JP5118281B2 - 両親媒性ポリマーベシクル - Google Patents

Description

【０００１】
（関連出願） 本出願は、１９９９年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６０／１６３，６７８号、２０００年７月１３日に出願された米国特許出願第０９／６１５，３０５号に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の技術分野）本発明は、一般にベシクルの分野にある。さらに詳細には、本発明は、安定性が向上した自己集合性ポリマーベシクルの分野にある。
【０００３】
（発明の背景） 自己組織性または自己集合性構造は既知である。一般的な例は、リポソームである。リポソームは、好ましくは界面活性剤がの存在下で、水中での両親媒性（場合によっては疎水性または親油性）分子を乳化することによって作成される。リポソームは、様々な脂質から製造される単層または多層球のどちらかである。例えば薬剤は、リポソーム内にカプセル化するか、リポソーム膜内に捕捉することができる。
【０００４】
従来技術で既知の自己集合性構造の安定性は、限定されていることが多く、例えば静脈投与後に、血液からの薬剤装填ベシクルの急速クリアランスが誘導される。安定性向上のためのさまざまな方法には、分解に対してさらに耐性である架橋リポソームが含まれる。表面を「ＰＥＧ化した」、すなわち、表面にポリエチレングリコールを被覆するか、または結合させたリポソームは、患者への投与後の循環時間が長くなる。安定性を高めたリポソームを調製する他の方法は、乳化重合および界面重合などの調製技術を含む。しかし、これらの技術はかなり攻撃的な反応条件を必要とするため、これらの手順では感受性の物質を使用できない。リポソームの安定性は、ベシクル凝集体における親水性ポリマーの表面グラフトによってまたは反応の脂質分子の重合によって向上させることができる。最近、ベシクルの脂質二重層を疎水性モノマーによって膨潤させ、次に重合させることによって、同様のベシクルの機械的安定化が得られた。
【０００５】
ナノメータおよびマイクロメータの大きさの球状ポリマー殻を調製するための別の方法は、マイクロメーターのサイズの球面のポリマーに荷電したナノ粒子の表面への高分子電解質の層ごとの堆積、次いでテンプレート粒子の溶解または両親媒性ジブロックコポリマーのミセル内への自己集合、それらの親水性殻の選択の架橋、およびその後の疎水性核の分解が含まれる。適切な条件の下で両親媒性ブロック共重合体が自発的にベシクル構造に凝集できることは数年間の既知であったが、中空球形態を用いた凝集体のこのような直接形成は、ポリマーナノカプセルを調製するある１つのケースで使用されただけである。しかし本方法は、むしろ複雑な方法を使用した。ヘキサン中でのポリ（イソプレン）−ブロック−ポリ（２−シナモイルエチルメタクリラート）（ＰＩ−ＰＣＥＭＡ）ジブロックコポリマーの形成に続いて、ＰＣＥＭＡブロックの光架橋、さらに水溶性の中空ナノ球体を作成するためのＰＩブロックの選択的ヒドロキシル化を行った。
【０００６】
したがって本発明の目的は、両親媒性分子の自己組織性の概念を使用して、機械的および化学的に安定な新しい種類のベシクルおよびナノカプセルを提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、これらの構造物を製造するために、両親媒性コポリマー、１つの実施例においては、架橋可能なトリブロックコポリマーを提供することである。
【０００８】
さらなる目的は、両親媒性コポリマーからベシクルおよびナノカプセルを作成する方法を提供することである。
【０００９】
さらなる目的は、両親媒性コポリマーから作成された、膜壁に分子が挿入されたベシクルおよびナノカプセルを提供することである。
【００１０】
（発明の概要） ベシクルはセグメント化された両親媒性Ａ＋Ｂコポリマーから作成され、ここでＡは親水性であり、Ｂは疎水性であり、油または水に分散させると自己集合する。１つの態様において、ベシクルはＡＢＡトリブロックコポリマーから作成され、ここで内核は親水性であり、中間層は疎水性であり、外殻は親水性である。別の態様において、ベシクルはＢＡＢトリブロックコポリマーから作成される。別の態様において、ベシクルはＡＢジブロックコポリマーによって作成される。コポリマーはベシクルに形成して、次にナノカプセル作成のために安定化させる目的で、重合または架橋した。
【００１１】
ベシクルは、末端基重合によっておよび／または内部基を架橋することによって安定化できる。重合および架橋は、イオン結合、共有結合および／または他の種類の結合によって行える。１つの態様において、コポリマーの末端基が重合される。重合は、通常は光開始剤の存在下での光重合、またはレドックス重合などの、多くの手段によって行える。１つの態様において、ベシクルを架橋して、送達する薬剤をカプセル化した後、ナノカプセルを形成する。
【００１２】
ベシクルまたは架橋ナノカプセルは、多くの目的に使用できる。１つの態様において、ナノカプセルを用いて、治療用、予防用または診断用薬剤を必要とする患者に送達する。例えばＡＢＡコポリマーを使用する場合、親水性薬剤をベシクル内にカプセル化するか、疎水性薬剤をベシクルの中間層にカプセル化することができる。
【００１３】
別の態様において、脂質膜タンパクなどの分子をベシクル膜に挿入する。続く膜の重合／架橋は、分子を不活性にしない。
【００１４】
別の局面においては、両親媒性コポリマーからベシクルおよびナノカプセルを作成する方法を開示する。 （好ましい態様の詳細な説明）
【００１５】
定義 ベシクルという語は本明細書で使用されるように、一般に球面の形で、内部に空隙を有する、自然に形成される凝集体のことを指す。
【００１６】
ナノスフィアおよびナノカプセルという語は、本明細書では同義的に使用され、架橋によって安定化されるベシクルを指す。ナノカプセルが一般にナノメータサイズ範囲である一方、それらは約２０ミクロンもの大きさになることがある。したがってこの語は、ナノメータサイズ範囲のカプセルに限定されていない。カプセルは、球形であっても、他のどんな形状でもよい。
【００１７】
重合という語は本明細書で使用されるように、両親媒性コポリマーの末端への給合を指す。
【００１８】
架橋という語は本明細書で使用されるように、他のコポリマーへの、コポリマーの任意部分の共有またはイオン結合と同様、末端への結合を含むすべての型に結びつく内部ポリマーを表している。架橋は、末端基または内部基によることが可能であり、共有、イオンあるいは他の種類の結合でもよい。
【００１９】
１以上の親水性Ａセグメントおよび１以上の疎水性Ｂセグメントを含み、ベシクルを形成するために自己集合するセグメント化コポリマーと、そのようなベシクルを作成する方法を開示する。主に本明細書で述べるコポリマーは、ブロックコポリマーである。この語が直鎖状ブロックコポリマーはもちろんのこと、ＡおよびＢセグメントの両方を含むグラフトおよびコーム構造などの、他の各種の構造を指すことも理解される。
【００２０】
様々な種類の両親媒性コポリマーを使用できる。１つの態様において、コポリマーはＡＢＡコポリマーであり、ここでＡは親水性であり、Ｂは疎水性である。親水性内部層および外部層および中間疎水性層を有するベシクルが作成される。別の態様において、ＢＡＢコポリマーが使用され、疎水性内部層および外部層および中間親水性層を有する「逆ベシクル」が作成される。Ａが水／油混合物において親水性である、ＡＢＡコポリマーを用いた別の態様において、親水性、Ｕ字形分子を有するベシクルが形成され、コポリマーの各親水性末端はベシクルの外面にあり、コポリマーの疎水性中間セグメントはベシクルの内部空隙に向かっている。ベシクルの内部には、油が充填されている。使用する液相によって、ベシクルの外側または内側が親水性であり、反対側が疎水性である、ＡＢセグメント化コポリマーも使用することもできる。
【００２１】
コポリマーによるベシクルの形成は、セグメント化されたコポリマーの両親媒性性質の結果である。凝集は非共有相互作用を経て発生するため、可逆的である。ベシクルは、安定性をさらに与えるために架橋することができる。コポリマーは末端基によって重合されるか、内部の架橋可能な基によって架橋されるか、末端基および内部基の重合／架橋の組合せを使用することができることが理解されるべきである。ベシクルが架橋される場合、結果として生じるナノカプセルはさらに安定かつ形状持続性であり、水溶液から取り出された後でさえ、中空形態を維持することができる。
【００２２】
特定のベシクルの安定性は、大部分が、コポリマー間の疎水性および親水性相互作用の強さに依存する。強度も、親水性および疎水性セグメント間の結合の安定性に依存し、親水性または疎水性セグメントと重合とユニット間の接合部にも、使用される場合には依存する。安定性はさらに、重合または架橋の強度にも依存する。ベシクルの安定性は、親水性および疎水性セグメント間、親水性または疎水性セグメント内、あるいは親水性または疎水性セグメントおよび重合単位の間に、生分解性結合またはイオン性架橋などの弱い結合を導入すると低下させることができる。
【００２３】
架橋は、例えば、光重合開始剤の存在下での、またはアルキル化剤の使用によるアクリレート基の光重合を含め、多くの標準技術を使用して行える。架橋はまた、フリーラジカル重合によって重合できる側鎖基および末端基、カチオン重合によって重合できる側鎖基、および開環重合によって重合できる側鎖基を使用して行える。
【００２４】
親水性および疎水性セグメントに加え、膜は、反応性基を有するモノマーまたはマクロマーなどの架橋剤、界面活性剤および架橋開始剤、特に光開始剤と同様に、追加の疎水性および／または親水性成分も含むことができる。標的または生体信号分子は、ベシクルの外側表面に結合できる。
【００２５】
１．両親媒性コポリマー ベシクルは、親水性および疎水性セグメントを含む両親媒性セグメント化コポリマーによって形成される。１つの態様において、コポリマーはＡＢＡコポリマーであり、Ａは同一または異なる親水性セグメントであり、Ｂは疎水性セグメントである。
【００２６】
適切な重合材料の１つのクラスは、Hirtらへの米国特許第５，８０７，９４４号に記載されている。そこで開示される物質は主としてコンタクトレンズ用であるため、物質が酸素およびイオン透過性であることはたいへん望ましい。このことはドラッグデリバリーなどの、他の用途の要求事項ではないが、実際は一部の用途において望ましくない。１つの態様において、両親媒性ポリマーは、生体適合性である。多くの適切な両親媒性コポリマーならびに疎水性および親水性コポリマーが、国際公開公報第９７／４９３８７号に記載されている。
【００２７】
Ａ．親水性および疎水性セグメント 両親媒性セグメント化コポリマーは、疎水性ポリマーを含む１以上のセグメントＢを含む。これに限定されるわけではないが、ポリジメチルシロキサンおよびポリジフェニルシロキサンなどのポリシロキサン、ペルフルオロポリエーテル、ポリスチレン、ポリオキシプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリオキシブチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアルキルアクリレート（ＰＡＡ）、ポリアルキルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ＰＴＨＦ、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスルホン、ポリビニルエーテルおよびポリ（プロピレンオキシド）およびそのコポリマーなどの、多数の疎水性ポリマーのいずれでも使用できる。
【００２８】
疎水性セグメントは、支配的な量の疎水性モノマーを好ましくは含む。疎水性モノマーは、通常、水に不溶性のホモポリマーを与えるモノマーであって、水の１０重量％未満を吸収できる。
【００２９】
適切な疎水性モノマーは、Ｃ１−Ｃ１８のアルキルおよびＣ３−Ｃ１８シクロアルキルアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３−Ｃ１８アルキルアクリルアミドおよびメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニルＣ１−Ｃ１８アルカノエート、Ｃ２−Ｃ１８アルケン、Ｃ２−Ｃ１８ハロアルケン、スチレン、（低級アルキル）スチレン、Ｃ４−Ｃ１２アルキルビニルエーテル、Ｃ２−Ｃ１０ペルフルオロアルキルアクリレートおよびメタクリレートならびに対応する部分的にフッ素化されたアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３−Ｃ１２ペルフルオロアルキルエチルチオカルボニルアミノエチルアクリレートおよびメタクリレート、アクリロキシおよびメタクリロキシアルキルシロキサン、Ｎ−ビニルカルバゾール、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、メサコン酸、酢酸ビニル、ビニルプロピオナート、ビニルブチラート、ビニル吉草酸、クロロプレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルトルエン、ビニルエチルエーテル、ペルフルオロヘキシルエチルチオカルボニルアミノエチルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、トリフルオロエチルメタクリレート、ヘキサフルオロイソプロピルメタクリレート、ヘキサフルオロブチルメタクリレート、トリストリメチルシリロキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＲＩＳ）および３−メタクリロキシプロピルペンタメチルジオキサンのＣ１−Ｃ１２アルキルエステルである。
【００３０】
１つの態様において、これに限定されるわけではないが、ポリシロキサン、ペルフルオロアルキルエーテル、特定の不飽和ポリマーおよびポリスルホンなどの疎水性ポリマーは比較的高い、それを通過する酸素拡散速度を示す。１つの態様において、疎水性ポリマーは端子アルキレン基を有するポリシロキサンブロックである。
【００３１】
もう１つの態様において、疎水性ポリマーは、ペルフルオロアルキル−ポリエーテルブロックを含む。もう１つの態様において、疎水性ポリマーは、ハロゲンまたは低級アルキルによって置換される共役脂肪族または脂環式ジエンなどの不飽和ポリマーを含み、これらは低級アルキルまたはトリメチルシリル、共役ジエンおよび親水性か疎水性ビニルモノマーのコポリマーによって、またこれらの化合物の部分的に水和された誘導体によって置換されることがある。
【００３２】
共役ジエンの好ましい具体例は、シス、トランス、イソまたはシンジオタクチックポリ１，２−ブタジエン、ポリ１，４−ブタジエンまたはポリイソプレン、ポリペンテナマー、ポリクロロプレンおよびポリピペリレンである。コポリマーの好ましい例は、アクリロニトリル、スチレン、アクリル酸またはヒドロキシメチルメタクリレートなどの親水性または疎水性ビニルモノマーを有するブタジエンたはイソプレン−コポリマーである。ポリアルキンの例は、ポリ−１−トリメチルシリル−プロピンである。特に好ましい不飽和ポリマーは、シンジオタクチックポリ−１，２−ブタジエン、ポリ−１，４−ブタジエンおよびポリイソプレンである。特に好ましい不飽和ポリマーは、ポリ−１−トリメチルシリル−プロピンである。特に好ましい他の不飽和ポリマーは、ポリ−１，４−ブタジエンである。
【００３３】
疎水性ポリマーは、１種類のポリマー、または上述の２種以上のポリマーなどの、２種類以上のポリマーを含むことがある。１個のセグメントＢの平均分子量は、約５００〜約５０，０００の範囲、好ましくは約８００〜約１５，０００の範囲、より好ましくは、約１，０００〜１２，０００の範囲、特に好ましくは約５，０００〜約１２，０００の範囲である。
【００３４】
疎水性セグメントＢに加えて、両親媒性セグメント化コポリマーは、これに制限されるわけではないが、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、ポリ（ビニルエーテル）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアルキレンイミン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などのポリヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレートおよびヒドロキシプロピルアクリレート、ポリオールおよび上述の２以上のポリマーの共重合体混合物、多糖類およびポリペプチドなどの天然高分子およびそのコポリマー、およびポリアリルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリアニリン、スルホン化ポリアニリン、ポリピロールおよびポリピリジニウムなどのポリイオン分子、ポリチオフェン−酢酸、ポリスチレンスルホン酸、両性イオン分子、塩およびそのコポリマーなどの、１以上の疎水性ポリマーを含む１以上のセグメントＡを含む。
【００３５】
親水性セグメントは、親水性モノマーによって好ましくは支配的な量を含む。親水性コモノマーは、通常、水に可溶であるか、１０重量％の水を吸収できるホモポリマーを与えるモノマーである。
【００３６】
適切な親水性モノマーは、ヒドロキシル置換低級アルキルアクリレートおよびメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、（低級アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、エトキシル化ヒドロキシル置換アクリレートおよびメタクリレート、ポリエチレングリコール−モノメタクリリレートおよびポリメチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ヒドロキシル置換（低級アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ヒドロキシル置換低級アルキルビニルエーテル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ビニルオキサゾリン、２−ビニル−４，４′−ジアルキルオキサゾリン−５−オン、２−および４−ビニルピリジン、合計３〜５の炭素原子を有するビニル不飽和カルボン酸、アミノ（低級アルキル）−（アミノという語が四級アンモニウムも含む場合）、モノ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）およびジ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）アクリレートおよびメタクリレート、アリルアルコール、３−トリメチルアンモニウム−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートクロライド（例えばNippon OilによるBlemer.QA）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、グリセリロールメタクリレートおよびＮ−（１、１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミドである。
【００３７】
１つの態様においてセグメントＡを含むポリマーは、比較的高い、それを通過する水またはイオン拡散速度を示す。このようなポリマーを作成できる親水性モノマーの具体例は、環状イミノエーテル、ビニルエーテル、エポキシドを含む環状エーテル、環式不飽和エーテル、Ｎ−置換アジリジン、β−ラクトンおよびβ−ラクタムである。さらに適切なモノマーは、ケテンアセタール、ビニルアセタールおよびホスホランを含む。適切な環状イミノエーテルは、２−オキサゾリンを含む。２つの位置にアルケニル基を有する２−オキサゾリンが親水性モノマーとして使われる場合、重合可能な不飽和基は、両親媒性セグメント化されたコポリマーによってセグメントＡ（側鎖の）内に供給され、ポリマー生成物を得るための最終重合に必要な重合可能不飽和基として、またはポリマーの調製において直接架橋を可能にする追加の重合可能不飽和基として作用する。最も好ましい環状イミノエーテルは、２−メチルオキサゾリンである。最も好ましいビニルエーテルは、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルおよびメトキシエチルビニルエーテルである。
【００３８】
１個のセグメントＡの平均分子量は、約５００〜約５０，０００の範囲、好ましくは約８００〜約１５，０００の範囲、より好ましくは、約１，０００〜１２，０００の範囲、特に好ましくは約５，０００〜約１２，０００の範囲である。
【００３９】
Ｂ．両親媒性コポリマーの調製 セグメントＡおよびＢは、加水分解性または非加水分解性である結合により共に結合されている。非加水分解性結合は、例えば酸性または塩基性条件下で、通常の水溶または溶媒加水分解反応によって切断されない共有結合である。加水分解性の特異的結合は、当業者にとって周知である。
【００４０】
両親媒性セグメント化コポリマーのセグメントＡおよびＢ間の非加水分解性結合は、親水性モノマーの単位ブロックが親水性ポノマーの官能基化部位から成長するように、適切に官能基化された疎水性モノマー（セグメントＢによる）の存在下で適切な親水性モノマー（セグメントＡによる）を重合させるか、あるいは、疎水性モノマーの単位ブロックが疎水性ポノマーの官能基化部位から成長するように、適切に官能基化された親水性モノマーの存在下で適切な疎水性モノマーを重合させることによって作成することができる。
【００４１】
官能基化するセグメントは高分子開始剤とも呼ばれる。適切な高分子開始剤は、熱的にまたは光化学的に活性可能な陽イオン性またはアニオン性基、あるいは熱的にまたは光化学的に活性可能なラジカル開始剤基を含む。アニオン重合、重縮合および重付加も使用できる。好ましい光化学的に活性可能なカチオン開始剤基によって具体例は、トリフレート（−Ｏ−ＳＯ₂−ＣＦ₃）、−Ｉ（ヨウ化物）−Ｏ−メシル、−Ｏ−トシルおよび−ＣＩ＋／−ＡｇＳｂＦ₆である。最も好ましい開始剤基は、トリフレート基である。開始剤基は、両親媒性セグメント化コポリマーを調製するために、開始セグメントの末端基とグラフト共重合中に開始セグメントに結合する成長セグメントを形成する最初のモノマーの間に、共有非加水分解性結合を設けて開始セグメントに結合する。グラフトとは、ポリマー鎖が、別の事前形成されたポリマーに対して、末端位置または懸垂位置のモノマーから成長することを意味する。
【００４２】
開始基は事前形成されたポリマーに適切な方法で、例えばカチオンまたは熱開始基の結合によって、開始モノマーに存在する官能基に導入される。懸垂開始基を与えるためには、後者の方法のみが適している。好ましいトリフレート基は、末端または懸垂官能ヒドロキシル基と（ＣＦ₃ＳＯ）₂Ｏなどの活性化トリフル酸誘導体との反応によって導入できる。
【００４３】
ベシクルまたはナノカプセルを分解するために、ＡセグメントおよびＢセグメント間の分解性結合を使用できる。ＡまたはＢセグメント内の分解性結合も使用できる。生分解性領域は、生分解を受けやすい結合を使用するポリマーまたはモノマーにから作成することができる。単一の分解性結合または１以上の分解性領域より成る分解性領域の包含によって、分解性を付与することができる。分解性結合および分解性領域という語は、以後、互換的に用いられる。
【００４４】
分解性領域は、好ましくはインビボ条件の下で分解可能である。例えば、分解可能な領域は、グリコリド、ラクチド、ε−カプロラクトンのポリマーまたはオリゴマー、あるいは非毒性または体内に通常の代謝物として存在する物質を生じる他の生分解性ポリマーから作成されるような、加水分解性領域でもよい。酵素分解によって生分解する領域も使用できる。好ましいポリ（α−ヒドロキシ酸）は、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）およびポリ（Ｌ−乳酸）である。他の有用な物質は、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファジン）およびポリ（ホスホエステル）である。例えばポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）およびポリ（γ−ブチロラクトン）などのポリラクトンも有用である。生分解性領域は、１から実質的に非水溶性の生成物を生じる値までの範囲の重合度になる場合がある。それゆえモノマー、ダイマー、トリマー、オリゴマーおよびポリマー領域を使用できる。
【００４５】
したがって、両親媒性セグメント化されたコポリマーは、１つの態様において、セグメントＡ１個およびセグメントＢ１個（Ａ−Ｂ型、ジブロック）、または、セグメントＡ１個およびセグメントＢ２個（Ｂ−Ａ−Ｂ型、トリブロック）で構成されるか、セグメントＡ１個から複数のセグメントＢが懸垂していて、セグメントＡがさらに１個または２個の末端セグメントＢを有するコーム型構造を有することがある。もう１つの態様において、両親媒性セグメント化コポリマーは、１個のセグメントＢおよび、みずからの末端に結合する２個のセグメントＡからなることがある（Ａ−Ｂ−Ａ型、トリブロック）。もう１つの態様において、両親媒性セグメント化コポリマーは、１個のセグメントＢから複数のセグメントＡが懸垂しており、さらにＢが１個または２個の末端セグメントＡを有するコーム型構造を有することがある。好ましくは、コポリマーはＡＢＡトリブロックコポリマーである。
【００４６】
また、例えば第１の親水性セグメントＡを事前形成した疎水性セグメントＢ上で成長させた後、疎水性セグメントＢ′を前に調製したセグメントＡの末端に結合させて、グラフト共重合の間、モノマーを変更することも可能である。また異なる親水性モノマーを使用して、異なる親水性セグメントＡ′を親水性セグメントＡの末端に作成することもできる。再び、両親媒性セグメント化コポリマーの他の態様は、官能基化親水性セグメントＡから開始して生成されることがある。
【００４７】
開始セグメント（ＡまたはＢ）を作成するポリマーの数平均分子量Ｍ_ｎは通常、約５００〜約５０，０００の範囲であり、好ましくは約８００〜約１５，０００の範囲であり、より好ましくは、約１，０００〜１２，０００の範囲であり、特に好ましくは約５，０００〜約１２，０００の範囲である。開始セグメント上にグラフト共重合される１個以上のセグメントＡ、Ｂ、Ａ′またはＢ′は、グラフト共重合用に添加するモノマー（親水性または疎水性）の量を制御することによって容易に制御できる。このような方法で、セグメントのサイズおよびそれらの比を、容易に制御できる。
【００４８】
両親媒性セグメント化コポリマーは、溶媒があってもなくても作成することができる。実質的に不活性の溶媒、すなわち反応に関与しない溶媒を使用することが有利である。適切な例は、クロロホルムまたはメチレンクロリドなどのハロゲン化炭化水素、アセトニトリルアセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの両極性の中性溶媒、トルエンまたはキシレン、ピリジンまたはＮ−メチルモルホリンなどの炭化水素、およびその混合物である。
【００４９】
本発明の両親媒性セグメント化コポリマーの調製において、反応温度は例えば、−６０℃〜１５０℃、好ましくは０℃〜８０℃となりうる。反応時間は、約１５分〜７日の範囲であり、好ましくは約２〜４８時間である。反応は、必要に応じて、保護ガスとしてアルゴンまたは窒素下で実施する。適切な触媒、例えばジラウリル酸ジブチルスズ（ＤＢＴＤＬ）は、ウレタン形成末端官能基化反応に添加される。
【００５０】
Ｃ．重合基 セグメント化コポリマーは、例えば、疎水性セグメントＢがポリブタジエンまたはポリイソプレンなどのジエンポリマーを含む場合や、親水性セグメントの作成に使用するモノマーが例えば２−アリル−オキサゾリンなどの不飽和側鎖を含んでいる場合など、すでに疎水性および／または親水性セグメント内に重合可能な基を含んでいることがある。存在していてもいなくても、例えば成長セグメントからの懸垂末端に、適切な反応によって重合可能な基を導入することは可能である。このため、成長セグメントのグラフト重合は、適切な連鎖長に達し、および鎖末端に存在する開始剤基が、例えばヒドロキシスチレン、アリルアルコール、ＨＥＭＡ、プロパルギルアルコール、アリルアミンおよびプロパギルアミンなどの特定試薬を用いて、またはＫＯＨ／ＥｔＯＨまたは−ＯＨまたは−ＮＨ−基を残す１級アミンまたは成長セグメント端の不飽和基を使用して、キャップ形成された後に停止する。ヒドロキシル基は、グラフト共重合において、例えば２−ヒドロキシアルキルオキサゾリンなどの適切なコモノマーを使うことによってコポリマーに導入できる。ヒドロキシル、または−ＮＨ−基は次に、例えば重合可能な不飽和基を有するイソシアネートと反応させてもよい。このような二官能化合物の好ましい例は、特に好ましい２−イソシアナートエチルメタクリレート（ＩＥＭ）およびビニルイソシアナート、アリルイソシアネート、アクリロイルイソシアネート、スチレンイソシアネート、ビニルベンジルイソシアネート、プロパギルイソシアネートおよび（メタ）アクリル無水物である。他の重合可能な基は、当業者に既知の方法によって導入されることができる。
【００５１】
重合／架橋のいかなる型も使用できる。例には、光重合、レドックス重合、アニオン重合、縮合反応、付加反応および連鎖重合反応が含まれる。
【００５２】
Ｄ．その他のモノマー 好ましいポリマー生成物において、両親媒性セグメント化コポリマーの重量比は全ポリマー生成物に基づいて、１００〜５０％の範囲にあり、詳細には１００〜８０％の範囲にあり、好ましくは１００〜９０％の範囲にある。ポリマー生成物は、適切な開始剤の存在下でコモノマーを添加しない、両親媒性セグメント化コポリマーの直接熱または光化学重合あるいは架橋反応によって得られる。しかし、一部の場合では、コモノマーの包含が好ましいこともある。望ましいタイプのコモノマーは、疎水性または親水性コモノマー、あるいはカチオン性またはアニオン性コモノマーを含む。架橋可能基などの特異官能性基、または以下で述べるように、膜の内部または表面に包含される分子に対して特別の親和性を有する基を含むコモノマーを包含することも望ましい。適切な疎水性および親水性コモノマーは、上で議論したものを含む。
【００５３】
コモノマーは、両親媒性ポリマーネットワーク内に包含させるか、両親媒性ポリマーによって相互貫入または半相互貫入網目構造として架橋させることもできる。架橋は、例えば多価不飽和コモノマーなどの、コモノマーおよび／または架橋剤の添加によって行える。
【００５４】
Ｅ．架橋剤 ポリマー網目は必要に応じて、例えば多価不飽和コモノマーなどの架橋剤を添加して補強することができる。必要ならば、両親媒性セグメント化コポリマーと１以上のビニルコモノマーおよび１以上の架橋剤との重合および架橋反応による生成物を含む架橋ポリマー生成物も作成できる。架橋は、多くの各種手段、例えばこれに限定されるわけではないが、フリーラジカル架橋、レドックス架橋および塩架橋によって行うことができる。
【００５５】
適切な架橋剤の例は、アリルメタクリレート、低級アルキレングリコールジメタクリレート、ポリ（低級アルキレン）グリコール時メタクリレート、低級アルキレンジメタクリレート、ジビニルエーテル、ジビニルスルホン、ジおよびトリビニルベンゼン、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ビスフェノールＡジメタクリレート、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、トリアリルフタレートおよびジアリルフタレート、ビス（メタクロキシ）テトラメチルジシロキサンなどのα−ω−ビス（メタアクリロキシアルキル）−オリゴシロキサンおよびペルフルオロアルキル−またはペルフルオロアルキルエーテル−ビスメタクリレートを含む。
【００５６】
使用する架橋剤の量は、全ポリマーに基づく重量の比で表され、２０〜０．０５％の範囲にあり、詳細には１０から０．１％の範囲にあり、好ましくは５〜０．１％の範囲にある。
【００５７】
Ｆ．架橋開始剤 ポリマー生成物は、当業者に慣習的な重合反応によって、対応するモノマー（モノマーという語はここでは、両親媒性セグメント化コポリマーも含む）によって、当業界で周知の方法で架橋される。
【００５８】
フリーラジカル架橋によって架橋されるモノマーの場合、モノマー混合物は、フリーラジカルフォーマーを添加しながら通常加温される。そのようなフリーラジカルフォーマーの例は、アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ペルオキソ二硫酸カリウム、過酸化ジベンゾイル、過酸化水素および過炭酸ナトリウムである。例えば、化合物が加温されると、ホモリシスによってフリーラジカルが生成し、次に重合が開始する。
【００５９】
重合反応は、フリーラジカル重合および／または架橋を開始できる光重合開始剤を使用して実施できる。適切な光重合開始剤の例は、ベンゾインメチルエーテル、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、およびDarocureおよびIrgacure生成物、好ましくはDarocure1173（登録商標）およびIrgacure2959（登録商標）を含む。例えばマクロマーに包含可能であるか、特異コモノマーとして使用可能な反応性光重合開始剤も適している。例は、欧州特許第０６３２３２９号に記載されている。光重合は次に、例えば光、特に適切な波長を有するＵＶ光などの化学線放射によって開始できる。スペクトル要求事項は、必要に応じて、適切な光増感剤の添加によって適切に制御できる。
【００６０】
重合可能領域は、最も好ましくは可視または長波長紫外線放射におけるフリーラジカル生成による光重合開始によって重合できる。重合可能領域は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレートまたは他の生物学的に許容可能な光重合可能な基である。好ましい第三級アミンは、トリエタノールアミンである。
【００６１】
有用な光重合開始剤は、細胞毒性がなく、短い時間枠内、最高でも数分間、最も好ましくは数秒以内でマクロマーのフリーラジカル生成によって開始するために使用できる光重合開始剤である。ＬＷＵＶ開始の選択の開始剤として好ましい染料は、エチルエオシン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、他のアセトフェノン誘導体およびカンフルキノンである。すべての場合において、架橋および重合は、コポリマー間で、例えば２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンまたはエチルエオシン（１０^-4−１０^-2mM）およびトリエタノールアミン（０．００１〜０．１M）の組合わせなどの光活性化フリーラジカル重合開始剤によって開始される。
【００６２】
光重合開始剤の選択は、光重合可能領域に大きく依存する。例えば、マクロマーが１以上の炭素−炭素二重結合を含む場合、染料による光吸収によって染料に三重項状態をとらせ、次にアミンと反応している三重項状態が、重合を開始するフリーラジカルを形成する。これらの物質と使用するのに好ましい染料は、エオシン染料および２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−フェニルアセトフェノンなどの開始剤およびカンフルキノンを含む。このような開始剤を用いて、例えば、長波長紫外光または約５１４nmのレーザ光によって、コポリマーをその場所で重合することができる。レーザを用いると、レーザによって精密な制御が可能となるため、光重合可能な溶液からどんなナノスフィアも重合することができる。したがって、両親媒性ポリマーを含まなくても、本明細書に記載されているように、ナノスフィアを作成することができる。
【００６３】
重合開始は、約２００〜７００nmの波長、最も好ましくは長波長紫外範囲または可視範囲の３２０nm以上、最も好ましくは約５１４nmまたは３６５nmにおける光による照射によって行う。光感応性フリーラジカル重合開始剤は、単一化合物（例えば２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン）または染料および助触媒の組合せ（例えば、エチルエオシンおよびトリエタノールアミン）でもよい。
【００６４】
Ｇ．溶媒 重合／架橋は、溶媒があってもなくても実施できる。適切な溶媒は、使用するモノマーを溶解するすべての溶媒である。例えば水、エタノールまたはメタノールなどの低級アルコールなどのアルコール、ジメチルホルムアミドなどのカルボキサミド、ジメチルスルホキシドまたはメチルエチルケトンなどの双極性非プロトン溶媒、アセトンまたはシクロヘキサノンなどのケトン、トルエンなどの炭化水素、ＴＨＦ、ジメトキシエタンまたはジオキサンなどのエーテル、トリクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、例えば、水／エタノールまたは水／メタノール混合物など、水およびアルコールの混合物などの適切な溶媒の混合物である。
【００６５】
II．両親媒性コポリマーによって形成されるベシクル 一般にベシクルは、当業者に既知の多くの手段によって作成できる。自己集合技術は好ましい。１つの態様において、両親媒性コポリマーを約５％〜３０％の濃度でエタノールなどの溶媒に溶解させる。次に水溶液にポリマー溶液を撹拌しながら加える（ＡＢＡコポリマーの場合）。本手順によって通常、かなり広範囲のサイズ分布のトリブロックコポリマーの分散液が生成される。サイズ分布は、ベシクル調製の当業者に既知の方法によって制御できる。さらにサイズ分布は、多分散ベシクルを規定の孔径を有する１以上のフィルタに通過させることによって選択できる。得られたベシクル寸法は、フィルタ膜の孔径によって直接に決定される。
【００６６】
重合 両親媒性コポリマーは両方の鎖末端に重合可能な基を有し、および／または内部の重合可能な基を有することができる。これらの重合可能な基は、自己集合性ベシクルの形成後に重合することができる。さらに、疎水性セグメント中の架橋可能基などの、架橋可能な基をコポリマーに包含させることによって、重合ベシクルをさらに架橋することができる。
【００６７】
ナノカプセルは水性溶媒から取り出したときでも、その形状を維持する。これらのナノカプセルの形持続性は、特に一部の用途による状況にて大いに興味深い。この形状の安定性によって、例えば、有機溶媒中で疎水性薬剤を粒子に装填し、装填したポリマー殻を単離し、次に水性溶媒中でカプセル化物質を放出することができる。重合ベシクルは、凍結乾燥によって水性溶液から単離することもできる。これによりロウ状固体が生成する非重合系に対して、重合ベシクル分散液は細かい無色粉末を生じるため、有機溶媒（クロロホルムまたはエタノールなど）または水に、容易に再分散させることができる。
【００６８】
サイズ ベシクルの直径は約５０nm〜約２０μmの範囲である。好ましいサイズ範囲は、具体的な用途によって変化する。例えば、口紅または自動車用の染料は、マイクロメーター領域内で粒子によってカプセル化できる。これに対して、製薬物質は、マイクロメーター以下の粒子にカプセル化することが好ましい。
【００６９】
ベシクルのクリアランス 架橋されていないベシクルは、溶解および腎臓によるクリアランスによって分解される。架橋粒子の分解は、架橋結合の加水分解によって発生する。分解速度を上昇させるために、無水物などのさらに分解性の結合、または上述の他の結合を含むことができる。
【００７０】
ブロック共重合体ベシクルは、Stealth（登録商標）リポソームに匹敵するインビボ半減期を有する（DD Lasic: Liposomes: from physics to application, Eleservier Science Publishers B.V., 1993を参照）。
【００７１】
III．ベシクルへの分子の組込 ベシクル、特に架橋ナノカプセルは、ほぼすべてのタイプの治療用、診断用または予防用薬剤（集合的に「治療薬」または「薬剤」と称する）の送達に適している。１つの態様において、治療薬はベシクルの分解ではなく、ベシクルを通じた拡散によって標的部位に送達される。カプセル化薬剤を適切に送達するために、ポリマーは薬剤に対して透過性である必要がある。
【００７２】
親水性および疎水性薬剤、および高分子量および低分子量化合物はどちらも送達できる。薬剤は、タンパク質またはペプチド、多糖類、脂質、核酸分子または合成有機分子でもよい。親水性分子の例は、大部分のタンパク質および多糖を含む。疎水性化合物の例は、サイクロスポリンおよびタキソールなどの一部の化学療法剤を含む。これらは、ホルモン、化学療法剤、抗生剤、抗ウイルス性、抗真菌剤、血管作用、免疫調節化合物、ワクチン、局所麻酔剤、抗血管形成剤、抗体、神経伝達物質、精神作用薬、生殖器官に影響を及ぼす薬剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。診断薬は、ガス、放射性標識、磁性粒子、放射線不透過化合物および当業者に周知の他の物質を含む。
【００７３】
本明細書では主に薬剤に関して述べているが、治療薬または診断薬だけではなく、多種多様な薬剤の送達にベシクルが使用可能なことを理解する必要がある。例は、香料、染料、光活性化合物、化学反応用試薬、および制御送達系を必要とする他の物質を含む。
【００７４】
大量の治療用物質を、ベシクルの中央空隙に組込むことができる。ポリマー殻の体積が比較的小さいため、比較的少量の治療用物質を外殻に組込むことができる。
【００７５】
薬剤は２以上の異なる経路でポリマー内にカプセル化できる。１つの方法では、コポリマーの調製時に薬剤を直接コポリマーに添加することができる。例えば薬剤は、エタノール中にポリマーとともに溶解させることができる。
【００７６】
第２の方法では、薬剤は、共有架橋の後、コポリマーに組込まれる。架橋ベシクルは、水溶液から単離させ、エタノールなどの溶媒中に再溶解させることができる。エタノールは一般に、ポリマーの親水性および疎水性部の良溶媒である。それゆえ、ベシクルのポリマー殻は、エタノール中で膨潤し、透過性となる。粒子を水に戻すと、殻透過性が低下する。
【００７７】
ベシクルは、分子が特異的にまたは優先的に特定の細胞または組織特性部位に結合する場合、表面に結合した、またはベシクル内から表面に突出した標的分子を用いて、特定部位にターゲッティングできる。標的分子の例は、炭水化物、タンパク質、葉酸、ペプチド、ペプトイドおよび抗体を含む。粘膜型組織への結合を促進する有用なリガンドのリストには、シアル酸、ノイラミン酸、ｎ−アセチルノイラミン酸、ｎ−グリコリルノイラミン酸、４−アセチル−ｎ−アセチルノイラミン酸、ジアセチル−ｎ−アセチルノイラミン酸、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、グルコース、マンノースおよびフコースを含む。抗体は特異性細胞表面分子、または例えば癌マーカーなど、細胞種が病気にかかった場合に発現される抗原に向けられる。
【００７８】
別の態様において、分子はベシクル膜壁に挿入される。ペプチドおよびタンパク、脂質、多糖類、無機分子、有機分子、核酸を含む、多くの異なる種類の分子をベシクル壁に挿入できる。疎水性または両親媒性分子は、ＡＢＡコポリマーで作成されており、Ｂが疎水性である場合に、さらに容易に壁に組込まれる。組込み可能な分子の量は、分子量、疎水性および電荷を含め、多くの因子に依存し、当業者によってただちに決定できる。１つの態様において、分子は、タンパク質など生体分子であり、特に好ましくは、膜タンパクまたは生体膜内に通常存在するタンパク質である。
【００７９】
したがって、組込み分子を有するベシクルまたはナノカプセルは、分子がゲーティング機能またはさらに有効な機能を担うナノリアクタとして機能することができる。
【００８０】
膜タンパクの例は、細菌ポーリンＯｍｐＦなどの一般輸送タンパク質、マルトポーリンおよびＬａｍＢなどの特異性輸送タンパク質、Ｎａ−Ｋ−ポンプ、ホスホトランスフェラーゼおよびバクテリオロドプシンなどの活性輸送タンパク質、およびＩｇＧ、Ｔ−細胞受容体、ＣＤ４、ＣＤ８およびＮ−ＣＡＭなどの免疫グロブリンを含む。
【００８１】
分子は、ベシクル形成の間にポリマー溶液に加えて組込むことができる。分子はあるいは、ベシクル形成後にベシクル壁に組込むこともできる。１つの態様において、ベシクル形成後にベシクルの片側の溶液中に分子を包含させて、生体分子をベシクル壁に組込む。ベシクル壁への分子挿入は、膜を越えてポテンシャルを加えることによって、加速されることが多い。
【００８２】
場合によっては大型の分子が重合時または架橋時にベシクルから排出されることがあるが、膜の重合／架橋の前後に分子をベシクルに組込むことができる。
【００８３】
IV．ベシクルおよびナノカプセルの使用 上でさらに詳細に説明したように、ベシクルおよびナノカプセルは薬剤送達に使用できる。他の用途は、水性または非水性溶液からの汚染物質の除去、記録材料、油圧液、コーティング、クロマトグラフィー、触媒およびプラスチック用充填剤および補強剤が含まれる。
【００８４】
以下の非制限的な例を参照すると、本発明がさらに理解される。
【００８５】
（実施例） 両方の鎖末端に重合可能な基を有するポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）トリブロック共重合体を実施例１で説明する。本物質の合成は、Nardin, C., Hirt, T., Leukel, J., Meier, W., Langmuir 2000, 16, 1035にも記載されている。
【００８６】
本トリブロックコポリマーによるベシクルの形成は、ポリマーの次の重合と同様に、実施例２に記載されている。
【００８７】
重合の前後のベシクルの物理特性は実施例３で特性付けされており、結果を従来のリポソームと比較した。
【００８８】
ベシクルへのタンパク質の組込は、実施例４に記載されている。
【００８９】
実施例１：ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡジブロックおよびトリブロックコポリマーの合成
二官能ポリ（ジメチルシロキサン）
（モレキュラーシーブ（４Ａ）を充填した）ソックスレー抽出器、復水器および第２すり合わせ連結部に隔壁を備えた２５０mLの丸底二つ口フラスコに、３４．２ｇ（６．３４mmol）のα−ω−ビス（３−ヒドロキシプロピル）ポリジメチルシロキサン（１＜１５、Wacker Chemie，薄膜蒸発器でさらに精製；Ｍ_Ｗ＝５４００gmol^-1）を９０mLのヘキサンに溶解させ、窒素雰囲気下で１７時間還流させて蒸留した。本乾燥手順の後、溶液はなお、２１ppmの水を含んでいた。次に溶液を６０mLのヘキサンに濃縮し、０℃まで冷却して、３．６ｇ（４５．５mmol）の無水ピリジンを加えた。さらに１２．４ｇ（４３．９mmol）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を１５分にわたって加え、混合物を０℃にてさらに３０分間撹拌した。２０mLのクロロホルム（含水量＜１０ppm）を加えた後、残りの懸濁液をＧ４ガラスフィルタ漏斗を用いて真空下で濾過した。溶媒は高真空下で蒸発させた。
【００９０】
収量は、橙色油２１．５ｇであった。この油を次に、４０mLの無水ヘキサンに溶解させ、活性炭を添加し、混合物を次に約２分間撹拌して、再度濾過した。溶媒の蒸発後、収量は無色透明油１９．０ｇであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃，２５０MHz）：０ppm（ＣＨ₃−Ｓｉ）、０．５ppm（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓｉ）、１．８ppm（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）、４．４ppm（ＣＦ₃ＳＯ₃ＣＨ₂−ＣＨ₂−）。官能基性＞９５％は、¹Ｈ−ＮＭＲデータに基づく。
【００９１】
遊離末端基を有するポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）トリブロックコポリマー
【００９２】
５．０４ｇ（５９．２mmol）の新たに蒸留した２−メチル−２−オキサゾリンおよび８．０５ｇ（１．４mmol）の二官能性ＰＤＭＳを、室温で１５mLの１，２−ジクロロエタン（含水量＜５ppm）に添加した。溶液を１．５時間撹拌し、次に４０℃まで加熱した。４８時間後、溶液を再度室温まで冷却し０．５MのＫＯＨエタノール溶液を加えた。生じた溶液を１時間撹拌し、次に溶媒を高真空下で蒸発させた。収量は、無色固体ポリマー１２．０ｇであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3，２５０MHz）：０ppm（ＣＨ₃−Ｓｉ），２．０−２．１ppm（ＣＨ₃ＣＯＮ＜），３．３−３．５ppm（＞Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｎ＜）。官能基性＞９５％は、ＯＨ滴定（＞０．４ｍＥｑｇ^-1）による。ＴＨＦ中でのＧＰＣによって、トリブロックコポリマーの分子量Ｍ_ｎ＝９０００gmol^-1と多分散性Ｍｗ／Ｍ_ｎが明らかになった。結果として、２つのポリ−２−メチルオキサゾリンブロックの分子量はそれぞれ、Ｍ_ｎ＝１８００gmol^-1であった。
【００９３】
重合可能な末端基を有するＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックコポリマー
丸底フラスコに、７．６８ｇ（１．３２mmol）のヒドロキシ官能基化ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックコポリマーを室温にて、２０mLの無水酢酸エチル（含水量＜１０ppm）に溶解させた。この溶液に４２０mg（２．７mmol）の２−イソシアナート−エチルメタクリレート（ＩＥＭ）と約４０mgのジラウリル酸ジブチルスズを加えた。光に当てないようにして、溶液を４８時間撹拌した。その後、溶媒を高真空下にて、温度０℃で５時間蒸発させた。粗生成物は不純物を除去するために、水／エタノール混合物中で限外濾過を用いて精製した。６．８９ｇの無色固体ポリマーが得られた。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃，２５０MHz）：０ppm（ＣＨ₃−Ｓｉ），２．０−２．２ppm（ＣＨ₃−ＣＯ），３．３−３．５ppm（＞Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｎ＜，＞Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ＜），５．５ppm（ＣＨ₂＝），６．１ppm（ＣＨ₂＝）。官能基性＞９５％は、¹Ｈ−ＮＭＲによる。
物質の分子量（Ｍｗ）は９０００gmol^-1であり、分子は５４００gmol^-1の可撓疎水性ＰＤＭＳ中間ブロック１個とそれぞれ１８００gmol^-1の親水性ＰＭＯＸＡブロック２個を含んでいる。多分散性はＭｗ／Ｍ_ｎ＝１．７と決定された。
【００９４】
直鎖状ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックコポリマーは、濃縮水溶液中で離液性液晶相を示す。ポリマーは室温では、相図の水が多い側に、約５０wt%のポリマーまで広がる、広範な混和性ギャップを示した。この濃度を超えると、ポリマーは層状液晶相に従う。
【００９５】
実施例２：ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡからのベシクルの調製 以下の手順にしたがって、トリブロックコポリマーから小単層ベシクルを作成した。
【００９６】
末端基官能基化ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡブロックコポリマーをエタノールに溶解させ、１７wt%のポリマーを含む透明な均質溶液を得た。本溶液は、それぞれの体積の２回蒸留した水に激しく撹拌しながら滴下した。手順によって、幅広いサイズ分布のトリブロックコポリマーベシクルの分散液が得られた。
【００９７】
孔径が２００nmのNucleoporeフィルタ（Millipore）でベシクル分散液を押し出すことによって、多分散性が低下した。 ベシクルの重合は、ＵＶランプ（Ultratech ４００Ｗ、波長＝２５４nm、Osram AG）によって分散液に１５分間照射することによって行った。ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡは、重合を防止するために暗所に保管される場合、数週間は安定であり、この期間の後も実験精度内でのサイズおよびサイズ分布の変化は示されなかった。
【００９８】
実施例３：ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡによるベシクルのキャラクタリゼーション 凍結破壊複製透過電子顕微鏡法
【００９９】
約１０マイクロリットルのベシクル分散液のをサンプルを室温にて金小平板上に乗せ、１５％の２−メチルブタンおよび８５％のプロパンの混合物中へ８３Kにて手動で投入して失活させた。失活後、サンプルを液体窒素中に移し、黄銅ブロック（Balzer）上にクランプした。それをBalzer凍結エッチング装置（ＢＡＦ３００）に取付け、次に圧力を５×１０^-9mbarに減圧した。排気の後、サンプルは液体窒素で冷却されたマイクロトームによって破壊した。表面構造の対比を向上させるために、サンプルを１５３Kに加温して、１０分間エッチングした。その後、サンプルを液体窒素によって再度冷却し、３０°の角度でＷ／Ｔａを用いて投影した。サンプルを室温に加温し、大気圧にされた後、複製をクロロホルムで洗浄し、４００メッシュの銅ＴＥＭグリッド上に置いて、１００keVで動作している日立Ｈ−８０００電子顕微鏡を用いて検査した。
【０１００】
顕微鏡写真は、調製手順によって球状ベシクルをが得られたことを明らかに示した。表示された粒子の直径は、約５０nm〜約２５０nmの範囲であった。
【０１０１】
静的および動的光散乱（それぞれＳＬＳおよびＤＬＳ） 静的および動的光散乱実験は、３０°と１５０°の間の散乱角に、倍周波数ＮｄＹＡｇレーザ（ＡＤＬＡＳ、波長＝５３２nm）を備えた市販のゴニオメータ（ALV-Langen）を用いて実施した。ＡＬＶ−５０００／Ｅ相関計は、光子強度自己相関関数ｇ²（１）を計算する。サンプルは、Milliporeフィルタ（ＨＮ０．４５μm）を用いて溶液を１０mm石英セル内に濾過して調製した。これらのセルは、温度精度Ｔ＝０．０２Kのサーモスタット付き光学マッチングバット内に配置した。実験は、Ｔ＝２９３Kで実施した。
【０１０２】
屈折率増分ｄｎ／ｄｃは、市販のＡＬＶ−ＤＲ−１示差屈折率検出器を用いて、光散乱実験の該当する温度および波長にて得られた。ＤＬＳのデータはＷｉｌｌｉａｍ−Ｗａｔｓ関数を用いて分析した〔WilliamsらTrans. Faraday Soc., 1970, 66, 80; WilliamsらTrans. Faraday Soc., 1971,67,1323; LindseyらJ. Chem. Phys., 1980, 73, 3348〕。ベシクルのサイズ多分散性は、参考文献に従って決定した〔Van Zanten. In Vesicles: Rosoff, M.; Marcel Dekker, Inc.: New York, 1996; Vol.62, p240; Van Zantenら、J. Colloid and Interface Science, 1991, Vol.146, 330; Ruf. et al. Methods in Enzymology, 1989, Vol. 172,364〕。
【０１０３】
結果として得られたベシクルの多分散性は、動的光散乱から約２０％であると決定され、これは、低分子量脂質分子から構成されている従来の押し出されたベシクルについて報告された値とよく一致している。
ゼロ散乱角に外挿値のみをプロットした代表的なZimm図は、静的光散乱の濃度依存において、約１．７×１０^-3ｇmL^-1の最小限の非重合トリブロックコポリマーが見られることを示している。この濃度付近では、回転半径Ｒ_ｇは最大値を示す。相互並進拡散係数Ｄ_ｍは、濃度曲線の傾きの中断を示す。この挙動は、モノマーが特定の濃度まで凝集するミセル形成においてと同様に、閉じた会合の典型である。この場合は、それ以下ではベシクル凝集物が個々に溶解したトリブロックコポリマー分子に分解する、臨界凝集濃度（ｃａｃ）があることを意味している。凝集体、すなわちトリブロックコポリマーベシクルの詳細は、測定値をｃ＞２×１０^-3ｇmL^-1に外挿して得ることができる。同様に、ｃａｃ未満の領域にデータを外挿することによって、個々のトリブロックコポリマー分子に関する情報が得られなければならない。ｃａｃ付近で個々のトリブロックコポリマー分子とベシクルが共存すると仮定すると、散乱光の強度は、それぞれの成分による強度の和として表すことができる。臨界凝集濃度は、ｃａｃ＝０．１５×１０^-3gL^-1（すなわち１．６×１０^-5molL^-1）として計算され、これは、代表的な低分子量脂質の値に匹敵し、トリブロックコポリマー分子のそれぞれの親水性および疎水性ブロックの長さに著しく依存する。この濃度でｃａｃが生じることは、ベシクル分散液の表面張力測定によっても確認された。これはトリブロックコポリマー分子のメタクリレート末端基のＵＶ誘起架橋重合によるものである。重合はむしろ高度の変換を引き起こす。結果として、すべてのトリブロックコポリマー分子は、ベシクル内の新たに形成されたポリマー網目構造に共有結合され、そのために希釈しても凝集物からもはや離れることができない。重合および非重合ベシクルの両方に対する静的および動的光散乱の結果を表１にまとめる。
【０１０４】
【表１】

【０１０５】
重合時には、凝集物の平均分子量、寸法または多分散性は見られなかった。このことは、それぞれのトリブロックコポリマー分子によって、平均凝集数ｐのベシクル間交換（すなわち粒子の分子量）、ベシクルの粒径寸法およびサイズ多分散性が起こるため、フリーラジカル重合がベシクル内のみで発生することを反映している。さらに光散乱データも、粒子の中空球形態を支持している。静的光散乱による回転半径Ｒおよび動的光散乱による流体力学半径Ｒ_ｈが、非重合および重合トリブロックコポリマーベシクルの両方でほぼ同一であることがわかったため、それぞれｐ＝１．０９７の比ｐ＝Ｒ／Ｒ_ｈとなる。いわゆるｐ−パラメータは、散乱粒子の放射密度分布を反映している構造感受性特性である。ｐ＝１の比は、球状殼の特性である。
【０１０６】
凍結乾燥され、エタノール中で再分散されるナノカプセルの動的光散乱により、流体力学半径Ｒ_ｈ−９０nmが得られた。これは、Ｒ_ｈ＝１１３nmと決定された、水中での元の重合粒子の値と合理的に良好に一致している。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
【０１０７】
水中の非押出型架橋ベシクル分散液の１滴を、シリコンウェファに置いた。水を蒸発させた後、サンプルをPhilips SL30 SEMによって検査した。非押出型ベシクルの重合によって生成されたベシクルのＳＥＭ顕微鏡写真は、ナノカプセルが形状維持性であり、水溶液から単離の後でも、その中空球状形態を保存するという結論を裏付けている。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
【０１０８】
サンプルは、架橋ベシクル分散液を２％酢酸ウラニル溶液によって陰性染色して調製した。それらを炭素被覆銅グリッド上に堆積させ、Philips EM400によって検査した。凍結乾燥によって水から単離し、エタノール中に再分散させたナノカプセルの顕微鏡写真は、球状ナノカプセルの最密充填を反映している。粒径は、約５０nm〜約２５０nmの範囲にある。より小さい粒子が相当量存在し、より大きい粒子が存在しないことは、粒子の氷晶が仲介した分裂の仮定を裏付けている。
【０１０９】
表面張力測定 重合および非重合ベシクル分散液の表面張力γは、Du-Nouy環法を用いて、２５℃に温度設定したKruss K8張力バランス界面張力計を用いて決定した。トリブロックコポリマー分散液の臨界凝集濃度（ｃａｃ）は、γ（ln c_polymer）曲線の不連続から推定し、０．１５ １０^-3ｇmL^-1（または１．６ １０^-5molL^-1）であることがわかり、光散乱データと一致している。重合ベシクルの場合、調査した濃度領域ではｃａｃは検出できなかった。
実施例４：ＡＢＡトリブロックコポリマーベシクルにおけるチャネルタンパク質の再構成
【０１１０】
再構成実験の場合、よく特徴づけられた細菌ポーリンＯｍｐＦをモデル系として使用した〔Nikaido, H., Molecular Microbiology, 1992, 6, 4, 435; Winterhalter, M., Colloids and Surfaces A, 1999, 149, 547; Schiermer, T., Keller, T. A., Wang, Y-F., Rosenbusch, J.P., Science, 1995, 267, 512; Eisenberg, B., Acc. Chem. Res., 1998, 31, 117〕。このポーリンは、グラム陰性菌の外膜にトリマーチャネルを形成する膜貫通タンパク質である。これらの水充填チャネルによって、イオン、栄養素または抗生物質などの小型の溶質が膜を通じて受動拡散することが可能となる。ポーリンのベシクルへの組込は、β−ラクタマーゼがアンピシリンをアンピシリン酸に加水分解する機能を用いて、直接監視することができる。アンピシリンとは対照的に、アンピシリン酸はヨウ素を微量ヨード滴定によって、すなわちデンブンヨウ素錯体の脱色によって、測定可能なヨウ化物に還元することができる。
【０１１１】
ポーリン原液（１wt%オクチルポリオキシエチレン、１００mMＮａＣｌおよび２．５mMHepes、pH７．４中に１３．３mgmL^-1）を、トリブロックコポリマーの１７wt%エタノール溶液に混合すると、最終モル比は１：１０００となった（タンパク質：ポリマー）。酵素β−ラクタマーゼをベシクル内部にカプセル化するために、溶液をβ−ラクタマーゼ水性溶液（１０mMＨｅｐｅｓ，１００mMＮａＣｌ、pH７．４中の０．０２４mg/ml）にゆっくりと加え、最終コポリマー濃度は１wt%であった。生じた懸濁液は、孔径２００nmのNucleopore Filtersによって押出し、平均直径２５０nm³を有するベシクルの単分散集合が生じた。カプセル化されなかったタンパク質はSephadex G-200でのクロマトグラフィーによって除去した。
【０１１２】
ベシクルは、ＵＶ光をによってベシクル分散液に２分間照射して重合した。
【０１１３】
１０μlの１mMアンピシリン溶液（１０mMHepes，１００mMＮａＣｌ、pH７．４中）をナノカプセル分散液に添加し、混合物を３０分間インキュベートした。デンプンヨウ素試薬は、５mlの８mMヨウ素、３２０mMヨウ化カリウム溶液を、２M酢酸中の２０mlの１Mウォルフラム酸ナトリウムと混合し、次に、３分間静かに煮沸して１M酢酸に溶解させた５mlの２wt%可溶性デンプンを加えた。次に、０．５mlのデンプンヨウ素試薬をナノカプセル混合物に加え、デンプンヨウ素錯体の６２３nmの吸収を時間の関数として測定した。結果を図２に示し、プラス記号は作成されたナノリアクタを表し、黒三角は遊離した、組込まれていない酵素を示し、黒菱形は組込酵素も遊離酵素もないナノカプセルを表す。
【０１１４】
ポーリンが組込まれていないナノカプセルでは、吸収は一定のままであった。これに対して、ポーリン組込ナノカプセルの場合、吸収は時間とともにゆっくり低下した。しかし、ベシクル組込ポーリンの反応速度は遊離酵素の場合よりも遅かった。
【０１１５】
本発明によって修正および変更は、上述の詳細な説明から当業者にとって明らかである。すべての修正および変更は、以下の請求項に含まれているものとする。本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、水中のＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックコポリマーベシクルと、ナノカプセルを作成するためのトリブロックコポリマーの重合可能な末端基のＵＶ照射による、個々のトリブロックコポリマーのベシクル内架橋の概略図である。
【図２】 図２は、１０μlの１mMアンピシリン溶液が存在下で、３０分インキュベーションした後の、６２３nmにおけるデンプン−ヨウ素複合体の吸収度の時間座標図である。プラス記号は、作成されたナノリアクタを示し、黒三角形は、遊離した、包含されていない酵素を示し、黒菱形は包含された酵素または遊離酵素を含まないナノカプセルを示す。

Claims (27)

1. 疎水性および親水性セグメントを有する両親媒性コポリマーから形成される膜を含むベシクルであって、前記コポリマーが、ＡＢＡトリブロックコポリマーであり、ＡおよびＢのうち一方が前記疎水性セグメントであり、もう一方が前記親水性セグメントである、ベシクル。
2. 前記疎水性セグメントが、ポリシロキサンであり、
   前記親水性セグメントが、環状イミノエーテルから作成される、
   請求項１記載のベシクル。
3. 請求項１又は２記載のベシクルの安定化によって形成されるナノカプセル。
4. 疎水性および親水性セグメントを有する両親媒性コポリマーから形成される膜を含むベシクルの安定化によって形成されるナノカプセルであって、前記コポリマーが、末端基重合によって安定化される、ナノカプセル。
5. 前記疎水性セグメントが、ポリシロキサンであり、
   前記親水性セグメントが、環状イミノエーテルから作成される、
   請求項４記載のナノカプセル。
6. 前記ナノカプセルが、前記コポリマーの架橋によって安定化される、
   請求項３記載のナノカプセル。
7. 前記コポリマーが、ＡＢコポリマーであり、ＡおよびＢのうちの１つが疎水性であり、もう１つが親水性である、
   請求項４又は５記載のナノカプセル。
8. 前記ナノカプセルが、前記コポリマーの架橋によって安定化される、
   請求項４又は５記載のナノカプセル。
9. 活性剤が、前記ベシクル内にカプセル化される、請求項１又は２記載のベシクル。
10. 活性剤が、前記ベシクル内にカプセル化される、請求項３記載のナノカプセル。
11. 活性剤が、前記ベシクル内にカプセル化される、請求項４又は５記載のナノカプセル。
12. 前記ベシクルが、親水性内部層、疎水性中間層および親水性外部層を含む、請求項１又は２記載のベシクル。
13. 前記コポリマーが、Ｕ字形であり、前記ベシクルが、疎水性内部層および親水性外部層、または親水性内部層および疎水性外部層を有する、請求項１又は２記載のベシクル。
14. 前記重合が、光重合による、請求項４又は５記載のナノカプセル。
15. 分子が、前記ベシクル膜内に組み込まれる、請求項１又は２記載のベシクル。
16. 前記ナノカプセルの乾燥時に、前記ナノカプセルの中空形態が、維持される、請求項３〜５のいずれか１項記載のナノカプセル。
17. 前記ベシクルが、生分解性である、請求項１又は２記載のベシクル。
18. 前記ナノカプセルが、生分解性である、請求項３〜５のいずれか１項記載のナノカプセル。
19. 疎水性および親水性セグメントを有する両親媒性コポリマーからベシクルを形成すること、ここで、前記コポリマーは、ＡＢＡトリブロックコポリマーであり、ＡおよびＢのうち一方は、疎水性であり、もう一方は、親水性である、および
    前記ベシクルを安定させること
    を含む、ナノカプセルの作成方法。
20. 前記疎水性セグメントが、ポリシロキサンであり、
    前記親水性セグメントが、環状イミノエーテルから作成される請求項１９記載の方法。
21. 前記ベシクルが、前記コポリマーを相互に架橋することによって安定化される、請求項１９又は２０記載の方法。
22. 前記コポリマーが、重合可能な末端基を含み、前記ベシクルが、末端基を重合させることによって安定化される、請求項１９又は２０記載の方法。
23. 前記安定化の工程が、さらに、前記コポリマーを内部で架橋させることを含む、請求項２２の方法。
24. 前記ベシクル表面に結合した標的分子をさらに含む、請求項１、２、９、１２、１３、１５、１７いずれか１項記載のベシクル。
25. 前記標的分子が、炭水化物、タンパク質、葉酸、ペプチド、ペプトイドおよび抗体からなる群より選択される、請求項２４記載のベシクル。
26. 前記ベシクル表面に結合した標的分子をさらに含む、請求項３〜８、１０、１１、１４、１６、１８いずれか１項記載のナノカプセル。
27. 前記標的分子が、炭水化物、タンパク質、葉酸、ペプチド、ペプトイドおよび抗体からなる群より選択される、請求項２６記載のナノカプセル。

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