外光谱分析证明了YPM F(最大波长分别为236、255、549和586nm)含有十元环烯二炔类化合物中蒽醌的发色团。高分辨质谱(HRMS) 分析得到YPM F的[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为472.1028，与其标准分子式C₂₆H₁₇NO₈ ([C₂₆H₁₇NO₈+H]⁺，分子量为472.1032)的数值一致。¹H与¹³C核磁共振谱(NMR)，以及二维NMR 的联合分析表明YPM F中含有洋浦霉素的特征结构部分，包括十元环烯二炔基团和蒽醌基团。

YPM F:化合物颜色为紫色；[α]_D ²⁵+3400(C＝0.001,MeOH)；UV(MeOH)：λmax(logε)236nm, 255nm,549nm,586nm，见图1；CD谱见图2；¹H NMR(500 MHz,acetone-d₆)和¹³C NMR(125 MHz,acetone-d₆)数据见表1；HRMS：C₂₆H₁₈NO₈ ⁺[M+H]⁺的计算值：472.1032，实测值：472.1028。

表1 YPM F在acetone-d₆中的¹H NMR(500 MHz)和¹³C NMR(125 MHz)核磁共振数据

YPM F的结构式如式(II)所示：

YPM G的结构分析说明：

YPM G通过全面的结构分析进行了完整的结构表征。紫外光谱分析证明了YPM G(最大波长分别为256、539和556nm)含有十元环烯二炔类化合物中蒽醌的发色团。YPM G的高分辨质谱[M+ H]⁺分子离子峰(m/z)为456.1080，与其标准分子式C₂₆H₁₇NO₇([C₂₆H₁₇NO₇+H]⁺,分子量为456.1083)的数值一致。YPM G与YPM F的核磁共振数据对比表明两者结构十分相似，仅仅在C-6位置上缺少一个羟基。

YPM G：化合物颜色为紫色；[α]_D ²⁵+1900(C＝0.001,MeOH)；UV(MeOH)：λmax(logε)256nm, 539nm,556nm见图1；¹H NMR(600 MHz,acetone-d₆)和¹³C NMR(150 MHz,acetone-d₆)数据见表2；HRMS：C₂₆H₁₈NO₇ ⁺[M+H]⁺的计算值：456.1083，实测值：456.1080。

表2 YPM G在acetone-d₆中的¹H NMR(600 MHz)和¹³C NMR(150 MHz)核磁共振数据

YPM G的结构式如式(III)所示：

实施例3

YPM F和YPM G的体外抗肿瘤活性测试：

肿瘤及其它过度增殖疾病可以与导致细胞开始不可控制地再生的任何疾病有关，但是原型实例是癌症。癌症发生的主要原因则是细胞无法正常凋亡，因此任何作用于杀死癌症细胞的化合物均可能成为治疗癌症的重要治疗剂。在本发明公开内容中，YPM F和YPMG使肿瘤细胞的生存能力大大降低，具有有效的杀灭多种类型的肿瘤细胞系的能力。预计本公开内容的YPM F和YPM G可以用于治疗任何肿瘤细胞所引发的疾病。

可以用本公开内容的化合物治疗的肿瘤细胞包括但不限于来自血液、骨、骨髓、肺、肝、胃肠、结肠、皮肤、前列腺、乳腺、宫颈或子宫的细胞。此外癌症可以具体地具有以下组织学类型，但不限于以下这些:赘生物、恶性癌、未分化型巨细胞及纺锤细胞癌、小细胞癌、乳头状癌、鳞状细胞癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、毛基质癌、移行细胞癌、乳头状移行细胞癌、腺癌、胃泌素瘤、恶性胆管癌、肝细胞癌、结合性肝细胞癌、胆管癌、柱状腺瘤、囊腺癌、腺瘤性息肉中的腺癌、家族性结肠息肉症实体癌、类癌肿瘤、恶性细支气管-肺泡腺癌、乳头状腺癌、嫌色细胞癌、嗜酸细胞癌、嗜酸性腺癌、嗜碱细胞癌、透明细胞腺癌、颗粒细胞癌、滤泡状腺癌、乳头状及滤泡状腺癌、非包囊性硬化癌、肾上腺皮质癌、类子宫内膜癌、皮肤附件癌、大汗腺腺癌、皮脂腺癌、耵聍腺癌、黏液表皮样癌、囊腺癌、乳头状囊腺癌、乳头状浆液囊腺癌、黏液囊腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、浸润性腺管癌、髓样癌、小叶癌、炎性癌、佩吉特病乳腺、腺泡细胞癌、腺鳞状细胞癌、具有鳞状细胞化生的腺癌、胸腺瘤、恶性卵巢基质瘤、恶性泡膜细胞瘤、恶性颗粒形细胞瘤、其它特定的非霍奇金淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、多发性骨髓瘤、肥大细胞肉瘤、免疫增生性小肠疾病、白血病、淋巴细胞性白血病、浆细胞白血病、红细胞白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、髓性白血病、嗜碱粒细胞白血病、嗜酸粒细胞白血病、单核细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核母细胞白血病、髓性肉瘤和多毛细胞白血病。现对本发明的YPM F和YPM G列举四种不同类型的人肿瘤细胞系Caco-2，Jurkat，A549，SKBR-3的体外抗肿瘤活性。通过MTT法测定评估YPM F和YPM G的细胞毒性。将四种人肿瘤细胞系以每孔 2,000至4,000个细胞的密度接种在96孔板(Corning，Germany)中。24小时后，用不同浓度的测试化合物处理细胞。进一步孵育72小时后，通过添加细胞计数试剂盒溶液(10μL/孔)测定细胞存活 (在450nm处测量吸光度)。表3是通过MTT法来分析来测试YPM F和YPM G的体外抗肿瘤活性，并与已知的YPM A和临床用药丝裂霉素(Mitomycin)进行比较。整体来看，洋浦霉素类似物针对所列举的四种肿瘤细胞系的细胞毒性达到纳摩尔级，远远高于临床用药丝裂霉素的微摩尔级。

表3 YPM F和YPM G的体外抗肿瘤活性

实施例4

YPM F和YPM G的体外抗菌活性测试：

本文所公开的YPM F和YPM G可以用于治疗细菌感染。尽管人在他们的身体上和内部含有多种不同的细菌，但是细菌水平的不平衡或病原细菌的引入可以导致有症状的细菌感染。病原细菌导致多种不同的疾病，其包括但不限于多种食物传播的疾病、伤寒、肺结核、肺炎、梅毒和麻风。不同的细菌与身体具有广泛的相互作用，并且这些相互作用可以调节细菌导致感染的能力。例如，细菌可以是条件致病的，以使得它们仅在特定条件下导致感染。例如，葡萄球菌属和链球菌属细菌存在于正常人细菌生物群落中，但是当它们定殖到身体其它部分时，这些细菌导致皮肤感染、肺炎或脓毒病。另一些细菌被称为机会病原体，,仅在免疫系统较弱或患有另一种疾病或病症的患者中导致疾病。细菌还可以是胞内病原体，其可以在宿主生物体的细胞内生长和再生。最后，细菌感染可以针对身体内或身体上的特定位置。例如，如果仅暴露于特定器官，则细菌可以是无害的，但是当它与特定器官或组织接触时，则所述细菌可以开始复制并导致细菌感染。

具体地，本发明人考虑了细菌感染的治疗，包括金黄色葡萄球菌所引起的细菌感染。金黄色葡萄球菌是主要的人体病原体，其导致从轻度皮肤和软组织感染以及食物中毒到危急生命的疾病(如深部术后感染、败血病、心内膜炎、坏死性肺炎和中毒性休克综合征等多种疾病)。这些生物体具有积累其它抗生素抗性决定簇的显著能力，从而导致形成多药物抗性菌株。另外，本发明所提供的化合物可以用于治疗大肠杆菌感染。大肠杆菌(Escherichia coli)是人肠道中最主要且数量最多的一种短杆状细菌，属于革兰氏阴性菌同时还具备多重耐药，因此发掘新型抗生素在治疗上是重要的。

测试YPM F和YPM G对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，标准金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 29213)和大肠杆菌(E.coli)的抗菌活性。使用微量肉汤稀释法确定其最小抑菌浓度(MIC)。将菌株培养过夜并在Luria-Bertani肉汤中稀释至10⁶ CFU/mL。将YPM F和YPM G溶解于DMSO中，连续稀释至20个浓度(1,2,4,8,16,32,64,128,256和512ng/mL；1,2,4,8,16,32,64,128,256和512 pg/mL)在每个96孔板上。将万古霉素溶解在DMSO中，在每个96孔板上连续稀释至10个浓度 (0.03125-16μg/mL)。每孔混合100μL洋浦霉素类似物(包含之前被报道过的洋浦霉素A(YPM A)) 或万古霉素和100μL菌液。万古霉素和未处理的培养基分别作为阳性和阴性对照。在每个96孔板上一式两份地测试YPM F和YPM G和对照组洋浦霉素A和万古霉素。将96孔板在37℃下孵育18小时。最后，向每个孔中加入50μL刃天青以显示结果。结果如表4所示。

正对照临床用药万古霉素针对标准标准金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1μg/mL，实验对照组洋浦霉素类似物(包含之前被报道过的YPMA)的最小抑菌浓度普遍达到pg/mL浓度级别。特别是万古霉素显示抗菌无效的革兰氏阴性菌大肠杆菌，洋浦霉素类似物显示出ng/mL级别以及更强的体外抗菌活性。尤其是YPM F，其MIC更是低至32pg/mL，活性为已知YPM A的4倍。

表4 YPM F和YPM G对S.aureus ATCC 29213,MRSA和E.coli的MIC值

实施例5

YPM F和YPM G测试针对体外肿瘤细胞系SKBR-3的快速杀死测试：

通过MTT法测定评估YPM F和YPM G对肿瘤细胞的快速杀死能力。将肿瘤细胞系SKBR-3以每孔2,000至4,000个细胞的密度接种在96孔板(Corning，Germany)中。24小时后，用不同浓度的测试化合物处理细胞。进一步孵育8小时后，通过添加细胞计数试剂盒溶液(10μL/孔)测定细胞存活(在450nm处测量吸光度)。检测YPM F和YPM G测试针对体外肿瘤细胞系SKBR-3的快速杀死能力，并与已知的YPM A和临床用药丝裂霉素进行比较，结果如图3所示。在肿瘤细胞系SKBR-3 快速杀死实验中，YPM F较已知的YPM A显示出更快的杀伤作用。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (4)

1.一种如式（Ⅰ）所示洋浦霉素（yangpumicin）类似物：

其中，R为羟基。

2.一种如权利要求1所述的洋浦霉素类似物在制备抗菌和抗肿瘤药物方面的用途。

3.一种制备权利要求1所述洋浦霉素类似物的方法，其特征在于，包含以下步骤：

A、发酵：将10 vol%的小单胞菌Micromonosporayangpuensis的种子培养液接种至发酵生产培养基中，并在发酵24-72小时后，加入大孔吸附树脂；

B、分离：将发酵结束后的树脂过滤、干燥、真空浓缩、萃取，得到可溶部分；然后将可溶部分真空浓缩、洗涤，得到粗提物；将粗提物溶解、过柱、洗脱、真空浓缩，得到四个组分，分别为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4；进一步纯化Fr.3，得到9个组分，分别为Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.3.3、Fr.3.4、Fr.3.5、Fr.3.6、Fr.3.7、Fr.3.8、Fr.3.9；进一步分离Fr.3.9，得到6个组分Fr.3.9.1、Fr.3.9.2、Fr.3.9.3、Fr.3.9.4、Fr.3.9.5、Fr.3.9.6、；进一步分离Fr. 3.9.5和Fr. 3.9.6得到洋浦霉素类似物；

所述步骤A中发酵生产培养基为：每升发酵生产培养基的成分为可溶性淀粉10g，棉籽粉5g， CuSO₄ 0.05g，NaI 5 mg，CaCO₃ 2g；

所述步骤A中大孔树脂为SP825L，所述SP825L的加入量为每100mL发酵培养基6g 树脂；

所述步骤B中干燥后的树脂用MeOH洗脱并在真空下浓缩；

所述步骤B中粗提物溶解在MeOH中，并过Sephadex LH-20色谱柱，用MeOH洗脱，得到四个组分；

所述小单胞菌Micromonosporayangpuensis的保藏号为DSM 45577。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B后还包括检测，所述检测包括圆二色谱、高分辨质谱、核磁共振、高效液相色谱分析。

Images