DE10343794A1

DE10343794A1 - Aktivierung und Stabilisierung empfindlicher Katalysatoren in amphiphilen Netzwerken

Info

Publication number: DE10343794A1
Application number: DE2003143794
Authority: DE
Inventors: Nico Bruns; Jörg Dr. Tiller
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2005-04-14
Also published as: WO2005037432A1; EP1670587A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalysatorsystem, welches befähigt ist, empfindliche Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme, zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß beispielsweise Synthesereaktionen, wie insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen immobilisierten Katalysator, wobei der Katalysator in ein segmentiertes amphiphiles Polymernetzwerk eingebracht ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalysatorsystem, welches befähigt ist, empfindliche Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme, zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß beispielsweise Synthesereaktionen, wie insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen immobilisierten Katalysator, wobei der Katalysator in ein segmentiertes amphiphiles Polymernetzwerk eingebracht ist.
Enzyme und andere enantioselektive Katalysatoren haben vor allem in der Wirkstoffsynthese große Bedeutung. Allerdings können viele dieser Katalysatoren nicht großtechnisch eingesetzt werden, da sie gegenüber dem verwendeten Lösungsmittel empfindlich sind, wenig aktiv bzw. in den eingesetzten Mengen beispielsweise durch hohen Schwermetallgehalt stark umwelttoxisch sind.
Zudem ist die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere Enzymen, wäßrig. Wasser ist jedoch für viele präparative Reaktionen in der organischen Chemie ein schlechtes Lösungsmittel, da die meisten organischen Verbindungen in diesem Medium unlöslich sind. Außerdem ist das Entfernen von Wasser aus Reaktionsgemischen aufgrund seines hohen Siedepunktes und der großen Verdampfungsenthalpie zeit- und energieaufwendig. Darüberhinaus treten in wäßriger Lösung verstärkt Nebenreaktionen wie Hydrolyse, Racemisierung bzw. Polymerisationen auf. Ferner sind die gebildeten Produkte bei Anwesenheit von Wasser oft instabil. Um diese Probleme zu umgehen, werden daher die meisten organischen Synthesen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Insofern aber die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere Enzymen, wäßrig ist, erschwert dies die Verwendung solcher Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln, da üblicherweise Enzyme und andere Proteine in diesen instabiler und weniger aktiv sind. Enzyme sind in organischen Lösungsmitteln im wesentlichen nicht löslich, trotzdem werden sie teilweise auch zum Einsatz in diesen Medien „immobilisiert". In diesem Fall spricht man von einer Trägerung. Sie erleichtert auch die Abtrennung der Katalysatoren, da lediglich größere Partikel abfiltriert werden müssen. Außerdem erreicht man durch eine Trägerung eine größere Oberfläche des Biokatalysators und unter anderem dadurch auch eine höhere Aktivität. Meistens wird eine Adsorption des Enzyms auf mikroporöse Träger wie z.B. Silica, Celite oder Glas ausgenutzt. In vielen Fällen führt eine derartige Immobilisierung jedoch nicht zum gewünschten Erfolg, da die immobilisierte Substanz aufgrund von konformellen Änderungen oder Diffusionsproblemen nicht mehr aktiv oder zugänglich ist.

Amphiphile Polymere sind in diesem Zusammenhang bis heute selten verwendet worden. In der Literatur ist lediglich die Immobilisierung von Lipasen durch Adsorption auf mikroporöse amphiphil modifizierte Polyallylmethacrylat-co-Polyglycidylmethacrylat-Partikel sowie auf Copolymere aus mit Divinyl vernetztem Polystyrol und tensidischen Monomeren beschrieben; vgl. Yasuda et al., Macromolecular Chemistry and Physics, 2001, Bd. 202 (16), Seiten 3189–3197, bzw. 2002, Bd. 203, Seiten 284–293; Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2002, Bd. 40, Seiten 874–884, bzw. Journal of Chemical Engineering of Japan, 2003, Bd. 35 (6), Seiten 519–526.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Katalysatorsystem bereitzustellen, welches befähigt ist, Enzyme und andere enantioselektive Katalysatoren zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß organische Synthesereaktionen, insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere wird ein immobilisierter Katalysator bzw. Katalysatorsystem bereitgestellt, wobei der Katalysator in ein aus mindestens einer hydrophilen und einer hydrophoben Komponente aufgebautes, segmentiertes amphiphiles Netzwerk, das eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm, vorzugsweise 8 bis 300 nm, besonders bevorzugt 8 bis 50 nm, aufweist, eingebracht ist. Ein derartiger immobilisierter Katalysator kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte:

(i) Herstellen eines segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie bzw. eines Monomers und eines Makromonomers mit jeweils unterschiedlicher Hydrophilie und
(ii) Beladen des Polymernetzwerks mit dem Katalysator.

Die vorliegende Erfindung ist auf die Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme, in einem segmentierten amphiphilen Polymernetzwerk gerichtet. Das erfindungsgemäß verwendete, segmentierte, amphiphile Polymernetzwerk weist erfindungsgemäß eine Nanophasenseparation auf, so daß hydrophile und hydrophobe Einheiten des Polymernetzwerks im Bereich von 5nm bis 500 nm benachbart liegen. Grundsätzlich ist die Nanophasenseparation erfindungsgemäß derart gestaltet, daß die Größe der Domänen nicht kleiner als der einzulagernde Katalysator ist. Die Nanophasenseparation kann beispielsweise durch AFM-Messungen bestätigt werden. In Abhängigkeit von der Art des Lösungsmittels (wäßrig, organisch) quellen entweder die hydrophilen oder die hydrophoben Bereiche im Netzwerk. Infolgedessen kann ein Katalysator, wie insbesondere ein Enzym, in einem hydrophilen (hydrophoben) Lösungsmittel in das amphiphile Netzwerk eindiffundieren und dann in einem anderen hydrophoben (hydrophilen) Lösungsmittel eine katalytische Aktivität entfalten. Die Verteilung des Katalysators im erfindungsgemäß verwendeten amphiphilen Polymernetzwerk ist homogen. Zudem gewährleistet die enge Nachbarschaft von hydrophilen und hydrophoben Bereichen geringe Diffusionswege. Beides sind Voraussetzungen für eine effiziente katalytische Reaktion.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der eingesetzte Katalysator ein Enzym. Die Klasse des in das Netzwerk inkorporierten Enzyms unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So kommen im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Enzyme Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen in Frage. In besonders vorteilhafter Weise können im Rahmen der vorliegenden Erfindung Peroxidasen bzw. als deren Untergruppe Häm-Enzyme, die den Komplex Eisen-Protoporphyrin IX als prosthetische Gruppe enthalten, eingesetzt werden. Beispielhaft ist hier Meerrettichperoxidase (HRP) anzuführen. So können Peroxidasen eine Reihe synthetisch nützlicher Reaktionen katalysieren, wie z.B. Polymerisationen elektronenreicher Aromaten, asymmetrische Sulfoxidationen und Epoxidierungen. Das Potential der Peroxidasen im Bereich der (asymmetrischen) Biotransformationen wird derzeit kaum in einer kommerziellen Synthese ausgenutzt, da diese Enzyme zwei große Nachteile aufweisen. Zum einen werden Peroxidasen wie Häm-Enzyme durch Peroxide inaktiviert. Zum anderen limitiert die schlechte Wasserlöslichkeit vieler synthetisch interessanter Substrate bei Peroxidasen genauso wie bei den meisten anderen Enzymen die kommerzielle Anwendung der enzymatischen Biotransformationen. Eine Lösung dieses allgemeinen Problems wird erfindungsgemäß durch das Immobilisieren bzw. Einbetten solcher Enzyme wie beispielsweise Peroxidasen in eine segmentierte amphiphile Polymermatrix erreicht.

Neben solchen Enzymen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung aber auch empfindliche Metallkatalysatoren eingesetzt werden, die durch das Immobilisieren bzw. Einbetten in eine amphiphile Polymermatrix stabilisiert und aktiviert werden. So können wasserempfindliche Metallkatalysatoren durch Einschluß in die hydrophoben Phasen bzw. Bereiche der erfindungsgemäß verwendeten, segmentierten amphiphilen Polymernetzwerke stabilisiert und aktiviert werden. Als empfindliche Metallkatalysatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind der Sharpless-Katalysator zur asymmetrischen Epoxidation von Allylalkoholen oder auch Pd-Nanoteilchen zur Heck-Reaktion, zu nennen.

Polymernetzwerke sind Polymere, bei denen die Polymerketten dreidimensional untereinander verknüpft sind. Bei einem Netzwerk sind sämtliche Polymerketten miteinander verknüpft, es liegt ein einziges großes Molekül vor. Die Synthese von Netzwerken kann prinzipiell durch Vernetzung von linearen Polymerketten mittels Polymer-analoger Reaktion oder durch eine vernetzende Copolymerisation mit einem niedermolekularen Vernetzer erfolgen. Bei der Copolymerisation können anstelle von Monomeren auch Makromonomere eingesetzt werden. Unter diesem Begriff versteht man Oligo- oder Polymere mit polymerisierbaren Gruppen. Durch die Copolymerisation eines an beiden Endgruppen mit einer polymerisierbaren Gruppe modifizierten Makromonomers und einem niedermolekularen Monomer entstehen Netzwerke mit einer segmentierten Topologie, die zwischen der von gepfropften bzw. Kammpolymeren und der von interpenetrierenden Netzwerken angesiedelt ist. Derartig aufgebaute segmentierte Polymernetzwerke, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, werden üblicherweise mit Poly(A)-linked-Poly(B) bezeichnet, wobei Poly(A) ein polymerer Vernetzer für das Monomer B ist.

Chemisch vernetzte Polymere sind in allen Lösungsmitteln grundsätzlich unlöslich. Gibt man jedoch ein Polymernetzwerk in ein Lösungsmittel, welches mit den Polymersegmenten gut verträglich ist, so dringt Lösungsmittel in die Probe ein. Das Polymer quillt, bis sich ein Gleichgewicht zwischen dem osmotischen Druck des Lösungsmittels und der elastischen Rückstellkraft der Kettensegmente eingestellt hat. Ein gequollenes Netzwerk bezeichnet man als Gel.

Ist nun bei einem aus zwei Komponenten aufgebauten Netzwerk die eine Komponente hydrophil und die andere hydrophob, so ist das Netzwerk in einem weiten Bereich von Zusammensetzungen sowohl in organischen Lösungsmitteln als auch in wäßrigen Medien quellbar. Man spricht dann von einem amphiphilen Netzwerk. Die starke Unverträglichkeit zwischen den polaren und unpolaren Komponenten bzw. Kettensegmenten führt zu einer Phasenseparation, dabei verhindern allerdings die kovalenten Bindungen zwischen den Segmenten eine makroskopische Phasentrennung, es kommt lediglich zu einer viel kleinräumigeren Trennung, und es bilden sich Domänen im Nanometerbereich. Die Netzwerke erscheinen dadurch makroskopisch homogen und optisch klar. Amphiphile Netzwerke sind aus miteinander nicht mischbaren, d.h. unverträglichen Polymerketten aufgebaut. Als häufigste Synthesestrategie ist im Stand der Technik die vorstehend diskutierte Makromonomermethode zu finden, welche die Copolymerisation eines Makromonomeren mit einem niedermolekularen Monomer vorsieht und, topologisch betrachtet, zu segmentierten Netzwerken führt.

Die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten amphiphilen Netzwerke können durch Copolymerisation eines Monomers (hydrophil oder hydrophob) mit einem Makromonomer (hydrophob oder hydrophil) bzw. durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie erzeugt werden. Vorzugsweise wird in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein hydrophobes Makromonomer mit einem hydrophilen Monomer copolymerisiert.

Die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Komponenten auf Basis von Isobutylen, Dimethylsiloxan, etc., zum Einsatz kommen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks vorzugsweise ein Polydimethylsiloxan-Makromonomer. Das Molekulargewicht eines solchen Polydimethylsiloxan-Makromonomers unterliegt wiederum keiner spezifischen Beschränkung. Beispielsweise können Polydimethylsiloxan-Makromonomere mit einem Molekulargewicht M_n im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol³ eingesetzt werden. Üblicherweise wird zur Synthese des segmentierten, amphiphilen Netzwerks ein α,ω-endgruppenfunktionalisiertes Polydimethylsiloxan-Makromonomer, beispielsweise ein bifunktionelles α,ω-Methacryloyloxypropylfunktionalisiertes PDMS-Makromonomer (PDMS(MA)₂) mit einem Molekulargewicht M_n im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol³ eingesetzt.

Die hydrophile Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Komponenten auf Basis von Monomeren, wie (Meth)acrylat und dessen Derivate, Diisocyanate, Diole, Diamine, Disäuren, oder Makromonomeren wie Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, und Polyoxazolinen mit Methacrylat-, Epoxy, Amino-, Isocyanato- oder Hydroxylendgruppen, etc., zum Einsatz kommen. Die hydrophile Komponente wird vorzugsweise aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat und deren Derivaten, insbesondere Hydroxyethyl-acrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Dimethylacrylamid und Dimethylaminoethylmethacrylat, ausgewählt. Mit den Bezeichnungen (Meth)acrylsäure bzw. (Meth)acrylat sind hier im folgenden Acrylsäure und Methacrylsäure bzw. Acrylat und Methacrylat gemeint.

Um zu verhindern, daß die starke Unverträglichkeit zwischen den unterschiedlichen Kettensegmenten nicht schon bei der Synthese zu einer makroskopischen Phasentrennung führt, werden die erfindungsgemäß vorgesehenen amphiphile Netzwerke üblicherweise nicht in Masse, sondern aus einer Lösung als Gele polymerisiert. Wenn die Monomere nicht miteinander mischbar sind und die Verwendung von Phasen vermittelnden Lösungsmitteln nicht ausreichend ist bzw. wenn eines der Monomere bereits in diesem unlöslich ist, so können in vorteilhafter Weise Schutzgruppen-modifizierte Monomere eingesetzt werden. Diese können dann aus Lösung oder in Masse polymerisiert werden. Ein Beispiel für diese Strategie ist der Ersatz des hydrophilen Monomers Methacrylsäure (MAA) durch das hydrophobe Trimethylsilylmethacrylat (TMSMA), welches mit hydrophoben Makromonomeren und organischen Lösungsmitteln gut verträglich ist. Es entstehen dann zunächst Vorläufernetzwerke, deren polare Kettensegmente Trimethylsilyl-Schutzgruppen tragen. Um daraus ein amphiphiles Netzwerk zu erhalten, werden die Schutzgruppen dann in einem zweiten Schritt durch Hydrolyse mit Alkohol/Wasser-Gemischen abgespalten.

Vorzugsweise werden die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren amphiphilen Netzwerke durch thermisch oder UV-initiierte radikalische Copolymerisation von PDMS-Makromonomeren und (Meth)acrylaten- bzw. deren Derivate synthetisiert, wobei als hydrophile Komponenten vorzugsweise Methacrylsäure (MAA), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Hydroxyethylacrylat (HEA) und Dimethylaminoethylmethacrylat (DMAEMA) zum Einsatz kommen. MAA, HEMA und HEA können dabei in Form ihrer hydrophoben Trimethylsilyl-geschützten Derivate ins Polymernetzwerk inkorporiert werden, wonach das Vorläufernetzwerk anschließend durch Entfernung der Schutzgruppe in ein amphiphiles Netzwerk überführt wird.

Mittels der vorstehend ausgeführten Synthesestrategie können aber auch beispielsweise PHEMA-I-PIB bzw. PMAA-I-PIB basierende Netzwerke hergestellt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die amphiphilen Netzwerke durch radikalische Copolymerisation eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Makromonomers mit zwei Methacrylat-Endgruppen und des Monomers Hydroxyethylacrylat (HEA) hergestellt werden. Ein derartiges Copolymerisat weist die gewünschte Phasenseparation auf. Während die hydrophile Phase (Poly-HEA) selektiv in Wasser quillt, kann die hydrophobe Phase (PDMS) in Lösungsmitteln wie Toluol oder n-Heptan gequollen werden. Derartige amphiphile Netzwerke können erfindungsgemäß mit Enzymen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRP), beladen werden, indem sie in einer wäßrigen Enzymlösung inkubiert werden. Nach dem Trocknen befindet sich das Enzym in der hydrophilen Phase des Netzwerks und zeigt bei einer HRP-katalysierten Reaktion wie beispielsweise der oxidativen Kupplung von Phenol und N,N-Dimethylphenylendiamin mit t-Butylhydroperoxid in n-Heptan gegenüber dem freien Enzym eine um mehr als das 40 bis 120-fache höhere Aktivität und eine bis dreimal höhere Stabilität. Eine derartig überraschende vorteilhafte Eigenschaft wird jedoch nicht bei einer Trägerung des Enzyms in Netzwerken, die aus PHEA und einem kurzkettigen Vernetzer aufgebaut sind und demgemäß keine Nanophasenseparation im erforderlichen Bereich zeigen, beobachtet.

Die erfindungsgemäß verwendeten amphiphilen Netzwerke können in Form von Filmen bereitgestellt werden, welche mit dem Katalysator wie z.B. einem Enzym beladen sind, der wiederum durch den Einschluß in das amphiphile Polymernetzwerk stabilisiert und aktiviert wird und damit für Reaktionen in organischen Lösungsmitteln einsetzbar gemacht wird. Die erfindungsgemäße Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren wie z.B. Enzyme durch die Verwendung segmentierter amphiphilen Polymernetzwerke ermöglicht insbesondere, daß im organischen Lösungsmittel selektiv die hydrophobe Phase quillt, während sich die Enzymmoleküle in der hydrophilen Phase befinden und von dieser schützend umschlossen werden. Somit sind die hydrophilen Phasen und damit auch die Enzymmoleküle üblicherweise leicht für im organischen Lösungsmittel gelöste Substrate zugänglich, wodurch die Enzymaktivität gesteigert wird.

Bei Einlagerung solcher Enzyme in die erfindungsgemäß verwendeten amphiphilen Polymernetzwerke zeigen die beladenen Netzwerke, wenn als Film bereitgestellt, nach drei Wochen Lagerung bei 4°C keinen merklichen Aktivitätsverlust. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Einlagerung von derartigen Katalysatoren, wie insbesondere Enzymen, gegenüber einer Trägerung an mikroporösen Materialien wie z.B. Silica, liegt insbesondere darin, daß es sich um ein organisches Polymer handelt, welches das amphiphile Polymernetzwerk aufbaut, was eine beliebige Formgebung ermöglichen kann. Zudem ist die Katalysatorverteilung im Trägermaterial viel feiner als bei entsprechenden mikroporösen Materialien, da Domänen im Nanometerbereich vorliegen und sich der Katalysator nicht nur auf einer inneren Oberfläche befindet, sondern direkt in eine der Phasen eingelagert ist. In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt es insofern zu einer Anreicherung des Enzyms im Polymernetzwerk. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Enzyme die Tendenz besitzen, sich an Oberflächen anzulagern. Fasst man die Grenzflächen zwischen den hydrophilen und den hydrophoben Bereichen bzw. Phasen des Netzwerkes als Oberfläche auf, so ergibt sich durch die Nanophasenseparation eine sehr große „innere" Oberfläche, an der sich die Enzyme im Vergleich zur Lösung aufkonzentrieren können. In Abhängigkeit von der Enzymkonzentration in der entsprechenden Lösung, mit welcher das Polymernetzwerk in Schritt (b) behandelt wird, und dem spezifischen chemischen Aufbau des gewählten segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks werden üblicherweise Beladungen im Bereich von 1 bis 100 μg Enzym, wie z.B. HRP, pro cm² Polymernetzwerk in der Form eines Films erreicht. Die Quantifizierung der Enzymbeladung kann z.B. im Falle von Meerrettichperoxidase durch UV/VIS-Spektroskopie erfolgen.

Die meisten Enzyme sind üblicherweise in organischen Lösungsmitteln unlöslich. Sie werden üblicherweise als Lyophilisat kristallin oder auf bestimmten Materialien geträgert eingesetzt. Bei den Trägermaterialien handelt es sich sehr häufig um mikroporöse Materialien wie Silica. Takahashi et al., Chemical Materials, 2000, Bd. 12, Seiten 3301-3305, beschreibt die Trägerung von Meerrettichperoxidase an Silica, wobei eine Steigerung der Aktivität um den Faktor 10 erreicht wird. Demgegenüber zeigt eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisierte Meerrettichperoxidase in organischen Lösungsmitteln eine gegenüber dem reinen Enzym um das 120-fache gesteigerte Aktivität. Dies ist insbesondere darauf zurückzuführen, daß das Enzym durch den Einschluß in die hydrophile Phase des amphiphilen Netzwerks „quasi-gelöst" vorliegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen immobilisierten Katalysatorssystems in der organischen Synthese, insbesondere der Wirkstoffsysnthese.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von segmentierten amphiphilen Polymernetzwerken, die eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweisen, zur Immobilisierung von Katalysatoren, wie insbesondere Enzymen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

1. Modifizierung von Glasoberflächen mit Methacrylatgruppen
Mit einem Glasschneider wurden Objektträger (mit Mattrand, Länge: 7,6 cm) auf die Breite eines Tesafilms (1,5 cm) zurechtgeschnitten und anschließend mit Piranha-Lösung (45 ml konz. H₂SO₄ und N₂O₂-Lösung (30 %) im Verhältnis 3:2) in einem Färbetrog und unter Einwirkung von Ultraschall angeätzt.
Anschließend wurden sie mit Wasser gespült und an Luft getrocknet. Die so vorbehandelten Objektträger wurden in einem Färbetrog mit einer Lösung von 3-Methacryloyltrimethoxysilan (50 ml, 20 %ig in Toluol) versetzt und bei Raumtemperatur 2 h geschüttelt. Danach überführte man sie in einen weiteren, mit Wasser (50 ml) gefüllten Trog, behandelte sie für 5 min mit Ultraschall, tauschte das Wasser aus (50 ml) und behandelte erneut mit Ultraschall (5 min). Abschließend wurden die Objektträger mit Wasser gespült, an Luft getrocknet und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert.
2. Herstellung dünner, kovalent an Oberflächen gebundener Filme
Ein Monomergemisch für Polyhydroxyethylacrylat-I-polydimethylsiloxan-Filme (PHEA-I-PDMS) wurde hergestellt, indem der Photoinitiator Irgacure 651 (5 mg/ml) in frisch destilliertem Triethylsilyloxyethylacrylat (TMSOEA) unter Schütteln gelöst, dazu PDMS_5.2(MA)₂ gegeben und erneut kräftig geschüttelt wurde.
Auf einen unmodifizierten Objektträger wurde blasen- und faltenfrei ein Streifen Tesafilm geklebt und auf diesen das Monomergemisch (60 μl) gleichmäßig aufgetragen. Anschließend wurde ein „silanisierter" Objektträger parallel zum Tesafilm unter Vermeidung eines Luftblaseneinschlusses auf das Monomergemisch geklebt. Die Polymerisation erfolgte durch Bestrahlen mit einer handelsüblichen UV-Polymerisationslampe (Heraflash der Fa. Heraeus Kulzer) (2 × 180 s von jeder Seite mit jeweils 30 s Abkühlzeit zwischen den Belichtungen; Gesamtbelichtungszeit: 720 s). Der Tesafilm wurde dann mitsamt dessen Träger vorsichtig von dem amphiphilen Film gelöst und letzterer in ein MeOH/H₂O Gemisch (90 ml, 1:1) gegeben. Darin wurde er bei Raumtemperatur für mindestens 12 h unter Schütteln und mit zweimaligen Wechseln des Lösungsmittels inkubiert. Anschließend wurden die geträgerten Filme mit MeOH gewaschen und im Trockenschrank (50 mbar, 60°C) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Auf diese Weise wurden PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 91/9, 77/23, 50/50, 41/59 bzw. 9/91 hergestellt.
3. Herstellung dünner, ungeträgerter PHEA-I-PDMS-Filme
Es wurden ungeträgerte PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 77/23 hergestellt. Die Synthese erfolgte analog zu der oben für die Herstellung von kovalent an Träger gebundene Filme beschriebenen Methode. Anstelle eines oberflächenmodifizierten Objektträgers wurde ein unmodifizierter verwendet, der Film ließ sich nach dem Entschützen in MeOH/Wasser von diesem im Wasserbad trennnen. Anschließend wurde er auf eine Teflonfolie überführt und auf dieser zunächst an Luft, später im Trockenschrank (50 mbar, 60°C) getrocknet.
4. Beladung von dünnen, kovalent an Träger gebundenen amphighilen Netzwerken mit Enzymen
Von den vorstehend erhaltenen Filmen wurde das Mattrandende des Objektträgers mit einem Glasschneider entfernt, die Träger mit dem Film nach oben zeigend in eine eigens dafür gefertigte Teflonwanne (Innenabmessungen: 5,7 × 1,7 cm, Tiefe: 1,5 cm) gelegt und mit Enzymlösung (2 ml, c = 1 mg/ml bzw. 25 μmol/l, Meerrettichperoxidase (HRP) in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7) versetzt. Anschließend wurde bei T = 4°C unter Schütteln für mindestens 16 h inkubiert, dann der Film aus dem Beladungsbad genommen, mit einem Papiertuch getrocknet, mit Phosphatpuffer gespült (3 × 5 ml) und erneut mit einem Papiertuch getrocknet. Zum abschließenden Trocknen wurde der beladene Film an Luft stehen gelassen (30 min). Die Lagerung der Filme erfolgte bei 4°C.
5. Aktivitätsbestimmung geträgerter und suspendierter HRP am Beispiel der oxidativen Kupplung von Dimethylaminoanilin und Phenol in Heptan
Aktivitätsassays mit Dimethylaminoanilin und Phenol wurden in n-Heptan durchgeführt. Es wurden die folgenden Lösungen angesetzt:

1. Dimethylaminoanilin-Lösung (2,724 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan)
2. Phenol-Lösung (1,882 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan)
3. tert-Butylhydroperoxid (10 mM in n-Heptan): 9,10 μl einer tert-BuOOH-Lösung (ca. 5,5 M in Dekan) wurden mit Heptan auf 5 ml aufgefüllt.

Die Konzentrationen im Assayvolumen betrugen (s.u.): c(Dimethylaminoanilin) = 1,67 mM, c(Phenol) = 1,67 mM, c (H₂O₂ bzw. t-BuOOH) = 0,83 mM.
Aktivitätsassay von HRP-beladenen amphiphilen Filmen:
Aktivitätsassays wurden mit HRP-beladenen PHEA-I-PDMS-Filmstücken der Zusammensetzung 77/23 (A(Film) = 0,7 – 1,3 cm²) in n-Heptan durchgeführt. Die Flächenkonzentration an HRP lag zwischen 2 bis 10 μg/cm². Für den Blindversuch wurde ein mit Trypsin beladenes PHEA-I-PDMS (77/23)-Filmstück verwendet. Die Filmstücke wurden in eine Küvette (d = 1 cm) gegeben, Lösungsmittel (2.000 ml), Dimethylaminoanilin-Lösung (200 μl) und Phenol-Lösung (200 μl) zugesetzt und die Reaktion durch Zugabe von t-BuOOH-Lösung (200 μl) gestartet. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Zunahme der Absorption im Absorptionsmaximum des gebildeten Farbstoffes (λ_max = 546 nm) gegen reines Lösungsmittel als Hintergrund gemessen. Dazu wurde die Reaktionslösung mit einem Rührfisch gerührt und in regelmäßigen Abständen (60 s bzw. 5 min) die Absorption aufgezeichnet.
Aus dem linearen Bereich der Reaktionen (t_R×n = 30 – 70 min) kann unter Berücksichtigung der Blindreaktion nach der folgenden Gleichung die spezifische Aktivität bestimmt werden:
Eine Unit wurde definiert als die Zunahme der Absorption im Absorptionsmaximum um 0,001 pro Minute bei einem Reaktionsvolumen von 2,4 ml und einer Schichtdicke von 1 cm.
Die spezifischen Aktivitäten der geträgerten HRP betrugen 0,02 bis 0,05 U/μg Enzym, während das Enzym über einen Zeitraum von ca. 40 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.
Aktivitätsassay von ungeträgerter HRP
Die Aktivität von ungeträgerter HRP wurde in n-Heptan in zwei Versuchen mit unterschiedlichen Enzymmengen bestimmt (350 μg und 740 μg). Für jeden dieser Versuche wurde in mehreren Rollrandgläsern die gleiche Enzymmenge eingewogen und jeweils 1,8 ml Heptan (auf 25 °C temperiert) zugegeben. Anschließend suspendierte man das Lyophilisat durch kurze Ultraschallbehandlung gab Dimethylaminoanilin-Lösung (je 200 μl) und Phenol-Lösung (je 200 μl) zu und startete die Reaktionen simultan durch Zugabe von t-BuOOH-Lösung (je 200 μl). Man rührte kräftig bei 25 °C. In zeitlichen Abständen von zunächst 15 min und 30 min ab einer Reaktionszeit von 45 min wurde jeweils einer der Ansätze durch einen Spritzenfilter filtriert und die Absorption des Filtrats bei 546 nm gemessen (Schichtdicke 1 cm).
Die spezifische Aktivität ergibt sich gemäß nachstehender Gleichung unter Berücksichtigung der Blindreaktion (s.o.) aus dem linearen Bereich der Reaktionen (t_R×n = 30 – 45 min)
Die spezifische Aktivität von suspendierter HRP lag bei 0,0004 bis 0,0005 U/μg Enzym, während die Aktivität über ca. 15 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.

Claims

Immobilisierter Katalysator, wobei der Katalysator in ein aus mindestens einer hydrophilen und einer hydrophoben Komponente aufgebautes, segmentiertes amphiphiles Netzwerk, das eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweist, eingebracht ist.
Katalysator nach Anspruch 1, wobei der Katalysator ein Enzym ist.
Katalysator nach Anspruch 2, wobei das Enzym eine Peroxidase, insbesondere Meerrettichperoxidase, ist.
Katalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die hydrophobe Komponente ein Polydimethylsiloxan-Makromonomer mit einem Molekulargewicht M_n im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol³ ist.
Katalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die hydrophile Komponente aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat oder deren Derivaten ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung des immobilisierten Katalysators nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Schritte: (i) Herstellen eines segmentierten, amphiphilen Polymernetzwerks durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie bzw. eines Monomers und eines Makromonomers mit jeweils unterschiedlicher Hydrophilie und (ii) Beladen des Polymernetzwerks mit dem Katalysator.
Verfahren nach Anspruch 6, worin in Schritt (i) ein hydrophobes Makromonomer mit einem hydrophilen Monomer umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das hydrophobe Makromonomer ein α,ω-endgruppenfunktionalisiertes Polydimethylsiloxan-Makromonomer mit einem Molekulargewicht M_n im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol³ ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das hydrophile Monomer aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat oder deren Derivaten, insbesondere Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Dimethylacrylamid oder Dimethylaminoethylmethacrylat, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 bis 9, worin das Polymernetzwerk in Schritt (i) durch UV-initiierte radikalische Copolymerisation in Masse durchgeführt wird.
Verwendung des immobilisierten Katalysators nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5 in der organischen Synthese, insbesondere der Wirkstoffsynthese.
Verwendung von segmentierten amphiphilen Polymernetzwerken, die eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweisen, zur Immobilisierung von Katalysatoren wie insbesondere Enzymen.