JP5120884B2 - ラッカーゼ活性を有する新規タンパク質 - Google Patents
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(1)ラッカーゼ活性および以下の特性(1)〜(8)を有するタンパク質:
(1)サブユニット分子量:約36,000〜37,000Da(SDS−PAGE);活性体分子量:約70,000〜80,000Da(ゲル濾過)、
(2)至適pH:約8〜9、
(3)基質特異性:フェノール性化合物、複素環式化合物およびアスコルビン酸を酸化する、
(4)反応混合物中に銅を必要としない、
(5)熱安定性:80℃にて10分間の処理により、90%以上の活性が保持される、
(6)界面活性剤耐性:1%ドデシル硫酸ナトリウム存在下で、90%以上の活性が保持される、
(7)キレート剤耐性:5〜50mMエチレンジアミン四酢酸存在下で、90%以上の活性が保持される、
(8)活性に糖鎖修飾を必要としない。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸35−359に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列を含み、前記特性(1)〜(8)を有するタンパク質;
(d)上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記特性(1)〜(8)を有するタンパク質。
(4)上記(1)または(2)に記載のタンパク質をコードするDNA。
(5)以下の(a)〜(c):
(a)配列番号1に示される塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号1の103−1077位に示される塩基配列を含むDNA、
(c)上記(a)または(b)のDNAの塩基配列において、1個もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列を含むDNA、
(d)上記(a)または(b)のDNAの塩基配列と少なくとも90%の同一性を有する塩基配列を含むDNA
のいずれかである、上記(4)に記載のDNA。
(7)上記(4)もしくは(5)に記載のDNAまたは上記(6)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(8)上記(1)〜(3)のいずれか1つに記載のタンパク質の製造方法であって、該タンパク質を産生し得る条件下で上記(7)に記載の宿主細胞を培養するステップ、細胞または培地から該タンパク質を回収するステップ、および場合により該タンパク質を化学修飾するステップを含む、上記方法。
(1)サブユニット分子量:約36,000〜37,000Da(SDS−PAGE);活性体分子量:約70,000〜80,000Da(ゲル濾過)、
(2)至適pH:約8〜9、
(3)基質特異性:フェノール性化合物、複素環式化合物およびアスコルビン酸を酸化する、
(4)反応混合物中に銅を必要としない、
(5)熱安定性:80℃にて10分間の処理により、90%以上の活性が保持される、
(6)界面活性剤耐性:1%ドデシル硫酸ナトリウム存在下で、90%以上の活性が保持される、
(7)キレート剤耐性:5〜50mMエチレンジアミン四酢酸存在下で、90%以上の活性が保持される、
(8)活性に糖鎖修飾を必要としない、
を有するタンパク質に関する。
(1)ラッカーゼ遺伝子のクローニング
活性汚泥から抽出したメタゲノムDNAを平均鎖長2〜3kbとなるように物理的に剪断し、T4 DNAポリメラーゼにより末端を平滑化した。次いで、得られたDNA混合物をアンピシリン耐性遺伝子を担持するプラスミドpUC118とライゲーションすることにより、環境メタゲノムライブラリーを作製した。プラスミドとのライゲーションにはT4 DNAリガーゼ(タカラバイオ社製)を使用した。このライゲーション溶液を用いて大腸菌コンピテントセルJM109を形質転換した。100μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレート上での培養により、形質転換体を選択した。
陽性クローンが有するベクターのインサートDNAの塩基配列を解析した結果、配列番号1に示される塩基配列を有する遺伝子配列が含まれることが明らかになった。配列番号1に示される塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列(配列番号2)は、BLAST−P検索では既知のラッカーゼタンパク質とは有意な相同性が見らなかった。このことから、得られた遺伝子が新規ラッカーゼ遺伝子であることが示唆された。
配列番号2に示されるアミノ酸配列について、SignalP3.0プログラムを用いてシグナルペプチド予測を行った(Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. Bendtsen,J.D.,Nielsen,H.,von Heijne,G. and Brunak,S., J. Mol. Biol.,340:783−795,2004.)。ソフトウェアは開発者により提供されているオンライン使用できるサーバー上で行った(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
(1)DNA構築物の作製
上述のシグナルペプチド領域を除いた配列番号2のアミノ酸35−359に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現構築物を、以下のようにして作製した。
5’−ttttcatATGGCAGAGAGGGAATTTGATATGACTATTGAG−3’(配列番号3)
5’−tttttaagcttCCTCCCTGGACGACGTTGACGTTGTTC−3’(配列番号4)
を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、実施例1で得られた陽性クローンに含まれていたプラスミドDNAを鋳型として、定法に従いPCRを行って、配列番号1の103−1077位に示される塩基配列を有するラッカーゼ遺伝子を増幅した。得られた産物を0.8%アガロースゲル電気泳動により分離して、約1kbのバンドを切り出した。PCR Purification kit(キアゲン社製)を用いてPCR産物を精製し、水で溶出した。制限酵素NdeIおよびHindIII(NEB社製)を用いてDNAを消化し、PCR Purification kit(キアゲン社製)を用いてDNA断片を精製し、水で溶出した。同様に、プラスミドpET−29b(+)をNdeIおよびHindIIIを用いて消化し、キットを用いてDNA断片を精製し、水で溶出した。これらのDNA断片溶液を等量混合し、T4 DNAリガーゼ(NEB社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション溶液で大腸菌JM109を形質転換し、50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の組み換えプラスミドを有するクローンを選択し、陽性クローンからプラスミドを精製した。このプラスミドは、配列番号2のアミノ酸35−359に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのコード配列を、該ポリペプチドのN末端に開始メチオニン残基が、またC末端にHisタグが付加された形で有する。作製されたコード配列の塩基配列を配列番号5に、アミノ酸配列を配列番号6にそれぞれ示す。
上記で作製したプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天プレート上で培養することにより、形質転換体を選択した。それぞれ1コロニーをピックアップし、カナマイシン(50μg/mL)、オーバーナイトエクスプレス溶液1(ノバジェン社製)(製造元の使用説明書に従い使用)、硫酸銅(0.1mM)を含むLB培地1Lに植菌し、30℃にて24時間培養した。
上記のカラム溶出画分のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、得られたラッカーゼタンパク質の分子量は約40kDaであると推定された。C末端に融合しているHisタグの推定分子量を考慮すると、本発明の新規ラッカーゼタンパク質のみの分子量は約36,000〜37,000Daであると予想される。
上記のカラム溶出画分を20mMトリス塩酸(pH8.0)、0.2M塩化ナトリウムに対して透析した。透析後のタンパク質溶液を限外濾過カラムウルトラ−15(アミコン社製)を用いて約10mg/mLまで濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムSuperose6(GEヘルスケア社製)を用いて分析した。20mMリン酸ナトリウム(pH7.4)、0.2M塩化ナトリウムを溶出液として用い、流速は0.6mL/分とした。分子量標準としてBROAD RANGE(バイオラッド社製)を用いた。
(1)サンプル調製
上記実施例4で透析・濃縮した精製タンパク質約10μgを、サンプルバッファー(終濃度:30%グリセロール、0.25%キシレンシアノール、0.25%ブロモフェノールブルー、1%SDS)を用いて処理し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。サンプル調製の際に、メルカプトエタノール添加・不添加、熱処理(99℃、10分間)あり・なしの4種類のサンプルを作製した。
メルカプトエタノールを添加したサンプルについて、電気泳動後にゲルを水道水で10分間洗浄し、クーマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質染色した。その結果、熱処理なしのサンプルでは約75kDa(本発明のタンパク質のみでの推定分子量70kDa)、熱処理ありのサンプルでは約40kDa(本発明のタンパク質のみでの推定分子量36kDa)のバンドが検出された。
一方、メルカプトエタノールを添加していないサンプルについて、電気泳動後にゲルを水道水で10分間洗浄し、McIlvaine緩衝液(pH8.5)、1mMガーリック酸を含む溶液に浸漬した。この染色では、活性型酵素の分子量を検出することができる。結果を図2に示す。その結果、熱処理ありのサンプルでは約75kDaの位置に弱いバンドが検出され、熱処理なしのサンプルでは約75kDaの位置に強いバンドが検出された。モノマーのサブユニット分子量と推定される40kDa付近には染色バンドがなく、機能分子量が約70kDaであることが示唆された。
pH5.0〜9.0の範囲のMcIlvaine緩衝液、1mMグアイアコール反応液中で、5μgの精製タンパク質を用いて酸化反応を行った。酸化反応の検出は、マイクロプレートリーダーVersaMax(Molecular Devices社製)を用いた470nmにおける吸光度測定により行った。反応開始から5分間の反応速度をpHに対してプロットした。結果を図3に示す。結果から、本発明の新規ラッカーゼタンパク質がアルカリ条件で強い活性を有することが示された。
界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウムの存在(1%)または不存在下で、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.4)、1mM シリンガルダジンを含む反応溶液を調製した。5μgの精製タンパク質を用いて25℃にて酸化反応を行った。酸化反応の検出は、マイクロプレートリーダーVersaMax(Molecular Devices社製)を用いた530nmにおける吸光度測定により行った。
金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を種々の濃度(0、5、10、20および50mM)で添加して、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.4)、1mM シリンガルダジンを含む反応溶液を調製した。5μgの精製タンパク質を用いて25℃にて酸化反応を行った。酸化反応の検出は、マイクロプレートリーダーVersaMax(Molecular Devices社製)を用いた530nmにおける吸光度測定により行った。
20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、0.2M塩化ナトリウム中に精製タンパク質を1mg/mLの濃度で溶解させ、それぞれ40℃、50℃、60℃、70℃、80℃または90℃にて10分間加熱した。熱処理後の残存活性を、McIlvaine緩衝液、1mMグアイアコール反応液を用いた酸化反応により測定した。その結果、加熱処理なしの対照と比較して、40℃、50℃、60℃、70℃または80℃で処理したサンプルは同等の活性を有していた。90℃で処理したサンプルの活性は、対照と比較して85%であった。これにより、本発明の新規ラッカーゼタンパク質は、80℃、10分という加熱処理によって顕著に活性が低下せず、優れた熱安定性を有していることが示された。
McIlvaine緩衝液(pH8.5)に種々の基質を終濃度1mMで添加し、精製タンパク質5μgを用いて25℃にて酸化反応を行った。
上記実施例2と同様にして、配列番号1に示されるコード配列の全長を含む発現ベクターを構築した。配列番号2に示されるアミノ酸配列全長のN末端またはC末端にHisタグを付加したコード配列を含む2種類の発現ベクターを作製し、タンパク質の発現および金属アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる精製を試みた。
また、活性分析の結果もシグナルペプチド除去タンパク質と同様であった。
配列番号3、4:プライマー
配列番号5、6:合成構築物
Claims (8)
- ラッカーゼ活性および以下の特性(1)〜(8)の全てを有するタンパク質:
(1)サブユニット分子量:約36,000〜37,000Da(SDS−PAGE);活性体分子量:約70,000〜80,000Da(ゲル濾過)、
(2)至適pH:約8〜9、
(3)基質特異性:フェノール性化合物、複素環式化合物およびアスコルビン酸を酸化する、
(4)反応混合物中に銅を必要としない、
(5)熱安定性:80℃にて10分間の処理により、90%以上の活性が保持される、
(6)界面活性剤耐性:1%ドデシル硫酸ナトリウム存在下で、90%以上の活性が保持される、
(7)キレート剤耐性:5〜50mMエチレンジアミン四酢酸存在下で、90%以上の活性が保持される、
(8)活性に糖鎖修飾を必要としない。 - 以下の(a)〜(d)のいずれかである、請求項1に記載のタンパク質:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸35−359に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むアミノ酸配列を含み、前記特性(1)〜(8)の全てを有するタンパク質;
(d)上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記特性(1)〜(8)の全てを有するタンパク質。 - 化学的に修飾された、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 請求項1または2に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 以下の(a)〜(d):
(a)配列番号1に示される塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号1の103−1077位に示される塩基配列を含むDNA、
(c)上記(a)または(b)のDNAの塩基配列において、1個もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含む塩基配列を含むDNA、
(d)上記(a)または(b)のDNAの塩基配列と少なくとも90%の同一性を有する塩基配列を含むDNA
のいずれかである、請求項4に記載のDNA。 - 請求項4または5に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4もしくは5に記載のDNAまたは請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質の製造方法であって、該タンパク質を産生し得る条件下で請求項7に記載の宿主細胞を培養するステップ、細胞または培地から該タンパク質を回収するステップ、および場合により該タンパク質を化学修飾するステップを含む、上記方法。
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